CN102864147A

CN102864147A - 与神经增殖迁移功能相关的6种大鼠源miRNA、相应的miRNA前体和反义寡核苷酸及用途

Info

Publication number: CN102864147A
Application number: CN2012103941243A
Authority: CN
Inventors: 顾晓松; 丁斐; 于彬; 李石营; 周松林; 钱天梅; 顾芸
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2012-10-17
Publication date: 2013-01-09
Also published as: CN102329799A

Abstract

本发明提供了六种与大鼠坐骨神经离断过程中神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA、其前体序列和反义寡核苷酸序列，以及其在制备治疗周围神经损伤药物中的用途。

Description

与神经增殖迁移功能相关的6种大鼠源miRNA、相应的miRNA前体和反义寡核苷酸及用途

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，涉及与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，以及在制备治疗神经再生药物中的用途。

技术背景

周围神经损伤是常见的临床病症，而周围神经损伤后能够再生。miRNA（microRNA，微RNA）是一类具有19～25nt的RNA分子，由其前体分子在酶的作用下加工生成，其前体序列一般为70～120nt，广泛存在于生物体中。由于miRNA在各种生物体中具有保守性，因此普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程；在动物机体, miRNA通过转录后调控许多基因和蛋白的表达, 在发育、分化、增殖、细胞的存活与癌变以及神经系统等发挥重要作用。基础和临床研究表明，miRNA无论在正常生理过程还是在疾病过程中都是重要的调节因子。许多miRNA呈现组织特异性表达，因此在调控组织特异性和组织特异性基因的功能中发挥重大作用。近年来的研究发现miRNA与神经再生有着极为密切的关系，例如，miRNA在轴突生长及突触功能和可塑性等方面具有调控作用。

虽然已经在各种生物发现了相当数量的miRNA，但仍不断有许多新的miRNA被挖掘，特别是那些在特定组织或特定阶段表达的miRNA。周围神经损伤和再生过程中, 许多基因和蛋白的表达水平发生改变，而单个miRNA能够调控成千上百个靶基因的表达，因此作为转录后调控的miRNA的发现和功能鉴定对基于miRNA的周围神经损伤的修复具有十分重要的意义。

发明内容

由于各种意外造成的神经损伤的发病率逐年增加；而神经损伤后，再生能力差，致残率高，因此本发明针对神经损伤和治疗的生物分子的发现具有重要的应用价值。

本发明以大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和近端神经为材料进行miRNA的Solexa测序。测序结果经过SOAP软件与大鼠基因组序列比对，MIREAP软件分析miRNA前体的发夹结构，滤掉自由能大于-20 kcal/mol的候选miRNA，基于miRBase17.0过滤掉已报道的miRNA，MiPred软件进一步过滤掉功能上非保守的虚拟的miRNA前体等生物信息学分析，并进一步通过RT-PCR验证。然后对这些新的miRNA进行功能筛选，结果发现了与增殖和迁移有关的miRNA。本发明所提供的miRNA克隆自大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和近端神经，成熟miRNA序列长度约为22nt，其前体序列具有miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA的结构特征。

本发明的目的是提供6种与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，以及该发明所涉及的miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸在制备神经损伤药物中的用途。

本发明的具体技术方案如下：

本发明所提供的与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA序列如下：

1）miRNA-sx1 5’-AACAGGUGAUCUUCAAGUAGA-3’，染色体定位xq21；

2）miRNA-sx2 5’-UGGGGGACAGGGCAAGGUGG-3’，染色体定位1q12；

3）miRNA-sx3 5’-UGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGA-3’，染色体定位19p11；

4）miRNA-sx4 5’-AUGUAAGUGUGUAUGUAUAUG-3’，染色体定位17q12.3；

5）miRNA-sx5 5’-UAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGA-3’，染色体定位1q12；

6）miRNA-sx6 5’-UGAGGAUUACGAAGAGGAUGGU-3’，染色体定位5q35。

据此，本发明所提供的与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA的前体RNA序列如下：

1）5’-CAAUUCUGAAAACAGGUGAUCUUCAAGUAGAAAAAACACAAAAAAGG

CAGUUUUCUAUUUGAAGUCAUCUCUUCUCCCUUUAA-3’；

miRNA-sx2前体：

2）5’-GAGGCCAGUUUGGGGGACAGGGCAAGGUGGGCAGUAGCUGACAGCCU

GUUUACACUUGCCCUUUUUUCCCCAGGCUAUAGUUCGGUUGUGGCAGA-3’；

miRNA-sx3前体：

3）5’-CGGAAUUCACUGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGACAGGAGACUAGAGAGU

