CN105255887B - 一种重组慢病毒及其在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SEQ ID NO.1和2所示的核苷酸序列，本发明还公开了包包含前述核苷酸序列的重组质粒PLLU2G‑shPrmt1‑3，以及包含该重组质粒的重组慢病毒LV‑shPRMT1。本发明SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示shRNA、包含前述shRNA的重组质粒PLLU2G‑shPrmt1‑3以及包含该重组质粒的重组慢病毒LV‑shPRMT1，可以沉默PRMT1基因，下调PRMT1的表达，进而降低H4R3me2a以及可卡因成瘾相关基因Cdk5和CaMK II的表达，可以制备成为治疗可卡因成瘾的药物，临床应用前景良好。

Description

一种重组慢病毒及其在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种重组慢病毒及其在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途。

背景技术

可卡因(Cocaine)又称古柯碱,化学名为苯甲酰甲基芽子碱(methylbenzoylecgonine)，一般呈白色晶体状,无臭,味苦而麻，其最早用于局部麻醉和治疗哮喘，是最强的天然中枢兴奋剂，因其对中枢神经系统的兴奋作用而导致滥用，1985年起成为世界性主要毒品之一。

可卡因成瘾，是一种慢性复发性脑部疾病，属于药物依赖(drug dependence)类疾病，可卡因成瘾会引起大脑结构和功能的可塑性变化，相关脑区包括伏隔核、纹状体、前额皮质、海马和腹侧被盖区，健康也受到多方面的危害，包括精神颓废、人格缺损、心智功能紊乱、并发相应的感染合并症以及吸毒者不顾一切地寻求和使用毒品而诱发各种违法犯罪活动。

可卡因成瘾的主要特点表现为即使患者在知晓用药的严重后果后，依然强迫性索取和使用以满足欲望、对药物的寻觅和索取失去控制、对事物失去兴趣、成瘾记忆十分深刻，即使经过戒断治疗若干年后，接触与成瘾有关的刺激(如毒友、与过去用药有关的环境等)都可能诱发复吸。

鉴于可卡因成瘾危害甚大，找到合适的治疗靶点和药物，治疗可卡因成瘾迫在眉睫。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一类治疗可卡因成瘾的药物。

PRMT1：蛋白精氨酸甲基化转移酶1。

PRMT1抑制剂：抑制蛋白精氨酸甲基化转移酶1的酶活或者表达的物质。

本发明提供了一种沉默PRMT1表达的基因治疗剂。

首先，本发明提供了一种核苷酸序列，其核苷酸序列如下：

TGCTGAGGACATGACATCCAAACTCGAGTTTGGATGTCATGTCCTCAGCTTTTTC(SEQ ID NO.1)。

本发明还提供了一种核苷酸序列，其核苷酸序列如下：

TCGAGAAAAAGCTGAGGACATGACATCCAAACTCGAGTTTGGATGTCATGTCCTCAGCA(SEQ IDNO.2)。

本发明还提供了一种重组质粒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述核苷酸序列的重组质粒。

优选地，所述重组质粒是重组PLLU2G质粒。进一步优选地，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种重组慢病毒，它包含前述任意一项的重组质粒。

本发明还提供了前述的核苷酸序列、重组质粒或重组慢病毒在制备PRMT1抑制剂中的用途。

本发明还提供了前述的核苷酸序列、重组质粒或重组慢病毒在制备可卡因成瘾的药物中的用途。

优选地，所述药物是降低H4R3me2a的表达水平的药物。进一步优选地，所述药物是降低基因Cdk5和CaMK II的表达水平的药物。

本发明还提供了一种治疗可卡因成瘾的药物，它是以前述的核苷酸序列、重组质粒或重组慢病毒为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

优选地，所述制剂是注射制剂。

本发明SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示shRNA、包含前述shRNA的重组质粒PLLU2G-shPrmt1-3以及包含该重组质粒的重组慢病毒LV-shPRMT1，可以沉默PRMT1基因，下调PRMT1的表达，进而降低H4R3me2a以及可卡因成瘾相关基因Cdk5和CaMK II的表达，可以制备成为治疗可卡因成瘾的药物，临床应用前景良好。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1小鼠条件性位置偏爱箱

图2自发活动检查箱.

图3 M:100bp DNA ladder；Lane1,8,15：阳性对照；Lane 2-7：pDown-shPrmt1-1-eGFP①～⑥克隆；Lane 9-14：pDown-shPrmt1-2-eGFP①～⑥克隆；Lane 16-21：pDown-shPrmt1-3-eGFP①～⑥克隆。

图4筛选shRNA干扰PRMT1表达序列。Neuro2A-sh Prmt1-3最大程度抑制PRMT1表达。

图5慢病毒载体结构图谱

图6病毒滴度测定稀释图。10倍梯度稀释，稀释范围为10^-5-10^-9

图7验证慢病毒在伏隔核中表达，卡通示意图取自小鼠脑图谱冠状1.5mm切片。

图8 LV-shPRMT1特异性干扰PRMT1表达。Student’s t tests,*p<0.05，LV-GFP n＝6，LV-shPRMT1n＝6。

图9伏隔核内注射LV-shPRMT1特异干扰PRMT1蛋白的表达。(A)LV-shPRMT1干扰伏隔核PRMT1蛋白的表达；(B)LV-shPRMT1不影响伏隔核PRMT4蛋白的表达；(C)LV-shPRMT1不影响伏隔核PRMT5蛋白的表达；Actin作为内参蛋白，Student’s t tests，*p<0.05，LV-GFPn＝4，LV-shPRMT1n＝4。

图10伏隔核内注射LV-shPRMT1不影响纹状体PRMT1，PRMT4和PRMT5的表达。(A)LV-shPRMT1不影响纹状体PRMT1蛋白的表达；(B)LV-shPRMT1不影响纹状体PRMT4蛋白的表达；(C)LV-shPRMT1不影响纹状体PRMT5蛋白的表达；Actin作为内参蛋白，LV-GFP n＝4，LV-shPRMT1n＝4。

