CN111514145B

CN111514145B - 一种hipk2基因表达的抑制剂、试剂盒及其应用

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Publication number: CN111514145B
Application number: CN202010279217.6A
Authority: CN
Inventors: 肖俊杰; 贝毅桦; 黄珍珍; 段祎; 吕毅成
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: CN111514145A

Abstract

本发明提供了一种HIPK2基因表达的抑制剂、试剂盒及其应用，涉及药物开发技术领域。本发明提供了HIPK2基因表达的抑制剂和试剂盒，以及所述抑制剂和试剂盒在制备预防和/或治疗心力衰竭药物中的应用，同时还提供了预防和/或治疗心力衰竭药物。本发明通过验证，所述抑制剂可以抑制HIPK2的表达，同时有改善心功能的作用，因此可将所述抑制剂应用于心力衰竭的诊断或开发抑制心力衰竭的药物。

Description

一种HIPK2基因表达的抑制剂、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于药物开发技术领域，具体涉及一种HIPK2基因表达的抑制剂、试剂盒及其应用。

背景技术

病理性心肌肥厚常见于高血压、冠心病等疾病状态，是众多心脏疾病的终末状态，它会导致心脏纤维化和心力衰竭。心力衰竭被称为心脏病学领域尚未被征服的冰山，也是最后的战场。为了改善心功能、防治病理性心肌肥厚带来的并发症，临床上通常采用利尿剂、RAAS抑制剂、β-受体阻滞剂、血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂(LCZ696)等药物。但是除了心脏移植外，目前尚未发现可以完全治愈的方法。据统计，我国心血管病患者平均每年住院2.4次，半数以上患者会在1年内再次入院，给社会带来了沉重的经济负担。因此，发现心肌缺血诱发的心力衰竭的发生机制和诊断指标对防治心血管疾病具有积极的意义。

长期适当的运动是一种良好的生活习惯，特别是在心血管疾病的治疗方面已获得普遍认可。其主要原理为：长期的有氧运动可以诱导生理性心肌肥厚，与病理性的心肌肥厚不同，生理性心肌肥厚在促进心肌细胞体积增大和数目的增多的同时还不会诱导纤维化、损伤心功能。已有的研究证明长期有规律的运动可以通过促进心脏的生理性心肌肥厚和心脏再生，保护心肌缺血再灌注及主动脉缩窄所致的心力衰竭。

已有研究发现微小RNA-222在运动诱导的生理性心肌肥厚中显著上调，并反向调节其下游靶基因同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)。HIPK2是同源结构域相互作用蛋白激酶家族(HIPK1、HIPK2、HIPK3和HIPK4)的成员之一，它们是一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶。HIPKs作为细胞外刺激的传感器，可以响应多重应激反应，参与调节细胞凋亡、细胞增殖、胚胎发育和DNA损伤等过程。其中，HIPK2被发现在心肌中相对高表达。有研究证明肾脏纤维化过程中，HIPK2的表达升高，通过p53激活TGF-β/Smad3、Wnt/β-catenin以及NF-κB信号通路进而调节细胞凋亡、纤维化以及炎症反应。在肿瘤细胞中，HIPK2被报道通过磷酸化p53促进肿瘤细胞的凋亡，实现其抑癌作用。然而目前尚无其他关于HIPK2对长期缺血诱发的心力衰竭的诊断与治疗的发明。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种HIPK2基因表达的抑制剂、试剂盒及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种HIPK2基因表达的抑制剂，所述抑制剂的活性成分包括tBID和/或PKI1H；

所述tBID的分子结构如式I所示：

所述PKI1H的分子结构如式II所示：

本发明还提供了一种抑制HIPK2基因表达的试剂盒，所述试剂盒中包括上述抑制剂。

本发明还提供了所述抑制剂或所述试剂盒在制备预防和/或治疗心力衰竭药物中的应用。

优选的，所述心力衰竭包括由高血压、心肌梗死、冠心病或长期缺血诱发的慢性心力衰竭。

本发明还提供了一种预防和/或治疗心力衰竭的药物，所述药物的有效成分包括上述抑制剂。

优选的，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述辅料包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

本发明还提供了一种心力衰竭的预测工具，所述预测工具包括试剂盒，所述试剂盒包括放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、单克隆抗体试剂盒或酶标多克隆抗体夹心试剂盒；所述试剂盒中包括HIPK2基因的抗体。

