CN103417985B

CN103417985B - 核糖体蛋白类似物rpl22l1的反义核苷酸序列在制备抑制卵巢癌细胞生长药物中的应用

Info

Publication number: CN103417985B
Application number: CN201310298411.9A
Authority: CN
Inventors: 傅松滨; 金焰; 秦颖; 吴楠; 孟祥宁; 孙文靖
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2013-07-16
Publication date: 2015-06-24
Anticipated expiration: 2033-07-16
Also published as: CN103417985A

Abstract

本发明公开了核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列在制备抑制卵巢癌细胞生长药物中的应用。在本发明中，设计合成了三对核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列，分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明针对RPL22L1高扩增的卵巢癌细胞，利用RPL22L1反义核苷酸序列，通过RNAi干扰的方法减少RPL22L1的表达，研究发现上述反义核苷酸序列能够有效抑制卵巢癌细胞的生长，降低其恶性程度。将RPL22L1的反义核苷酸序列应用于卵巢癌细胞生长抑制药物的制备中，能够为卵巢癌的生物治疗提供新的药物选择和靶向性治疗方案，从而提高治疗的特异性。

Description

核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列在制备抑制卵巢癌细胞生长药物中的应用

技术领域

本发明涉及核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列的新用途，具体的，本发明涉及一种核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列在制备抑制卵巢癌细胞生长药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。

背景技术

RPL22L1（ribosomal protein L22-like1），与核糖体蛋白RPL22具有高度同源结构，核糖体是细胞内合成蛋白质的重要细胞器，主要有4条核糖体RNA和80多种核糖体蛋白质构成。在核糖体的翻译过程中，核糖体蛋白可促进rRNA折叠，“微调”核糖体空间构象，在核糖体的结合位点上协调核糖体和mRNA之间的相互作用，与rRNA协同作用催化蛋白质合成。除了参与蛋白质合成，许多核糖体蛋白还具有独立于核糖体之外的许多功能，包括参与DNA复制、转录、修复、RNA剪接和修饰，调控细胞生长和增殖，调控凋亡和发育以及细胞转化等等，统称为核糖体外功能。核糖体蛋白异常会导致细胞代谢失常、细胞表面抗原减少、细胞生长停顿或死亡，最终引发各种遗传代谢性疾病或者肿瘤。数十年前已有研究报道，RPS3a过表达能够诱导NIH3T3细胞向恶性转化，并且诱导裸鼠成瘤。还有许多研究发现在结直肠癌、肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤中都存在核糖体蛋白基因高表达的现象。同时，也有一些相反的实验研究结果，发现一些核糖体蛋白在肿瘤细胞中表达下降，也有研究认为某些核糖体蛋白在分化不同的同种肿瘤中表达水平也有明显不同。

双微体是1962年在人类结肠癌中首次发现的染色体外成对存在、着色与染色质相似或较浅、可自由复制的细胞遗传学结构，常含有扩增基因，参与细胞增殖，或为细胞生长提供选择优势。多种肿瘤的演进过程往往伴随着癌基因的扩增和过表达，癌基因拷贝数的增加是导致癌基因激活的重要机制之一。我们的前期工作发现并确认人卵巢癌细胞UACC-1598中有RPL22L1基因的扩增和过表达，提示其表达水平在卵巢癌形成及演进过程中可能起重要作用。

化疗是传统治疗卵巢癌的方法，既可单独使用，也可作为综合治疗的重要措施，但因癌症化疗的副作用较大，往往会引起很多毒副反应和合并症、后遗症，从而为广大卵巢癌患者带来了较大伤害。

针对肿瘤细胞的特点进行特异性治疗可以提高肿瘤治疗的敏感性和特异性，本发明针对在卵巢癌细胞发生发展过程中起重要作用的RPL22L1，有的放矢，用其反义核苷酸序列进行干扰，发现通过抑制RPL22L1的表达能够有效控制卵巢癌细胞的生长，因此提出了核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列在制备抑制卵巢癌细胞生长药物中的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前卵巢癌化疗效果欠佳的情况，提供一种能够通过干扰RPL22L1表达，从而抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，起到抑制卵巢癌细胞生长的作用的药物。

