CN105002179B - 能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒，该质粒含有四个shRNA表达基因，能同时编码四种分别靶向流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因保守区域的特异shRNA。该质粒适用于多种转基因技术。使用慢病毒载体将该质粒转入体外培育的MDCK细胞后，经攻毒实验证明，筛选得到的转基因细胞系具有抵抗不同亚型流感病毒感染的能力。将该质粒通过静脉与肌肉注射入4周龄仔猪，然后用H3N2亚型猪流感病毒感染，发现经血液注射组具有更强的抑制流感病毒的复制。为RNAi应用于猪流感病毒的研究以及猪流感的防治积累了必要的实验数据，为转基因猪抗流感研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体地说，涉及一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒及其应用。
背景技术
猪流感(Swine Influenza，SI)是由正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)引起的一种急性、高度接触传染的呼吸道疾病，临床症状表现为，发热、咳嗽、流鼻涕，结膜炎、厌食及精神不振等。猪流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)能在猪上呼吸道上皮细胞内复制，造成猪感染，致使猪体免疫系统稳态发生变化，导致细菌、支原体和其他病毒的继发或混合感染，使疫情加重，病猪死亡率上升，给养猪业带来极大经济损失。越来越多的资料表明，猪作为流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨种属障碍感染新宿主的过程中，起着重要的作用。猪上皮细胞具有唾液酸α-2,6半乳糖苷和唾液酸α-2,3半乳糖苷，人流感病毒可与前者结合，而禽流感病毒与后者结合，由此决定了能够同时被人流感病毒和禽流感病毒感染，使其成为IAV发生基因重组或重排的主要场所。猪流感HA受体结合位点具有与两种流感病毒受体相同的结合特异性，是SIV不仅可感染猪，同时也具有感染禽和人类的能力。因此，猪流感除了具有兽医公共卫生意义外，还具有深远的人类公共卫生意义。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指RNA对基因表达的调控，由dsRNA(double-strand RNA)或siRNA(small interfering RNA，siRNA)引发的对同源性mRNA降解的现象。它最大优点在于具有高度的有效性和特异性，且具有快速的预防与治疗效果。它的作用在基因功能研究和病毒性疾病的治疗领域有非常广阔的前景，例如在抗艾滋病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都发现，RNAi对于抑制这些病毒的复制具有较好的效果，可能是这类病毒病治疗的有效途径。
A型流感病毒(IAV)属于正粘病毒科，是单股负链RNA病毒，以变异速度快、感染致病性强、传播速度快成为造成人、哺乳动物和禽类流感大流行的主要病毒。目前抗病毒药物和疫苗免疫存在局限性，使病毒对药物产生耐受性，迫于选择压力病毒会快速发生变异以逃避药物或疫苗免疫；研究人员选择RNAi方法抑制流感病毒的复制通常针对流感病毒基因的保守序列作为靶序列，由于干扰序列的高度转移性，使RNAi技术在流感病毒防治的应用中也遇到了技术屏障。因此，亟需开发一种基于RNAi技术的抗病毒治疗新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒及其应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种能抑制猪流感病毒复制与感染的shRNA，所述shRNA是以猪流感病毒PB2，以及任选PA、PB1、NP中的至少两种为靶基因，编码所述shRNA的核苷酸序列为(如SEQ ID No.1-8所示的核苷酸序列)：