优选的，若利用所述预测工具检测细胞或者组织中HIPK2基因较正常细胞或组织的表达水平升高2倍以上，则表示有较大可能发生心力衰竭

本发明提供了一种HIPK2基因表达的抑制剂和试剂盒，以现有的商品用化合物tBID和/或PKI1H作为活性成分，用于抑制HIPK2基因的表达，从而达到了抑制细胞和组织中HIPK2的表达、或能够破坏细胞和组织中HIPK2的稳定性、或能够降低细胞和组织中HIPK2的活性、或能够降低细胞或者组织中HIPK2的有效作用时间的效果，因此可将其应用于制备预防和/或治疗心力衰竭的药物。

在本发明中，利用蛋白免疫印迹法检测到HIPK2基因在小鼠主动脉弓缩窄(TAC)手术后4周心脏组织中的表达量上调；蛋白免疫印迹法检测到HIPK2抑制剂能有效抑制HIPK2基因的表达，并改善主动脉弓缩窄术后的小鼠心功能、心脏纤维化及心肌肥厚现象。

附图说明

图1为蛋白免疫印迹法检测HIPK2在小鼠主动脉弓缩窄(TAC)手术后4周心脏组织中的表达量上调(n＝3)；其中**表示p<0.01；

图2为荧光定量PCR法检测HIPK2敲除有效敲除HIPK2的mRNA表达(n＝6)；其中**表示p<0.01；

图3为蛋白免疫印迹法检测HIPK2抑制剂有效抑制HIPK2的表达(n＝3)；其中*表示p<0.05；**表示p<0.01，***表示p<0.001；

图4为敲除HIPK2改善主动脉弓缩窄术后的小鼠心功能、心脏纤维化及心肌肥厚；其中A表示TAC 4周后运用小动物心脏超声检测左室射血分数(EF，％)和左室短轴缩短率(FS，％)；B表示TAC后4周马松检测心脏纤维化；C表示TAC 4周后WGA检测心脏横截面积；在图4中*表示p<0.05；**表示p<0.01，***表示p<0.001；

图5为注射HIPK2抑制剂改善主动脉弓缩窄术后的小鼠心功能、心脏纤维化及心肌肥厚；其中A表示TAC 4周后运用小动物心脏超声检测左室射血分数(EF，％)和左室短轴缩短率(FS，％)；B表示TAC后4周马松检测心脏纤维化；C，TAC 4周后WGA检测心脏横截面积；图5中*表示p<0.05；**表示p<0.01，***表示p<0.001。

具体实施方式

所述tBID的分子结构如式I所示：

所述PKI1H的分子结构如式II所示：

在本发明中，tBID是HIPK2的选择性抑制剂(IC₅₀＝0.33μM)，属于ATP竞争性抑制剂。tBID通过和HIPK2铰链区上的Val 213,Val 261,Phe 277,Leu 280,Met 331,Ile 345产生疏水作用使其氮原子和HIPK2相对位置上的Lys228相结合，从而特异性的抑制了HIPK2的活性；PKI1H是一类对吡啶酮噻唑烷二酮化合物，通过高通量激酶分析，以及进行结构-活性关系研究确定可以有效的抑制HIPK2的活性(IC₅₀＝74nM)。本发明对所述tBID和PKI1H的来源并没有特殊限定，优选购自MCE(MedChemExpress)。本发明所述抑制剂优选包括tBID和/或PKI1H的生理盐水溶液，在使用前优选将所述抑制剂配制成20μg/mL的母液，在使用时对其进行稀释，在本发明实施例中，对小鼠进行灌胃时，tBID和/或PKI1H的使用量为200μg/kg体重/日。本发明中HIPK2基因转录翻译后可得到含有1189个氨基酸残基的蛋白质，同源结构域相互作用结构域在氨基端192-798，其中第228位赖氨酸决定激酶活性，其中人源的HIPK2基因的Gene ID为28996，小鼠源的HIPK2基因的Gene ID为15258。

本发明还提供了一种抑制HIPK2基因表达的方法，所述方法优选包括利用所述抑制剂抑制HIPK2基因表达，或敲除所述HIPK2基因。本发明对敲除所述基因的方法并没有特殊限定，优选采用CRISPR技术将HIPK2转录本的外显子exon3进行敲除。在本发明中，所述抑制剂的来源优选包括天然或人工合成的蛋白或小分子化合物。本发明对所述抑制剂的具体种类并没有特殊限定，优选能够抑制细胞和组织中HIPK2的表达、或能够破坏细胞和组织中HIPK2的稳定性、或能够降低细胞和组织中HIPK2的活性、或能够降低细胞或者组织中HIPK2的有效作用时间即可，更优选包括所述tBID和/或PKI1H。