CUGCUUUGCCAUCUCUCUUGCAGGCAUGUGCCU-3’；

miRNA-sx4前体：

4）5’-AUGUGUGUAUAUGUAAGUGUGUAUGUAUAUGUGUUUAUAUGAAUAUAC

AUAUACAUACUCACGCACACAUACACGCAA-3’；

miRNA-sx5前体：

5）5’-AUCGAUCCCCAUCCCAGCUUCCUUCCAGCCCUUGAUGUUUCAGUAUG

CACAUAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGAUGGGGAAAGA-3’；

miRNA-sx6前体：

6）5’-UAAAACGGAGUGAGGAUUACGAAGAGGAUGGUGUGGCUUUAAUAUUAG

AACUUUACAGCAUCCUCUUCAUAAUCUUUACUCCGUUUUAC-3’。

据此，本发明所提供的与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA的反义寡核苷酸序列如下：

1）miRNA-sx1反义寡核苷酸 5’-UCUACUUGAAGAUCACCUGUU-3’；

2）miRNA-sx2反义寡核苷酸 5’-CCACCUUGCCCUGUCCCCCA-3’；

3）miRNA-sx3反义寡核苷酸 5’-UCUGCUCUGUCAUUCUACCCACA-3’；

4）miRNA-sx4反义寡核苷酸 5’-CAUAUACAUACACACUUACAU-3’；

5）miRNA-sx5反义寡核苷酸 5’-UCCCCAACCUCUUUCUAGCCUA-3’；

6）miRNA-sx6反义寡核苷酸 5’-ACCAUCCUCUUCGUAAUCCUCA-3’。

本发明提供的miRNA及其前体序列、反义寡核苷酸序列也可采用化学合成的方法得到；为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行硫代修饰或甲氧基修饰，也可采取两种方法结合修饰。

本发明提供的miRNA及其前体序列、反义寡核苷酸序列可用于制备治疗周围神经损伤修复的药物。可以以其单独或混合形式为有效组分配制成非肠道给药制剂，依据给药模式、受害者的体征以适量剂量给药，也可采用基因治疗的方法，以治疗或病毒为表达载体，使其在周围神经损伤部位高效表达。

附图说明

图1为本发明所述的6个miRNA序列。

图2为本发明所述的6个miRNA前体序列。

图3为本发明所述的6个miRNA反义寡核苷酸序列。

图4为本发明所述的6个miRNA RT-PCR电泳结果。

图5为本发明所述的6个miRNA转染施万细胞后对施万细胞迁移的影响图示。

图6为本发明所述的6个miRNA转染施万细胞后对施万细胞迁移的影响结果。

图7为本发明所述的6个miRNA转染施万细胞后对施万细胞增殖的影响图示。

图8为本发明所述的6个miRNA转染施万细胞后对施万细胞增殖的影响结果。

图9为本发明所述的6个miRNA的靶基因双报告基因系统分析结果。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体工艺步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1 动物模型构建和样品制备

成年雄性SD大鼠(180～220g)被麻醉后(10 mg/kg xylazine, 95 mg/kg keUamine, acepromazine 0.7 mg/kg), 左后肢外侧坐骨神经被切开一个1 cm长的切口，然后皮肤被缝合。动物饲养在合适的温度和湿度条件下进行, 每天12 h光照，自由饮水和采食。坐骨神经切断后的0, 1, 4, 7和14天, 处死大鼠, 取大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和坐骨神经缺口处向上0.5 cm的近端神经用于分析。

实施例 2 RNA 提取和 Solexa 测序

（ 1 ） RNA 提取

取大鼠近端神经样品，用Trizol试剂盒（Invitrogen）提取总RNA，操作步骤按Trizol试剂盒自带说明书进行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度计（Amersham Biosciences）测定提取的RNA在260nm（OD₂₆₀）和280nm（OD₂₈₀）波长的吸光度值以确定RNA的纯度和浓度。质量合格的RNA浓度应在1μg/μl以上，OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8-2.0之间，且经电泳检测条带清晰，无明显降解和DNA污染。

