CN110846318A - 治疗hpv感染的纳米粒制剂中新的靶向序列以及新pbae的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于敲降或敲除HPV的靶向序列，还提供了用于靶向敲降或敲除HPV的重组质粒，还提供了一种用于治疗HPV感染的纳米粒制剂，还提供了一种制备聚(β氨基酯)聚合物的方法。本发明提供的靶向序列针对九种HVP亚型，并使用这些靶向序列构建了靶向敲降/敲除质粒，可有效地敲降/敲除被转染的细胞中的相应HPV。本发明制备的新PBAE可高效地将DNA转染至目标细胞内，并且具有更低的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及生物药物制剂领域，更特别地，涉及一种用于敲降或敲除HPV的靶向序列，还涉及用于靶向敲降或敲除HPV的重组质粒，还涉及一种用于治疗HPV感染的纳米粒制剂，还涉及一种制备聚(β氨基酯)聚合物的方法。
背景技术
宫颈癌严重危害妇女健康，占全世界女性恶性肿瘤疾病的第三位。超过85％的宫颈癌新发病例和癌症致死病例出现在发展中国家(Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.)。
近年来，随着基础医学的不断进展，出现了一系列新的具有靶向敲降或敲除HPV的重组质粒DNA，包括靶向敲降HPV的短发夹RNA(shRNA)重组质粒DNA、规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)重组质粒DNA等。
但是，该敲降/敲除技术面临两个问题，一是要求高效而精准的靶向，另外一个是要求载剂能够有效透过组织屏障和细胞屏障。
我们在2015年提交了申请号为2015109993917的专利中，公开了一种治疗HPV感染的纳米粒制剂，具有转染效率和特异性高的优点。在此基础上，我们进一步研究，改进了靶向序列和聚合物的制备方法，获得了新的可用于治疗HPV感染的纳米粒制剂。
发明内容
基于以上研究，本发明提供了一种用于敲降或敲除HPV的靶向序列，序列如SEQ IDNO:1-45之一所示。
本发明还提供了一种用于靶向敲降或敲除HPV的重组质粒，所述重组质粒包含上述靶向序列。
在一个具体实施方案中，所述重组质粒为CRISPR质粒，每个所述CRISPR质粒包含SEQ ID NO:1-27之一所示的序列作为靶向序列。
在一个具体实施方案中，所述重组质粒为shRNA质粒，每个所述shRNA质粒包含SEQID NO:28-45之一所示的序列作为靶向序列。
本发明还提供了一种用于治疗HPV感染的纳米粒制剂，所述纳米制剂包括上述重组质粒和聚(β氨基酯)聚合物。
在一个具体实施方案中，所述聚(β氨基酯)聚合物与所述重组质粒的质量比为20:1-40:1。
本发明还提供了一种制备聚(β氨基酯)聚合物的方法，包括以下步骤：
S1：使1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇溶解在溶剂中反应得到反应体系；
S2：使所述反应体系在避光条件下在65-75℃下反应，得到基础聚合物；
S3：将所述基础聚合物与1,4-丁二醇二丙烯酸酯的DMF的溶液反应，得到所述聚(β氨基酯)聚合物。
在一个优选实施方案中，S1中，1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇溶解在溶剂N,N-二甲基甲酰胺中得到所述反应体系。
在一个优选实施方案中，S2中，所述反应体系缓慢升温至65-75℃，在连续搅拌反应48小时。
在一个优选实施方案中，S3中，所述基础聚合物的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪的摩尔比为1：4至1:6。
本发明提供了针对九种HVP亚型的靶向序列，并使用这些靶向序列构建了靶向敲降/敲除质粒，可有效地敲降/敲除被转染的细胞中的相应HPV。本发明制备的新PBAE可高效地将DNA转染至目标细胞内，并且具有更低的细胞毒性。
附图说明
图1为本发明的新PBAE在不同的PBAE-DNA质量比(20:1、30:1、40:1)下的细胞毒性统计图，以空白和以前的PBAE(60:1)做对照；
图2为本发明的新PBAE在不同的PBAE-DNA质量比(20:1、30:1、40:1)下的转染效率统计图，以空白和以前的PBAE(60:1)做对照；
图3为转染HPV16-CRISPR-1和HPV16-shRNA-1对SiHa细胞增殖的影响；
图4为转染HPV18-CRISPR-1和HPV18-shRNA-1对Hela细胞增殖的影响；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.制备聚(β氨基酯)聚合物
步骤1：用电子天平称取1,4-丁二醇二丙烯酸酯2.18克(11mmol)于烧杯中，加入2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，超声溶解，搅拌至分散均匀。
步骤2：称取4-氨基-1-丁醇0.89g(10mmol)于烧杯中，加入适量的DMF，超声溶解，搅拌至分散均匀。得到的溶液与步骤1的溶液混合，补DMF至总体积18.38mL，使所称取的1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇的摩尔比为1.1:1，密度为167mg/mL。在研究中意外的发现，该摩尔比可做出较好的效果。
步骤3：将步骤1和步骤2中的溶液一起加入到避光玻璃烧瓶中，烧瓶放入恒温磁力搅拌油浴锅中，烧瓶中的液体放入磁珠，烧瓶上方安装自来水冷凝装置和充满氮气的气球。开始搅拌，从室温缓慢升温至65-75℃，升温速率为1℃/分钟，连续搅拌42-56小时(从升温至40℃时开始计时)。用适量DMF稀释反应液，再将其滴入6-10倍体积的乙醚中进行沉淀，洗两遍以除去未反应完的单体，用低速离心机离心得沉淀，氮吹后置于真空干燥箱干燥得基础聚合物。