本发明还提供了所述抑制剂或所述试剂盒在制备预防和/或治疗心力衰竭药物中的应用。本发明所述心力衰竭优选包括慢性心力衰竭，所述慢性心力衰竭优选由高血压、心肌梗死、冠心病或长期缺血诱发。

本发明还提供了一种预防和/或治疗心力衰竭的药物，所述药物的有效成分优选包括上述抑制剂。本发明所述药物能够抑制细胞和组织中HIPK2的表达、或能够破坏细胞和组织中HIPK2的稳定性、或能够降低细胞和组织中HIPK2的活性、或能够降低细胞或者组织中HIPK2的有效作用时间。本发明所述药物中优选还包括药学上可接受的辅料，所述辅料优选包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定，根据本领域的常规药物剂型制备即可。

本发明还提供了一种心力衰竭的预测工具，所述预测工具包括试剂盒，所述试剂盒包括放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、单克隆抗体试剂盒或酶标多克隆抗体夹心试剂盒；所述试剂盒中包括HIPK2基因的抗体。本发明对所述抗体的制备方法并没有特殊限定。在本发明中，若利用所述预测工具检测细胞或者组织中HIPK2基因较正常细胞或组织的表达水平升高2倍以上，则表示有较大可能发生心力衰竭。

下面结合实施例对本发明提供的HIPK2基因表达的抑制剂、试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

利用唯尚立德设计的saCas9的CRISPR靶点(SEQ ID NO.1)：AAGTTCCAACTGGGACATGACTGGGT，将HIPK2转录本的外显子exon3进行敲除，品系为缺失56个碱基(SEQ ID NO.2)TGGGTACGGCTCCCACAGCAAAGTGTACAGCCAGAGCAAGAACATAC CACCTTCTC的突变体杂合子Hipk2(+/-)小鼠，然后再进行配种得到Hipk2(-/-)小鼠。

利用下述引物测定测定HIPK2敲除小鼠和未敲除小鼠(WT)的mRNA水平：

M-HIPK2-KD-F(SEQ ID NO.3)：TGTACAGCCAGAGCAAGAACA；

M-HIPK2-KD-R(SEQ ID NO.4)：TCTTGCGCTTGAGTCCACAT；

Mouse-18S-F(SEQ ID NO.5)：TCAAGAACGAAAGTCGGAGG；

Mouse-18S-R(SEQ ID NO.6)：GGACATCTAAGGGCATCAC。

结果如表1和图2所示，其中表1中每一行表示进行一个组不同小鼠实验的检测数据，敲除HIPK2转录本后，可有效抑制HIPK2的mRNA表达。

表1 HIPK2敲除小鼠mRNA水平

WT	HIPK2<sup>-/-</sup>
		1.312413	0.004412
0.947516	0.00658
		1.358696	0.006097
0.495019	0.00377
		0.90264	0.007167
1.324599	0.003967

实施例2

1、新生大鼠心肌细胞和成纤维细胞的分离及培养

选取新生的SD大鼠，进行如下操作：

a)取心脏。75％酒精消毒其胸腹皮肤，提前用紫外照射超净台30min，在超净台上杀鼠取心脏，要求去除结缔组织及心房，并将心脏放在冰上，用1×ADS漂洗，将血挤净。

b)消化。将挤过血的组织转移至安剖瓶里剪碎至1～2mm，剪成匀浆状。准备一250ml消毒的玻璃瓶或烧杯，先后加入剪碎后的混合物和胰酶胶原酶消化液，加入酶液的时候，用10ml电枪，吹打若干次，使酶和组织块接触完全。放入37℃摇床(转速：90～120rpm)震荡10min，静置后取细胞悬液转移至50ml离心管中，加入马血清(5:1)终止消化。

c)重悬。混匀后离心(1000rpm，5min)，将泡泡吸走后弃上清，加入2-3ml心肌细胞培养基(NRCM)重悬，放回37℃摇床(转速：90～120rpm)继续震荡。