具体的，在本发明的一种实施方式中，shRNA以猪流感病毒PB2、PA、PB1和NP为靶基因；
在本发明的一种实施方式中，shRNA以猪流感病毒PB2、PA和PB1为靶基因；
在本发明的一种实施方式中，shRNA以猪流感病毒PB2、PA和NP为靶基因；
在本发明的一种实施方式中，shRNA以猪流感病毒PB2、PB1和NP为靶基因。
本发明还提供一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒，所述质粒共含有三个或四个shRNA表达盒，即含有以猪流感病毒PB2为靶基因的shRNA表达盒，以及任选猪流感病毒PA、PB1、NP中的至少两种为靶基因的shRNA表达盒。
其中，以猪流感病毒PA为靶基因的shRNA表达盒在h7SK启动子控制下，以猪流感病毒PB1为靶基因的shRNA表达盒在hH1启动子控制下，以猪流感病毒PB2为靶基因的shRNA表达盒在hU6启动子控制下，以猪流感病毒NP为靶基因的shRNA表达盒在mU6启动子控制下，且各表达盒呈串联状态。
上述RNA聚合酶III型启动子h7SK、hH1、hU6和mU6使各shRNA表达盒在真核细胞中稳定持续表达。每个启动子具有精确的碱基启动位点和终止信号，可以保证shRNA最高效地被启动转录，
前述重组质粒的出发质粒为pGenesil-EGFP。
前述出发质粒中含有嘌呤霉素抗性基因。
将本发明构建的重组质粒分别记为pGenesil–PA-PB1-PB2、pGenesil–PA-PB1-NP、pGenesil–PA-PB2-NP、pGenesil–PB1-PB2-NP与pGenesil–PA-PB1-PB2-NP，它们分别含有三个或四个shRNA表达基因，能同时编码三种或四种猪流感病毒基因组PA、PB1、PB2与NP基因保守区域的特异shRNA。
本发明还提供含有编码前述能抑制猪流感病毒复制与感染的shRNA的DNA的转基因细胞、宿主及工程菌。
本发明还提供含有前述重组质粒的转基因细胞、宿主细胞及工程菌。
本发明所述的细胞为真核细胞，来自人、哺乳动物和/或禽类。
本发明还提供所述重组质粒在转基因育种中的应用。
所述应用是将所述重组质粒转入哺乳动物，使转基因动物后代抵抗流感病毒感染，提高抗病能力。
本发明进一步提供所述重组质粒在抑制猪流感病毒复制与感染中的应用。所述重组质粒可以应用于制备抑制猪流感病毒复制与感染的药物组合物。
所述应用是将所述重组质粒经静脉注射或肌肉注射到哺乳动物体内，使动物能抵抗流感病毒感染，提高抗病能力。
优选地，所述哺乳动物为猪。
本发明将shRNA表达盒通过酶切构建到慢病毒表达载体，获得复制缺陷性慢病毒，分别命名为pLV-EGFP-shPAPB1PB2、pLV-EGFP-shNPAPB1、pLV-EGFP-shNPAPB2、pLV-EGFP-shNPB1PB2与pLV-EGFP-shNPAPB1PB2。经重组慢病毒滴度检测确定慢病毒滴度。
用所述复制缺陷型慢病毒感染MDCK细胞，2μg/mL嘌呤霉素抗性筛选，建立整合有目的基因的细胞系，分别命名为shPAPB1PB2-MDCK、shNPAPB1-MDCK、shNPAPB2-MDCK、shNPB1PB2-MDCK、shNPAPB1PB2-MDCK与Mock-MDCK。
本发明采取了多基因干扰shRNA基因串联构建到一个质粒载体上的策略，并且对三基因与四基因串联进行比较，首次证明了四基因串联质粒载体对H1N1猪流感病毒的抑制作用高于三基因，多基因干扰shRNA在H1N1猪流感病毒复制周期中发挥更强的抑制作用。
经攻毒实验首次证明，表达四基因shNPAPB1PB2-MDCK细胞系不仅能抵抗H1N1亚型猪流感病毒，还能抵抗H3N2亚型猪流感病毒，此外，还能抵抗H5N1亚型禽流感病毒，具有对不同毒株交叉抑制的潜力。
本发明通过静脉注射与肌肉注射两种方式接种shRNA表达载体，比较两种给药途径研究shRNA对H3N2亚型猪流感病毒的抑制作用，结果首次证明静脉注射的shRNA有更好地抑制H3N2亚型猪流感病毒的作用。