步骤4：用DMF配制0.5M的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液。取步骤3合成的基础聚合物与4-6倍摩尔比的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液混合，室温搅拌10min，静置24小时后停止反应，将反应液滴入相应体积的乙醚中进行沉淀，再次洗两遍后，用低速离心机离心得沉淀，氮吹后置于真空干燥箱干燥，得最终产物聚(β氨基酯)聚合物，即本发明的新PBAE。我们将对本发明的新PBAE与我们之前的授权专利ZL2015109993917中的PBAE在细胞毒性和转染效率进行了比较。
2.设计用于靶向敲降或敲除hpv的序列
本发明针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58设计了相应的靶向序列，用于靶向敲降或敲除对应的HPV。SEQ ID NO:1-27设计为CRISPR靶向序列，SEQ ID NO:28-45设计为短发卡RNA基因序列。其中：
SEQ ID NO:1-3为针对HVP6的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV6-CRISPR-1、2、3)；
SEQ ID NO:4-6为针对HVP11的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV11-CRISPR-1、2、3)；
SEQ ID NO:7-9为针对HVP16的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV16-CRISPR-1、2、3)；
SEQ ID NO:10-12为针对HVP18的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV18-CRISPR-1、2、3)；
SEQ ID NO:13-15为针对HVP31的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV31-CRISPR-1、2、3)；
SEQ ID NO:16-18为针对HVP33的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV33-CRISPR-1、2、3)；
SEQ ID NO:19-21为针对HVP45的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV45-CRISPR-1、2、3)；
SEQ ID NO:22-24为针对HVP52的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV52-CRISPR-1、2、3)；
SEQ ID NO:25-27为针对HVP58的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV58-CRISPR-1、2、3)；
SEQ ID NO:28-29为针对HVP6的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV6-shRNA-1、2)；
SEQ ID NO:30-31为针对HVP11的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV11-shRNA-1、2)；
SEQ ID NO:32-33为针对HVP16的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV16-shRNA-1、2)；
SEQ ID NO:34为针对HVP18的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV34-shRNA-1)；
SEQ ID NO:35-36为针对HVP31的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV31-shRNA-1、2)；
SEQ ID NO:37-38为针对HVP33的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV33-shRNA-1、2)；
SEQ ID NO:39-40为针对HVP45的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV45-shRNA-1、2)；
SEQ ID NO:41-42为针对HVP52的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV52-shRNA-1、2)；
SEQ ID NO:43-45为针对HVP58的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV58-shRNA-1、2、3)。
3.重组质粒的构建
将SEQ ID NO:1-27所示序列分别克隆CRISPER载体中，得到针对相应HPV的CRISPR靶向敲除/敲降质粒；将SEQ ID NO:28-45所示序列分别克隆至shRNA质粒中，得到针对相应HPV的shRNA靶向敲除/敲降的重组质粒。
靶向重组质粒构建完成后，分别将上述含有重组成功质粒的菌液扩增，提取去除内毒素的质粒。为方便描述，下面将“靶向敲降或敲除的重组质粒”简称为靶向重组质粒。
本发明对于提取质粒DNA的提取方法并无特别限制，只要保证提取的质粒DNA样品的完整并去除内毒素即可，可以购买商品化的去内毒素质粒DNA提取试剂盒，本实验采用omega无内毒素质粒大提试剂盒，按照说明书操作来去除内毒素。提取的质粒分装保存在-20℃。
将上述含有重组成功靶向重组质粒的菌液可加10％甘油后置于-80℃冰箱冻存保种，只需将保种的菌液扩增即可。
4.制备纳米颗粒悬液
聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA分别用25mM乙酸钠溶液适当稀释，混合后，制成聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为20:1至40:1的溶液，根据本发明人的试验，意外的发现这个范围的质量比可做出较好的效果，尤其是当质量比为40:1效果更好。例如，质量比为40:1时，把4000μg的聚(β氨基酯)聚合物用25mM乙酸钠溶液稀释至40μL，把100μg的质粒DNA用25mM乙酸钠溶液稀释至40μL，把两个溶液迅速混合震荡，室温孵育15-20分钟，制成治疗HPV感染的纳米颗粒悬液80μL。
