CN104302767A - 用于减少肺癌肿瘤发生和化学疗法抗性的MiRNA以及相关组合物和方法 - Google Patents

用于减少肺癌肿瘤发生和化学疗法抗性的MiRNA以及相关组合物和方法 Download PDF

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Abstract

公开了用于减少肿瘤生长、癌细胞迁移和与EGFR(表皮生长因子受体)和MET(肝细胞生长因子的受体酪氨酸激酶)的失调相关的各种其它癌症病理学(特别是在非小细胞肺癌中)的组合物，例如核酸、载体、细胞、动物模型等。

Description

用于减少肺癌肿瘤发生和化学疗法抗性的MiRNA以及相关组合物和方法
发明人：Carlo M.Croce,Michela Garofalo
相关申请的交叉参考
本申请要求2011年12月10日提交的美国临时申请61/569,237的利益，所述美国临时申请的公开内容通过引用并入本文，用于所有目的。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的基金号NO.CA113001下由政府支持进行的。美国政府具有本发明的某些权利。
发明背景
不承认本部分公开的背景技术在法律上构成现有技术。
MiRNA通过抑制mRNA翻译或通过促进mRNA降解来抑制基因表达，并被认为是从增殖至细胞凋亡的各种过程的主调控者。miRNA功能的丧失和获得分别通过不同靶基因的上调和沉默来促成癌症发展。
非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的约85％。虽然NSCLC是包括不同形态学和分子亚型的明显异质性的疾病，但表皮生长因子受体(EGFR)和MET(肝细胞生长因子的受体酪氨酸激酶(RTK))的活化是共同的并且与大鼠肉瘤(RAS)-丝裂原活化蛋白激酶1(ERK)和磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)-v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1(AKT)轴的刺激相关，所述刺激导致NSCLC细胞增殖、存活和侵袭。
酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼和埃罗替尼有效地靶向患NSCLC个体的EGFR，但这些治疗剂最终受到赋予药物抗性的突变和其它分子机制的出现的限制。MET蛋白表达和磷酸化与NSCLC患者对EGFRTKI疗法的原始抗性和获得抗性相关。需要组合物和方法，例如控制MET表达(作为有效治疗靶)，以克服肺癌对该重要类别的药物的抗性。
序列表
本申请包括，已通过EFS-网提交并且通过引用整体并入本文的序列表。2012年12月7日创建的ASCII拷贝被命名为604_53534_SEQ_LIST_2012-111.txt，其大小为10,800字节。
发明概述
本发明提供了，包含至少一种选自下列的核酸的组合物：APAF-1的miR-221/222结合位点的分离的核苷酸154至160(5'-ATGTAGC-3')；BIM的miR-30b结合位点的分离的核苷酸288至294(5'-TGTTTACA-3')；与PKC-ε的miR-103结合位点的27至33互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG-5')；与PKC-ε的miR-103结合位点的核苷酸1517至1523互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG)；与PKC-ε的miR-103结合位点的核苷酸1564至1570互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸656至662互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1116至1122互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1595至1601互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；和，与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1706至1712互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')。
还提供了包含至少一种选自5'-ATGTAGC-3'；5'-TGTTTACA-3'；3'-ACGACG-5'和3'-UAAAGU-5'的核酸的分离的核酸。
在本文中还提供了分离的核酸或组合物，所述核酸或组合物还包含选自启动子、增强子、重复序列、标志物和报道基因的元件。
在本文中还提供了分离的核酸，所述核酸是探针、引物、miRNA、质粒、载体、病毒、细胞或生物。
在本文中还提供了物质组合物，其包含至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