d)多次消化。向玻璃瓶中加入新的胰酶胶原酶缓冲液消化，用10ml电枪，吹打若干次；重复以上操作直至心脏组织碎块消化完全，消化完全的标准是瓶里的组织碎块全部消失，变成絮状。

e)差速贴壁。使用孔径为100μm一次性滤网过滤细胞悬液到10cm细胞培养皿，摇匀后放入细胞培养箱差速贴壁30～60min。

f)重悬。差速离心贴壁后，收集未贴壁的细胞离心(1000rpm，5min)，弃上清，再加1xADS重悬。

g)密度梯度。配1％明胶coating培养板(1g明胶粉剂放入100ml双蒸水中，120度高温灭菌，在50度时用0.22μm孔径过滤器过滤，为10％明胶，再用灭菌过的双蒸水稀释成1％的明胶)，明胶至少提前2个小时铺。按实验所需配制Percoll stock、Top percoll、Bottompercoll；使用percoll液由上至下配制密度梯度：依次由2ml细胞悬液、4ml Top percoll、3ml Bottom percoll组成(先向每个15ml离心管加入4ml top percoll，再向离心管底部轻轻加入3ml bottompercoll，使两种液体之间出现分隔线，再在top percoll液面上轻轻加入2ml细胞悬液)。

h)取样。室温离心(3000rpm，30min)，取第一层细胞悬液即为成纤维细胞悬液，置于50ml离心管中。

i)计数。在离心管中加入成纤维细胞培养基适量，而后1000rpm，5min离心。弃上清，用成纤维细胞培养基重悬后进行计数。

j)培养。根据实验需要按一定密度铺入培养皿中，用0.1％明胶包被于培养箱(37℃，5％CO₂)中培养过夜。

2、主动脉弓缩窄手术(TAC模型)

选用八周龄C 57BL/6雄性小鼠，对小鼠进行TAC手术。具体手术步骤如下：

a)术前准备。准备手术区域，手术区域用75％酒精擦拭灭菌；确认电热毯的温度(34℃)，设置小动物呼吸机频率为110～20次/分，潮气量2.0ml；将手术器械高温灭菌；配置浓度为4％的水合氯醛。

b)麻醉。首先对小鼠进行称重，按照10μl/g体重标准将4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，用医用胶带将小鼠以仰卧位四肢固定在手术台上。用镊子夹小鼠的尾巴及四肢，观察其反射程度，以此来观察小鼠是否充分麻醉。

c)气管插管。待小鼠完全麻醉后，脱毛膏蘸在棉签上，用棉签在小鼠颈部和胸口处均匀涂布脱毛膏，注意脱毛膏不要涂太多。1min后用刀片轻轻刮掉毛发露出皮肤，接着碘伏涂布裸露皮肤进行消毒。在体视镜下使用显微镊和蚊剪在小鼠颈部纵向剪开一0.5cm小口，分理处组织和肌肉，直到暴露出气管。然后启动呼吸机，在声门下两个气管软骨环之间插入呼吸机气管，连接呼吸机，观察到小鼠胸廓起伏频率与呼吸机频率一致，气管插管即表明成功。

d)主动脉弓收缩。在体视镜下先沿小鼠胸骨正中纵向剪开一个大约0.8cm长的开口，然后再将胸骨剪到第二肋骨，拉钩拉开胸骨并用显微镊将胸腺组织分开，慢慢拨开脂肪以找到主动脉弓。随后用7-0带针线从左颈总动脉和右头臂动脉尖穿过，将一枚27G规格的注射器针头并排平行放置于主动脉弓旁。接着用显微镊将7-0丝线打结结扎主动脉弓和针头，再次打结固定，之后迅速抽出针头。

e)手术结束后。与分离步骤相反，依次缝合肌肉和皮肤且对伤口进行碘酒消毒。

f)刺激小鼠有反应后即可拔掉气管插管，将小鼠放到电热毯上自行恢复，待小鼠麻药褪去并恢复自主呼吸后放回饲养笼，继续饲养四周。

g)假手术组操作步骤除结扎不做外，其余保持一致。

3、小鼠灌胃

对小鼠进行HIPK2抑制剂灌胃，操作步骤如下：

a)提前准备好实验器械，用生理盐水配制20μg/mL的HIPK2抑制剂。

b)用左手大拇指与食指抓住小鼠后背皮肤，小拇指抓住小鼠尾巴，使小鼠头部无法转动且身体呈竖直状态。

c)根据小鼠的体重用1ml注射器注射器吸入相应量的的HIPK2抑制剂，将12号灌胃平头针头从小鼠嘴边伸入小鼠口腔；然后将针头轻轻压住小鼠舌头，顺着舌头竖直自然探入小鼠食道，要在无阻力的情况下将药液推进小鼠食道，否则容易对小鼠的食道造成不可逆的损伤；完成灌胃后轻轻抽出针头，小鼠放回笼位，注意观察小鼠的生存状况。

