CN102747038B - Nox4敲减的a375稳转细胞株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学分子生物学领域。本发明所述的NOX4敲减的A375稳转细胞株是利用逆转录病毒载体pSuper.retro.puro将模板DNA双链中的F链5'-GATCCCCGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTTCAAGAGAGCTTAGACACAATCCTAGCCCTTTTTA-3'和R链5'-AGCTTAAAAAGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTCTCTTGAAGCTTAGACACAATCCTAGCCCGGG-3'插入进A375细胞基因组，经转录后生成的干扰RNA靶向降解A375细胞内源性NOX4mRNA，靶向沉默内源性NOX4表达，进而靶向敲减A375细胞内源性NOX4表达80%以上的稳转细胞株。

Description

NOX4敲减的A375稳转细胞株及其构建方法

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域。

背景技术

NADPH氧化酶由NOX、p47^phox、p67^phox、p40^phox、Rac和p22^phox等亚基组成（图1）。NOX是NADPH氧化酶的功能核心亚基，包含6个跨膜区(Ⅰ-Ⅵ)，跨膜区Ⅲ和Ⅴ之间结合两个亚铁血红素(Heme)，羧基端含有FAD和NADPH的结合位点；NOX结合NADPH后，电子沿NADPH→FAD→亚铁血红素→O2的方向传递；NADPH氧化酶依赖于NOX将电子从供体NADPH传递给受体O₂，生成O₂ ^－。（图2）。1986年，Royer-Pokora等克隆出吞噬细胞内发挥电子传递作用gp91^phox亚基的基因，该基因被命名为NOX2。随后相继发现NOX家族的其他成员，包括：NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2。NOX家族各成员具有高度保守的同源结构，同源结构与其电子传递功能密切相关。人NOX4基因定位于11号染色体（11q14.2-q21），基因全长265,259 bp, 由18个外显子和17个内含子组成； 其cDNA 为1737 bp, 编码578个氨基酸。

NOX家族成员分布于人黑色素瘤、结肠癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌和肺癌等肿瘤，并且与肿瘤的形成、增殖和凋亡密切相关。Arnold等构建出NOX1高表达的小鼠成纤维细胞NIH 3T3，NOX1的高表达导致NIH 3T3细胞中ROS水平增高，细胞的生长特性发生改变，具体表现为增殖能力提高，密度依赖性生长抑制作用丧失，将NOX1高表达的NIH 3T3细胞注射到裸鼠皮下后，该细胞具有成瘤能力。Brar等通过RT-PCR和免疫染色等方法发现NOX4存在于人黑色素瘤细胞M1619中。通过反义RNA技术抑制M1619细胞中NOX4的表达，或用NOX的抑制剂二联苯碘(Diphenylene iodonium, DPI)处理M1619细胞后，肿瘤细胞内ROS水平降低，NF-κB(Nuclear factor-kappa B)、ATF-1/2(Activating transcription factor-1/2)和CREB-1(cAMP response element binding protein-1)等转录因子的功能降低，肿瘤细胞增殖能力下降。Yamaura等发现在13种人黑色素瘤细胞中NOX4的表达量都增加并伴随细胞内ROS水平增高，通过siRNA方法敲减人黑色素瘤细胞MM-BP中NOX4后，细胞内ROS水平降低，肿瘤细胞增殖能力下降，裸鼠皮下成瘤能力下降。Zhao等用DPI处理小鼠黑色素瘤细胞B16后，细胞内ROS水平下降，肿瘤细胞的增殖能力下降，并且还发现DPI能促进B16细胞的分化。Lu等用NOX的抑制剂夹竹桃麻素(Apocynin)处理人前列腺癌细胞22Rv1后发现，肿瘤细胞内ROS水平降低，肿瘤细胞对放疗的敏感性增强。可见，NOX与肿瘤的发生、发展、临床表现及治疗均有密切关系。