（ 2 ）小 RNA 文库的构建

将质量合格的大鼠总RNA用于构建小RNA文库，构建好的文库采用Solexa测序高通量测序（北京基因组研究所）。18～30 nt的小RNA经过凝胶纯化，连接到Solexa测序接头，连接产物被纯化、逆转录和PCR扩增。扩增产物经过凝胶纯化后进行测序，测序得到的图像文件被转换成数字信号，在移去杂质信号和接头序列后，结果被计算机分析处理。

（ 3 ） miRNA 的筛选

从Solexa测序得到的小分子RNA序列首先用SOAP软件与大鼠基因组序列比对(Li R, Li Y, Kristiansen K, Wang J. 2008. SOAP: short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 24:713-714)；MIREAP用来分析候选miRNA的发夹结构(Chen X, Li Q, Wang J, Guo X, Jiang X, Ren Z, Weng C, Sun G, Wang X, Liu Y, Ma L, Chen JY, Wang J, Zen K, Zhang J, Zhang CY. 2009. Identification and characterization of novel amphioxus microRNAs by Solexa sequencing. Genome Biol 10:R78)；滤掉自由能大于-20 kcal/mol的候选miRNA(Wang X, Zhang J, Li F, Gu J, He T, Zhang X, Li Y. 2005. MicroRNA identification based on sequence and structure alignment. Bioinformatics 21:3610-3614)；基于miRBase17.0，过滤掉已报道的miRNA(Griffiths-Jones S, Saini HK, van DS, Enright AJ. 2008. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res 36:D154-D158)；MiPred进一步过滤掉功能上非保守的虚拟的miRNA前体(pre-miRNA)( Jiang P, Wu H, Wang W, Ma W, Sun X, Lu Z. 2007. MiPred: classification of real and pseudo microRNA precursors using random forest prediction model with combined features. Nucleic Acids Res 35:W339-W344)。

（4）RT – PCR 分析

同Solexa测序的小分子RNA用来进行定量RT–PCR分析；10 ng的RNA用茎环逆转录引物（RT-miRNA-sx8）和TaqMan反转录试剂盒(ABI)逆转录到cDNA。然后进行PCR实验，用三蒸水作为阴性模板对照，进行PCR分析，PCR条件为94℃ 30 sec，60℃ 1 min，72℃ 20 sec, 30 cycle。本发明所述的6个miRNA及其前体以及反义寡核苷酸的引物序列如下，图4为对应电泳结果。

引物序列如下：

	引物（5’-3’）
		miRNA-sx1	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTACT
miRNA-sx1前体	CGCTCACAGGTGATCTTCAAGT
		miRNA-sx1 反义寡核苷酸	GTGCAGGGTCCGAGGT
miRNA-sx2	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCACCT
		miRNA-sx2前体	CCTGTGGGGGACAGGGCAA
miRNA-sx2反义寡核苷酸	GTGCAGGGTCCGAGGT
		miRNA-sx3	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCTGCT
miRNA-sx3前体	CCGCGTGTGGGTAGAATGACA
		miRNA-sx3反义寡核苷酸	GTGCAGGGTCCGAGGT
miRNA-sx4	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCATATA
		miRNA-sx4前体	CCGTCGCGTAAGTGTGTATGTATAT
miRNA-sx4反义寡核苷酸	GTGCAGGGTCCGAGGT
		miRNA-sx5	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCCCCA
miRNA-sx5前体	CCGTGCTAGGCTAGAAAGAGGT
		miRNA-sx5反义寡核苷酸	GTGCAGGGTCCGAGGT
miRNA-sx6	GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCATC
		miRNA-sx6前体	CGGTGAGGATTACGAAGAGGA
miRNA-sx6反义寡核苷酸	GTGCAGGGTCCGAGGT

实施例 4 MicroRNA 对施万细胞的作用

用DMEM培养基培养施万细胞，利用Lipofectamine™ RNAiMAX (invitrogen)反转入细胞, 24孔板，miRNA mimics （购自于广州锐博生物科技有限公司）用量为6 pmol, miRNA inhibitor （购自于广州锐博生物科技有限公司）用量为12 pmol, 96孔板 mimics用量为1.2 pmol, inhibitor用量为2.4 pmol, 培养液为无血清的DMEM, 按说明书操作。5-8小时后加含10% 血清的完全培养液。培养36小时后，分别进行迁移和增殖实验。