按照同样的方法，聚(β氨基酯)聚合物与上述制备的靶向重组质粒分别设定三个不同的质量比，即：聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为20:1、聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为30:1、聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为40:1。
5.不同剂型的制备
可将纳米颗粒悬液添加药物辅料或佐剂，进一步制成不同的剂型。例如，可把上述所得的治疗HPV感染的纳米颗粒悬液与各种适宜的辅料如化学药品、中药等配制成临床可接受的剂型，如阴道喷雾剂、阴道洗液、阴道凝胶、阴道软胶囊和硬胶囊、阴道栓剂、阴道膜、阴道片剂、阴道泡腾片、男士喷雾剂、软膏、霜剂等，含片、咀嚼片、口香糖等。含纳米颗粒悬液的洗液可供女性日常清洁阴部，其他各种剂型可直接放入阴道内，消除阴道和宫颈局部的人乳头瘤病毒(HPV)感染。以下分别列举了凝胶、洗液、阴道栓剂等剂型，但不限于上述剂型。对于各剂型中的用量也可以适当调整。
1)阴道凝胶的制备
以治疗HPV感染的纳米颗粒悬液加入普兰尼克(Pluronic)F127制成阴道凝胶为代表说明。
4℃下，将40g普兰尼克(Pluronic)F127加入60mL水中，搅拌制成凝胶基质；冰上或4℃条件下，将上述纳米颗粒悬液加入凝胶基质中，充分搅拌混匀制成均质凝胶。凝胶基质与纳米颗粒悬液的比例可根据需要优化，例如，80μL凝胶基质与120μL纳米颗粒悬液混合。
2)外阴洗液的制备
将聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒加入蒸馏水中，加入20g甘油混匀。将0.3g香精加入10g乙醇溶解，加于上述溶液混匀。补加蒸馏水至1000mL，分装4℃保存。
3)阴道栓的制备
把9g明胶加热溶解于蒸馏水中，加入甘油7.2g，定容至5.6mL，搅拌混匀。待上述甘油明胶温度降至约50℃，加入聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒混悬液，混匀，分装4℃保存。
6.新旧PBAE的细胞毒性测定与比较
在宫颈癌前病变细胞系SiHa上进行毒性试验，具体方法如下：将100ng绿色荧光质粒与10μl 25mM乙酸钠混合；将聚(β氨基酯)按照20:1、30:1和40:1的PBAE-DNA质量比与10μL 25mM乙酸钠溶液混合；3.将混合好的聚(β氨基酯)乙酸钠溶液与质粒乙酸钠溶液混合，静置15-20min，加入96孔板中。原PBAE作为阳性对照(质量比60比1)结果如图1所示，转染72小时后，使用本发明的新PBAE进行转染的细胞活性均高于原PBAE(60:1)，由此可见，本发明的新PBAE的细胞毒性明显小于专利ZL2015109993917中的PBAE。
7.新旧PBAE的转染效率测定与比较
将上述PBAE-DNA组合物用于转染HEK293细胞。结果如图2所示，本发明的新PBAE以30:1的PBAE-DNA质量比转染效率最高，达到80％以上，高于专利ZL2015109993917中的PBAE的最高转染效率(60:1,70％左右)。在30:1的质量比下，本发明的PBAE具有更小的细胞毒性和更高的转染效率，优于专利ZL2015109993917中的PBAE。
8.PBAE-靶向重组质粒的宫颈癌细胞抑制实验
使用上文的靶向重组质粒分别与本发明的新PBAE组合成相应的质粒纳米颗粒，用于进行HPV抑制实验。结果显示本发明的质粒纳米颗粒均可抑制相应HPV感染的细胞的增殖。以下列举其中一些例子。
1)HPV16-CRISPR-1和HPV16-shRNA-1对siha细胞的抑制实验如图3所示，分别使用HPV16-CRISPR-1和HPV16-shRNA-1构成的质粒纳米颗粒均可抑制siha细胞的增殖；
2)HPV18-CRISPR-1和HPV18-shRNA-1对Hela细胞的抑制实验如图4所示，分别使用HPV18-CRISPR-1和HPV18-shRNA-1构成的质粒纳米颗粒均可抑制Hela细胞的增殖。
其他的靶向重组质粒与新PBAE组合成的质粒纳米颗粒同样能够抑制相应子宫癌细胞的增殖，限于篇幅，不一一展示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120> 治疗HPV感染的纳米粒制剂中新的靶向序列以及新PBAE的制备方法
<141> 2019-11-29
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aggatccagc aacacgaccc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aggacgcaga ggagaaacca 20
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcatgatttg tgtcaggcgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaagaatag tgtatagaga 20
<210> 28
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggcttct gttgggaaca ctaaactcga gtttagtgtt cccaacagaa gctttttg 58
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccggggacaa gattcacaac ctttactcga gtaaaggttg tgaatcttgt cctttttg 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccgggctggg cacactaaat attgtctcga gacaatattt agtgtgccca gctttttg 58