图11伏隔核内注射LV-shPRMT1明显改善可卡因诱导行为可塑。(A)伏隔核内注射LV-shPRMT1抑制可卡因诱导的奖赏行为，One-way ANOVA，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，LV-GFP Saline n＝13，LV-shPRMT1Saline n＝13，LV-GFP Cocaine n＝11，LV-shPRMT1Cocaine n＝12。(B)伏隔核内注射LV-shPRMT1减弱可卡因诱导的自发活动行为，Two-way ANOVA analysis followed by bonferroni post-tests，*p<0.05,**p<0.01and***p<0.001，LV-GFP Saline n＝11，LV-shPRMT1Saline n＝12，LV-GFP Cocaine n＝12，n＝13LV-shPRMT1Cocaine。

图12PRMT1调控可卡因奖赏行为与低表达PRMT1相关。(A)PRMT1调控可卡因奖赏行为与低表达PRMT1mRNA相关，One-way ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，n＝6/组。(B)PRMT1调控可卡因奖赏行为与低表达PRMT1蛋白相关，One-way ANOVA，*p<0.05，***p<0.001，n＝3/组。

图13PRMT1调控H4R3me2a和acH3K9/K14的修饰。(A)低表达PRMT1降低H4R3me2a的修饰，One-way ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，n.s.表示没有统计学差异，n＝4/组。(B)低表达PRMT1通过控制H4R3me2a的修饰影响acH3K9/K14的表达，One-way ANOVA，*p<0.05，n.s.表示没有统计学差异，n＝4/组。

图14 H4R3me2a和acH3K9/K14调控Cdk5基因转录。(A)在可卡因重复给药模型中，H4R3me2a和acH3K9/K14在Cdk5基因启动子位点结合增加，Students’t-test，*p<0.05，N＝3/组，4只动物伏隔核样本并入一个样本(视为N＝1)；(B)可卡因重复给药上调伏隔核Cdk5mRNA的表达，Students’t-test，*p<0.05，n＝5/组。

图15 H4R3me2a和acH3K9/K14调控CaMK II基因转录。(A)在可卡因重复给药模型中，H4R3me2a和acH3K9/K14在CaMK II基因启动子位点结合增加，Students’t-test，*p<0.05，N＝3/组，4只动物伏隔核样本并入一个样本(视为N＝1)；(B)可卡因重复给药上调伏隔核CaMK II mRNA的表达，Students’t-test，*p<0.05，n＝5/组。

图16可卡因重复给药增高H4R3me2a的表达。可卡因重复给药增加伏隔核H4R3me2a的表达，增高H4R3me2a的表达状态至少维持到可卡因戒断后第7天。伏隔核样本检测时间分别为可卡因戒断1天(D1)、7天(D7)、14天(D14)、28天(D28)和42天(D42)，Actin作为内参蛋白，*p<0.05表明与生理盐水组相比较有统计学差异，n＝3/组。

图17可卡因重复给药降低伏隔核H3K9me2的表达。降低H3K9me2的表达在可卡因戒断第7天即恢复正常水平。伏隔核样本检测时间分别为可卡因戒断1天(D1)、7天(D7)、14天(D14)、28天(D28)和42天(D42)，Actin作为蛋白内参，*p<0.05表明与生理盐水组相比较有统计学差异，n＝3/组。

图18可卡因重复给药降低伏隔核H3K36me3的表达。降低H3K36me3表达在可卡因戒断第7天即恢复正常水平。伏隔核样本检测时间分别为可卡因戒断1天(D1)、7天(D7)、14天(D14)、28天(D28)和42天(D42)，Actin作为蛋白内参，*p<0.05表明与生理盐水组相比较有统计学差异，n＝3/组。

具体实施方式

实施例1本发明干扰PRMT1表达慢病毒的构建

1设计序列

根据靶基因PRMT1设计并合成shRNA oligo，oligo序列如下表：

shRNA PRMT1oligo序列

2构建载体

2.1Oligo DNA的退火

把待退火DNA oligo用DEPC处理的水配制成50μM，溶解退火缓冲液(5×)，混匀备用。设置反应体系如下：DEPC-water 40μl；退火缓冲液(5×)20μl；DNA oligo-F(50μM)20μl；DNA oligo-R(50μM)20μl；总反应体系为100μl。按照上述反应体系依次加入各种试剂，混匀。然后设置PCR仪进行退火反应如下：95℃2min；每8s下降0.1℃，降至25℃约90min；4℃长时间保存。最后，-20℃冰箱保存。

2.2酶切载体PLLU2G

酶切体系设置如下：PLLU2G(515ng/μl)3μl；10×K buffer 5μl；XhoI 1μl HpaI 1μl；H₂O40μl；总反应体积为50μl。反应条件为在37℃酶切3个小时，然后用6×loadingbuffer终止反应，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳并切胶回收。DNA琼脂糖凝胶电泳回收参照天根的DNA琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒进行回收，并测浓度(ng/μl)。

2.3连接PLLU2G与shRNA片段

连接体系设置如下：PLLU2G酶切回收产物(160ng)(160/Con)μl；退火的Oligo DNA(1/10稀释1μl；10×T4DNA ligase buffer 2.5μl；T4DNA ligase 1μl；加H₂O到25μl；总反应体系体积为25μl，然后16℃连接过夜。

2.4转化stb13细菌

把10μl连接反应物加入到100μL STBL3Chemically Competent E.coli中，冰上孵育30分钟；42℃热击细胞30秒；立即转移到冰上孵育2分钟；加入250μl S.O.C.medium，在37℃、225RPM.的摇床里孵育1小时；把100μl转化物涂到含有100μg/mL Amp的LB平板上，37℃孵育过夜。

2.5PCR筛选阳性重组子

PCR鉴定引物：PLLU2G-flank-f：AGGCTTAATGTGCGATAAAAGAC，PLLU2G-flank-r：GAGCTTATCGATACCGTCGAC；按照下列PCR反应体系：灭菌水16.1μl；10×Taq Buffer with(NH4)2SO43μl；dNTP Mixture(10μM)3μl；MgCl22μl；引物-F(10μM)1.2μl；引物-R(10μM)1μl1.2μl；Taq DNA polymerase 1.5μl；模板DNA 2μl；总反应体积为30μl。PCR扩增程序：94℃3min；94℃,30S；60℃,30S；72℃,1min(2kb/min)；29个循环72℃1min。