至今为止，文献报道的NOX4敲减的人黑色素瘤细胞有1个来源。Yamaura等将能表达siNOX4-1(5'-CAGAACATTCCATATTAC-3')或siNOX4-2(5'-ACTTT GTTGAACTGAATG-3')的DNAN模板插入含H1启动子的表达载体pSilencer hygro形成重组载体，通过Lipofectamine 2000介导重组载体转染人黑色素瘤MM-BP细胞。因pSilencer hygro携带潮霉素(Hygromycin)抗性，所以用含Hygromycin 400 μg/ml的培养基筛选转染后的细胞，从而获得阳性细胞株，再通过RT-PCR和Western Blot检测NOX4的干扰效率。此外，Brar等通过反义核苷酸技术将靶向NOX4 mRNA的正义核苷酸链(5'-TCGAGGAGGTCCTGTGTCGG-3')或反义核苷酸链(5'- AGCTCCTCCAGGACACAGCC-3')转染M1619细胞后，经反义核苷酸链转染后的M1619细胞增殖能力下降，NF-κB、ATF-1/2和CREB-1等转录因子的活性下降。但是反义核酸链介导NOX4表达下降是短期的效应并不能长期维持，而且并未检测转染后NOX4 mRNA和蛋白表达水平，故这株M1619细胞不能确定为NOX4敲减的细胞。

黑色素瘤发病率在全球范围内逐年升高，虽然黑色瘤的发病率具有种族和民族特异性，但是国内皮肤黑色素瘤的发病率也逐年升高，主要以肢端黑色素瘤为主，外伤、先天性小痣是国内皮肤黑素瘤的主要病因。黑色素瘤对放化疗不敏感，手术切除是治疗早期黑色素瘤唯一有效的方法，而一旦发生转移，病情迅速恶化，预后极差，因此深入研究黑色素瘤发生发展机制和寻找有效治疗方法是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种NOX4敲减的A375稳转细胞株，作为模型用于研究

NOX4与肿瘤的相关性及其机理。

本发明的另一目的在于提供这种细胞株的构建方法。

本发明所述的NOX4敲减的A375稳转细胞株是利用逆转录病毒载体pSuper.retro.puro将模板DNA双链中的F链5'-GATCCCCGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTTCAAGAGAGCTTAGACACAATCCTA GCCCTTTTTA-3'和R链5'-AGCTTAAAAAGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTCTCTTGAAGCTTA GACACAATCCTAGCCCGGG-3'插入进A375细胞基因组，经转录后生成的干扰RNA靶向降解A375细胞内源性NOX4 mRNA，靶向沉默内源性NOX4表达，进而靶向敲减A375细胞内源性NOX4表达80%以上的稳转细胞株。

本发明所述的NOX4敲减的A375稳转细胞株的构建方法由以下步骤组成：

(一)、 设计合成shRNA序列

利用BLOCK-iT™ RNAi Designer设计针对人NOX4基因NM_016931的3组shRNA序列NOX4-shRNA 1、NOX4-shRNA 2、NOX4-shRNA 3和1组无关对照序列Scramble-shRNA，每组序列包括2条DNA单链，即F链和R链，每条DNA单链含有针对人NOX4基因的正义和反义干扰序列、9个核苷酸的Loop结构以及两端限制性内切酶Bgl Ⅱ或Hind Ⅲ的酶切位点；

(二)、 构建逆转录病毒表达载体pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA

按设计合成DNA模板单链F链和R链，退火形成双链模板，用Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切逆转录病毒表达载体pSuper.retro.puro后成为线性质粒；退火后的双链DNA模板与线性载体pSuper.retro.puro在T4 DNA 连接酶作用下连接形成重组载体，重组载体转化E.coli DH5α感受态细菌，将转化菌液涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板，过夜培养；挑选阳性菌落扩增培养，提取质粒测序鉴定重组载体pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA是否构建成功；

(三)、 pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA载体的干扰效率筛选

Lipofectamine 2000 分别介导重组干扰载体pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA 1, 2, 3和pSuper-retro-puro-scramble-shRNA 瞬时转染A375-WT 细胞，转染48 小时 后收集细胞并提取总RNA和总蛋白，以β-actin 作为内参，分别用于荧光定量PCR 和Western Blot 检测NOX4的表达；