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccggggaaga cttgttaccc taaagctcga gctttagggt aacaagtctt cctttttg 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccggggacag agcccattac aatatctcga gatattgtaa tgggctctgt cctttttg 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggcatgg agatacacct acattctcga gaatgtaggt gtatctccat gctttttg 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggcatgg acctaaggca acattctcga gaatgttgcc ttaggtccat gctttttg 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggctgtt aatgggctca tttggctcga gccaaatgag cccattaaca gctttttg 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccggggagga tatggttgac tttatctcga gataaagtca accatatcct cctttttg 58
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggccgat cctgaaggta caaatctcga ggccgatcct gaaggtacaa attttttg 58
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggccaac gttaaaggaa tatgtctcga gacatattcc tttaacgttg gctttttg 58
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggctcgg cagatgacct tagaactcga gttctaaggt catctgccga gctttttg 58
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggccaga tggacaagca gaacactcga gtgttctgct tgtccatctg gctttttg 58
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ccgggccacg gttcgtttgt gtatcctcga ggatacacaa acgaaccgtg gctttttg 58
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgggctcag acgaggatga aatagctcga gctatttcat cctcgtctga gctttttg 58
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ttaagaatag tgtatagaga 20
Claims (10)
1.一种用于敲降或敲除HPV的靶向序列，其特征在于，序列如SEQ ID NO:1-45之一所示。
2.一种用于靶向敲降或敲除HPV的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求1所述的靶向序列。
3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为CRISPR质粒，每个所述CRISPR质粒包含SEQ ID NO:1-27之一所示的序列作为靶向序列。
4.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为shRNA质粒，每个所述shRNA质粒包含SEQ ID NO:28-45之一所示的序列作为靶向序列。
5.一种用于治疗HPV感染的纳米粒制剂，其特征在于，包括权利要求2-4中任一项所述的重组质粒和聚(β氨基酯)聚合物。
6.根据权利要求5所述的纳米制剂，其特征在于，所述聚(β氨基酯)聚合物与所述重组质粒的质量比为20:1-40:1。
7.一种制备聚(β氨基酯)聚合物的方法，包括以下步骤：
S1：使1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇溶解在溶剂中反应得到反应体系；
S2：使所述反应体系在避光条件下在65-75℃下反应，得到基础聚合物；
S3：将所述基础聚合物与1,4-丁二醇二丙烯酸酯的DMF的溶液反应，得到所述聚(β氨基酯)聚合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S1中，1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇溶解在溶剂N,N-二甲基甲酰胺中得到所述反应体系。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S2中，所述反应体系缓慢升温至65-75℃，在连续搅拌反应42-56小时。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S3中，所述基础聚合物的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪的摩尔比为1：4至1:6。
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