为了达到以上目的本发明所采用的技术手段为：

1、检测肿瘤细胞中RPL22L1扩增情况

选择含有双微体的人卵巢癌细胞系UACC-1598为研究对象。

（1）常规细胞培养；

（2）通过PCR和RT-PCR技术从DNA及mRNA水平检测细胞中RPL22L1扩增情况。

2、构建pSuper-shRNA-RPL22L1基因真核表达载体抑制RPL22L1表达。

（1）构建并鉴定pSuper-shRNA-RPL22L1及pSuper-RPL22L1–sis对照组表达载体；

（2）将构建成功的载体转染入UACC-1598细胞中，分别以Real-time PCR及Western Blotting验证RPL22L1mRNA和蛋白水平沉默的效果；

（3）建立UACC-1598稳定转染pSuper-shRNA-RPL22L1细胞系。

3、抑制RPL22L1表达对UACC-1598细胞生物学行为的影响。

（1）绘制细胞生长曲线检测抑制RPL22L1表达后细胞增殖能力的变化；

（2）流式细胞术检测抑制RPL22L1表达后的细胞周期变化；

（3）划痕实验检测抑制RPL22L1表达后细胞迁移能力的变化；

（4）侵袭实验检测抑制RPL22L1表达后细胞侵袭能力的变化。

在此研究的基础上，本发明提出了核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列在制备抑制卵巢癌细胞生长药物中的应用。

在本发明中，优选的，所述的核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

一种核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列，其特征在于所述的核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示。

当然，含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞也应在本发明的保护范围之内。

在本发明中，优选的，所述的表达载体是以载体pSUPER.retro.puro为基础载体构建得到的。

更优选的，所述的表达载体是通过以下方法构建得到的：

（1）合成以下含有核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列的寡核苷酸序列：

hRPL22L1-SiR+:GATCCCCAAGAAATACCTTAAGAAGAACTTCAAGAGAGTTCTTCTTAAGGTATTTCTTTTTTTA（SEQ ID NO.4所示）

hRPL22L1-SiR-:AGCTTAAAAAAAGAAATACCTTAAGAAGAACTCTCTTGAAGTTCTTCTTAAGGTATTTCTTGGG（SEQ ID NO.5所示）；

或

hRPL22L1-SiR+:GATCCCCAAAATCTTTTATGTACTCAGGTTCAAGAGACCTGAGTACATAAAAGATTTT TTTTTA（SEQ ID NO.6所示）

hRPL22L1-SiR-:AGCTTAAAAAAAAATCTTTTATGTACTCAGGTCTCTTGAACCTGAGTACATAAAAGATTTT GGG（SEQ ID NO.7所示）；

或

hRPL22L1-SiR+:GATCCCCAAAGTGCTGATTATAGCTGTGTTCAAGAGACACAGCTATAATCAGCACTTT TTTTTA（SEQ ID NO.8所示）

hRPL22L1-SiR-:AGCTTAAAAAAAAGTGCTGATTATAGCTGTGTCTCTTGAACACAGCTATAATCAGCACTTT GGG（SEQ ID NO.9所示）；

（2）寡核苷酸退火：

反应条件：95℃5min；80℃10min；70℃10min；60℃10min；50℃10min；37℃10min；获得含有核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列的寡核苷酸片段；

（3）pSUPER.retro.puro载体线性化：

用BglⅡ、HindⅢ两种内切酶对pSUPER.retro.puro进行双酶切，获得线性质粒载体；

（4）步骤（2）得到的寡核苷酸片段与线性化的表达质粒pSUPER.retro.puro连接重组，获得pSUPER-shRNA-RPL22L1重组质粒；

（5）pSUPER-shRNA-RPL22L1重组质粒的转化至感受态DH5a细胞中，37℃培养过夜，提取pSUPER-shRNA-RPL22L1重组质粒DNA，即得。

更进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的表达载体在制备抑制卵巢癌细胞生长药物中的应用。

本发明针对RPL22L1高扩增的卵巢癌细胞，利用RPL22L1反义核苷酸序列，通过RNAi干扰的方法减少RPL22L1的表达，从而有效抑制卵巢癌细胞的生长，降低其恶性程度，将RPL22L1的反义核苷酸序列应用于卵巢癌细胞生长抑制药物的制备中，能够为卵巢癌的生物治疗提供新的药物制备和靶向性治疗方案，提高治疗的特异性。