(四)、逆转录病毒包装和生产

病毒包装质粒和重组载体pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA 1通过磷酸钙法共转染293FT细胞，6 小时后取出培养皿，弃去培养基，1×PBS清洗细胞3次，并轻柔地加入8 ml新鲜的293FT培养基，继续培养；细胞转染36-48 小时后，收集培养基上清液作为逆转录病毒液，之后每3 小时收集1次，共收集3-4次，每次收集的病毒上清液用0.45 μm的PVDF膜过滤；

(五)、逆转录病毒感染A375细胞

胰酶消化处于生长对数期的A375细胞，离心后用无抗生素的培养基重悬细胞，取5×10⁵个A375细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入2 ml温浴后的病毒上清液，加入聚凝胺Polybrane，终浓度为2 μg/ml，培养3 小时，弃去培养基，更换2 ml病毒上清液继续培养，重复2次；

(六)、A375-NOX4∆稳转细胞筛选和鉴定

A375细胞经病毒上清液感染3次后，向培养皿中加入无抗生素的培养基，培养48小时后，弃去培养基，换用含嘌呤霉素的培养基培养并筛选阳性细胞，隔日观察细胞，弃去原培养基及死细胞，1×PBS清洗细胞3次，更换抗性培养基继续培养细胞，持续筛选10 天，待细胞长满时，消化细胞，接种于10 mm培养皿中扩增培养，传代3次；筛选结束后通过荧光定量PCR和Western Blot检测NOX4 mRNA和蛋白表达；与A375细胞相比，筛选所得细胞的NOX4 mRNA和NOX4蛋白分别下降66.11 %和82.63 %，表明NOX4敲减的A375-NOX4∆稳转细胞株构建成功。

在步骤二中，按照图3分别合成8条DNA单链（4条F链和4条R链），各组shRNA序列和无关对照序列分别经退火形成双链模板，用Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶消化逆转录病毒表达载体pSuper-retro-puro（图4）后成为线性质粒；退火后的双链DNA模板与线性载体pSuper-retro-puro在T4 DNA 连接酶作用下连接形成重组载体；重组载体转化E.coli DH5α感受态细菌，将转化菌液涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板，过夜培养；挑选阳性菌落扩增培养，提取质粒DNA测序、鉴定，确认重组载体pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA构建成功，如图5的NOX4-shRNA 1和图6的Scramble-shRNA测序。

在步骤三中，结果显示：A375-Scramble-shRNA、A375-NOX4-shRNA1、A375-NOX4-shRNA2 和A375- NOX4-shRNA3 细胞中NOX4 mRNA 表达量分别为A375-WT 细胞的95.15 % (P=0.165)、22.13 % (P<0.01)、46.28 % ( P<0.01)和33.20 % ( P<0.01) (图7)；而NOX4 蛋白表达量分别为A375-WT 细胞的95.42 %(P=0.086)、25.23 % (P<0.01)、43.93 %(P<0.01)和34.59 % (P<0.01) (图8和图9)。因pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA 1的干扰效率最高，故用于后续的稳转细胞株构建。

上述的A375细胞株为现有技术，购于中国科学院细胞库。它来源于一位54岁的女性皮肤恶性黑色素瘤患者，由D.J.Giard等人建立，贴壁生长，属上皮细胞，具有致瘤性（使免疫抑制的小鼠产生类似于恶性黑色素瘤的皮下肿瘤）。经细胞遗传学分析显示为含62条同源染色体的亚三倍体细胞，有9条标记染色体，其DNA上的STR位点有：Amelogenin: X；CSF1PO: 11,12；D13S317: 11,14；D16S539: 9；D5S818: 12；D7S820: 9；THO1: 8；TPOX: 8,10 和 vWA: 16,17。

所述的BLOCK-iT™ RNAi Designer 为现有技术，登载于http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/design.do。