2.6挑取阳性克隆质粒以及送交阳性克隆测序鉴定

送交阳性克隆测序鉴定的测序引物为：shRNA-F：TGATAGGCTTGGATTTCT，PLLU2G-R：GCGCCCTTCGTCTGACGTG。菌落PCR鉴定结果如图3。利用Western blot对3个序列体外干扰PRMT1表达检测，结果显示，PLLU2G-shPRMT1-3(含有shPrmt1-1-F和shPrmt1-1-R的重组质粒)对PRMT1抑制效果最好(图4)，故后续病毒包装中选用该发卡序列作为目的序列。图5所示为载体结构图谱。

PLLU2G-shPRMT1-3的全序列(SEQ ID NO.3)：

序列说明：

下划线的序列为插入到PLLU2G载体的第一条shPrmt1-1 Hairpin sequence，其余两条干扰载体的全序列可用其对应的Hairpin sequence替换红色标识的序列而得。

PLLU2G-control全序列如SEQ ID NO.4所示。

3病毒包装及滴度测定

3.1病毒包装

取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿5×10⁶个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜；第二天转染前去除旧的培养液，加入5mL新鲜的含10％血清DMEM培养液；制备DNA-Lipofectamine2000复合物，以一个10cm培养皿的用量为示范：准备一支无菌的5mL离心管，先加入1.5mL无血清培养液，再加入pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5、目的质粒(各4μg)，轻轻颠倒混匀；准备另外一支无菌的5mL离心管里，加入1.5mL无血清培养液和40μL的Lipofectamine 2000，轻轻颠倒混匀。室温孵育5分钟；5分钟后，将已稀释DNA加入到含有Lipofectamine 2000的无血清培养液，轻轻颠倒混匀。室温孵育20分钟；将DNA-Lipofectamine 2000复合物一滴一滴地添加到293FT细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。放置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中过夜培养；转染后一天，更换10mL含10％血清DMEM培养液。放置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养；转染后48小时收集培养上清进行浓缩；加入10ml新鲜的培养液继续培养，转染后72小时再次收集浓缩；收集浓缩条件为：3000rpm低速离心15min，上清用0.45μm滤器进行过滤，以彻底去除细胞碎片；每个UT离心管装20mL滤液，4℃50000×g高速离心90min沉淀病毒颗粒，弃去上清，用少量HBSS重悬；在UT离心管装10mL预冷的20％蔗糖溶液(HBSS溶解)，将重悬溶解好的病毒液小心加到蔗糖页面上，20℃50000×g高速离心120min沉淀病毒颗粒；弃去离心上清，用HBSS重悬病毒沉淀，即得本发明重组慢病毒LV-shPRMT1，分装进入0.5ml进口AXYGEN管中，每管100ul。分装好的病毒放置-80℃保存。

3.2滴度测定

宿主细胞的准备：转导前一天(第1天)，胰酶消化细胞并计数细胞密度，按照合适的细胞密度接种到6孔板中(一个样品准备两块细胞)，能使转染当天的融合度达到30％-50％。放置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱过夜培养。病毒转染：转导当天(第2天)，融解病毒，准备10倍稀释系列样品，稀释倍数从10^-5到10^-9。对于每一个稀释样品，用完全培养液稀释病毒至总体积1ml。在含有病毒的培养液中加入聚凝胺(工作浓度是6μg/ml，1ml稀释病毒液中加入1μl聚凝胺)，以促进病毒感染细胞。轻轻吹打充分混匀。去除细胞中的培养液，加入已含有不同病毒量的完全培养液。另外，保留一孔不添加病毒的细胞，作为空白对照组，每孔加入的培养液的体积应为1ml(如图6)。放置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱过夜培养。转染后一天(第3天)，去除含有病毒的培养液，加入2mL新鲜的完全培养液。放置37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱过夜培养；接种病毒2～3天后计数荧光克隆数目，并计算病毒滴度，PLLU2G-shPrmt1-3病毒(即含有PLLU2G-shPrmt1-3重组质粒的慢病毒——LV-shPRMT1)滴度结果见下表a，对照组滴度结果见下表b。

表a PLLU2G-shPrmt1-3病毒(LV-shPRMT1)滴度结果

表b PLLU2G-control病毒滴度结果

本发明构建得到了包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示shRNA的重组质粒PLLU2G-shPrmt1-3，其可以有效干扰PRMT1表达，本发明还构建得到了含有PLLU2G-shPrmt1-3重组质粒的重组慢病毒(LV-shPRMT1)。

以下用实验例的方式验证本发明的有益效果：

实施例1 本发明重组慢病毒LV-shPRMT1治疗可卡因成瘾

1实验试剂

本部分使用的试剂如表1-1。

表1-1实验试剂

2主要仪器

本部分使用的实验仪器如表1-2。

表1-2实验仪器

3实验方法

3.1实验动物

雄性SPF级健康性成熟(8-12周龄)C57BL/6J小鼠由上海市斯莱克实验动物有限责任公司提供，体重20-22g，未交配过。饲养条件：国家成都新药临床前安全性评价中心普通动物房，温度20-25℃，相对湿度55-65％，整个实验过程中，动物自有摄食和饮水，饲养环境符合国标GB14925-2001。本课题所有的动物实验操作均符合AAALAC要求，实验前正常饲养实验动物一段时间以熟悉并适应环境。

3.2脑内注射PRMT1抑制剂

经过单侧伏隔核埋管的小鼠，采用33型微量注射针和微量注射导管，按照表1-3给药剂量给予不同的PRMT1抑制剂——MTA，AMI-1和SKLB-639。MTA，AMI-1和SKLB-639用DMSO配制为100X的储备液，使用前用生理盐水稀释至可用浓度。

表1-3PRMT1抑制剂注射剂量

3.3伏隔核脑区埋管

脑区定位埋管是脑区定位给药的直接手段和常用技术。本研究中使用10％水合氯醛(0.4g/kg体重)麻醉小鼠，头顶部剃毛，将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上，固定后调节头部至水平状态，医用酒精消毒皮肤，手术暴露颅骨，用棉球和眼科剪刀除去颅骨表面的脑膜，找到前囟部位，记号笔标记；调节立体定位仪，安置注射导管(深圳瑞沃德生物科技有限公司，#62003，OD 0.48mm X ID 0.34mm)，于前囟点调零；以前囟部位为原点，参考定位坐标(伏隔核：AP+1.6；ML+1.5)把注射针移动到注射部位的正上方，使注射针与颅骨刚接触，调零Y坐标，向下缓慢移动注射针至3.4mm深，松开坐标臂并移开，将牙科粉与稀释液调至浆糊状固定套管下部，与颅骨相连达到固定导管的目的。插入导管帽(深圳瑞沃德生物科技有限公司，#62102，OD 0.30mm)，防止导管堵塞，缝合头顶部伤口。手术结束后，将小鼠保温至苏醒，然后放入干净饲养笼中，单只单笼饲养。从手术后第二天开始，每天后腿部肌肉注射青霉素钠溶液(160000U/ml,0.1ml/只小鼠)，并隔天松动导管帽，确保导管通畅，小鼠的术后恢复期为7天。经过此手术的动物用于研究伏隔核注射PRMT1抑制剂(包括MTA，AMI-1和SKLB-639)调控可卡因条件性位置偏爱行为检测。