在本文中还提供了物质组合物，其包含至少2种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
在本文中还提供了物质组合物，其包含至少3种选自miR-103；miR-203；抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
在本文中还提供了物质组合物，其包含miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含化学疗法治疗。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含肺癌化学疗法治疗。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含选自西妥昔单抗；帕木单抗；扎芦木单抗；尼妥珠单抗和马妥珠单抗的单克隆抗体。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含选自吉非替尼；埃罗替尼；拉帕替尼；AP26113和马铃薯羧肽酶抑制剂的小分子。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含吉非替尼。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含PKC-ε表达激动剂。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含MET抑制剂。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含SU11274。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含DICER抑制剂。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含E-钙粘蛋白表达激动剂。
在本文中还提供了物质组合物，其还包含佐剂、赋形剂和/或其它药学上可接受的组合物。
在本文中还提供了被配制用于注射、输注、摄入或跨膜运输的物质组合物。
本发明提供了下调哺乳动物细胞的DICER的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物细胞中的可用度(availability)，和下调哺乳动物细胞的DICER。
本发明提供了减少哺乳动物癌细胞的迁移的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减少哺乳动物癌细胞的迁移。
本发明提供了减小哺乳动物癌细胞的EGFR化学疗法抗性的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减小哺乳动物癌细胞的EGFR化学疗法抗性。
本发明提供了减小哺乳动物癌细胞的吉非替尼抗性的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减小哺乳动物癌细胞的吉非替尼抗性。
本发明提供了减少间充质标志物在哺乳动物癌细胞中的表达的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减少哺乳动物癌细胞的间充质标志物的表达。
本发明提供了增加E-钙粘蛋白在哺乳动物癌细胞中的表达的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和增加哺乳动物癌细胞的E-钙粘蛋白的表达。
本发明提供了诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化。提供了其中通过PKC-ε和/或DICER诱导间充质-上皮转化的此类方法。
本发明提供了诱导哺乳动物癌细胞的程序化细胞死亡的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的程序化细胞死亡。
本发明提供了下调哺乳动物癌细胞的AKT/ERK的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化。
本发明提供了增加哺乳动物癌细胞的吉非替尼敏感性的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和增加哺乳动物癌细胞的吉非替尼敏感性。
提供了其中癌细胞是肺癌细胞的此类方法。
提供了其中癌细胞是非小细胞肺腺癌细胞的此类方法。
提供了其中癌细胞是表皮癌细胞的此类方法。