鉴于国内外缺乏NOX4敲减的人黑色素瘤A375稳转细胞株及其相关研究的报道，本申请应用shRNA-逆转录病毒系统沉默A375细胞内源性NOX4表达80%以上，构建了NOX4敲减的A375稳转细胞株(A375-NOX4∆)，并对NADPH氧化酶活性进行了初步探讨。本细胞模型可用于探究NADPH氧化酶与肿瘤的相关性及其机理；也可用于从NADPH氧化酶和ROS的角度探讨人恶性黑色素瘤发生发展的机制。

本申请构建的NOX4敲减的A375细胞的方法不同于现有技术，其特点为应用pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA靶向敲减人皮肤恶性黑色素瘤A375内源性NOX4表达的稳转细胞株。现有技术如：（1）Yamaura等应用表达载体pSilencer hygro将表达，siNOX4-1(5'-CAGAACATTCCATATTAC-3')或siNOX4-2(5'-ACTTT GTTGAACTGAATG-3')的DNAN模板连接形成重组载体，再由Lipofectamine 2000介导转染人黑色素瘤MM-BP细胞，经潮霉素(Hygromycin) 筛选获得阳性细胞株，再通过RT-PCR和Western Blot检测NOX4的干扰效率及细胞周期的变化。本申请与之的不同有: 细胞不同（A375细胞与MM-BP细胞）；载体不同（pSuper.retro.puro与pSilencer hygro）；设计的序列不同；过程不同（本申请经病毒包装和生产，并用嘌呤霉素筛选）。（2）反义核苷酸技术：Brar等应用NOX4的反义核苷酸瞬时转染M1619细胞后，观察细胞生长及增殖能力，但未检测转染后NOX4 mRNA和蛋白表达水平，而且反义核酸介导的是短期效应，不同于稳定转染的细胞株。本申请应用pSuper.retro.puro载体引入外源的NOX4-shRNA，导致A375细胞内同源的NOX4 mRNA特异性的降解, 从而抑制NOX4基因表达，与传统的反义核酸技术相比，具有特异性强、针对性强、级联放大等优点。

附图说明

图1 是NADPH氧化酶的亚基组成图。

图2是图1中NOX亚基的结构图。

图3是针对人NOX4 基因设计的shRNA序列。

图4 是pSuper.retro载体的结构图。

图5是pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA 1重组载体DNA测序图。

图6是pSuper-retro-puro-scramble-shRNA重组载体DNA测序图。

图7是Real-time PCR筛选shRNA干扰效率图。

图8是NOX4和β-actin的Western blot 结果图。

图9是图8的灰度扫描结果图。

图10是A375-WT和A375-NOX4∆细胞的NOX4 mRNA表达结果图。

图11是A375-WT和A375-NOX4∆细胞NOX4的Western blot结果图。

图12是图11的灰度扫描结果图。

图13是分光光度法测定A375-WT和A375- NOX4∆细胞的NADPH氧化酶活性的结果图。

具体实施方式

(1) 选择干扰载体及设计合成shRNA模板DNA

选取携带嘌呤霉素抗性标记的pSuper.retro.puro作为干扰载体。根据人NOX4基因(NM_016931)和pSuper.retro.puro载体的信息，利用BLOCK-iT™ RNAi Designer (http:// rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/design.do)设计3组shRNA

干扰序列（NOX4-shRNA 1、NOX4-shRNA 2、NOX4-shRNA 3）和1组无关对照序列（Scramble-shRNA），每组序列包括2条DNA单链（F链和R链），每条DNA单链含有针对人NOX4基因的正义（Sense）和反义（Antisense）干扰序列、9个核苷酸的Hairpin结构以及两端限制性内切酶Bgl Ⅱ或Hind Ⅲ的酶切位点（图3），并由上海捷瑞公司合成。

