CN103305515B - 一种fam84b反义核苷酸及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种FAM84B反义核苷酸，所述的核苷酸序列为SEQ？ID？No.1，还包括含有本发明核苷酸序列的表达载体及其宿主细胞。本发明通过抑制FAM84B，进而抑制结直肠癌细胞的增殖及侵袭能力，最终起到抑制结直肠癌细胞生长的作用。

Description

一种FAM84B反义核苷酸及其应用
技术领域
本发明涉及一种FAM84B反义核苷酸及其在制备抑制结直肠癌细胞生长药物中的应用，具体涉及通过抑制FAM84B而抑制结直肠癌细胞的生长，属于生物医药领域。
背景技术
序列相似家族84成员B(family with sequence similarity84,member B，FAM84B)，FAM84B又名BCMP101，该基因在多种肿瘤中都高表达：乳腺癌、慢性粒细胞性白血病、食管癌、前列腺癌、结肠癌、黑色素瘤等。在结肠癌中发现该基因与myc共扩增的现象，该基因在乳腺癌中表达位于细胞相互接触的质膜处，且与α1-连环蛋白(α1-catenin)相互作用。连环蛋白是一组具有相似结构的胞内糖蛋白家族，是细胞骨架蛋白和细胞内信号转导分子，连环蛋白与上皮型钙粘蛋白形成的cadherin/catenin复合体在肿瘤的侵袭转移中起到重要的作用，该复合体是细胞间粘附分子的重要成员，不仅介导细胞间粘附，还直接或间接参与细胞的信号转导，在肿瘤的发生、发展和侵袭转移过程中具有重要作用。
双微体是基因扩增的一种主要形式，它们是细胞中环状成对、可自主复制的额外染色体成分，经常含有扩增的基因，参与细胞增殖，或为细胞生长提供选择优势。我们的前期工作发现并确认人结直肠腺癌细胞NCI-H716中有FAM84B基因的扩增和过表达，且该基因以双微体形式扩增，提示其过表达在结直肠癌的形成及演进过程中可能起到重要的作用。
在结直肠癌的手术治疗后，辅助化疗是结肠癌综合治疗的一个重要组成部分。辅助化疗的机理在于用化疗控制减灭根治术后体内的残留病灶。但因癌症化疗的副作用较大，往往会引起很多毒副反应和合并症、后遗症，从而为广大结直肠癌患者带来了较大伤害。
针对肿瘤细胞的特点进行特异性治疗可以提高肿瘤治疗的敏感性和特异性，有的放矢，我们针对与结直肠癌细胞发生发展过程中起重要作用的FAM84B用其反义核苷酸序列进行干扰，通过抑制FAM84B的表达从而控制结直肠癌细胞的生长，针对与结直肠癌细胞双微体形成密切相关的FAM84B进行干预，通过减少肿瘤细胞中双微体数目，从而可应用于结直肠癌细胞生长抑制药物的制备中。
发明内容
本发明针对目前结直肠癌化疗效果欠佳的情况，提供一种FAM84B反义核苷酸序列，核苷酸序列为SEQ ID No.1，这一序列干扰FAM84B表达，从而抑制结直肠癌细胞生长。
本发明通过抑制FAM84B，进而抑制结直肠癌细胞的增殖及侵袭能力，最终起到抑制结直肠癌细胞生长的作用。
本发明还包括含有上述核苷酸序列的表达载体以及宿主细胞，及其在制备抑制结直肠癌细胞生长的药物中的应用。
本发明取得的有益效果：
本发明针对FAM84B高扩增和高表达的结直肠癌细胞，利用FAM84B反义核苷酸序列，通过RNAi干扰的方法抑制FAM84B的表达，减少双微体数目，从而有效抑制结直肠癌细胞的生长，降低其恶性程度，将FAM84B的反义核苷酸序列应用于结直肠癌细胞生长抑制药物的制备中，能够为结直肠癌的生物治疗提供新的药物制备和靶向性治疗方案，提高治疗的特异性。
附图说明
图1为ShRNA-FAM84B重组质粒酶切鉴定图；
图2为使用NCBI数据库对测序所得到的沉默序列与基因FAM84B进行BLAST同源性分析比对图；
图3为NCI-H716转染后FAM84B表达情况的Realtime RT-PCR检测图；
图4为FAM84B基因沉默后NCI-H716细胞中期核型图；其中图A为对照-shRNA细胞中期核型图，图B为FAM84B-shRNA细胞中期核型图；
图5为FAM84B基因沉默后NCI-H716细胞中双微体数目散点图(平均值±标准差)；
图6为FAM84B基因沉默后NCI-H716细胞生长曲线图；
图7为FAM84B基因沉默后流式细胞术检测NCI-H716的细胞周期图；其中图A为对照-shRNA，图B为FAM84B-shRNA；
图8为FAM84B基因沉默后NCI-H716细胞的基底膜侵袭实验结果图；其中图A为对照-shRNA，图B为FAM84B-shRNA；
图9为FAM84B基因沉默后NCI-H716细胞侵袭细胞数比较的统计学分析图，其中,*为P<0.05，表示转染后细胞与未转染细胞相比，侵袭细胞数存在差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料：
人结肠直肠腺癌细胞系NCI-H716购自美国菌种保藏中心(ATCC，美国)；大肠杆菌DH5α菌株购自美国Invitrogen公司；pSUPER-vector购自美国Oligoengine公司；