本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长量的至少一种核酸，所述核酸选自：APAF-1的miR-221/222结合位点的分离的核苷酸154至160(5'-ATGTAGC-3')；BIM的miR-30b结合位点的分离的核苷酸288至294(5'-TGTTTACA-3')；与PKC-ε的miR-103结合位点的27至33互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG-5')；与PKC-ε的miR-103结合位点的核苷酸1517至1523互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG)；与PKC-ε的miR-103结合位点的核苷酸1564至1570互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸656至662互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1116至1122互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1595至1601互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；和，与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1706至1712互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')。
本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的选自5'-ATGTAGC-3'、5'-TGTTTACA-3'、3'-ACGACG-5'和3'-UAAAGU-5'的核酸。
本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221。
本发明提供了还包括施用化学疗法治疗的此类方法。
本发明提供了还包括施用肺癌化学疗法治疗的此类方法。
本发明提供了还包括施用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的此类方法。
本发明提供了还包括施用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的此类方法。
本发明提供了还包括施用选自西妥昔单抗、帕木单抗、扎芦木单抗、尼妥珠单抗和马妥珠单抗的单克隆抗体的此类方法。
本发明提供了还包括施用选自吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、AP26113和马铃薯羧肽酶抑制剂的小分子的此类方法。
本发明提供了还包括施用吉非替尼的此类方法。
本发明提供了还包括施用PKC-ε表达激动剂的此类方法。
本发明提供了还包括施用MET抑制剂的此类方法。
本发明提供了还包括施用SU11274的此类方法。
本发明提供了还包括施用DICER抑制剂的此类方法。
本发明提供了还包括施用E-钙粘蛋白表达激动剂的此类方法。
本发明提供了还包括施用佐剂、赋形剂和/或其它药学上可接受的组合物的此类方法。
本发明提供了其中施用是通过注射、输注、摄入或跨膜运输进行的此类方法。
本发明提供了其中肿瘤是肺肿瘤的此类方法。
本发明提供了其中肿瘤是肺癌的此类方法。
本发明提供了其中肿瘤是肺腺癌的此类方法。
本发明提供了其中肿瘤是非小细胞肺癌的此类方法。
本发明提供了其中肿瘤生长相较于对照减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％和至少60％的此类方法。
本发明提供了促进需要伤口愈合促进的哺乳动物的伤口愈合的方法，包括施用促进伤口愈合的量的本文中的组合物。
本发明提供了包括本文中的组合物的试剂盒。
本发明提供了包含本文中的组合物的细胞。
本发明提供了包含本文中的组合物的小鼠。
当结合附图阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员将变得显然。
附图概述
本专利或申请文件包含一个或多个以彩色绘制的附图和/或一张或多张照片。具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开案的拷贝可应要求和支付必要的费用后由美国专利和商标局提供。
图1A-1J.TKI-调节的miRNA靶。
图1A.EGFR和MET沉默后EGFR和MET的蛋白和mRNA的下调。
图1B.EGFR(shEGFR)、MET(shMET)或shCtr(混杂RNA)敲低后Calu-1细胞中的无监督层次聚类分析。CTR，对照。P<0.05。
图1C.受shEGFR和shMET调控的miRNA的交叉。
图1D.显示在shMET后失调的miRNA的Northern印迹。snRNA U6，上样对照。
图1E.萤光素酶报告测定显示miRNA与PRKCE(PKC-ε)、SRC、APAF1和BCL2L11(BIM)的3'UTR之间的直接相互作用。仅在SRC中，1,595-1,601nt上的位点参与与miR-203的结合；1,706-1,712nt上的位点的缺失不能拯救萤光素酶活性(图8)。WT，野生型；MUT，突变的；scr，混杂的。
图1F.一组NSCLC细胞中miR-103、miR-203、miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c与靶蛋白之间的反相关。