(2) shRNA模板DNA插入载体

分别将合成好的F与R链干粉加水稀释为1 μg/μl浓度，取对应的

F与R链各5 μl加入EP管中，95℃水浴5分钟，自然冷却，缓慢降至室温，退火形成DNA双链干扰序列。用Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶消化载体pSuper.retro.puro载体（图4），具体反应体系为：10×NEB 2号 buffer 4 μl，限制性内切酶BglⅡ(10 U/μl) 1 μl，Hind Ⅲ(10 U/μl) 1 μl，pSuper.retro.puro载体20 μl(2 μg)，加水补足至40 μl，37 ℃酶切2 小时，酶切后琼脂糖电泳，切胶回收线性载体。将退火后的双链干扰序列4.5 μl，线性载体pSuper.retro.puro 5 μl，10×Buffer 2 μl，T4 DNA连接酶1 μl，加水补足20 μl，16 ℃过夜连接。

(3) 重组干扰载体转化DH5α感受态细菌并鉴定

取E.coli DH5α感受态细菌100 μl进1.5 ml EP管中，加入10 μl重组干扰载体，冰浴30 分钟，42 ℃水浴90 s后立即冰浴1 min。冰浴后加入37 ℃预热的LB培养基(无氨苄青霉素)700 μl，37 ℃摇床振荡培养1 小时。取适量菌液涂布于LB固体培养基(含氨苄青霉素)上，37 ℃过夜培养。次日观察LB板菌落生长情况，挑选菌落加至200 μl LB培养基(含氨苄青霉素)中，37 ℃摇床振荡培养6 小时后接种细菌于10 ml LB培养基(含氨苄青霉素)中，37 ℃摇床振荡过夜培养。次日观察LB培养基浊度，超净台内取600 μl菌液，加入280 μl甘油混匀，-20 ℃保种，其余菌液按质粒提取试剂盒说明书进行质粒抽提。提取纯化后的重组干扰载体送华大基因公司进行测序，根据测序结果验证重组干扰载体构建是否成功，如图5是pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA 1重组载体DNA测序图，图6是pSuper.retro.puro-scramble-shRNA重组载体DNA测序图。

(4) Lipofectamine 2000介导重组载体瞬时转染A375-WT细胞

胰酶消化A375-WT细胞并计数，5×10⁴ cells/well接种于6孔板中，DMEM(10 % FBS, 无抗生素)培养基培养细胞至汇合度达到90 %。取10 μl Lipofectamine 2000稀释于250 μl DMEM(无血清)培养集中，混匀后室温静置5 分钟。取4 μg重组干扰载体DNA，稀释于250 μl DMEM(无血清)培养集中，混匀。将两种稀释液混匀，室温静置20 分钟。弃去A375-WT培养基，将上述混合液加至6孔板1个孔中，并继续加入无血清DMEM培养基1.5 ml，轻摇6孔板培养版，混匀，置6孔板于培养箱中培养48 小时，培养条件为37 ℃、5% CO₂。

(5) 荧光定量PCR检测瞬时转染后重组载体的干扰效率

细胞内总RNA提取：瞬转后细胞培养于6孔板中，当细胞汇合度达到约80 %时，弃去培养基，加入预冷的1×PBS溶液1 ml 清洗细胞1次，加入RNAiso Plus 1 ml/well，枪头吹打，使细胞充分裂解；室温放置5分钟后转移至1.5 ml EP管(DEPC处理)中，加入氯仿0.2 ml/tube，用力振摇15 s。室温静置5 分钟后，离心(4 ℃, 12000 rpm, 15 分钟)。离心后液体分为三层(无色上清液，中层白色蛋白层和底层红色有机层)。小心吸取上清液并转移至另一支EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，-20℃下静置30 分钟，离心(4 ℃, 12000 rpm, 10 分钟)。弃去上清，加入1 ml 75 ％乙醇，温和振荡悬浮沉淀，离心(4 ℃, 12000 rpm, 5 分钟)，尽量弃去乙醇，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5 分钟。后每管加入20-50 μl水(DEPC处理)溶解。