3.4伏隔核定位注射慢病毒

10％水合氯醛(0.4g/kg体重)麻醉小鼠，头顶部剃毛，将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上，调节头部至水平状态，医用酒精消毒皮肤，手术暴露颅骨，用棉球和眼科剪刀除去颅骨表面的脑膜，找到前囟部位，记号笔标记；调节立体定位仪，按照定位坐标(AP+1.6；ML±1.5；DV-3.4)，利用33型注射针，以0.1μl/min速率双侧伏隔核内注射0.5μl慢病毒，注射完毕后，缓慢移出注射针，缝合头顶部皮肤。手术结束后，保温小鼠至苏醒，然后放入干净饲养笼中，单只单笼饲养。从手术后第二天开始，每天后腿部肌肉注射青霉素钠溶液(160000U/ml,0.1ml/只小鼠)，连续注射3天，小鼠的术后恢复期为7天。经过此手术的动物用于研究伏隔核注射抑制PRMT1表达慢病毒调控可卡因条件性位置偏爱行为学检测和自发活动行为学检测。

3.5可卡因诱导小鼠条件位置偏爱模型(CPP)

CPP小鼠可卡因成瘾模型建立参考文献方法学后稍作修改^[32]，CPP操作如图1所示。CPP试验箱由有机玻璃做成的黑、白两个大箱和中间一个灰箱构成，一个箱子具有黑色四壁和具有圆孔的粗糙地面，另一个白色四壁和条纹型的粗超地面。小鼠在实验箱内自由活动，适应三天。CPP实验分为3个阶段，在实验过程中，按照表1-4注射可卡因和生理盐水。第一阶段(day1)：测试小鼠的自然偏好，在一般条件下，小鼠对黑箱表现出天然的偏好，所以后面的训练阶段以白箱为伴药箱。第二阶段(day2-day7)：为训练阶段，在此期间，用隔板封闭箱间的通道，第2,4,6天注射可卡因，并立即将小鼠放入白箱中，第3,5,7天注射生理盐水，并立即将小鼠放入黑箱中，每次小鼠在箱内停留的时间为15min；第三阶段(day8)：为测试阶段，在此阶段，将箱间的隔板去除，让小鼠在箱内自由活动，并记录15min小鼠分别在黑、白箱内停留时间。小鼠测试结束后，于30min内快速解剖，取出伏隔核用于后续检测。

结果用条件性位置偏爱测试期间，条件诱导箱体停留时间减去另外一个箱体停留时间差值作为诱导后偏好，与自然偏好时间相比较来表达。采用SPSS统计软件分析实验结果，差值以均数±标准差表示，用t检验分析法比较可卡因给药组和生理盐水对照组的差异，p<0.05为有统计学差异。

注意事项：每次动物训练时，应该轻拿轻放，不要对动物的情绪造成重大影响；每次训练结束应该对箱体进行擦拭，以消除每个动物的气味。光照强度，每天的训练时间，训练时长，噪音应该注意控制。

表1-4可卡因给药途径、给药剂量、给药体积汇总表

3.6可卡因奖赏行为的消退模型建立

可卡因条件性位置偏爱模型建立后，将生理盐水组动物随机分为生理盐水+溶剂对照组，生理盐水+MTA组；将表现出偏爱的可卡因组动物随机分为可卡因+溶剂对照组，可卡因+MTA组，所有动物在完成CPP测试后，立即注射相对应的溶剂对照或MTA，然后立即放入饲养笼，24h后再次测定小鼠对CPP箱的偏爱行为，并记录15min小鼠分别在黑、白箱内停留时间。

3.7可卡因自发活动模型建立

实验前，小鼠适应检测仪器(图2)3天，每天5min。实验开始后，第1天记录小鼠的自发活动值，作为基础值；以后每天约同一时间腹腔注射20mg/kg可卡因，连续6天，每天1次。药物注射后立即放入自发活动箱内，记录30min内小鼠的行为活动(如活动距离)。

3.8构建shRNA-PRMT1慢病毒

按照实施例1的方法制备。

3.9蛋白提取与蛋白印迹(Western Blot)

3.9.1总蛋白的提取与定量

取冻存的组织，根据组织大小加入RIPA裂解液，对于伏隔核组织，加入100μl左右，置于冰上裂解5min，然后超声10次，2秒/次(置于冰上)，目的是破碎组织细胞，充分溶解释放蛋白，然后4℃，13,000g离心15min，取出上清液，放冰上。蛋白定量主要参照BCA方法，主要步骤为：首先，稀释BSA至1,0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.05,0mg/ml浓度梯度；然后将提取的蛋白液按照伏隔核(1:10稀释)，纹状体(1:50稀释)，海马(1:50稀释)以及前额皮质(1:10稀释)稀释，BSA和蛋白样品分别加入10μl至相应孔内。测定前，在各孔中加入200μl考马斯亮蓝G250,595nm测定吸光度值，BSA标准曲线现行相关性为R²>0.99为合格定量标准，然后计算出对应的蛋白浓度；每个样本加入5X的蛋白上样缓冲液(含β-巯基乙醇)，使最终浓度为1X。煮沸样品5min，分装，储存于-20℃。3.9.2聚丙烯酰胺凝胶电泳