附图说明

图1为pSuper-shRNA-RPL22L1重组质粒酶切鉴定结果；

图2为RealTime-PCR检测UACC-1598转染前后RPL22L1RNA表达水平；

图3为Western Blot检测UACC-1598转染前后RPL22L1蛋白表达；

图4为转染前后UACC-1598细胞生长曲线；

图5为流式细胞仪检测细胞周期；

图6为转染前后UACC-1598细胞迁移能力的改变；

A、C为UACC-1598/sis，B、D为UACC-1598/SiRNA-333；A、B为0h，C、D为72h；

图7为转染前后UACC-1598细胞的基底膜侵袭实验结果（100×）；

A为UACC-1598/SIS，B为UACC-1598/SiRNA-333，均为24h；

图8为转染前后UACC-1598细胞侵袭细胞数比较的统计学分析。

（**：P<0.01转染后细胞与未转染细胞相比，侵袭细胞数存在显著性差异）

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1pSuper-shRNA-RPL22L1基因真核表达载体的构建

（1）合成以下含有核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列的寡核苷酸序列（oligos）：

hRPL22L1-SiR(333)+:GATCCCCAAGAAATACCTTAAGAAGAACTTCAAGAGAGTTCTTCTTAAGGTATTTCTTTTTTTA（SEQ ID NO.4所示）

hRPL22L1-SiR(333)-:AGCTTAAAAAAAGAAATACCTTAAGAAGAACTCTCTTGAAGTTCTTCTTAAGGTATTTCTTGGG（SEQ ID NO.5所示）

或

hRPL22L1-SiR(687)+:GATCCCCAAAATCTTTTATGTACTCAGGTTCAAGAGACCTGAGTACATAAAAGATTTT TTTTTA（SEQ ID NO.6所示）

hRPL22L1-SiR(687)-:AGCTTAAAAAAAAATCTTTTATGTACTCAGGTCTCTTGAACCTGAGTACATAAAAGATTTT GGG（SEQ ID NO.7所示）

或

hRPL22L1-SiR(926)+:GATCCCCAAAGTGCTGATTATAGCTGTGTTCAAGAGACACAGCTATAATCAGCACTTT TTTTTA（SEQ ID NO.8所示）

hRPL22L1-SiR(926)-:AGCTTAAAAAAAAGTGCTGATTATAGCTGTGTCTCTTGAACACAGCTATAATCAGCACTTT GGG（SEQ ID NO.9所示）

合成以下含有无义序列的对照组核苷酸序列（oligos）：

hRPL22L1-sis+：

GATCCCCCTGGCATCGGTGTGGATGATTCAAGAGATCATCCACACCGATGCCAGTTTTTA（SEQ ID NO.10所示）

hRPL22Ll-sis-：

AGCTTAAAAACTGGCATCGGTGTGGATGATCTCTTGAATCATCCACACCGATGCCAGGGG（SEQ ID NO.11所示）

（2）寡核苷酸退火：

溶解上述oligos的浓度至100nmol/mL，反应体系：

（3）pSUPER.retro.puro（简称pSUPER）载体线性化：

环状siRNA表达质粒载体pSUPER.retro.puro（OligoEngine公司产品，质粒全长为6349bp）含有BglⅡ、HindⅢ限制性酶切位点，用这两种内切酶对pSUPER.retro.puro进行双酶切，获得线性质粒载体，且两端为所需酶切位点粘性末端。

酶切体系如下：

37℃水浴2h；1%琼脂糖凝胶电泳；按照PCR产物回收步骤进行回收。

（4）寡核苷酸片段与线性化的SiRNA表达质粒pSUPER连接重组：

反应体系：

16℃反应过夜。

（5）从-80℃冰箱中取出感受态，立即插入冰内，待其自然融化。加入10μL连接产物，轻轻混匀后冰上放置30min。42℃水浴60s。在放入冰上5min。加入500μLLB培养液（不含氨苄），置于37℃振荡培养箱中培养，150rpm，2h。离心，3500rpm，2min。弃400μL上清液，剩余100μL液体轻轻混匀，均匀涂布于AMP（+)LB培养皿上，37℃培养过夜。