本发明所用试剂均为市售。
实施例1构建并鉴定pSuper-shRNA-FAM84B表达载体
(1)siRNA序列设计
根据siRNA Target Finder软件设计针对FAM84B的21nt的siRNA靶序列，设计构建基因沉默表达载体pSUPER相对应的shRNA正向和反向寡核苷酸序列，正向寡核苷酸序列为SEQ ID No.2(含有寡核苷酸序列SEQ ID No.1及其SEQ ID No.1的反义寡核苷酸序列)，反向寡核苷酸序列为SEQ ID No.3(含有寡核苷酸序列SEQID No.1及其SEQ ID No.1的反义寡核苷酸序列)。
对照siRNA序列为SEQ ID No.4，将此序列构建基因沉默表达载体pSUPER相对应的正向寡核苷酸序列为SEQ ID No.5，反向寡核苷酸序列为SEQ ID No.6，用于后续实验。
(2)寡核苷酸退火连接
溶解正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列的浓度至100nmol/mL，反应体系：
反应条件：95℃5min；80℃10min；70℃10min；60℃10min；50℃10min；37℃10min。
(3)pSUPER载体线性化
环状siRNA表达载体pSUPER含有BglⅡ和HindⅢ限制性酶切位点，用这两种内切酶对pSUPER进行双酶切，获得线性载体，且两端为所需酶切位点粘性末端。
酶切体系如下：
37℃水浴2h后进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后对线性化的pSUPER载体进行回收。
(4)表达载体的构建
将退火后的寡核苷酸序列与线性化的SiRNA表达载体pSUPER连接重组：
反应体系：
16℃反应过夜，即获得pSuper-shRNA-control和pSuper-shRNA-FAM84B重组质粒。
(5)pSuper-shRNA-control和pSuper-shRNA-FAM84B重组质粒转化至感受态DH5α
从-80℃冰箱中取出感受态DH5α，立即插入冰内，待其自然融化。取感受态DH5α20μL分别加入10μL连接产物pSuper-shRNA-control和pSuper-shRNA-FAM84B重组质粒，轻轻混匀后冰上放置30min。42℃水浴60s。再放入冰上5min。加入500μL LB培养液，置于37℃振荡培养箱中培养，150r/min，2h。3500r/min离心2min。弃400μL上清液，剩余100μL液体轻轻混匀，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB培养皿上，37℃培养过夜。
挑选阳性克隆：在含氨苄青霉素的平皿培养基上接种后培养16～20h后，可见散在分布的菌落生长，从中挑选数个单克隆菌落，分别接种于2.5mL LB培养液中(含氨苄青霉素)，37℃振荡培养16～20h，180r/min。
根据QIAGEN公司提供的说明书进行操作快速提取pSuper-shRNA-FAM84B重组质粒DNA，应用BglⅡ和HindⅢ酶切法鉴定ShRNA-FAM84B与pSUPER质粒是否连接成功，由于连接成功的质粒没有BglⅡ的酶切位点，但有HindⅢ的酶切位点，因此用BglⅡ酶切后电泳仍为环状质粒条带，而用HindⅢ酶切后电泳为线性条带。鉴定结果见图1。所获得的质粒经上述方法初步验证后送Invitrogen公司测序。将测序所得到的序列使用NCBI数据库进行BLAST同源性分析比对，比对结果如图2。
实施例2实施例1构建的表达载体对FAM84B表达的抑制情况
将构建成功的pSuper-shRNA-control和pSuper-shRNA-FAM84B表达载体分别转染入NCI-H716细胞中，建立NCI-H716稳定转染pSuper-shRNA-FAM84B细胞株，以Real-time RT-PCR验证FAM84B沉默的效果。
转染：实验组：pSuper-shRNA-FAM84B组；对照组：pSuper-shRNA-control组。
将上述质粒转染入NCI-H716细胞，加入转染试剂脂质体(PEI)，按说明书操作。在转染24h之后，加入嘌呤霉素2.0μg/ml进行稳定筛选，2～3天更换含相同嘌呤霉素浓度的培养基。7天后，空白对照组细胞基本都已经死亡，而转染组的细胞有散在的细胞克隆，待6孔板内细胞生长至70～80%时转移至培养瓶中继续培养。得到稳定转染的细胞组和对照组培养至铺满培养瓶。之后，分别提取对照-shRNA(对照组)和FAM84B-shRNA(实验组)细胞的总RNA。进行逆转录成cDNA，并进行Realtime RT-PCR实验验证沉默效果，实验结果见图3。
试验例1抑制FAM84B表达对NCI-H716双微体和细胞生物学行为的影响
(1)收取中期细胞核型计数细胞双微体数目