按照表15，表1-6聚丙烯酰胺制备胶配制10％和15％的分离胶和5％的浓缩胶。将制备好的胶放入电泳槽中，点样。根据每个蛋白在伏隔核中的丰度，调整样品浓度，每个样本槽加入蛋白样本体积约为18μl。然后使用80V电压压缩蛋白样本至分离胶界限处时，将电压增加至120V，直至目的蛋白完全分离。进行转膜程序时，将载有目的蛋白的胶放入带有“三明治”的转膜夹中，并将经过甲醇活化的PVDF膜盖在胶上，转膜电压设定为100V，转膜时间根据蛋白大小而定。转膜完成后，用TBST配制的5％的脱脂牛奶封闭，封闭时间为1小时。将一抗按照需要的比例稀释，用杂交带封好，4℃过夜，第二天用TBST洗膜三次，每次10min。根据一抗源性，按照1:5000稀释相应的第二抗体，室温2h，结束后用TBST洗膜二次，每次10min，然后用TBS洗膜一次，同样10min。曝光时，按照1:1的比例配制发光A液和发光B液，在暗室中将载有目的蛋白的PVDF条带置于发光混合液中反应1min，将PVDF膜取出，用滤纸吸干多余发光液，按照正面朝上的原则，将PVDF膜放入暗盒中，膜正面也胶片接触，关闭暗盒，封闭胶片时间取决于蛋白丰度，洗片。

数据处理：将免疫印迹胶片用Image-Pro Plus 6.0系统读取各条带的灰度值，用beta-actin条带灰度值作为内参进行标准化比较。

表1-5Western blot分离胶制备配置

表1-6Western blot浓缩胶制备配置

3.10实时荧光定量PCR

3.10.1RNA提取

对于脑组织，将脑组织放入已有1ml Trizol的1.5ml EP管中，使用1ml枪头来回吹打近100次，使组织细胞尽量裂解。对于细胞培养，吸去培养液，加入1ml Trizol，室温放置5分钟后反复吹打细胞，使细胞尽量裂解，将细胞裂解物移入一个1.5ml EP管。然后对组织裂解液和细胞裂解液加入200μl氯仿，振荡15秒，室温放置2～3分钟；4℃，12000g，离心15min，离心后，液体分为三层，RNA存在于最上层的水相中，水相层的体积大约为进行匀浆时的Trizol体积的60％。将水相层转移到一个新的EP管(1.5ml)中，注意不要污染中间层，之前所用的1ml Trizol里加入0.5ml的异丙醇来沉淀RNA，混匀后室温孵育10min或者4℃孵育20～30min，4℃，12000g离心10min，RNA沉淀成胶状黏附在管底。倒掉上清，瞬离，吸净残留。1ml Trizol至少加入1ml 75％乙醇洗涤RNA，4℃，10000g，离心5min。倒掉上清，瞬离，吸净残留。并开盖室温干燥10min，注意不要过分干燥。使用20μl DEPC水溶解RNA，纯化的RNA样本保存于-80℃。

3.10.2琼脂糖凝胶电泳

将所用的电泳槽、梳子、制胶板子、锥形瓶、量筒(100ml、1000ml)准备好并且洗净(自来水、去离子水和milic水)，然后装上millic水用于之后稀释TAE。称取适量琼脂糖于锥形瓶中，按所需浓度及体积加入1X TAE溶液，可配置25-30ml(1％胶浓度，即0.25-0.3mg),在微波炉中融化。待稍冷时，加入5μl Gold View染料，轻摇匀，避免产生气泡。冷却至约60℃时倒胶(厚度在0.5cm以内)，待完全凝固时，拔出梳子，上样电泳，电泳缓冲液应没过胶板。加样，加样缓冲液不应小于1X。电泳电压(样品由负极(黑)向正极(红)移动)200V 7min，样本跑出点样孔约1-2cm后，用IMAGE LAB对琼脂糖凝胶成像。

3.10.3Realtime PCR反应

使用商品化的逆转录试剂盒合成cDNA(Bio-rad)，合成的cDNA保存于-80℃。然后进行realtime PCR反应，本部分使用到的基因mRNA引物序列如表1-7，将所有cDNA样品分别配置反应体系。体系配置如下：2X SYBR green mix 10μl，10μM PCR引物F 1μl，10μM PCR引物R 1μl，cDNA样本1μl，加水至总体积20μl，轻弹管底将溶液混合，小心盖上PCR管盖，5000rpm短暂离心，在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。将上述96-PCR板置于realtime PCR仪上进行PCR反应，反应按照以下程序进行：95℃3min，40个PCR循环(95℃，15秒；60℃，45秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的溶解曲线，扩增反应结束后，按从65℃缓慢加热到95℃。

表1-7基因mRNA引物序列列表

3.10.4结果与计算

各样品的目的基因和内参分别进行Realtime PCR反应，数据采用2^-ΔΔCt法进行分析。3.11数据统计

统计学差异通过IBM SPSS Statistics 21统计软件进行。比较两个实验组的统计学差异，使用Students’t检验；比较三个及以上的实验组使用单因素方差分析(One-wayANOVA)Tukey post hoc test进行，包括CPP行为学数据、Western blot数据、mRNA结果分析。对于自发活动的结果，采用GraphPad Prism 5软件做双因素方差分析(two-wayANOVAs)bonferroni post-tests。在图片中所有的结果以均值±SEM(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)表示。

4结果

4.1伏隔核内注射LV-shPRMT1特异性抑制PRMT1表达

本试验利用转基因手段，以慢病毒为载体，伏隔核定位注射shRNA-PRMT1表达慢病毒，观察PRMT1是否影响可卡因诱导的奖赏行为。GFP荧光图片表明(图7)，慢病毒在解剖位置上表达于伏隔核脑区。

为了验证shRNA-PRMT1病毒特异性抑制PRMT1，采用RT-qPCR方法检测PRMT1～PRMT8转录水平的表达。结果表明，LV-shPRMT1只干扰PRMT1基因的表达，对PRMT家族其他蛋白没有影响(图8)。以PRMT I型PRMT4和PRMT II型PRMT5为代表，利用Western blot方法检测伏隔核内PRMT4和PRMT5的表达。结果显示：LV-shPRMT1抑制PRMT1蛋白表达，对PRMT4和PRMT5的表达没有影响(图9)。采用同样的方法检测了慢病毒是否干扰伏隔核相邻脑区——纹状体中相应蛋白的表达。如图10所示，LV-shPRMT1不影响纹状体PRMT1、PRMT4和PRMT5的表达。以上结果表明伏隔核定位注射技术是准确的和慢病毒表达载体构建技术是可靠的。