本发明构建的能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒，该质粒含有四个shRNA表达基因，能同时编码四种分别靶向流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因保守区域的特异shRNA；四个shRNA表达基因分别在四个启动子h7SK、hH1、hU6、mU6的控制下，呈串联状态。该质粒适用于多种转基因技术。使用慢病毒载体将该质粒转入体外培育的MDCK细胞后，经攻毒实验证明，筛选得到的转基因细胞系具有抵抗不同亚型流感病毒感染的能力。将该质粒通过静脉与肌肉注射入4周龄仔猪，然后用H3N2亚型猪流感病毒感染，发现经血液注射组具有更强的抑制流感病毒的复制。为RNAi应用于猪流感病毒的研究以及猪流感的防治积累了必要的实验数据，为转基因猪抗流感研究奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例2中重组慢病毒载体的构建原理。
图2为本发明实施例2中重组慢病毒载体上串联shRNA基因和报告基因的排列。
图3为本发明实施例2中重组慢病毒感染MDCK细胞48h后荧光图；其中，A-E：101-105重组慢病毒接种MDCK细胞，F：阴性对照。
图4为本发明实施例3中H1N1猪流感病毒感染三基因和四基因细胞系上清中病毒滴度检测结果。
图5为本发明实施例4中shNPAPB1PB2-MDCK细胞系感染H3N2流感病毒上清中病毒滴度检测结果。
图6为本发明实施例4中shNPAPB1PB2-MDCK细胞系感染H5N1流感病毒上清中病毒滴度检测结果。
图7为本发明实施例5中静脉注射与肌肉注射后仔猪感染猪流感病毒鼻拭子病毒滴度比较结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 能抑制猪流感病毒复制与感染的shRNA转基因重组质粒的构建
1、能抑制猪流感病毒复制与感染的shRNA靶位点及引物设计
本实施例中能抑制猪流感病毒复制与感染的shRNA，是以流感病毒的基因组序列为基准，选取流感病毒中高度保守的PA、PB1、PB2和NP为靶序列，设计合成siRNAs，见表1。所选取的保守序列的具体位置(引物中用数字表示)为相应的siRNA。选择的靶基因片段以原基因命名。
表1 shRNA靶位点及引物设计
2、NP、PB2、PB1和PA基因shRNA表达盒的构建
分别用60μL退火缓冲液溶解单链DNA引物(2OD)，各取PB2-1154、NP-1946、PA-2087和PB1-2257的上、下游DNA引物2μL与16μL退火缓冲液混匀，94℃变性，自然冷却至室温。将退火产物100倍稀释，分别与带有不同Ⅲ型启动子的线性化pGenesil-EGFP真核表达载体连接。构建4个表达shRNA的真核表达载体。shRNA表达盒的结构见表2。
表2 shRNA表达盒结构
| 表达载体名称 | shRNA表达盒结构 |
| pGenesil-PB2 | MluI-hU6 promoter-PB2-HindIII-BamHI-EcoRI-SalI |
| pGenesil-NP | MluI-HindIII-NP-mU6 promoter-BamHI-EcoRI-SalI |
| pGenesil-PA | MluI-HindIII-BamHI-h7SK promoter-PA-EcoRI-SalI |
| pGenesil-PB1 | MluI-HindIII-BamHI-EcoRI-PB1-hH1 promoter-SalI |
以pGenesil-PB2为骨架，将pGenesil–NP、pGenesil–PA和pGenesil–PB1上的shRNA表达盒中的两个克隆到pGenesil–PB2上，构建表达四个shRNA的真核表达载体，分别命名为pGenesil–PA-PB1-PB2、pGenesil–PA-PB1-NP、pGenesil–PA-PB2-NP、pGenesil–PB1-PB2-NP；再将三个shRNA表达盒构建到pGenesil–PB2上，构建同时表达靶向流感病毒PB2、NP、PA和PB1基因的shRNA真核表达载体，命名为pGenesil–PA-PB1-PB2-NP。