逆转录合成cDNA：取总RNA 2 ng-2 μg，用Reverse Transcriptase M-MLV逆转录酶，按说明合成cDNA。具体步骤：先在总RNA中加入2 μl随机引物(浓度为25 μM)，加水(DEPC处理)补足至12 μl，混匀，70 ℃温育10 分钟后，冰浴急冷2 min。依次加入RNA酶抑制剂 0.5 μl，5×M-MLV Buffer 4 μl，RTase M-MLV (200 U/μl)0.5 μl，dNTP Mixture (各10 mM )1 μl，加水(DEPC处理)补足至20 μl， 30 ℃反应10 分钟，再42 ℃保温1 小时，最后70 ℃保温15 分钟灭活反转录酶后冰上冷却。

荧光定量PCR：按说明书配置反应体系，上机进行PCR扩增和检测。反应总体系为20 μl，具体是2×Mix SYBR Green I荧光反应液10 μl，上下游引物(10 μM)各0.25 μl，样品模板1 μl，用灭菌水补足20 μl体系。反应条件95 ℃ 2 min预变性，循环内95 ℃ 30 s变性，60 ℃退火35 s，PCR反应设置40个循环，并在每个循环延伸末收集荧光信号，绘制扩增曲线。40个循环后设置(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s)反应步骤，并且对60 ℃到95 ℃ 升温过程进行全程荧光信号收集，绘制融解曲线。用Bio-Rad CFX Manager version 1.6软件进行数据分析(图7)。

(6) Western blot检测瞬时转染后重组载体的干扰效率

细胞总蛋白提取：瞬转后细胞培养于6孔板中，当细胞汇合度达到约80 %时，弃去培养基，预冷的1×PBS溶液1 ml 清洗细胞1次，加入蛋白裂解液 200 μl/well，冰上裂解10 min。收集蛋白裂解液于EP管中。取少量蛋白裂解液用于总蛋白定量，其余蛋白裂解液加入5×SDS上样缓冲液(含0.01 % w/v 溴酚蓝) 50 μl/tube，100 ℃沸水浴5 min变性。

Western Blot：制备12 %分离胶和4 %压缩胶，向加样孔中用加入变性后的蛋白裂解液(总蛋白20 μg)，两端加样孔加入1 μl蛋白Marker。压缩胶60 V电泳30 min，分离胶100 V电泳70 min(电泳过程中观察蛋白Marker条带迁移情况)。电泳结束后， 准备2张滤纸和1张NC膜(其大小、形状与凝胶一致)。将滤纸和NC膜在转膜夹中依次按顺序叠放，排除气泡，将转膜夹置于转膜缓冲液中，低温恒流，300 mA转膜120min。转膜结束后，用5% BSA/TBST溶液，摇床缓慢摇动，封膜1 h。用稀释比例为1:5000的兔抗人NOX4(一抗) 4 ℃过夜孵育。TBST洗膜3次，每次10 min。用稀释比例为1:8000的HRP标记的羊抗兔IgG抗体(二抗)摇床孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。ECL检测，暗室曝光，冲洗胶片，用Bio-Rad Quantity One 4.6.2软件对胶片进行灰度分析。选取β-actin作为内参，Western Blot 步骤同上(图8和图9)。

(7) 重组干扰载体干扰效率筛选

根据荧光定量PCR和Western Blot结果，筛选出干扰效率最高的重组干扰载体pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA 1用于后续构建稳转细胞。