4.2伏隔核内低表达PRMT1调控可卡因诱导的奖赏行为

伏隔核内注射LV-shPRMT1的小鼠经过可卡因条件性位置偏爱给药训练，行为学结果显示，与LV-GFP生理盐水组比较，低表达PRMT1明显改善可卡因诱导的奖赏行为(图11A)，也显著减弱可卡因引起的自发活动频率(图11B)，但LV-shPRMT1生理盐水不影响小鼠自身的偏爱行为。为了研究LV-shPRMT1对奖赏行为的影响是否与低表达PRMT1相关，本试验采用RT-qPCR和Western blot方法检测PRMT1的表达。检测结果显示，与LV-GFP生理盐水组比较，LV-shPRMT1生理盐水组PRMT1在转录水平(图12A)和翻译水平(图12B)均被抑制；与LV-GFP可卡因组比较，LV-shPRMT1可卡因组PRMT1表达降低，有统计学差异。这些结果表明：伏隔核低表达PRMT1调控可卡因诱导的行为可塑。

4.3PRMT1通过调控H4R3me2a修饰影响可卡因诱导的奖赏行为

为了研究PRMT1调控可卡因CPP行为的作用机制，本研究利用Western blot检测PRMT1修饰底物H4R3me2a的表达。结果表明，与LV-GFP生理盐水组比较，LV-GFP可卡因组H4R3me2a的表达明显增加，但LV-shPRMT1生理盐水组H4R3me2a的表达没有统计学差异(图13A)；与LV-GFP可卡因组比较，LV-shPRMT1可卡因组H4R3me2a的表达明显下调。

H4R3me2a的修饰可影响组蛋白H3K9/K14的乙酰化，最终协同调控基因转录。为了了解伏隔核PRMT1调控H4R3me2a的修饰是否影响H3K9/K14的乙酰化，本试验进行Westernblot检测。如图13B所示，与LV-GFP可卡因组比较，LV-shPRMT1可卡因降低acH3K9/K14的水平。这些结果表明：伏隔核低表达PRMT1降低H4R3me2a和acH3K9/K14的修饰，进而抑制可卡因诱导的奖赏行为。

5结论

实验结果说明，本发明重组慢病毒LV-shPRMT1可以抑制PRMT1的表达，进而下调H4R3me2a的表达，抑制可卡因诱导的奖赏行为，治疗可卡因成瘾。

实施例2 H4R3me2a对成瘾相关基因表达的调控作用

1实验试剂

本部分使用的试剂如表2-1。

表2-1实验试剂

2实验仪器

本部分使用的仪器如表2-2。

表2-2实验仪器

3实验方法

3.1慢性腹腔注射可卡因

给药方案具体为：同实施例1第3.2节，样本用于ChIP、RT-qPCR和Western blot检测。

3.2可卡因戒断

C57小鼠接受20mg/kg可卡因重复注射，于最后一次注射后，分别于第1天，第7天，第14天，第28天和第42天取材伏隔核，用于Western blot检测，即为可卡因戒断1天(D1)，7天(D7)，14天(D14)，28天(D28)和42天(D42)。

3.3蛋白提取与蛋白印迹(Western Blot)

3.3.1总蛋白的提取与定量

取冻存的伏隔核组织，加入100μl RIPA裂解液，置于冰上裂解5min，超声10次，2秒/次(置于冰上)，目的是破碎组织细胞，充分溶解释放蛋白，然后4℃，13,000g离心15min，取出上清液，放冰上。蛋白定量主要参照BCA方法，主要步骤为：首先，稀释BSA至1,0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.05,0mg/ml浓度梯度；然后将提取的蛋白液按照伏隔核(1:10稀释)，纹状体(1:50稀释)，海马(1:50稀释)以及前额皮质(1:10稀释)稀释，BSA和蛋白样品分别加入10μl至相应孔内。测定前，在各孔中加入200μl考马斯亮蓝G250,595nm测定吸光度值，BSA标准曲线现行相关性为R²>0.99为合格定量标准，然后计算出对应的蛋白浓度；每个样本加入5X的蛋白上样缓冲液(含β-巯基乙醇)，使最终浓度为1X。煮沸样品5min，分装，储存于-20℃备用。

3.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳

按照表2-3，表2-4聚丙烯酰胺制备胶配制10％和15％的分离胶和5％浓缩胶。将制备好的胶放入电泳槽中，点样。根据每个蛋白在伏隔核中的丰度，调整样品浓度，每个样本槽加入蛋白样本体积约为18μl。然后使用80V电压压缩蛋白样本至分离胶界限处时，将电压增加至120V，直至目的蛋白完全分离。进行转膜程序时，将载有目的蛋白的胶放入带有“三明治”的转膜夹中，并将经过甲醇活化的PVDF膜盖在胶上，转膜电压设定为100V，转膜时间根据蛋白大小而定。转膜完成后，用TBST配制的5％的脱脂牛奶封闭，封闭时间为1小时。接下来，将一抗按照需要的比例稀释，用杂交带封好，4℃过夜，第二天用TBST洗膜三次，每次10min。根据一抗源性，按照1:5000稀释相应的第二抗体，室温2h，结束后用TBST洗膜二次，每次10min，然后用TBS洗膜一次，同样10min。曝光时，按照1:1的比例配制发光A液和发光B液，在暗室中将载有目的蛋白的PVDF条带置于发光混合液中反应1min，将PVDF膜取出，用滤纸吸干多余发光液，按照正面朝上的原则，将PVDF膜放入暗盒中，膜正面也胶片接触，关闭暗盒，封闭胶片时间取决于蛋白丰度，洗片。