实施例2 重组慢病毒载体的构建以及稳定表达shRNA细胞系的建立
1、重组慢病毒载体的构建
用ClaI和XbaI双酶切pLV-EGFP慢病毒载体，胶回收大片段与合成的多克隆位点5’-ClaI-Xmal-XhoI-MluI-XbaI-3’连接，构建的慢病毒表达载体命名为pLV-MCS，用XhoI与XbaI双酶切表达盒载体与慢病毒表达载体，命名为pLV-EGFP-shNPAPB1PB2，三基因表达盒与慢病毒表达载体命名为pLV-EGFP-shPAPB1PB2、pLV-EGFP-shNPAPB1、pLV-EGFP-shNPAPB2、pLV-EGFP-shNPB1PB2，构建原理如图1所示。
本发明中构建的串联shRNA基因和报告基因排列如图2所示。三基因shRNA和四基因shRNA在质粒上呈串联排列，载体中带有EGFP报告基因和PUROR嘌呤霉素筛选基因。
2、重组慢病毒的包装、病毒滴度测定
按照Lenti-XTMHT Packaging system慢病毒包装系统和Lipofectamine 2000说明书，将慢病毒表达载体与Lenti-XTMHT Packaging mix混合，共转染融合度达80％的293T细胞，转染5h后更换10％FBS的DMEM完全培养基。72h后收取细胞上清，3000rmp离心10min，收集上清-80℃保存。经重组慢病毒滴度检测确定慢病毒滴度。
将MDCK细胞接种于24孔板中，待细胞融合度达50-60％时，取一支冻存的慢病毒原液室温解冻，吸取50μL病毒原液用含有10％的FBS的DMEM(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL，8μg/mL Polybrene)培养基10-1-10-6梯度稀释，每个梯度接种两孔，每孔接种500μL病毒稀释液，两孔接种500μL培养基作为阴性对照，于37℃、5％CO2培养箱孵育12h后，去除病毒稀释液，加完全培养基，病毒感染48h后，计算细胞荧光数并根据公式：n×计量孔稀释倍数/接种病毒体积，计算慢病毒滴度，结果如图3所示。
3、稳定表达shRNA细胞系的建立
6孔细胞培养板每孔接种1×106个MDCK细胞，用MOI＝1的pLV-EGFP-shRNA和pLV-MCS重组慢病毒接种MDCK细胞，每组设两个复孔，两个孔不接种慢病毒作为阴性对照，感染后72小时除去含有慢病毒的培养液，6个孔均换上含2μg/mL嘌呤霉素的完全培养基进行药物筛选，连续筛选传代培养14天后，获得具有慢病毒整合子的细胞系。建立的细胞系分别命名为shPAPB1PB2-MDCK、shNPAPB1-MDCK、shNPAPB2-MDCK、shNPB1PB2-MDCK、shNPAPB1PB2-MDCK与Mock-MDCK。
实施例3 三基因与四基因细胞系抑制H1N1猪流感病毒复制比较
同步传代培养的6代shPAPB1PB2-MDCK、shNPAPB1-MDCK、shNPAPB2-MDCK、shNPB1PB2-MDCK、shNPAPB1PB2-MDCK、Mock-MDCK和MDCK，以1×105个细胞数计种植于12孔细胞培养板中，当细胞融合度达70％-80％时，用感染培养基(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL，TPCK-Trypsin 4μg/mL)稀释H1N1猪流感病毒(LM/2004株，1000TCID50)接种细胞，于室温孵育1h，吸去病毒稀释液，每孔加1mL感染培养基，于感染后12、24、36、48、60小时吸取细胞上清做10-1-10-8梯度稀释，每个稀释度接种3个9-10日龄的普通鸡胚，72h后(LM/2004)吸取尿囊液检测病毒滴度。
H1N1猪流感病毒感染三基因和四基因细胞系上清中病毒滴度检测结果如图4所示。
实施例4 四基因细胞系抑制H3N2、H5N1亚型禽流感病毒复制分析