（1）迁移实验: 运用Transwell小室 (BD公司) 进行迁移实验。首先在小室的下室面包被fibernection，然后将转染miRNA的施万细胞消化后调整细胞密度至1×10⁵种入transwell中，上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。下室采用加入500µl含FBS的培养基。常规培养24 h后结晶紫染色，染色后Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，随机选取10个视野计数细胞个数，结果如图5所示；然后用醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映迁移细胞数，图6为对应结果。

（2）增殖实验: 运用BrdU ELISA KIT (Roche) 进行增殖实验。具体实验步骤根据说明书，简单描述如下，将转染36小时的96孔板中的细胞中加入BrdU标记液，孵育4 h后固定，经一抗及二抗孵育后Leica DC 300F正置荧光显微镜进行观察和拍照，随机选取10个视野计数细胞个数，结果如图7所示；然后在酶标仪上检测其OD值，间接反映增殖细胞数，图8为对应结果。

根据实验结果筛选得到本发明所述的与增殖和迁移有关的6个miRNA。

1）miRNA-sx1 5’-AACAGGUGAUCUUCAAGUAGA-3’，染色体定位xq21；

2）miRNA-sx2 5’-UGGGGGACAGGGCAAGGUGG-3’，染色体定位1q12；

3）miRNA-sx3 5’-UGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGA-3’，染色体定位19p11；

4）miRNA-sx4 5’-AUGUAAGUGUGUAUGUAUAUG-3’，染色体定位17q12.3；

5）miRNA-sx5 5’-UAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGA-3’，染色体定位1q12；

6）miRNA-sx6 5’-UGAGGAUUACGAAGAGGAUGGU-3’，染色体定位5q35。

可根据这6种神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA对应的找到相应的前体RNA，序列如下：

1）5’-CAAUUCUGAAAACAGGUGAUCUUCAAGUAGAAAAAACACAAAAAAGG

CAGUUUUCUAUUUGAAGUCAUCUCUUCUCCCUUUAA-3’；

miRNA-sx2前体：

2）5’-GAGGCCAGUUUGGGGGACAGGGCAAGGUGGGCAGUAGCUGACAGCCU

GUUUACACUUGCCCUUUUUUCCCCAGGCUAUAGUUCGGUUGUGGCAGA-3’；

miRNA-sx3前体：

3）5’-CGGAAUUCACUGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGACAGGAGACUAGAGAGU

CUGCUUUGCCAUCUCUCUUGCAGGCAUGUGCCU-3’；

miRNA-sx4前体：

4）5’-AUGUGUGUAUAUGUAAGUGUGUAUGUAUAUGUGUUUAUAUGAAUAUAC

AUAUACAUACUCACGCACACAUACACGCAA-3’；

miRNA-sx5前体：

5）5’-AUCGAUCCCCAUCCCAGCUUCCUUCCAGCCCUUGAUGUUUCAGUAUG

CACAUAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGAUGGGGAAAGA-3’；

miRNA-sx6前体：

6）5’-UAAAACGGAGUGAGGAUUACGAAGAGGAUGGUGUGGCUUUAAUAUUAG

AACUUUACAGCAUCCUCUUCAUAAUCUUUACUCCGUUUUAC-3’。

据此，可人工合成这6种神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA相应的反义寡核苷酸，序列如下：