d)在此实验中对小鼠进行灌胃的HIPK2抑制剂使用量为200μg/kg/day，灌胃周期为28天。溶剂的配置标准为灭菌的生理盐水。

4、PE诱导的NRCM细胞病理性肥大模型

新生小鼠心肌细胞培养一代后，以20万/ml的细胞密度铺入明胶包被的细胞培养皿，细胞密度达到60％后换无血清培养基培养24h，之后进行苯肾上腺素(PE)刺激，具体步骤如下：

(1)心肌细胞贴壁后，将细胞原有的全培养基换成无血清培养基，对细胞饥饿处理6～8小时；

(2)在避光条件下，称取一定量的PE，使用无血清培养基溶解，使得终浓度为50μM；

(3)在超净工作台避光条件下，吸去饥饿处理心肌细胞的原有培养基，加入上一步配制的溶有PE的培养基，同时设置空培养基为对照实验；

(4)用锡箔纸对细胞孔板进行包裹避光，同时也要注意留空隙防止细胞缺氧)，接着放入37℃二氧化碳培养箱培养48h；

(5)收取细胞，根据实验需要进行以后的操作。

5、提取心脏组织的RNA后，利用Thermo Scientific逆转录试剂盒合成第一链cDNA，利用该第一链cDNA进行实时荧光定量PCR反应，实验结果通过相对定量法进行分析，采用2^-ΔΔCt方法进行计算，以18s作为内参，用SPSS20.0进行独立样本T检验。

6、蛋白免疫印迹法

a)提蛋白。从组织上切下米粒大小样本；放入1.5ml EP管中；加入钢珠和400μl蛋白酶裂解液；震荡15min；冰上静置20min以上；4℃、12000r离心20min；吸取上清置于新的1.5ml EP管中；即刻定蛋白或放入-80℃冰箱保存。

b)测蛋白浓度及定蛋白。从-20℃取出2mg/ml BSA,室温融化后备用；取六个1.5mlEP管，分别标上2、1.5、1、0.5、0.25、0(表示对应的BSA浓度，单位：mg/ml)；用去离子水稀释2mg/ml BSA，得到体系120μl对应浓度的溶液；将10μl样本蛋白稀释10倍；将蛋白溶液和标准品40μl加入到48孔酶标板中，标准品3重复，蛋白溶液2重复；按BCA(Takala试剂盒)A液：B液＝100：1充分混匀，每孔中加200μl BCA试剂；摇床慢摇5min；37℃烘箱30min；用枪头赶走气泡；酶标仪测浓度；定蛋白以制备C＝4ug/μl，V＝150μl的蛋白体系(120μl稀释后的蛋白溶液+30μl loadingbuffer)。

c)电泳及转膜。配制SDS-PAGE凝胶和1×电泳液；架胶，加电泳液；依次在样孔中加入3μl蛋白Marker、7μl蛋白样本和4μl loadingbuffer→电泳，在上层胶时用80V电压电泳，在下层胶时用120V电压电泳；将蛋白质转移到PVDF膜上，按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，300mA恒流条件下，根据所需蛋白的分子量来设定转膜时间。

d)敷抗体。对western blot膜进行封闭和抗体孵育。洗膜PBS 3×5min快摇；5％脱脂奶封闭1.5h；PBS漂洗一遍；一抗摇床过夜；吸走抗体，TBST3×5min快摇；敷二抗慢摇2h；倒掉二抗，TBST 2×5min、PBS 2×5min快摇清洗；曝光显影：利用天能显像系统采集；使用Image J对图片进行数据处理和用GraphPad绘制图像。

7、小动物心脏超声

使用Visual Sonics小动物心脏超声仪检测小鼠的心功能。对小鼠用异氟烷麻醉后，进行胸部脱毛处理，接着用胶布将小鼠四肢固定在心脏超声仪上。在需检测处涂上超声耦合剂，运用小动物心脏超声仪(Vevo2100，Visual Sonics，频率：30MHz)选取左室长轴，并在左室乳头肌截面采集M-mode图像。当小鼠心率处于400-450次/min时，以左心室功能模块测量并计算左室射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)。