挑选阳性克隆：在含Amp的平皿培养基上接种后培养16～20小时后，可见散在分布的菌落，从中挑选数个单克隆菌落，分别接种于2.5mL LB培养液中（含氨苄），37℃，180rpm振荡培养16～20小时。

根据QIAGEN公司提供的说明书进行操作快速提取pSuper-shRNA-RPL22L1重组质粒DNA，双酶切法鉴定SiRNA-RPL22L1与pSUPER质粒是否连接成功，图1是1%琼脂糖凝胶电泳结果图，表示pSuper-shRNA-RPL22L1基因真核表达载体构建成功。所获得的质粒经上述方法初步验证后送Invitrogen公司测序。将测序所得到的序列使用NCBI数据库进行BLAST同源性分析比对。

实施例2抑制RPL22L1表达对UACC-1598细胞生物学行为的影响

1、检测肿瘤细胞中RPL22L1扩增情况

（1）常规细胞培养：选择含有双微体的人卵巢癌细胞系UACC-1598为研究对象,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于CO₂孵箱中于37℃条件下进行培养。

（2）DNA及mRNA水平检测UACC-1598细胞中RPL22L1扩增情况：

DNA水平，以正常人外周血DNA和人胚肾细胞HEK293DNA为对照，检测RPL22L1在UACC-1598中扩增情况；mRNA水平，以正常人卵巢组织cDNA和人胚肾细胞HEK293cDNA为对照，检测RPL22L1在UACC-1598中扩增情况。以上两种水平所用的对照均为本实验室前期已经提取好的样品。

按照QIAamp DNA Extract Kit(QIAGEN)说明书操作提取DNA，检索NCBIGene数据库，获得RPL22L1基因序列，应用Primer3.0software设计并合成基因特异性引物，所用引物由Invitrogen公司合成，序列如下：

DNA引物：

hRPL22L1 Sense:5'-TCTGAGCCATTTCTTTACTA-3'

Anti-sense：5'-ATCTTACTGGTTCCCTTACT-3'

其扩增片段长度为292bp

hACTB Sense:5'-ACCGCGAGAAGATGACCCAG-3'

Anti-sense：5'-TTAATGTCACGCACGATTTCCC-3'

其扩增片段长度为296bp

mRNA引物：

hRPL22L1 Sense:5'-GGAAATCTCGGGAATGTTGT-3'

Anti-sense：5'-AAGTTCGTAGGTCTCCTTGTCA-3'

其扩增片段长度为175bp

RPL22L1基因的PCR扩增反应条件为：

95℃5min

95℃30s，58℃30s，72℃30s，29个循环

72℃10min

16℃+∞

2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

采用TRIzol Reagent总RNA提取试剂，按说明书提供的方法提取人卵巢癌细胞UACC-1598的总RNA。依测定浓度调整各组样品总RNA量，采用Roche公司的Transcriptor First Stand cDNA System Kit逆转录试剂盒，按照说明书提供的方法逆转录合成cDNA第一链。反应条件50℃60min；85℃5min；16℃+∞。-20℃保存cDNA第一链。RT-PCR检测UACC-1598中mRNA水平RPL22L1扩增情况。应用SPSS16.0统计软件包进行统计学分析，两组计量资料的比较采用ANOVA检验，以P<0.05为差异有显著性。

2、将实施例1构建成功的载体pSuper-shRNA-RPL22L1转染入UACC-1598细胞中，分别以Real-time PCR及Western Blotting验证RPL22L1mRNA和蛋白水平沉默的效果.

pSuper-shRNA-RPL22L1的转染：分组为实验组：pSUSPER-RPL22L1-333组；pSUSPER-RPL22L1-687组；pSUSPER-RPL22L1-926组。对照组：pSUSPER-RPL22L1-sis组。