将处于对数生长期的对照-shRNA和FAM84B-shRNA两种细胞中加入终浓度为0.02μg/mL的秋水仙素，37℃继续培养1h，将细胞用吸管吹打下来，将悬液装入离心管中1000r/min离心5min，并用PBS冲洗两次，加入37℃预热的0.075mol/L的KCL，在37℃水浴中低渗作用13min，逐滴加入1mL新鲜固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)混匀，1500r/min离心7min，弃上清加入10mL固定液，轻轻混匀，室温固定30min，1500r/min离心7min，重复一次，弃上清，加入适当固定液混匀，将细胞悬液以一定高度滴于预冷的载玻片上，室温晾干。Giemsa染液染色7min，流水冲洗，晾干。置于显微镜下观察，实验结果见图4。每组细胞计数100-120个核型，计数双微体数目绘制成散点图，图5所示。应用t检验对对照-shRNA和FAM84B-shRNA双微体数目进行统计学分析，***P<0.001，FAM84B-shRNA细胞组双微体数目明显低于对照-shRNA中双微体数目。说明FAM84B表达抑制后细胞中双微体数目明显降低。
(2)绘制细胞生长曲线检测抑制FAM84B表达后细胞增殖能力的变化
MTS法绘制细胞生长曲线：接种细胞，取对数生长期对照组细胞对照-shRNA和实验组细胞FAM84B-shRNA，细胞浓度为4×104个/mL，接种于96孔板，每孔接种100μL，每种细胞每个观察时间点均设计为3个复孔。培养24h后，每孔加入AQueous One Solution Reagent20μL，继续培养4h。选择490nm波长，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光值，并记录结果，如表1。以时间为横轴，取3个相同生长天数及携带相同载体的光吸收值均值作为该类细胞FAM84B-shRNA的某天吸光值，并作为纵轴绘制细胞生长曲线，结果见图6。可见FAM84B-shRNA实验组细胞生长速率明显低于对照-shRNA对照组细胞。说明FAM84B表达抑制后细胞增殖能力受到影响，细胞生长减慢。
表1FAM84B基因沉默后MTT法测定细胞吸光值
(3)流式细胞术检测抑制FAM84B表达后的细胞周期变化
将培养好的对照-shRNA和FAM84B-shRNA两种细胞经0.25%胰酶消化、全培养液终止。3500r/min离心5min。PBS洗涤细胞2次后，加入3～5mL预冷的75％乙醇，4℃固定过夜。次日将细胞取出再次用PBS洗涤2次，用PBS配成1×106个/mL的细胞悬液，后续按照cycle TESTTM PLUS DNA试剂盒提供的操作步骤进行，行流式细胞术检测细胞周期的改变，检测结果见图7、表2。
表2FAM84B基因沉默后NCI-H716细胞周期的改变
(4)侵袭实验检测抑制FAM84B表达后细胞侵袭能力的变化
应用BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber对对照-shRNA和FAM84B-shRNA两组细胞进行重组基底膜侵袭实验。从-20℃取出侵袭小室放入24孔板中，室温放置。在24孔板和小室内各加入500μL热的(37℃)无血清1640培养基，37℃孵箱中水化2h。水化后，小心地将液体移出，不要碰到matrigel基底膜。将对照-shRNA和FAM84B-shRNA两种细胞用胰酶消化，全培养基终止消化，细胞计数，将细胞稀释到1×105个/mL。24孔板内加入750μL全培养基，之后，将小室放入24孔板中，注意小室膜下不要产生气泡。迅速加入500μL细胞悬液(5×104个/孔)，每组细胞设3个复孔。镜下观察，吹打均匀。37℃孵箱中，培养24h。取出24孔板，棉签蘸无血清培养基擦干净膜的内表面，去掉未发生侵袭的细胞。膜在无水甲醇中固定1min，蒸馏水洗2遍；苏木素染色5min，水洗干净(至无色)；伊红染色20s，水洗干净。将膜完全晾干。刀切膜，中性树胶将膜粘到载玻片上，盖上盖玻片。光镜下观察，计数，应用卡方检验进行统计学分析，*P<0.05。实验结果见图8、图9。可见FAM84B-shRNA实验组细胞侵袭率明显低于对照-shRNA对照组细胞。说明FAM84B表达抑制后细胞侵袭能力受到影响，细胞侵袭减慢。

Claims (3)

1.FAM84B反义核苷酸在制备抑制结直肠癌细胞生长的药物中的应用，其中所述的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
2.含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的表达载体在制备抑制结直肠癌细胞生长的药物中的应用。
3.含有表达载体的宿主细胞在制备抑制结直肠癌细胞生长的药物中的应用，其中所述的表达载体含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
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