图1G.miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c的过表达减少APAF-1和BIM蛋白的浓度。
图1H.miR-103和miR-203的过表达减少PKC-ε和SRC蛋白的浓度。
图1I.miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c的抑制剂增加APAF-1和BIM表达。
图1J.shMET诱导APAF-1和BIM的上调以及SRC和PKC-ε的下调。结果代表至少3个独立实验。误差棒，±s.d*P<0.001，**P<0.05，通过双尾学生氏t检验。
图2A-2D.MET-miRNA共表达分析。
图2A.通过ISH分析110个肺癌组织的miR-103、miR-222、miR-203和miR-30c表达，随后通过IHC分析MET。首行显示miR-103信号(蓝色)、MET信号(红色)和混合信号，其中荧光黄显示miRNA和蛋白共表达；在MET表达存在的情况下不存在miR-103。在相同癌症的连续切片中(在第二行中)，显示了miR-222、MET图像以及miR-222和MET的共表达。许多对于miR-222是阳性的癌细胞也表达MET(黄色)。左图框中的箭头(在第三行中)指向表达miR-203(蓝色)但不表达MET的良性基质细胞。第三行中的其它图像显示MET信号(红色)和混合信号。第四行中的左边图像中的箭头指向对于miR-30c是阳性的癌细胞。每一行中的右边图像显示ISH或IHC反应的RGB图像。
图2B.显示40个肺癌个体的miRNA表达的箱型图。使用截止值为0.5(2(-ΔCT))的轮函数，将实时PCR用于将肿瘤分成两组，低EGFR-MET和高EGFR-MET。*P<0.0001，通过学生氏t检验。
图2C.显示MET与miR-103之间和MET与miR-203之间的反相关的XY散布图。
图2D.对40个肺肿瘤组织的MET和EGFR IHC。显示了来自17个表达MET和EGFR的转移性肿瘤的一个代表性病例。大的绿色箭头指向肿瘤细胞，小的黑色箭头指向基质。比例尺，100μm。
图3A-3D.吉非替尼下调miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c。
图3A.用递增浓度的吉非替尼处理Calu-1、A549、PC9和HCC827细胞。24h后测量相对于未处理的对照的细胞活力。每一个数据点代表5个孔的平均值±s.d.。
图3B.显示在用5μM或10μM吉非替尼处理后miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222仅在PC9和HCC827吉非替尼-敏感性细胞中下调但不在Calu-1和A549抗吉非替尼细胞中下调的qRT-PCR。NT，未处理的细胞。
图3C.用5μM或10μM吉非替尼处理PC9、Calu-1和HCC827细胞24h。仅在HCC827和PC9吉非替尼-敏感性细胞中但未在Calu-1抗吉非替尼细胞中观察到BIM和APAF-1表达的增加和ERK磷酸化的减少。β-肌动蛋白用作上样对照。
图3D.显示miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c的表达在暴露于10μM吉非替尼24h的HCC827GR和PC9GR细胞(具有获得性吉非替尼抗性的细胞)中不减少的qRT-PCR。所有定量数据从最少3个重复实验产生。误差棒，±s.d。双尾学生氏t检验用于测定P值。*P<0.001，**P<0.05。
图4A-4F.miR-30b、miR-30c、miR-221、miR-222、miR-103和miR-203调节吉非替尼敏感性。
图4A.用递增浓度的吉非替尼处理亲代细胞和它们的抗性HCC827GR Q27Q16和PC9GR以及Calu-1克隆细胞。每一个数据点代表6个孔的平均值±s.d。
图4B.显示A549细胞中BIM和APAF-1过表达后和用吉非替尼(15μM)处理后吉非替尼诱导的切割的PARP片段的增加的western印迹。EV，空病毒。
图4C.HCC827和PC9细胞中BIM(siBAM)和APAF-1(siAPAF-1)的沉默减小对吉非替尼的响应。
图4D.对miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222不敏感的BIM和APAF-1互补DNA的过表达诱导A549细胞的吉非替尼敏感性。SiScr，SRC siRNA。
图4E-4F.miR-103和miR-203的过表达以及miR-30c和miR-222的沉默增加吉非替尼体内敏感性。用稳定地感染了对照miRNA(ctr)、miR-30c或miR-221的抑制剂以及感染了miR-103和miR-203或空病毒(作为对照)的A549细胞注射的裸小鼠中植入的肿瘤的生长曲线(图4D)和植入的肿瘤的比较(图4F)。图像显示来自每一个类别的5个肿瘤中的平均尺寸的肿瘤。在图4A和图4A-4D中，误差棒±s.d.，*P<0.001、**P<0.05，通过双尾学生氏t检验。Gef，吉非替尼。
图5A-5C.MiR-103和miR-203抑制NSCLC的迁移和增殖。