数据处理：将免疫印迹胶片用Image-Pro Plus 6.0系统读取各条带的灰度值，用内参蛋白条带灰度值进行标准化比较。

表2-3Western blot分离胶制备配置

表2-4Western blot浓缩胶制备配置

3.4实时荧光定量PCR

3.3.1RNA提取

将脑组织转移入已有1ml Trizol的1.5ml EP管中，使用1ml枪头来回吹打近100次，使组织细胞尽量裂解。对于细胞培养，吸去培养液，加入1ml Trizol，室温放置5分钟后反复吹打细胞，使细胞尽量裂解，将细胞裂解物移入一个1.5ml EP管。然后对组织裂解液和细胞裂解液加入200μl氯仿，振荡15秒，室温放置2～3分钟；4℃，12000g，离心15min，离心后，液体分为三层，RNA存在于最上层的水相中，水相层的体积大约为进行匀浆时的Trizol体积的60％。将水相层转移到一个新的EP管(1.5ml)中，注意不要污染中间层，之前所用的1ml Trizol里加入0.5ml的异丙醇来沉淀RNA，混匀后室温孵育10min或者4℃孵育20～30min，4℃，12000g离心10min，RNA沉淀成胶状黏附在管底。倒掉上清，瞬离，吸净残留。1mlTrizol至少加入1ml 75％乙醇洗涤RNA，4℃，10000g，离心5min。倒掉上清，瞬离，吸净残留。并开盖室温干燥10min，注意不要过分干燥。使用20μl DEPC水溶解RNA，纯化的RNA样本保存于-80℃。

3.3.2琼脂糖凝胶电泳

将所用的电泳槽、梳子、制胶板子、锥形瓶、量筒(100ml、1000ml)准备好并且洗净(自来水、去离子水和milic水)，然后装上millic水用于之后稀释TAE。称取适量琼脂糖于锥形瓶中，按所需浓度及体积加入1X TAE溶液，可配置25-30ml(1％胶浓度，即0.25-0.3mg),在微波炉中融化。待稍冷时，加入5μl Gold View染料，轻摇匀，避免产生气泡。冷却至约60℃时倒胶(厚度在0.5cm以内)，待完全凝固时，拔出梳子，上样电泳，电泳缓冲液应没过胶板。加样，加样缓冲液不应小于1X。电泳电压(样品由负极(黑)向正极(红)移动)200V 7min，样本跑出点样孔约1-2cm后，用IMAGE LAB对琼脂糖凝胶成像。3.3.3Realtime PCR反应

使用商品化的逆转录试剂盒合成cDNA(Bio-rad)，合成的cDNA保存于-80℃。然后进行realtime PCR反应，本部分使用到的基因mRNA引物序列如表2-5，将所有cDNA样品分别配置反应体系。体系配置如下：2X SYBR green mix 10μl，10μM PCR引物F 1μl，10μM PCR引物R 1μl，cDNA样本1μl，加水至总体积20μl，轻弹管底将溶液混合，小心盖上PCR管盖，5000rpm短暂离心，在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。将上述96-PCR板置于realtime PCR仪上进行PCR反应，反应按照以下程序进行：95℃3min，40个PCR循环(95℃，15秒；60℃，45秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的溶解曲线，扩增反应结束后，按从65℃缓慢加热到95℃。

表2-5基因mRNA引物序列

3.3.4结果与计算

各样品的目的基因和内参分别进行Realtime PCR反应，数据采用2^-ΔΔCt法进行分析。

3.5染色质免疫共沉淀(ChIP)

3.5.1ChIP操作方法

具体操作步骤为：解剖取材前几分钟配制含有1mM PMSF蛋白酶抑制剂的PBS液，将新鲜的伏隔核组织放入500ml的PBS(1mM PMSF)溶液中，4只小鼠伏隔核组织混在一起作为一个组织样本，用200μl枪头反复吹打组织，破碎组织至细微颗粒，然后离心，收集组织沉淀。利用37％甲醛交联15min，2M甘氨酸终止反应(终浓度为0.125M)，使用预冷PBS洗涤交联沉淀3次，每次5min，离心，最后收集沉淀，将沉淀置于SDS蛋白裂解液中，然后超声破碎组织，超声条件为调整超声破碎仪，在不产生泡沫的条件下，15秒/次，50秒间隙，共10次，整个超声过程中，样本置于冰浴上，经过超声得到的DNA片段为200bp-500bp的长度，4℃13000rpm离心10min，除去不溶物质，收集上清液150μl，其余的样本保存于-80℃。取超声破碎后的组织样本50μl用于H4R3me2a沉淀，50μl用于acH3K9/K14沉淀，50μl用于阴性对照，加入含有2.5μl蛋白酶抑制剂的450μl稀释缓冲液中，各取5％用于Input对照。Input对照放置于4℃冰箱中保存，在其他样本中分别加入20μl的经过重悬浮的蛋白G磁珠，将样本放置于4℃冰箱中混悬过夜，第二天，利用磁力架(Millipore)洗涤和分离磁珠和样本，按照先后顺序洗涤磁珠，500μl/管低盐洗涤液，500μl/管高盐洗涤液，500μl/管LiCl洗涤液和500μl/管TE洗涤液，在用TE洗涤液洗涤磁珠时，尽量吸尽洗涤液，在磁珠-蛋白-DNA复合物中加入含有1μl蛋白酶K的100μl ChIP洗脱液，置于65℃水浴过夜，然后95℃水浴中10min，冷却样本至室温，利用磁力架分离磁珠和上清液，专业上清液至另一干净的1.5ml的EP管，在各管样本中加入500μl的结合实际A，充分混匀，转移混合液于离心过滤器中，10000g离心30秒，弃掉离心液，收集沉淀；用洗涤试剂B洗涤沉淀，10000g离心30秒，弃掉离心液，收集沉淀；再次10000g离心30秒，弃掉离心管，将过滤器置于另一干净的收集管中，在滤器膜中直接加入50μl的洗脱缓冲液C，溶解纯化的DNA，10000g离心30秒，弃掉滤器，收集液体，并将液体保存于-20℃用于后续PCR检测。按照以下反应体系进行Realtime-PCR检测，ddH₂O 8.5μl，SYBR-green master mix 12.5μl，DNA基因引物F 1μl(表2-6)，DNA基因引物R 1μl，纯化的DNA模板2μl，总反应体系体积为25μl。完成加样后，轻弹管底将溶液混合，小心盖上PCR管盖，5000rpm短暂离心，在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。将上述96-PCR板置于realtime PCR仪上进行PCR反应，反应按照以下程序进行：95℃10min，50个PCR循环(95℃，20秒；60℃，60秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的溶解曲线，扩增反应结束后，按从65℃缓慢加热到95℃。

表2-6基因DNA引物序列

3.5.2ChIP结果与计算

1、标准化DNA的量

ΔCt[normalized ChIP]＝(Ct[ChIP]-(Ct[Input]-Log₂(Input DilutionFactor)))

