CN106811485A - Bancr基因过表达慢病毒载体、bancr慢病毒及构建方法和应用 - Google Patents

Bancr基因过表达慢病毒载体、bancr慢病毒及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种BANCR基因过表达慢病毒载体、BANCR慢病毒及构建方法和应用，涉及分子生物学的技术领域。本发明提供的BANCR基因过表达慢病毒载体，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，并整合有BANCR基因，解决了BANCR基因研究中所需要的过表达载体的技术问题，使BANCR基因研究更直观；本发明提供的BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，流程简单，阳性率高；本发明提供的BANCR慢病毒具备良好的生物安全性；此外，本发明还提供了BANCR慢病毒的构建方法及BANCR基因过表达慢病毒载体和/或BANCR慢病毒在制备BANCR基因过表达细胞中的应用。

Description

BANCR基因过表达慢病毒载体、BANCR慢病毒及构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种BANCR基因过表达慢病毒载体、BANCR慢病毒及构建方法和应用。
背景技术
目的基因过表达是研究基因功能常用的手段之一。将目的基因通过转染(包括电转染、脂质体转染等)、显微注射或病毒感染等方法将外源基因导入细胞内，从而建立目的基因过表达的稳定细胞系，可广泛应用于生物学研究。
慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转染效率。
慢病毒是一种分子生物学中对基因功能研究常见的工具质粒，能高效转染原核以及真核细胞，使细胞能够合成并且表达目的基因，通过对比目的基因在细胞内表达与否或者表达强度，实现对目的基因在细胞甚至机体功能中的作用进行验证和分析。因此，慢病毒在研究基因在细胞及机体功能中的应用极为广泛。
遗传学的“中心法则”描述了遗传信息从DNA通过RNA到相应蛋白质的信息流途径。几十年来，传统观点认为DNA是遗传物质的储存载体，基因要通过其表达的相应蛋白质来发挥作用。随着人类基因组计划的顺利完成，人们发现仅仅一小部分基因为蛋白编码基因，而90％以上的人类基因都已经发生了转录，这表明众多数量的转录本是不编码蛋白质的，这部分转录本被称为“非编码RNA”(non－coding RNA，ncRNA)。结构ncRNA在蛋白质翻译过程中发挥重要作用，包括转移RNA(transfer RNA，tRNA)，核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)，小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)和核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)；调节ncRNA包括小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，微小RNA(micro RNA，miRNA)，piwi蛋白相互作用的RNA(piwi－interacting RNAs，piRNAs)和长链非编码(long noncodingRNA，lncRNA)。lncRNA长度在200个核苷酸以上，大部分lncRNA被视为缺乏蛋白质编码的能力，极小部分lncRNA被证实可以编码一些小肽段。研究发现lncRNA可通过表观遗传、转录和转录后及代谢等多层面参与蛋白编码基因和非蛋白编码基因的表达调控。lncRNA在正常细胞分化、发育及人类疾病发生发展过程中发挥重要作用，包括恶性肿瘤。
BRAF活化的非编码RNA(BRAF－activated non－protein coding RNA，BANCR)是一种与黑色素瘤发生发展密切相关的lncRNA。该基因定位于染色体9q21.11，含4个外显子，BANCR是来自内含子的转录产物，长约693nt，在BRAFV600E突变的黑色素瘤细胞及黑色素瘤组织中高表达。体内外研究发现BANCR可通过激活ERK1/2和JNK MAPK信号转导通路参与黑色素瘤细胞的增殖调控，但是BANCR与MAPK信号转导通路之间的关系尚未完全阐明。此外，研究还发现BANCR可通过调控CXCL11基因的表达参与黑色素瘤细胞的迁移。鉴于BANCR在恶性黑色素瘤中的表达具有组织特异性及稳定性，可作为潜在的肿瘤诊断和肿瘤靶向治疗的生物学标记物。
在目前的国内外尚未见到BANCR基因过表达慢病毒载体及其相关研究的报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种BANCR基因过表达慢病毒载体，以解决BANCR基因研究中所需要的过表达载体的技术问题；
本发明的第二个目的在于提供一种BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，以构建BANCR基因过表达慢病毒载体；