图5A.迁移通过过滤器的并且用结晶紫染色的细胞的代表性图像。比例尺，40μm。结果为平均值±s.d。n＝3个实验。*P<0.001。
图5B.在用移液器尖头产生创伤后0h和24h，用miR-103、miR-203或对照miRNA(Scr miR)转染的A549细胞的汇合单层的刮伤区域的代表性照片。比例尺，500μm。*P<0.00001、**P<0.001，相对于混杂miRNA转染的细胞。
图5C.用对照miRNA、miR-103(103)、miR-203(203)、对照siRNA(Scr siRNA)以及PKC-ε(siPKC-ε)和SRC(siSRC)的siRNA转染的Calu-1和A549细胞的流式细胞术分布。miR-203对细胞周期的影响略强于miR-103的影响，如通过G0-G1相与S相之间的比率评估的。所有定量值显示平均值±s.d。n＝5。将双尾学生氏t检验用于测定G0-G1:S比率的P值。*P<0.00001和**P<0.005，相较于混杂miRNA。
图6A-6H.MET诱导上皮-间充质转化。
图6A.MET敲低后Calu-1细胞的形态学变化。比例尺，20μm。
图6B.Snail、波形蛋白和N-钙粘蛋白在Calu-1shCtr细胞和Calu-1shMET细胞中的免疫荧光。Snail表达在Calu-1shCtr细胞中很强并且存在于细胞核中，在Calu-1shMET细胞中较弱并且存在于细胞质中。比例尺寸，20μm。
图6C.显示在MET敲低后，Calu-1细胞的纤连蛋白、波形蛋白和Snail下调以及E-钙粘蛋白上调的Western印迹。上样对照，GAPDH。
图6D.显示Calu-1shCtr细胞和Calu-1shMET细胞的上皮和间充质标志物的表达的qRT-PCR。
图6E.显示在miR-103或miR-203过表达后，Calu-1细胞的纤连蛋白、Snail和波形蛋白表达减少的免疫荧光。比例尺，20μm。CtrmiR，对照miRNA。
图6F.显示在miR-103或miR-203加强表达后，Calu-1细胞的增加的E-钙粘蛋白信号的免疫荧光。比例尺，40μm。
图6G.显示在miR-103或miR-203过表达后，间充质标志物的下调的免疫印迹。
图6H.其中MET下调miR-103和miR-203的模型，所述下调反过来上调PKC-ε、Dicer和SRC，从而诱导吉非替尼抗性和上皮-间充质转化。MET还诱导miR-30b、miR-30c、miR-221、miR-222和miR-21上调，和从而通过BIM、APAF-1和PTEN下调诱导吉非替尼抗性。EGFR增加miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c表达。红色显示的是上调的miRNA，绿色显示的是下调的miRNA。结果代表至少4个独立实验。P值，双尾学生氏t检验。误差棒，±s.d.。
图7A-7B.MicroRNA在稳定的EGFR和MET沉默后失调。
图7A.显示了在EGFR(表1)和MET(表2)沉默后失调的、具有1.5倍(EGFR)和1.7倍(MET)变化的MicroRNA(P<0.05)。绿色＝下调的miR；红色＝上调的miR。
图7B.显示MET和EGFR沉默后miR-221/miR-222和-30b/c下调以及MET沉默后miR-103和-203上调的qRT-PCR。数据为3个独立实验的平均值±s.d.。*P<0.001，**P<0.0001。
图8A-8D.miR-221/miR-222、miR-30b-c、miR-103和miR-203的预测的靶。
图8A.APAF-13'UTR提供了一个miR-221/miR-222结合位点(核苷酸154-160(SEQ ID NO:38))；BIM提供了一个miR-30b/c结合位点(nt288-294(SEQ ID NO:42))；PKC-ε提供了3个miR-103结合位点(nt27-33(SEQ ID NO:39)、1517-1523(SEQ ID NO:40)、1564-1570(SEQ ID NO:41))；SRC3'UTR提供了4个miR-203结合位点(nt656-662(SEQ ID NO:43)、1116-1122(SEQ ID NO:44)、1595-1601(SEQ ID NO:45)、1706-1712(SEQ ID NO:46))。在图中，显示了种子区域与3'UTR(miR-221和miR-222与APAF-1、miR-30b/c与BIM、miR-103与PKC-ε以及miR-203与SRC11)的比对。靶诱变的位点以绿色显示：＝缺失的核苷酸。分别扩增APAF-1和BIM的3'UTR的370和342bp。产生PKC-ε的3个不同构建体(27-33(bp＝385)、1517-1570(bp＝496)、27-1570(bp＝1720))和SRC的2个不同构建体(656-1122(bp＝705)、1595-1712(bp＝805))。BS＝结合位点。
图8B.一组7种NSCLC细胞的Western印迹。蛋白质丰度报告为针对β-肌动蛋白表达标准化的western印迹光密度。
图8C.显示一组NSCLC细胞中miR-103、miR-203相较于miR-221/miR-222、miR-30b/c相对表达水平的低表达的qRT-PCR。