(8) NOX4敲减的A375-NOX4∆稳转细胞株构建

逆转录病毒的包装：转染前1天用胰酶消化处于生长对数生长期的293FT细胞，离心(1000 rpm, 5 min)，用无抗生素的 RPMI-1640(含10 %FBS)培养基重悬细胞，并进行细胞计数。取293FT细胞5×10⁶ cells/dish接种于10 cm培养皿中，加入293FT细胞培养基后，置于培养箱中，37 ℃, 5% CO₂条件下培养。细胞汇合度达到70 %时进行细胞转染，转染前2 h更换新鲜培养基。取一支1.5 ml EP管中制备磷酸钙质粒混合液，配置体系如下： 2×HBS (PH 6.9) 200 μl、 1 M CaCl₂ 50 μl、H₂O 110 μl、病毒包装质粒PIK 20 μg和pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA1质粒 20 μg，混合后室温静置20 min。轻柔地晃动EP管，待溶液混匀后将质粒混合液轻柔加到293FT细胞培养皿中，轻旋平皿，混合。然后，将细胞置于培养箱中，37 ℃, 5% CO₂条件下培养。6 h后取出培养皿，弃去培养基，1×PBS清洗细胞3次，并轻柔地加入8 ml新鲜的293FT培养基，继续培养。细胞转染36-48 h后，收集培养基上清液作为逆转录病毒液，之后每3 h收集1次，共收集3-4次。每次收集的病毒上清液用0.45 μm的滤膜过滤。病毒上清液如在1-2 h内使用则将其置于冰上，如间隔时间较长可置于干冰中冰冻，而后-80℃保存。

逆转录病毒感染A375-WT细胞：病毒感染细胞前，用胰酶消化处于生长对数期的A375-WT细胞，离心(1000 rpm, 5 min)，用无抗生素的 DMEM(10%FBS)培养基重悬细胞，并进行细胞计数。取A375-WT细胞5×10⁵ cells/dish接种于6 cm培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入2 ml温浴后的病毒上清液，加入聚凝胺Polybrane(终浓度为2 μg/ml)。37 ℃, 5% CO₂条件下培养3 h，弃去培养基，更换2 ml病毒上清液继续培养，重复2次。

(9) NOX4敲减的A375-NOX4∆稳转细胞株筛选及鉴定

A375-NOX4∆稳转细胞株筛选：A375-WT细胞经病毒上清液感染3次后，向培养皿中加入无抗生素的 DMEM(10%FBS)培养基，37 ℃, 5% CO₂条件下培养48 h后，弃去培养基，换用DMEM(10 % FBS, 0.5 μg/ml Puromycin)培养基培养并筛选细胞。隔日观察细胞，弃去原培养基及死细胞，1×PBS清洗细胞3次，更换DMEM(10 % FBS, 0.5 μg/ml Puromycin)培养基继续培养细胞，持续10 d。待细胞长满时，消化细胞，接种于10 mm培养皿中扩增培养，传代3次。

荧光定量PCR鉴定A375-NOX4∆稳转细胞株：荧光定量PCR检测A375-NOX4∆稳转细胞内NOX4 mRNA表达水平。总RNA提取、逆转录合成cDNA和荧光定量PCR过程同前(图10)。图10表明筛选所得细胞的NOX4 mRNA和NOX4蛋白分别下降66.11 %和82.63 %，NADPH氧化酶活性下降79.17 %。

Western Blot鉴定A375-NOX4∆稳转细胞株：Western Blot检测A375-NOX4∆稳转细胞内NOX4 蛋白表达水平。细胞内总蛋白提取及变性、Western Blot步骤同前(图11和图12)。

(10) NADPH氧化酶比活性检测

培养细胞，抽提总蛋白，并用BCA法进行蛋白定量。通过分光光度法检测反应体系中NADPH含量的改变，从而检测NADPH氧化酶。NADPH氧化酶活性定义： 在30 ℃条件下，1单位酶在单位时间(1 min)氧化1 μmol NADPH。较A375细胞，A375-NOX4∆稳转细胞NADPH氧化酶活性下降79.17 %(图13)。

F链5'-GATCCCCGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTTCAAGAGAGCTTAGACACAATCCTA GCCCTTTTTA-3'

R链5'-AGCTTAAAAAGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTCTCTTGAAGCTTA GACACAATCCTAGCCCGGG-3'

Claims (2)

1.一种NOX4敲减的A375稳转细胞株，其特征在于是利用逆转录病毒载体pSuper.retro.puro将shRNA模板DNA双链中的F链5'-GATCCCCGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTTCAAGAGAGCTTAGACACAATCCTA GCCCTTTTTA-3'和R链5'-AGCTTAAAAAGGGCTAGGATTGTGTCTAAGCTCTCTTGAAGCTTA GACACAATCCTAGCCCGGG-3'插入进A375细胞基因组，经转录后生成的干扰RNA靶向降解A375细胞内源性NOX4 mRNA，靶向沉默内源性NOX4表达，进而靶向敲减A375细胞内源性NOX4表达80%以上的稳转细胞株。