同步传代培养的6代shNPAPB1PB2-MDCK、Mock-MDCK和MDCK，以1×105个细胞数计种植于12孔细胞培养板中，当细胞融合度达70-80％时，用感染培养基(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL，TPCK-Trypsin 4μg/mL)稀释H3N2猪流感病毒(S4株，1000TCID50)、H5N1禽流感病毒(GD/1/96株，1000TCID50)接种细胞，于室温孵育1h，吸去病毒稀释液，每孔加1mL感染培养基，于感染后12、24、36、48、60小时吸取细胞上清做10-1-10-8梯度稀释，每个稀释度接种3个9-10日龄的普通鸡胚，48h后(GD/1/96)吸取尿囊液检测病毒滴度。
shNPAPB1PB2-MDCK细胞系感染H3N2流感病毒上清中病毒滴度检测结果如图5所示。
shNPAPB1PB2-MDCK细胞系感染H5N1流感病毒上清中病毒滴度检测结果如图6所示。
实施例5 静脉注射与肌肉注射四基因质粒抑制H3N2猪流感病毒复制比较
1、注射质粒的制备与纯化
(1)将pLV-EGFP-shNPAPB1PB2和pLV-MCS质粒转化感受态E.coli DH5-α，涂板后37℃培养箱过夜培养，挑取单个菌落接种至30mL LB培养基，37℃300rmp震荡培养到对数期OD值0.6。
(2)对数期的细菌培养物5mL接种到500mL的LB培养基中，37℃、300rmp震荡培养15h。
(3)将细菌培养物分装于500mL的离心管中(每管不超过400mL)，冰浴10min，4℃、8000rmp离心10min，弃去上清。
(4)用冰冷的SET重悬细菌沉淀，4℃、8000rmp离心10min，弃去上清。
(5)将细菌沉淀重悬于18mL的solutionⅠ中，剧烈震荡，加2mL新配置的溶菌酶溶液，轻轻混匀。
(6)加40mL新配置的solutionⅡ，轻柔颠倒离心管数次混匀，不能剧烈摇晃，室温静置7min。
(7)加20mL的solutionⅢ温和震荡数次，使溶液混匀，冰浴10min，JA-10转头9000rmp 4℃离心30min。
(8)用4层纱布将上清过滤至另外一个500mL离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10min，JA-10转头6000rmp4℃离心15min，弃上清。
(9)用70％乙醇洗涤沉淀和管壁，待DNA沉淀干燥后，用6mL TE buffer(pH＝8.0)溶解沉淀。
(10)将大量制备的DNA转到50mL的离心管中，加入等体积冰冷的5M的Licl，充分混匀，4℃、10000rmp离心5min。
(11)将上清移至另一管中，加等体积的异丙醇，充分混匀，静置10min后，16℃、1000rmp离心15min，弃上清。
(12)用70％的乙醇洗涤沉淀和管壁，待沉淀干燥后，加入含RNase的TE buffer溶解沉淀(pH＝8.0)。
(13)加入等体积的1.6M Nacl(含13％PEG8000)，充分混匀，4℃、12000rmp离心15min，弃上清。
(14)用10mL的TE buffer溶解DNA沉淀。
(15)加等体积的酚/氯仿，氯仿各抽提一次，4℃、12000rmp离心15min。
(16)转移水相至另一管中，加1/10体积的3M pH＝5.2的NaAC，再加2.5倍体积的无水乙醇-20℃沉淀过夜。
(17)12000rmp 4℃、离心5min，弃上清，用70％的乙醇洗涤一次，离心弃上清。
(18)超净工作台中干燥后，用适量的无菌PBS溶解DNA沉淀，在分光光度计上测定浓度，配制成2mg/mL PBS溶液备用。
2、猪感染实验
32头4周龄猪随机分为4组：shNPAPB1PB2-Group、Mock-Group和阳性对照组各8头，每头鼻腔内接种106.68EID50/S4株SIV；阴性对照组8头，每头鼻腔内接种2mL PBS单独隔离饲养(表3)。
表3 猪感染实验分组
3、质粒给药处理
感染后0、2、4和6天，每天定时给shNPPP-Group和Mock-Group耳缘静脉或肌肉注射pLV-EGFP-shNPPP与pLV-MCS质粒1mg/头(l mg质粒稀释于500μL PBS缓冲液中)；阳性对照组注射500μL PBS/头；阴性对照组不做任何处理。
4、鼻拭子病毒滴定