本发明的第三个目的在于提供一种BANCR慢病毒；
本发明的第四个目的在于提供一种BANCR慢病毒的构建方法；
本发明的第五个目的在于提供一种BANCR基因过表达慢病毒载体和/或BANCR慢病毒在制备BANCR基因过表达细胞中的应用。
本发明提供的一种BANCR基因过表达慢病毒载体，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，并整合有BANCR基因，得到BANCR基因过表达慢病毒载体。
本发明还提供了一种BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，该方法包括：
将利用PCR扩增人工合成的BNACR基因插入到基因转移载体中，得到重组连接产物，用重组连接产物转化感受态细胞，并进行鉴定，鉴定为阳性且序列无误的即为构建成功的BANCR基因过表达慢病毒载体。
进一步地，所述BANCR基因的上下游引物序列分别为：
BANCR－F：AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCATTCCCTTACTTTCTTAATAAAC(SEQ ID NO.2)
BANCR－R：GATCCATCCCTAGGTAGATGCATTTTTTTTTTTTTTAGGATTTTTTA(SEQ IDNO.3)。
进一步地，所述BANCR基因的上下游引物分别设有NotI和NsiI两侧同源序列，用于慢病毒载体的亚克隆。
进一步地，所述插入到基因转移载体中使用的试剂盒为EntryOne Step Cloning Kit试剂盒。
进一步地，所述基因转移载体为经过NotI和NsiI双酶切的表达绿色荧光蛋白的LV5。
本发明还提供了一种BANCR慢病毒的构建方法，使用包装质粒对上述的BANCR基因过表达慢病毒载体进行包装，通过转染293T细胞，得到BANCR慢病毒。
进一步地，所述包装质粒为pGag/Pol、pRev和pVSV－G。
本发明还提供了一种BANCR慢病毒，应用上述的BANCR慢病毒的构建方法构建得到。
本发明还提供了上述的BANCR基因过表达慢病毒载体和/或上述的BANCR慢病毒在制备BANCR基因过表达细胞中的应用。
本发明提供的BANCR基因过表达慢病毒载体，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，能够准确追踪载体进入细胞内的位置，并且能够了解不同环境下BANCR基因的强弱表达，使BANCR基因研究更直观。本发明提供的BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，流程简单，阳性率高。本发明提供的BANCR慢病毒具备良好的生物安全性，可直接用于感染其他的细胞株，进行体外机制研究；或者筛选稳定株，用于体内功能研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的LV5质粒的物理图谱；
图2为本发明实施例2提供的已插入BANCR的重组载体图；
图3为本发明实施例3提供的PCR扩增的目的基因BANCR的测序结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种BANCR基因过表达慢病毒载体，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，并整合有BANCR基因，得到BANCR基因过表达慢病毒载体。
BANCR基因为人LncRNA BANCR基因(Gene ID：100885775)，基因序列如下(SEQ IDNO.1)：
ATTCCCTTACTTTCTTAATAAACTCGCTTTCACTTTATGGATTCAACTGTAATTCTTTCTTGTGTGAGATCCAAGAACCTTCTTGTAGGGTCTGGATTGGGACCCTTTTCTGGTAACATCTTCCTGGTGACCATGAAGGGACAATACTGAAGAGACCCCTGACCCTAAGGAAATAGACTGCAGCACCAATGGGCCAACTTTGGGGCGATCATCTTGCCCAGAAACATCATGTTGAAACTCTTGGTCAGAGGTTGGATGAAAGCTGACAGGGTCCATCCAGGAGCAAGTTTGAGCCTTGCCAGTTCCATTTTGGGTGCTGAGTGGAGTGGCGACTATAGCAAACCTGTGATCTCTGGCTGCTGCTCAGAAGAAACAAGAGGGAGGGATGAATAATGTAAAACTCTGGATCAATATTCTAATTCTGAGCCTCTATTGGAATCAGCTAGCAACCACATATCAGCTTGGTTTCAACAGTTTCCCAGTTCATGCTGCTGAGAAGTTCAGAGTCAAACCTGAATCTCACCTCTGCAAAGAGCACAGGACTCCATGGCAAACGTTGTATATACGCAAGTCATCCCTGGCACCACATTGATTTACTGCACCAGGCTTTCTTCATTGTGATGATGTTCTCTCTCTTTTCTAAAAAAAAAATAAAAATAAAATTTAAAAAATCCTAAAAAAAAAAAAA