2.如权利要求1所述的NOX4敲减的A375稳转细胞株，其特征在于其构建方法由以下步骤组成：

(一)、 设计合成shRNA序列

利用BLOCK-iT™ RNAi Designer设计针对人NOX4基因NM_016931的3组shRNA序列NOX4-shRNA 1、NOX4-shRNA 2、NOX4-shRNA 3和1组无关对照序列Scramble-shRNA，每组序列包括2条DNA单链，即F链和R链，每条DNA单链含有针对人NOX4基因的正义和反义干扰序列、9个核苷酸的Loop结构以及两端限制性内切酶Bgl Ⅱ或Hind Ⅲ的酶切位点；所述3组shRNA序列NOX4-shRNA 1、NOX4-shRNA 2、NOX4-shRNA 3和1组无关对照序列Scramble-shRNA的序列如附图3所示；

(二)、 构建逆转录病毒表达载体pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA

按设计合成shRNADNA模板单链F链和R链，退火形成双链模板，用Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切逆转录病毒表达载体pSuper.retro.puro后成为线性质粒；退火后的双链shRNADNA模板与线性载体pSuper.retro.puro在T4 DNA 连接酶作用下连接形成重组载体，重组载体转化E.coli DH5α感受态细菌，将转化菌液涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基平板，过夜培养；挑选阳性菌落扩增培养，提取质粒测序鉴定重组载体pSuper.retro.puro-NOX4-shRNA是否构建成功；

(三)、 pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA载体的干扰效率筛选

Lipofectamine 2000 分别介导重组干扰载体pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA 1, 2, 3和pSuper-retro-puro-scramble-shRNA 瞬时转染A375-WT 细胞，转染48 小时 后收集细胞并提取总RNA和总蛋白，以β-actin 作为内参，分别用于荧光定量PCR 和Western Blot 检测NOX4的表达；

(四)、逆转录病毒包装和生产

病毒包装质粒和重组载体pSuper-retro-puro-NOX4-shRNA 1通过磷酸钙法共转染293FT细胞，6 小时后取出培养皿，弃去培养基，1×PBS清洗细胞3次，并轻柔地加入8 ml新鲜的293FT培养基，继续培养；细胞转染36-48 小时后，收集培养基上清液作为逆转录病毒液，之后每3 小时收集1次，共收集3-4次，每次收集的病毒上清液用0.45 μm的PVDF膜过滤；

(五)、逆转录病毒感染A375细胞

胰酶消化处于生长对数期的A375细胞，离心后用无抗生素的培养基重悬细胞，取5×10⁵个A375细胞接种于培养皿中，待细胞贴壁后，向培养皿中加入2 ml温浴后的病毒上清液，加入聚凝胺Polybrane，终浓度为2 μg/ml，培养3 小时，弃去培养基，更换2 ml病毒上清液继续培养，重复2次；

(六)、A375-NOX4∆稳转细胞筛选和鉴定

A375细胞经病毒上清液感染3次后，向培养皿中加入无抗生素的培养基，培养48小时后，弃去培养基，换用含嘌呤霉素的培养基培养并筛选阳性细胞，隔日观察细胞，弃去原培养基及死细胞，1×PBS清洗细胞3次，更换抗性培养基继续培养细胞，持续筛选10 天，待细胞长满时，消化细胞，接种于10 mm培养皿中扩增培养，传代3次；筛选结束后通过荧光定量PCR和Western Blot检测NOX4 mRNA和蛋白表达；与A375细胞相比，筛选所得细胞的NOX4 mRNA和NOX4蛋白分别下降66.11 %和82.63 %，表明NOX4敲减的A375-NOX4∆稳转细胞株构建成功。

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