于感染后2、4、6和8天采集shNPPP-Group、Mock-Group和Control-Group的鼻拭子保存于PBS病毒维持液中(含青霉素2000U/mL，链霉素2000μg/mL)，4℃作用2h，将病毒维持液做10-1-10-6梯度稀释，每个稀释度接种4个9-10日龄的普通鸡胚，72h后吸取鸡胚尿液测定血凝价，用Reed-Muench法计算样品的鸡胚半数感染量(EID50)。
静脉注射与肌肉注射后仔猪感染猪流感病毒鼻拭子病毒滴度比较结果如图7所示。
本发明采取了多基因干扰shRNA基因串联构建到一个质粒载体上的策略，并且对三基因与四基因串联进行比较，首次证明了四基因串联质粒载体对H1N1猪流感病毒的抑制作用高于三基因，多基因干扰shRNA在H1N1猪流感病毒复制周期中发挥更强的抑制作用。
经攻毒实验首次证明，表达四基因shNPAPB1PB2-MDCK细胞系不仅能抵抗H1N1亚型猪流感病毒，还能抵抗H3N2亚型猪流感病毒，此外，还能抵抗H5N1亚型禽流感病毒，具有对不同毒株交叉抑制的潜力。
本发明通过静脉注射与肌肉注射两种方式接种shRNA表达载体，比较两种给药途径研究shRNA对H3N2亚型猪流感病毒的抑制作用，结果首次证明静脉注射的shRNA有更好地抑制H3N2亚型猪流感病毒的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种能抑制猪流感病毒复制与感染的shRNA，其特征在于，所述shRNA是以猪流感病毒PB2，以及PA、PB1和NP为靶基因，编码所述shRNA的核苷酸序列为：
2.一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒，其特征在于，所述质粒含有以猪流感病毒PB2为靶基因的shRNA表达盒，以及猪流感病毒PA、PB1和NP为靶基因的shRNA表达盒；
其中，以猪流感病毒PA为靶基因的shRNA表达盒在h7SK启动子控制下，以猪流感病毒PB1为靶基因的shRNA表达盒在hH1启动子控制下，以猪流感病毒PB2为靶基因的shRNA表达盒在hU6启动子控制下，以猪流感病毒NP为靶基因的shRNA表达盒在mU6启动子控制下，且各表达盒呈串联状态。
3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，出发质粒为pGenesil-EGFP。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，出发质粒中含有嘌呤霉素抗性基因。
5.含有编码权利要求1所述shRNA的DNA的转基因细胞。
6.根据权利要求5所述的转基因细胞，其特征在于，所述细胞来自人、哺乳动物和/或禽类。
7.含有权利要求2-4任一项所述重组质粒的宿主细胞。
8.权利要求2-4任一项所述重组质粒在制备抑制猪流感病毒复制与感染的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为静脉注射剂或肌肉注射剂。
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| CN101245352A (zh) * | 2007-02-13 | 2008-08-20 | 马义才 | 一种多基因干扰的shRNA质粒表达载体及其构建方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription;Qing Ge 等;《PNAS》;20030304;第100卷(第5期);第2719页右栏9-17行，第2720页图1、表1 * |
| 通过载体表达siRNAs抑制禽流感病毒复制的研究;操胜 等;《科技导报》;20061231;第24卷(第3期);第10页中间栏第3-7行，第11页表1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105002179A (zh) | 2015-10-28 |
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