图8D.通过使用皮尔逊相关系数(r)和各自的p值(全部显著，P<0.01)在统计上计算7种NSCLC细胞中miR-103、miR-203、miR-30b/c、miR-221/miR-222与PKC-ε、SRC、BIM和APAF-1mRNA之间的关联性。皮尔逊相关性显示在所有分析的细胞中miR-103、miR-203、miR-30c、miR-222与PKC-s、SRC、BIM和APAF-1mRNA之间反相关。结果代表至少3个独立实验。误差棒描述±s.d。
图9A-9B.miR-221/miR-222、miR-30b/c、miR-103、miR-203靶向APAF-1、BIM、PKC-H和SRC。
图9A.用miR-221/miR-222和miR-30b/c转染的Calu-1MET-KD细胞显示APAF-1和BIM蛋白水平的降低。
图9B.相反地，抗-miR-103和miR-203分别增加PKC-ε和SRC的表达。Scr＝混杂的。结果代表至少3个独立实验。
图10A-10B.miR-103-PKC-ε、miR-222-APAF-1、miR-203-SRC和miR-30c-BIM共表达分析。
图10A.通过ISH分析110个肺癌组织的miR-103、miR-222、miR-203、miR-30c表达以及通过IHC分析PKC-ε、APAF-1、SRC和BIM。首行，从左边开始，miR-103(蓝色)和PKC-H(红色)结果显示该肺癌中miRNA的弱信号和蛋白质的强信号。图像的混合(第三个图框)未显示否则将呈现为黄色的两个靶的共表达；注意PKC-ε信号(红色)定位至癌细胞的巢(箭头)。第二行，左图框是强miR-222信号和癌细胞(大箭头，第二个图框)但非周围良性基质细胞(小箭头)的假定的靶APAF-1的弱信号。第三个图框未显示可检测的共表达。第三行，左图框为miR-203(蓝色)，接下来是SRC信号(红色)和混合信号；注意不存在miR-203与SRC的共表达。在右图框中，添加复染剂苏木精作为荧光湖绿(fluorescent turquoise)。这允许人们看见癌细胞(大箭头)而非良性促结缔组织增生细胞(小箭头)正在表达SRC。最后一行，左图框为miR-30c信号(蓝色)，接下来BIM(红色)和合并的图像，其中不存在黄色表明不存在两个靶的共表达。右图框显示基于常规颜色的图像(RGB＝红色、绿色、蓝色)。标尺表示100Pm。
图10B.显示110个肺肿瘤中的microRNA与蛋白质靶表达之间的反相关的表。
图11A-11E.MET在转移性肺肿瘤组织中过表达。
图11A.报导了在110个分析的肿瘤样品中观察到的MET和miR-30c、miR-103、miR-203、miR-222表达的百分比的表。在大部分肿瘤样本中，miR-103和miR-203与MET表达反相关并且miR30c和miR-222与MET表达正相关。
图11B.表达MET的转移性和非转移性肺肿瘤样品的百分比。MET在转移性肿瘤中相较于肺非转移性组织过表达。P＝0.021，通过Fisher精确检验。
图11C.通过轮函数，利用0.5(2(-DeltaCt))的截止值通过qRT-PCR将40个肺肿瘤分成“高”和“低”EGFR和MET表达。
图11D.显示EGFR和MET的IHC分析与qRT-PCR结果之间的关系的2x2列联表。P<0.0001，通过Fisher精确检验。
图11E.显示40个肺癌中表达MET和EGFR的转移性肿瘤的数目的表。注意转移灶与MET但非EGFR表达水平之间的正相关。MET、P＝0.026；EGFR、P＝不显著，通过Fisher精确检验。
图12A-12B.PC9GR和HCC827GR细胞的APAF-1和BIM表达。用5或10μM吉非替尼处理HCC827GR细胞(图12A)和PC9GR细胞(图12B)，进行24h。由于miR-221/miR-222和miR-30b/c的表达未改变，APAF-1和BIM表达以及ERK磷酸化在吉非替尼处理后未发生改变。Β-肌动蛋白用作上样对照。
图13A-13C.miR-30b、miR-30c、miR-221、miR-222参与吉非替尼诱导的细胞凋亡。
图13A.miR-30b、miR-30c、miR-221、miR-222的增强的表达增加HCC827和PC9敏感性细胞对吉非替尼诱导的细胞凋亡的抗性，如通过胱天蛋白酶3/7测定评估的。
图13B.miR-30b、miR-30c、miR-221、miR-222敲低增加具有从头(Calu-1)和获得的(HCC827GR和PC9GR)对TKI的抗性的NSCLC细胞的吉非替尼敏感性。
图13C.用miR-30b/c、miR-221/miR-222以及APAF-1和BIM cDNA(其后是它们的包含WT或突变的miRNA结合位点的3'UTR)共转染A549。通过MTS测定，miR-30b/c-和miR-221/miR-222-不敏感的BIM和APAF-1cDNA的过表达诱导A549细胞的吉非替尼敏感性。所有实验进行至少3次，结果基本上一致。显示了3个独立实验的一个代表。双尾学生氏t检验用于测定P值。误差棒描述±s.d。*P<0.001，**P<0.05。
图14A-14D.MET的抑制诱导miR-30b-c和miR-221/miR-222的下调。