LV5载体是基于HIV1构建的慢病毒基因过表达载体，采用EF1a启动子启动目的基因的表达。EF1a启动子来源于人类靶向延长因子1α(EF1A)基因，可在多种细胞中稳定表达。载体中荧光GFP基因具有独立的启动子CMV。既保留了GFP的作用，也避免了融合标签蛋白对目的基因功能产生影响。
本发明提供的BANCR基因过表达慢病毒载体，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，能够准确追踪载体进入细胞内的位置，并且能够了解不同环境下BANCR基因的强弱表达，使BANCR基因研究更直观。
本发明还提供了一种BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法：将利用PCR扩增合成的BNACR基因，重组克隆到基因转移载体中，得到重组连接产物，用重组连接产物转化感受态细胞，并进行鉴定，鉴定为阳性且序列无误的即为构建成功的BANCR基因过表达慢病毒载体。
本发明中，BANCR基因的上下游引物序列分别为：
BANCR－F：AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCATTCCCTTACTTTCTTAATAAAC(SEQ ID NO.2)
BANCR－R：GATCCATCCCTAGGTAGATGCATTTTTTTTTTTTTTAGGATTTTTTA(SEQ IDNO.3)。
本发明中，BANCR基因的上下游引物分别设有NotI和NsiI两侧同源序列，保护碱基酶切位点修饰，用于慢病毒载体的亚克隆。
将BANCR基因引物进行PCR反应，反应完成后，利用Agarose电泳并切胶回收BANCR基因片段。
本发明中，基因转移载体为经过NotI和NsiI双酶切的表达绿色荧光蛋白的LV5。
经过双酶切的LV5为线性化载体，将线性化的LV5通过Agarose电泳及DNA凝胶回收试剂盒进行回收。
本发明中，重组克隆中使用的试剂盒为Entry One StepCloning Kit试剂盒。
本发明中，用重组连接产物转化的感受态细胞为DH5α感受态细胞。待细菌复苏后，涂于LB平板上。从培养好的平板上挑取单独、饱满的菌落，培养菌液。将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104－02)抽提质粒，将抽提好的质粒进行双酶切鉴定。在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。取阳性克隆对应的菌液送测序，与目的基因序列进行比对，正确无误，即构建成功BANCR基因过表达慢病毒载体。
本发明还提供了一种BANCR慢病毒的构建方法，使用包装质粒对上述的BANCR基因过表达慢病毒载体进行包装，通过转染293T细胞，得到BANCR慢病毒。
在本发明中，BANCR慢病毒的包装滴度为108。
本发明中，包装质粒为pGag/Pol、pRev和pVSV－G。
本发明还提供了一种BANCR慢病毒，应用上述的BANCR慢病毒的构建方法构建得到。
本发明中，慢病毒表达系统包含四种质粒体系，四种质粒体系包括一种转移载体和三种辅助质粒，转移载体包含转移目的基因人LncRNA BANCR基因等慢病毒骨架及其包装产生相应基因组RNA的所有顺式作用元件。慢病毒通过顺式作用元件将病毒运送入细胞核，将所要表达的基因序列重组整合到细胞的基因组中，从而实现目的序列持续稳定的高表达；另外，通过三种辅助质粒pGag/Pol、pRev和pVSV－G，提供病毒包装所需的反式作用因子，同时采用“自我灭活”修饰，阻止子代病毒自我复制和转移，从而确保产生的慢病毒具备良好的生物安全性。
本发明还提供了上述的BANCR基因过表达慢病毒载体和/或上述的BANCR慢病毒在制备BANCR基因过表达细胞中的应用。
本发明中，BANCR基因过表达细胞应用慢病毒过表达系统构建成功，应用于制备BANCR基因过表达细胞中，与传统的电转染、脂质体转染等物理化学转染方法相比，除了保证良好的生物安全性，更具高效性和稳定性。
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中所使用的氨基酸均购自上海吉尔公司，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品，无特殊来源。
实施例1
选择过表达载体及合成人LncRNA BANCR基因全序列
选取表达绿色荧光蛋白的LV5作为过表达载体，合成人LncRNA BANCR基因序列所需的PCR引物通过oligo在线软件设计(http：//www.oligo.net/)，上下游引物分别加上LV5载体上NotI和NsiI两侧同源序列，用于载体的亚克隆。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。
将合成的引物稀释成50μM后，进行PCR反应，反应体系如下：
试剂 体积(μl)
LncRNA BANCR模版 1