8、Masson染色

根据实验需求对心脏特定部位进行取样，进行以下步骤：

(1)固定。将得到的心脏样本置于4％的多聚甲醛溶液中固定，以保护其组织及细胞的形态结构及核酸，放在常温环境保存。

(2)清洗。固定好的样本放在包埋盒中，用1×PBS清洗两到三遍。

(3)脱水。按照机器时间预设对心脏样本脱水处理。

(4)包埋。进行石蜡包埋，心脏样本要平放于包埋盒中。石蜡切片保证组织的完整性，厚度取为5μm。

(5)烘片脱腊。石蜡切片放在65℃烘箱烘片2h，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各脱蜡1次，每次10min，乙醇100％、乙醇95％、乙醇70％各水化1次，每次2min，石蜡切片放在重铬酸钾溶液中过夜。自来水冲洗10min，ddH2O冲洗2min。

(6)马松染色。滴加一滴(50～100μl)苏木素染液5～10min，蒸馏水冲掉染液。蒸馏水或自来水冲洗2～5min后，滴加一滴(50～100μl)混合染液染色5min。蒸馏水或自来水冲洗一下(2～3s，冲掉染液即可)，滴加一滴(50～100μl)磷钼酸，染色1min。甩干或自然晾干，滴加一滴(50～100μl)亮绿染液，染色5min。蒸馏水或自来水冲洗一下(2～3s，冲掉染液染叶即可)。

(7)烘片。将玻片放入65℃烘箱，烘干即可。

(8)树脂封片。在片子两端涂上指甲油防止盖玻片滑落。

(9)拍片。显微镜拍摄切片组织照片，并使用ImageJ软件统计每个切片中的纤维化面积和组织总面积。其中，我们所求的纤维化程度＝(纤维化面积/组织总面积)×100％。

9、WGA染色

a)包埋。根据实验需求对心脏特定部位进行取样，将得到的心脏样本进行OCT包埋，心脏样本需要平放，并置于-80℃冰箱冻存。

b)切片。进行冰冻切片，厚度取为5μm，置于-80℃冰箱冻存。

c)复温。染色前复温15min，然后用1×PBS清洗3次，每次5min，放在慢摇床上慢摇，清洗时注意不要让样本从载玻片上脱落。

d)封闭。擦拭切片上的1×PBS，滴加5％BSA，覆盖在组织切片上，封闭1h；1×PBS清洗3次，每次5min。

e)WGA染色。WGA染色20min，注意避光。

f)DAPI染色。1×PBS清洗3次，每次5min。加入DAPI溶液，室温避光孵育5min。

g)封片。1×PBS清洗3次，每次5min。滴加甘油进行封片，在荧光显微镜下拍照，并统计使用ImageJ软件统计每个切片中的细胞面积。

经过上述实验后，测定TAC模型心脏组织中HIPK2基因的相对表达量，以Actin为内参基因时，3次重复的表达量数据如表2和图1所示，HIPK2在小鼠主动脉弓缩窄(TAC)手术后4周心脏组织中的表达量上调。

表2 TAC模型中HIPK2的基因表达量

内参	TAC(4W)
		0.575963	1.27297
0.645471	1.223471
		0.810216	1.812763

利用上述方法，在灌胃结束后，测定小鼠HIPK2基因的表达情况(3次重复，以Actin为内参)，结果如表3和图3所示，HIPK2抑制剂可以抑制小鼠心脏组织HIPK2的表达。

表3灌胃抑制剂后HIPK2基因的表达

内参	tBID	PKL1H
			1.141933	0.4849836	0.1464295
1.003699	0.4696752	0.1653483
			0.8543681	0.3387851	0.2031637

利用上述方法，检测HIPK2敲除后，对TAC诱导的心功能、心脏纤维化及心肌肥厚的影响，如表4～7和图4所示，其中表4～7中，每一行表示同一组不同小鼠的数据(每组数量略有不同)，敲除HIPK2基因后，可改善主动脉弓缩窄术后的小鼠心功能、心脏纤维化及心肌肥厚。

表4 TAC 4周后左室射血分数(EF，％)

表5 TAC 4周后左室短轴缩短率(FS，％)