Input Dilution Factor＝(fraction of the input chromatin saved)^-1

2、要加入阴性对照的Ct值

ΔΔCt[ChIP/NIS]＝ΔCt[normalized ChIP]-ΔCt[阴性]

3、计算特定靶点的IP Fold Enrichment(富集程度)

Fold Enrichment＝2^{(-ΔΔCt[ChIP/NIS])}

4、S1和S2的比值计算

ΔΔCt[S2-S1]＝ΔCt[S2:normalized ChIP]-ΔCt[S1:normalized ChIP]

5、样品比值＝2^{(-ΔΔCt[S2-S1])}

3.6数据统计

统计学差异通过IBM SPSS Statistics 21统计软件进行。比较两个实验组的统计学差异，使用Students’t检验；比较三个及以上的实验组使用单因素方差分析(One-wayANOVA)Tukey post hoc test进行，包括Western blot数据和mRNA结果分析。在图片中所有的结果均以均值±SEM(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)表示。

4结果

4.1H4R3me2a和acH3K9/K14调控Cdk5和CaMK II基因的表达

ChIP实验技术用于检测基因转录调控子在基因启动子区的结合情况，根据基因调控子对基因的转录调控方向，研究其是否有调控作用。本试验采用染色质免疫共沉淀技术(ChIP)检测可卡因重复注射给药24h后伏隔核组织H4R3me2a和acH3K9/K14在Cdk5和CaMKII基因启动子区的富集程度。结果表明，可卡因增加H4R3me2a和acH3K9/K14在Cdk5基因启动子区的结合(图14A)，提示可卡因可能增强Cdk5基因转录活性。利用RT-qPCR技术检测伏隔核Cdk5基因的表达，检测结果显示：可卡因增加伏隔核Cdk5的表达(图14B)。利用同样的检测手段和数据处理方法研究CaMK II基因，发现可卡因也增加H4R3me2a和acH3K9/K14在CaMK II基因启动子区结合(图15A)，并且可卡因重复给药增加了伏隔核CaMK II的表达(图15B)。以上结果表明：H4R3me2a和acH3K9/K14调控可卡因成瘾相关基因的转录。

4.2可卡因重复给药较长时间维持H4R3me2a的修饰

为了评价H4R3me2a在可卡因重复给药引起的长时修饰作用，构建可卡因戒断模型。本试验采用Western blot技术检测可卡因戒断伏隔核H4R3me2a的表达水平。结果表明，与生理盐水组比较，可卡因戒断1天和戒断7天，H4R3me2a表达显著增加；可卡因戒断14天时，H4R3me2a虽然表达增加，但没有统计学差异，已开始恢复到正常水平(图16)。为了对比可卡因引起H4R3me2a增高表达维持时间，采用Western blot方法检测H3K9me2和H3K36me3的表达。结果表明，与生理盐水组比较，可卡因戒断1天H3K9me2和H3K36me3的表达降低，可卡因戒断第7天已恢复正常水平(图17和图18)，提示可卡因降低H3K9me2和H3K36me3的修饰不超过戒断第7天，明显少于H4R3me2a高表达维持的时间。

以上结果表明：可卡因上调PRMT1表达，增加H4R3me2a的修饰，进而调控下游靶基因的转录，最终影响可卡因诱导的行为可塑。

5结论

药物成瘾是一个进行性脑部疾病，很难根治，即使接受了戒断治疗若干年后，成瘾患者仍然面临高复吸的风险，意味着成瘾引起的动物脑部结构和功能紊乱非常稳定。因此，可卡因成瘾领域研究的关键挑战之一是寻找在大脑中相对稳定的变化，这也是很多研究者视基因表达的改变是成瘾形成的一个重要组成部分的原因之一。现今，可卡因引起的这种改变被视为“分子和细胞的记忆”，因为蛋白分子的改变可以引起基因表达的改变，进而影响神经元细胞形态和功能的变化，这种改变包括基因转录的改变、表观修饰的改变、突触可塑性的改变、全细胞可塑性的改变、神经形态的改变、神经营养因子平衡机制的改变。几乎所有的这些改变都可能与成瘾状态有关联。

本发明发现H4R3me2a表观标志正性影响可卡因成瘾相关基因Cdk5和CaMK II的表达，可卡因增加H4R3me2a表达的状态维持时间长于H3K9me2和H3K36me3降低表达。这个结果从一个全新的角度解释了可卡因成瘾产生长时记忆。

实验例1中证明了本发明本发明重组慢病毒LV-shPRMT1可以干扰PRMT1的表达，进而下调H4R3me2a表达，而本实验例证明了H4R3me2a会正性影响可卡因成瘾相关基因Cdk5和CaMK II的表达，说明本发明化合物SKLB-639可以通过抑制可卡因成瘾相关基因Cdk5和CaMK II的表达来治疗可卡因成瘾。

综上所述，本发明SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示shRNA、包含前述shRNA的重组质粒PLLU2G-shPrmt1-3以及包含该重组质粒的重组慢病毒LV-shPRMT1可以沉默PRMT1基因，下调PRMT1的表达，进而抑制H4R3me2a以及可卡因成瘾相关基因Cdk5和CaMK II的表达，可以制备成为治疗可卡因成瘾的药物，临床应用前景良好。

Claims (12)

1.SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.一种重组质粒，其特征在于：它包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒是重组PLLU2G质粒。

5.根据权利要求4所述的在重组质粒，其特征在于：所述重组质粒的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

6.一种重组慢病毒，其特征在于：它包含权利要求3～5任意一项所述的重组质粒。

7.权利要求1或2所述的核苷酸序列、权利要求3～5任意一项所述的重组质粒或权利要求6所述的重组慢病毒在制备PRMT1抑制剂中的用途。

8.权利要求1或2所述的核苷酸序列、3～5任意一项所述的重组质粒或权利要求6所述的重组慢病毒在制备治疗可卡因成瘾的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述治疗可卡因成瘾的药物是降低H4R3me2a的表达水平的药物。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物是降低Cdk5和CaMK II的表达水平的药物。

11.一种治疗可卡因成瘾的药物，其特征在于：它是以权利要求1～10任意一项所述的核苷酸序列、重组质粒或重组慢病毒为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

12.根据权利要求11所述的药物，其特征在于：所述制剂是注射制剂。