1）miRNA-sx1反义寡核苷酸 5’-UCUACUUGAAGAUCACCUGUU-3’；

2）miRNA-sx2反义寡核苷酸 5’-CCACCUUGCCCUGUCCCCCA-3’；

3）miRNA-sx3反义寡核苷酸 5’-UCUGCUCUGUCAUUCUACCCACA-3’；

4）miRNA-sx4反义寡核苷酸 5’-CAUAUACAUACACACUUACAU-3’；

5）miRNA-sx5反义寡核苷酸 5’-UCCCCAACCUCUUUCUAGCCUA-3’；

6）miRNA-sx6反义寡核苷酸 5’-ACCAUCCUCUUCGUAAUCCUCA-3’。

实施例 5 靶基因的确定

（1）靶基因预测

由于miRNA负调控靶基因的表达，并且动物miRNA的靶位点位于mRNA的3'UTR区。根据TargetScan算法(Robin C, et al. Most Mammalian mRNAs Are Conserved Targets of MicroRNAs. Genome Research. 2009, 19: 92-105)，从http://www.targetscan.org下载了所有大鼠基因的3'UTR序列和TargetScan源代码。通过miRNA的2-8位的种子序列和mRNA-3'UTR的比对，预测miRNA的潜在靶位点和靶基因，每个miRNA对应成千上百的靶基因，为了进一步确定靶基因，用与Solexa测序相同的样品进行microarray 表达谱芯片（上海伯豪生物技术有限公司）分析，获得所有基因的变化趋势，根据miRNA与对应靶基因的表达呈负相关，进一步筛选并确定与miRNA表达呈相反变化的靶基因。得到的靶基因被用来进行GO（Gene Ontology）功能富集分析，确定有与迁移和增殖功能相关的靶基因。据上述分析，miRNA-sx1的靶基因为Fgfr2（fibroblast growth factor receptor 2），miRNA-sx2的靶基因为Erbb4（v-erb-a erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 4 (avian)），miRNA-sx3的靶基因为CD44（CD44 molecule (Indian blood group)），miRNA-sx4的靶基因为Astn1（astrotactin 1），miRNA-sx5的靶基因为Cntn2（contactin 2 (axonal)），miRNA-sx6的靶基因为Rac2（ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 (rho family, small GTP binding protein Rac2)）。

（2）靶基因验证

用PCR的方法从小鼠基因组上克隆出与靶基因的3'UTR的全长片段，然后被嵌入用来验证miRNA靶基因的荧光素酶的报告载体pMIR-report的3'UTR端。构建的包含靶基因3'UTR的质粒与相应的miRNA mimics (购自广州锐博生物科技有限公司)共转入细胞，双报告基因系统分析验证了miRNA的靶基因。图9为对应结果。