WT+Sham	HIPK2<sup>-/-</sup>+Sham	WT+TAC	HIPK2<sup>-/-</sup>+TAC
				25.35703	27.37506	4.043966	13.67543
25.8881	31.97894	15.57044	20.32638
				24.20129	25.42199	11.30826	19.23879
29.22534	27.08687	16.06077	21.85272
				-	-	14.31798	19.31506
-	-	-	20.23644

表6 TAC 4周后心肌纤维化比例(％)

WT+Sham	HIPK2<sup>-/-</sup>+Sham	WT+TAC	HIPK2<sup>-/-</sup>+TAC
				2.26411	1.721458	7.798424	2.876235
0.6791533	1.778386	7.955098	4.877929
				0.5733435	0	5.581494	4.337941
1.823024	2.973409	5.562854	4.44261
				-	-	-	5.012897
-	-	-	2.450034

表7 TAC 4周后WGA检测心脏横截面积(mm²)

利用上述方法，检测灌胃HIPK2抑制剂后，对TAC诱导的心功能、心脏纤维化及心肌肥厚的影响，结果如图5和表8～11所示，其中表8～11中，每一行表示同一组不同小鼠的数据(每组数量略有不同)，HIPK2抑制剂能够改善主动脉弓缩窄术后的小鼠心功能、心脏纤维化及心肌肥厚。

表8 TAC 4周后左室射血分数(EF，％)

Sham+Vehicle	Sham+tBID	Sham+PKI1H	TAC+Vehicle	TAC+tBID	TAC+PKI1H
						54.87492	58.16601	73.6402	39.83878	53.93495	47.05652
60.43074	68.42501	54.13307	36.12054	46.04833	53.15765
						60.64541	72.25336	48.46039	43.44316	53.51495	48.50726
62.70896	60.5157	51.36397	38.33862	59.09899	54.62461
						55.68857	56.77824	64.83119	35.13115	43.97683	54.33448
60.40808	55.23774	62.78733	35.5693	60.93566	48.5731
						54.41701	52.22121	66.95783	32.31582	48.71622	55.06096
54.0157	62.5966	63.20113	39.25327	61.76156	48.19754
						52.54396	56.2265	63.8856	32.64245	46.91935	46.93023
61.02223	50.6735	60.62928	-	54.46737	47.39347

表9 TAC 4周后左室短轴缩短率(FS，％)

表10 TAC 4周后心肌纤维化比例(％)

Sham+Vehicle	Sham+tBID	Sham+PKI1H	TAC+Vehicle	TAC+tBID	TAC+PKI1H
						0.111738	0.062886	0.03175	5.786441	2.058186	4.013293
0.043971	0.038923	0.064929	5.41971	3.514244	2.533379
						0.182118	0.107577	0.012914	3.603051	3.47231	1.983867
0.012776	0.061314	0.034548	4.548841	1.78722	2.537788
						0.158152	0.040403	0.19422	5.058807	3.917371	2.251825
0.35453	0.152444	0.18194	7.998767	3.587622	2.928325
						0.5333	0.045823	0.05892	4.571229	2.904429	2.812576
0.27458	0.091598	0.032385	-	3.541813	2.067865
						0.03688	0.1387	0.149824	-	1.717882	2.882528
0.01174	0.17622	0.219578	-	-	-
						-	-	0.057891	-	-	-

表11 TAC 4周后WGA检测心脏横截面积(mm²)

利用本发明所述抑制剂可以显著抑制HIPK2基因的表达，并改善TAC诱导的心功能、心脏纤维化及心肌肥厚，可用于制备预防和/或治疗心力衰竭的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海大学

<120> 一种HIPK2基因表达的抑制剂、试剂盒及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagttccaac tgggacatga ctgggt 26

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgggtacggc tcccacagca aagtgtacag ccagagcaag aacataccac cttctc 56

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtacagcca gagcaagaac a 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcttgcgctt gagtccacat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaagaacga aagtcggagg 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggacatctaa gggcatcac 19

Claims

1. HIPK2基因表达的抑制剂在制备预防和/或治疗心力衰竭药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂的活性成分包括tBID和/或PKI1H；

所述tBID的分子结构如式I所示：

式I；

所述PKI1H的分子结构如式II所示：

式II。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述心力衰竭包括由高血压、心肌梗死、冠心病或长期缺血诱发的慢性心力衰竭。