5
上游引物BANCR－F 1
下游引物BANCR－R 1
dNTP 1
41
Pfu DNA polymerase 0.3
循环条件如下：
PCR反应完成后，利用Agarose电泳，并切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的片段条带，回收人LncRNA BANCR基因片段。
实施例2
目的基因人LncRNA BANCR克隆到载体LV5中
对LV5载体进行双酶切：在无菌的0.2mL EP反应管，取LV5载体15μL，用NotI和NsiI限制性内切酶进行双酶切，酶切体系按照说明书配制如下：
试剂 体积(μl)
10×Buffer 5
DNA 15
NotI 1
NsiI 1
28
将上述体系混匀后，37℃反应2h。此时，经过双酶切的LV5为线性化载体，将线性化的LV5通过Agarose电泳及DNA凝胶回收试剂盒进行回收。利用Entry OneStep Cloning Kit，将实施例1中扩增回收好的人LncRNA BANCR基因片段，重组克隆到线性化的LV5载体中，反应体系如下：
试剂 体积(μl)
5×CE Entry Buffer 4
LV5 1
LncRNA BANCR 2
Exnase Entry 2
11
使用移液器上下吹打上述混合物数次，轻轻混匀各组分。置于37℃反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min备用。LV5质粒的物理图谱如图1所示。已插入BANCR的重组载体如图2所示，从图2中可看到BANCR的插入位置。
实施例3
重组过表达载体转化DH5α感受态细胞并鉴定
重组连接产物的转化：将装有感受态细胞DH5α的离心管冰上放置4min，待感受态细胞解冻后，加入10μl重组连接产物，轻柔混匀内容物，在冰中放置30min。将离心管放到预加温到42℃的水浴锅中放好的试管架上，放置90s，不要摇动离心管。快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却3min。向每支离心管加入800μl LB培养基(不含抗生素)，然后将离心管转移到37℃摇床，250rpm，培育45min使细菌复苏。取200μl培育后的细胞均匀涂布于含50μg/ml Ampicillin LB平板上。等平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16h。从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，置于含有5ml(含50μg/ml Ampicillin)LB培养基的试管中，将上述试管置于细菌摇床中培养，37℃，250rpm，培养16h。将培养好的菌液，用质粒小提试剂盒(天根生化，DP104－02)抽提质粒，将抽提好的质粒进行双酶切鉴定。酶切37℃，1h后电泳，在目的条带大小对应区域有酶切得到的条带对应的克隆即为阳性克隆。取200μl阳性克隆对应的菌液送测序，并将剩余的菌液用甘油保存。将测序结果与目的基因序列进行比对，正解无误，显示重组载体构建成功，如图3所示。此外，用保存的甘油菌液接菌LB培养基，进行大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒。
实施例4
慢病毒包装、收集及滴度检测
病毒包装：将对数生长期的293T细胞接种至15cm培养皿，加入18ml含10％FBS的DMEM培养液，混匀后置于37℃，5％CO2培养箱培养过夜。次日，在一支无菌的5ml离心管中加入1.5ml无血清DMEM，按比例加入含目的序列的重组质粒和包装质粒pGag/Pol、pRev和pVSV－G，混匀，取另一支无菌的5ml离心管，加入1.5ml无血清DMEM，再加入300ul RNAi－Mate，混匀，室温放置5min后将两管混合，室温放置20－25min。除去15cm培养皿中的培养液，加入8ml无血清的DMEM培养液。将转染混合物逐滴加入15cm培养皿中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物，在37℃，5％CO2培养箱中温育4－6h。吸弃转染液，加入18ml含10％FBS的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养箱继续培养72h。
病毒收集：将培养皿中细胞上清液吸到50ml离心管中，4℃，4000rpm，4min。低速离心后，将离心管上清液倒入50ml注射器内，用0.45um过滤器过滤。滤液在离心机中进行超速离心，4℃，20000rpm，2h。将浓缩液收集分装至冻存管中。分装的病毒液贴上标签，－80℃冰箱保存。
病毒滴度检测：取对数生长期的293T细胞，按3×104个细胞/孔的浓度接种于96孔板，混匀后于37℃，5％CO2培养箱培养24h。次日，将慢病毒原液10μl，用10％FBS的DMEM培养液十倍稀释3－5个梯度。吸去96孔板中的培养液，每孔加入100μl稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37℃，5％CO2培养箱培养24h。吸弃96孔板中的稀释病毒液，每孔加入100μl10％FBS的DMEM培液，于37℃，5％CO2培养箱继续培养72h。通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。