将上述质粒分别转染入UACC-1598细胞，转染过程按照Lipofectin^TM2000转染试剂说明书操作。

48h后，采用TRIzol Reagent总RNA提取试剂，按说明书提供的方法提取总RNA。将qPCR反应体系加入96孔板中，在Roche LightCycler480型荧光定量PCR仪SYBR Green I/HRM Dye(465-510)系统下运行。每一样本测量3次，按照说明书提供的最佳反应条件，94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共45个循环；检测干扰效果。计算不同实验的数据平均值±标准差。统计方差分析SNK两两比较法（Student-Newman-Neuls）有统计学意义。图2是RealTime-PCR图，表示转染pSuper-shRNA-RPL22L1后UACC-1598中RPL22L1mRNA水平表达下降。

分别提取pSUSPER-RPL22L1-sis（对照组）和pSUSPER-RPL22L1-333、pSUSPER-RPL22L1-687和pSUSPER-RPL22L1-926（实验组）四种细胞的总蛋白。将提取的pSUSPER-RPL22L1-sis（对照组）和pSUSPER-RPL22L1-333、pSUSPER-RPL22L1-687和pSUSPER-RPL22L1-926（实验组）四种细胞的总蛋白进行Western印迹实验，以判断RNA干涉效果。图3是Western Blot图，表示转染转染pSuper-shRNA-RPL22L1后UACC-1598中RPL22L1蛋白水平表达下降。

（3）建立UACC-1598稳定转染pSuper-shRNA-RPL22L1细胞系。

挑选干扰效果最好的质粒，转染UACC-1598细胞，转染48h后，细胞加入确定浓度的puro，2～3天更换含相同puro浓度的培养基。14天后观察到有散在的细胞克隆，大部分细胞均已死亡。将细胞克隆做好标记、胰酶消化，转移至24孔板。待孔内细胞长至70～80%密度时再经胰酶消化转移至6孔板内培养。待6孔板内细胞生长至70～80%时转移至培养瓶中继续培养。得到稳定转染的细胞组和对照组，培养至细胞铺满培养瓶。

3、抑制RPL22L1表达对UACC-1598细胞生物学行为的影响。

MTT法绘制细胞生长曲线：接种细胞，取对数生长期对照组细胞pSUSPER-RPL22L1-sis和实验组细胞pSUSPER-RPL22L1-333，细胞浓度为1×10⁴/mL，接种于96孔板，每孔接种200μL，每种细胞每个观察时间点均设计为6个复孔。培养24h后，每孔加入含Aqueous One Solution Reagent的1640培养基100μL（Reagent：1640=1:4），继续培养4h。选择490nm波长，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光值，并记录结果。以时间为横轴，取6个相同生长天数及携带相同载体的光吸收值均值作为该类细胞的某天吸光值，并作为纵轴绘制细胞生长曲线。图4是抑制RPL22L1表达后的细胞生长曲线图，表示抑制RPL22L1表达后UACC-1598细胞增殖能力降低。

（2）流式细胞术检测抑制RPL22L1表达后的细胞周期变化；

将培养好的pSUSPER-RPL22L1-sis和pSUSPER-RPL22L1-333两种细胞经0.25%胰酶消化、全培养基终止。离心，3500rpm，5min。PBS洗涤细胞2次后，加入3～5mL预冷的75％乙醇，4℃固定过夜。次日将细胞取出再次用PBS洗涤2次，用PBS配成1×10⁶个/mL的细胞悬液，后续按照cycle TEST^TM PLUS DNA试剂盒提供的操作步骤进行，行流式细胞术检测细胞周期的改变，重复3次。结果如图5和表1所示，从该结果可以看出RPL22L1基因被沉默后，细胞从G1向S 和G2期转化受到抑制，因此转染后细胞处在G1期的比例较高，处在S期的比例较低。

表1转染前后UACC-1598细胞细胞周期的改变

（3）划痕实验检测抑制RPL22L1表达后细胞迁移能力的变化；

将处于对数生长期的pSUSPER-RPL22L1-sis和pSUSPER-RPL22L1-333两种细胞用胰酶消化接种到六孔板中，让其充分贴壁和伸展。第二天，用10μL移液器吸头在长至80%～90%的单层细胞上划一条直线，PBS冲掉悬浮的细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，倒置相差显微镜下拍照。之后，将六孔板放入37℃培养箱中继续培养。分别于12h、24h、36h、48h后镜下观察，拍照。对比细胞迁移能力的变化。图6是细胞划痕实验图，表示RPL22L1基因被沉默后细胞迁移能力下降。