<110>南通大学

<120>与神经增殖迁移功能相关的6种大鼠源miRNA、相应的miRNA前体和反义寡核苷酸及用途

<160>18

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

AACAGGUGAU CUUCAAGUAG A 21

<210>2

<211>20

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

UGGGGGACAG GGCAAGGUGG 20

<210>3

<211>23

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

UGUGGGUAGA AUGACAGAGC AGA 23

<210>4

<211>21

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

AUGUAAGUGU GUAUGUAUAU G 21

<210>5

<211>22

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

UAGGCUAGAA AGAGGUUGGG GA 22

<210>6

<211>22

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

UGAGGAUUAC GAAGAGGAUG GU 22

<210>7

<211>83

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

CAAUUCUGAA AACAGGUGAU CUUCAAGUAG AAAAAACACA AAAAAGGCAG UUUUCUAUUU GAAGUCAUCU CUUCUCCCUU UAA 83

<210>8

<211>95

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

GAGGCCAGUU UGGGGGACAG GGCAAGGUGG GCAGUAGCUG ACAGCCUGUU UACACUUGCC CUUUUUUCCC CAGGCUAUAG UUCGGUUGUG GCAGA 95

<210>9

<211>82

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

CGGAAUUCAC UGUGGGUAGA AUGACAGAGC AGACAGGAGA CUAGAGAGUC UGCUUUGCCA UCUCUCUUGC AGGCAUGUGC CU 82

<210>10

<211>78

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

AUGUGUGUAU AUGUAAGUGU GUAUGUAUAU GUGUUUAUAU GAAUAUACAU AUACAUACUC ACGCACACAU ACACGCAA 78

<210>11

<211>83

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

AUCGAUCCCC AUCCCAGCUU CCUUCCAGCC CUUGAUGUUU CAGUAUGCAC AUAGGCUAGA AAGAGGUUGG GGAUGGGGAA AGA 83

<210>12

<211>89

<212>RNA

<213>大鼠

<400>

UAAAACGGAG UGAGGAUUAC GAAGAGGAUG GUGUGGCUUU AAUAUUAGAA CUUUACAGCA UCCUCUUCAU AAUCUUUACU CCGUUUUAC 89

<210>13

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>大鼠源miRNA- miRNA-sx1反义寡核苷酸

<400>

UCUACUUGAA GAUCACCUGU U 21

<210>14

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>大鼠源miRNA- miRNA-sx2反义寡核苷酸

<400>

CCACCUUGCC CUGUCCCCCA 20

<210>15

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>大鼠源miRNA- miRNA-sx3反义寡核苷酸

<400>

UCUGCUCUGU CAUUCUACCC ACA 23

<210>16

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>大鼠源miRNA- miRNA-sx4反义寡核苷酸

<400>

CAUAUACAUA CACACUUACA U 21

<210>17

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>大鼠源miRNA- miRNA-sx5反义寡核苷酸

<400>

UCCCCAACCU CUUUCUAGCC UA 22

<210>18

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>大鼠源miRNA- miRNA-sx6反义寡核苷酸

<400>

ACCAUCCUCU UCGUAAUCCU CA 22

Claims

1.与神经增殖迁移功能相关的大鼠源miRNA，具有如下核苷酸序列：

1）miRNA-sx1 5’-AACAGGUGAUCUUCAAGUAGA-3’，染色体定位xq21；

2）miRNA-sx2 5’-UGGGGGACAGGGCAAGGUGG-3’，染色体定位1q12；

3）miRNA-sx3 5’-UGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGA-3’，染色体定位19p11；

4）miRNA-sx4 5’-AUGUAAGUGUGUAUGUAUAUG-3’，染色体定位17q12.3；

5）miRNA-sx5 5’-UAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGA-3’，染色体定位1q12；

6）miRNA-sx6 5’-UGAGGAUUACGAAGAGGAUGGU-3’，染色体定位5q35。

2.如权利要求1所述的大鼠源miRNA的前体RNA，具有如下核苷酸序列：

1）miRNA-sx1前体：

5’-CAAUUCUGAAAACAGGUGAUCUUCAAGUAGAAAAAACACAAAAAAGG

CAGUUUUCUAUUUGAAGUCAUCUCUUCUCCCUUUAA-3’；

2）miRNA-sx2前体：

5’-GAGGCCAGUUUGGGGGACAGGGCAAGGUGGGCAGUAGCUGACAGCCU

GUUUACACUUGCCCUUUUUUCCCCAGGCUAUAGUUCGGUUGUGGCAGA-3’；

3）miRNA-sx3前体：

5’-CGGAAUUCACUGUGGGUAGAAUGACAGAGCAGACAGGAGACUAGAGAGU

CUGCUUUGCCAUCUCUCUUGCAGGCAUGUGCCU-3’；

4）miRNA-sx4前体：

5’-AUGUGUGUAUAUGUAAGUGUGUAUGUAUAUGUGUUUAUAUGAAUAUAC

AUAUACAUACUCACGCACACAUACACGCAA-3’；

5）miRNA-sx5前体：

5’-AUCGAUCCCCAUCCCAGCUUCCUUCCAGCCCUUGAUGUUUCAGUAUG

CACAUAGGCUAGAAAGAGGUUGGGGAUGGGGAAAGA-3’；

6）miRNA-sx6前体：

5’-UAAAACGGAGUGAGGAUUACGAAGAGGAUGGUGUGGCUUUAAUAUUAG

AACUUUACAGCAUCCUCUUCAUAAUCUUUACUCCGUUUUAC-3’。

3.如权利要求1所述的大鼠源miRNA的反义寡核苷酸，具有如下核苷酸序列：

1）miRNA-sx1反义寡核苷酸 5’-UCUACUUGAAGAUCACCUGUU-3’；

2）miRNA-sx2反义寡核苷酸 5’-CCACCUUGCCCUGUCCCCCA-3’；

3）miRNA-sx3反义寡核苷酸 5’-UCUGCUCUGUCAUUCUACCCACA-3’；

4）miRNA-sx4反义寡核苷酸 5’-CAUAUACAUACACACUUACAU-3’；

5）miRNA-sx5反义寡核苷酸 5’-UCCCCAACCUCUUUCUAGCCUA-3’；

6）miRNA-sx6反义寡核苷酸 5’-ACCAUCCUCUUCGUAAUCCUCA-3’。

4.如权利要求1-3所述的核苷酸，其特征在于对该序列进行了硫代修饰、甲氧基修饰或两者的结合修饰。

5.如权利要求1-3所述的核苷酸，其特征在于该序列通过化学合成获得。

6.如权利要求1-3所述的核苷酸，其特征在于该序列通过构建真核细胞表达载体进行表达获得。

7.如权利要求6所述的核苷酸，其特征在于所述载体为质粒载体或病毒载体。

8.如权利要求3所述的反义寡核苷酸，该核苷酸选自DNA或RNA。

9.如权利要求1-3所述核苷酸序列在制备治疗周围神经损伤药物中的用途。