病毒滴度(BT＝TU/ml，transducing units)计算公式：TU/μl＝(P×N/100×V)×1/DF，其中，P＝％GFP+cells，N＝转染时的细胞数，V＝每孔加入病毒稀释液体积(μl)，DF＝稀释因子(dilution factor)＝1(undiluted)、10－1(diluted 1/10)、10－2(diluted 1/100)。
实施例5
慢病毒感染A375细胞
取对数生长期的A375细胞，按2.5×105个细胞/孔的浓度接种于24孔板中，加入500μl完全培养液，37℃，5％CO2培养箱培养过夜；次日，制备病毒稀释液(DMEM培养基400ul+终浓度5ug/ml Polybrene)，将实施例4包装的慢病毒原液按1：9加入到稀释液中，将稀释液加入到细胞培养孔中，37℃，5％CO2培养箱培养过夜。12－24h后移去细胞侵染后的病毒液，加入500μl完全培养液，37℃，5％CO2培养箱继续培养24－48h，在荧光倒置显微镜下观察结果。培养48h后，荧光倒置显微镜下可见绝大多数细胞呈现较强的绿色荧光，提示重组慢病毒载体成功感染A375细胞。
实施例6
慢病毒感染SW480细胞
取对数生长期的SW480细胞，按3.0×105个细胞/孔的浓度接种于24孔板中，加入500μl完全培养液，37℃，5％CO2培养箱培养过夜；次日，制备病毒稀释液(DMEM培养基400ul+终浓度10ug/ml Polybrene)，将实施例4包装的慢病毒原液按1：9加入到稀释液中，将稀释液加入到细胞培养孔中，37℃，5％CO2培养箱培养过夜。12－24h后移去细胞侵染后的病毒液，加入500μl完全培养液，37℃，5％CO2培养箱继续培养24－48h，在荧光倒置显微镜下观察结果。培养48h后，荧光倒置显微镜下可见绝大多数细胞呈现较强的绿色荧光，提示重组慢病毒载体成功感染SW480细胞。
由以上结果可知，本发明提供的BANCR基因过表达慢病毒载体及BANCR慢病毒构建成功。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明医科大学
<120> BANCR基因过表达慢病毒载体、BANCR慢病毒及构建方法和应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 688
<212> DNA
<213> 智人种（Homo sapiens）
<400> 1
attcccttac tttcttaata aactcgcttt cactttatgg attcaactgt aattctttct 60
tgtgtgagat ccaagaacct tcttgtaggg tctggattgg gacccttttc tggtaacatc 120
ttcctggtga ccatgaaggg acaatactga agagacccct gaccctaagg aaatagactg 180
cagcaccaat gggccaactt tggggcgatc atcttgccca gaaacatcat gttgaaactc 240
ttggtcagag gttggatgaa agctgacagg gtccatccag gagcaagttt gagccttgcc 300
agttccattt tgggtgctga gtggagtggc gactatagca aacctgtgat ctctggctgc 360
tgctcagaag aaacaagagg gagggatgaa taatgtaaaa ctctggatca atattctaat 420
tctgagcctc tattggaatc agctagcaac cacatatcag cttggtttca acagtttccc 480
agttcatgct gctgagaagt tcagagtcaa acctgaatct cacctctgca aagagcacag 540
gactccatgg caaacgttgt atatacgcaa gtcatccctg gcaccacatt gatttactgc 600
accaggcttt cttcattgtg atgatgttct ctctcttttc taaaaaaaaa ataaaaataa 660
aatttaaaaa atcctaaaaa aaaaaaaa 688
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agggttccaa gcttaagcgg ccgcattccc ttactttctt aataaac 47
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatccatccc taggtagatg catttttttt ttttttagga tttttta 47