（4）侵袭实验检测抑制RPL22L1表达后细胞侵袭能力的变化。

应用BD BioCoat^TM Matrigel^TM Invasion Chamber对pSUSPER-RPL22L1-sis和pSUSPER-RPL22L1-333两种细胞进行重组基底膜侵袭实验。从-20℃取出侵袭小室放入24孔板中，室温放置。在24孔板和小室内各加入500μL热的（37℃）无血清1640培养基，37℃孵箱中水化2h。水化后，小心地将液体移出，不要碰到matrigel基底膜。将pSUSPER-RPL22L1-sis和pSUSPER-RPL22L1-333两种细胞用胰酶消化，全培养基终止消化，细胞计数，将细胞稀释到10万/mL。24孔板内加入750μL全培养基，之后，将小室放入24孔板中，注意小室膜下不要产生气泡。迅速加入500μL细胞悬液（5万个细胞/孔），每组细胞设3个复孔。镜下观察，吹打均匀。37℃孵箱中，培养24h。取出24孔板，棉签蘸无血清培养基擦干净膜的内表面，去掉未发生侵袭的细胞。膜在无水甲醇中固定1min，蒸馏水洗2遍；苏木素染色5min，水洗干净（至无色）；伊红染色20s，水洗干净。将膜完全晾干。刀切膜，中性树胶将膜粘到载玻片上，盖上盖玻片。光镜下观察，计数，拍照。结果如图7和图8所示，图7是细胞基底膜侵袭实验图，表示RPL22L1基因被沉默后细胞侵袭能力下降。图8是细胞基底膜侵袭统计图，表示RPL22L1基因被沉默后细胞侵袭能力下降。（**：P<0.01转染后细胞与未转染细胞相比，侵袭细胞数存在显著性差异）

Claims

1.核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列在制备抑制卵巢癌细胞系UACC-1598生长药物中的应用，其中，所述的核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

2.含有核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列的表达载体在制备抑制卵巢癌细胞系UACC-1598生长药物中的应用，所述的核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的表达载体是以载体pSUPER.retro.puro为基础载体构建得到的。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的表达载体是通过以下方法构建得到的：

(1)合成以下含有核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列的寡核苷酸序列：

hRPL22L1-SiR+:GATCCCCAAGAAATACCTTAAGAAGAACTTCAAGAGAGTTCTTCTTAAGGTATTTCTTTTTTTA

hRPL22L1-SiR-:AGCTTAAAAAAAGAAATACCTTAAGAAGAACTCTCTTGAAGTTCTTCTTAAGGTATTTCTTGGG；

或

hRPL22L1-SiR+:GATCCCCAAAATCTTTTATGTACTCAGGTTCAAGAGACCTGAGTACATAAAAGATTTT TTTTTA

hRPL22L1-SiR-:AGCTTAAAAAAAAATCTTTTATGTACTCAGGTCTCTTGAACCTGAGTACATAAAAGATTTT GGG；

或

hRPL22L1-SiR+:GATCCCCAAAGTGCTGATTATAGCTGTGTTCAAGAGACACAGCTATAATCAGCACTTT TTTTTA

hRPL22L1-SiR-:AGCTTAAAAAAAAGTGCTGATTATAGCTGTGTCTCTTGAACACAGCTATAATCAGCACTTT GGG；

(2)寡核苷酸退火：

反应条件：95℃ 5min；80℃ 10min；70℃ 10min；60℃ 10min；50℃10min；37℃ 10min；获得含有核糖体蛋白类似物RPL22L1的反义核苷酸序列的寡核苷酸片段；

(3)pSUPER.retro.puro载体线性化：

(4)步骤(2)得到的寡核苷酸片段与线性化的表达质粒pSUPER.retro.puro连接重组，获得pSUPER-shRNA-RPL22L1重组质粒；

(5)pSUPER-shRNA-RPL22L1重组质粒转化至感受态DH5a细胞中，涂于含氨苄平板培养基上培养后挑取阳性菌落摇菌培养，提取pSUPER-shRNA-RPL22L1重组质粒DNA，即得。