Claims (10)

1.一种BANCR基因过表达慢病毒载体，其特征在于，以表达绿色荧光蛋白的LV5慢病毒过表达载体为基础进行构建，并整合有BANCR基因，得到BANCR基因过表达慢病毒载体。
2.权利要求1所述的BANCR基因过表达慢病毒载体的构建方法，其特征在于，该方法包括：
将利用PCR扩增合成的BANCR基因，插入到基因转移载体中，得到重组连接产物，用重组连接产物转化感受态细胞，并进行鉴定，鉴定为阳性且序列无误的即为构建成功的BANCR基因过表达慢病毒载体。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述BANCR基因的上下游引物序列分别为：
BANCR－F：AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCATTCCCTTACTTTCTTAATAAAC(SEQ ID NO.2)
BANCR－R：GATCCATCCCTAGGTAGATGCATTTTTTTTTTTTTTAGGATTTTTTA(SEQ ID NO.3)。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述BANCR基因的上下游引物分别设有NotI和NsiI两侧同源序列，用于慢病毒载体的亚克隆。
5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述插入到基因转移载体中使用的试剂盒为Entry One Step Cloning Kit试剂盒。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因转移载体为经过Not I和NsiI双酶切的表达绿色荧光蛋白的LV5。
7.一种BANCR慢病毒的构建方法，其特征在于，使用包装质粒对权利要求1所述的BANCR基因过表达慢病毒载体进行包装，通过转染293T细胞，得到BANCR慢病毒。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述包装质粒为pGag/Pol、pRev和pVSV－G。
9.一种BANCR慢病毒，其特征在于，应用权利要求8所述的BANCR慢病毒的构建方法构建得到。
10.权利要求1所述的BANCR基因过表达慢病毒载体和/或权利要求9所述的BANCR慢病毒在制备BANCR基因过表达细胞中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111321170A (zh) * 2020-03-13 2020-06-23 昆明医科大学 Mbp基因过表达型小胶质细胞及其制备方法和应用
WO2023137260A3 (en) * 2022-01-14 2023-08-31 Rosebud Biosciences, Inc. Bancr compositions and methods for treating disease

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695414A (zh) * 2016-03-10 2016-06-22 浙江大学 一株稳定表达eml4-alk基因的肺癌细胞株及其构建方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105695414A (zh) * 2016-03-10 2016-06-22 浙江大学 一株稳定表达eml4-alk基因的肺癌细胞株及其构建方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙兆刚: "人肌细胞增强因子2C 基因慢病毒载体的构建", 《中华临床医师杂志( 电子版)》 *
曾雅畅: "人β－地中海贫血CD41－42型突变基因慢病毒载体的构建和293T 的转染", 《遗传与优生》 *
李春梅: "肝癌相关抗原Cdc25C 过表达树突状细胞", 《广东医学》 *
李静辉: "冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）慢病毒过表达", 《畜牧生物技术》 *
赵元淑: "大鼠 GAD65 基因慢病毒载体的构建及其在 MSCs 中的表达", 《中风与神经疾病杂志》 *
郭勤浩: "长链非编码RNA BANCR在结直肠癌中的功能研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111321170A (zh) * 2020-03-13 2020-06-23 昆明医科大学 Mbp基因过表达型小胶质细胞及其制备方法和应用
WO2023137260A3 (en) * 2022-01-14 2023-08-31 Rosebud Biosciences, Inc. Bancr compositions and methods for treating disease

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