图14A.显示在用SU11274处理Calu-1细胞后miR-30b/c和miR-221/miR-222的下调的qRT-PCR。用MET抑制剂以1和3μM的浓度处理细胞24、48和72小时。如本文中所述，进行RNA提取和qRT-PCR。显示了来自3个不同实验的结果。
图14B.显示在MET KD后A549细胞中的miR-30c和miR-222下调的Northern印迹。SnRNA U6用作上样对照。
图14C.用MET抑制剂SU11274处理Calu-1细胞。24小时后，将细胞暴露于吉非替尼(5-10-10-20)μM)，进行24h。MET的抑制增加Caluu-1对药物的敏感性，如通过MTS测定评估的。
图14D.用吉非替尼(5-10-15-20μM)处理24h的Calu-1-MET敲低细胞(Calu-MET-KD)对吉非替尼更敏感，如通过胱天蛋白酶3/7测定评估的。以一式三份进行实验3次。误差棒代表标准差。双尾t检验用于测定所有P值。*P<0.001。
图15A-15B.EGFR和MET调节的miRNA参与吉非替尼抗性。显示在用5和10μM吉非替尼处理后，miR-21、miR-29a、miR-29c和miR-100在HCC827和PC9中但不在HCC827GR和PC9GR细胞中下调的qRT_PCT。相对值显示为平均值和±s.d。双尾学生氏t检验用于测定P值。*P<0.005，**P<0.001。
图16A-6B.miR-21、miR-29a/c、miR-100参与吉非替尼-诱导的细胞凋亡。miR-21、miR-29a/c、miR-100的加强表达增强暴露于10μM吉非替尼24小时的HCC827细胞的(图16A)和PC9细胞(图16B)的细胞活力并减少胱天蛋白酶3/7活性。显示了3个独立实验的一个代表。相对值显示为平均值和±s.d。双尾学生氏t检验用于测定P值。
图17A-17B.miR-21的敲低增加吉非替尼敏感性。
图17A.A549、HCC827GR和PC9GR细胞中通过抗-miR寡核苷酸产生的miR-21沉默减弱细胞活力，如通过MTS测定评估的，和图17B，在吉非替尼处理(10μM)24小时后，增加细胞死亡，如通过胱天蛋白酶3/7测定评估的。误差棒描述s.d。报告了来自至少3个独立实验的结果。*P<0.05，**P<0.001，通过双尾学生氏t检验。
图18A-18B.MET抑制剂SU11274诱导miR-103和miR-203上调。将Calu-1细胞暴露于不同的SU11274浓度(1和3μM)1，进行24、48和72小时。如本文中所述，通过qRT-PCR评估miR-103和miR-203表达水平。结果代表至少3个独立实验。误差棒描述±s.d。*P<0.001，**P<0.05。
图19A-19E.PKC-ε和SRC的敲低诱导吉非替尼敏感性。
图19A.A549细胞的miR-103、miR203的加强表达抑制AKT/ERK途径。β-肌动蛋白水平用作上样对照。显示了3个独立实验的一个代表。
图19B.Calu-1细胞的miR-103、miR-203过表达诱导吉非替尼敏感性，如通过胱天蛋白酶3/7和MTT测定评估的。结果代表至少4个独立的实验。
图19C.在敲低PKC-H和SRC，随后用吉非替尼处理(10μM、15μM)24小时后，Calu-1细胞的活力和胱天蛋白酶3/7测定。
图19D.显示相较于亲代HCC827细胞的具有MET扩增的HCC827GR细胞的减少的miR-103和miR-203的表达的qRT-PCT。
图19E.显示相较于亲代HCC837吉非替尼敏感性细胞的具有MET扩增的HCC827GR的增加的PKC-ε和SRC的表达的Western印迹。以一式三份进行实验三次。误差棒表示±s.d。通过学生氏t检验测定P值。*P<0.005。
图20A-20B.miR-103、miR-203、miR-221、miR-30c的体内作用。
图20A.利用稳定转染了空病毒、miR-103、miR-203以及抗-Ctr、抗-221、抗-30c的A549细胞注射的裸小鼠的肿瘤异种移植物的比较。注射后35天和用媒介物(0.1％tween80)或吉非替尼(200mg/kg)处理后，处死小鼠。图像显示来自每一个类别的5只小鼠中的一只小鼠。
图20B.显示肿瘤异种移植物的miR-103、miR-203上调和miR-30c、miR-221下调的qRT-PCR。数据表示为±s.d。*P<0.001。
图21A-21C.miR-103和miR-203过表达诱导MET。
图21A.显示在miR-103和miR-203加强表达后Twist和N-钙粘蛋白下调的免疫荧光。
图21B-21C.在Calu-1细胞的miR-103和miR-203加强表达以及PKC-ε和SRC沉默后的qRT-PCR。miR-103、miR-203的过表达以及PKC-ε、SRC的敲低诱导间充质标志物的减少和E-钙粘蛋白mRNA表达水平的升高。误差棒描述s.d。报告了来自至少3个独立实验的结果。*P<0.001，**P<0.05。
图22A-22E.DICER沉默促进NSCLC的吉非替尼敏感性和MET。
图22A.在Calu-1细胞中在MET稳定地敲低后和miR-103加强表达后DICER下调。
图22B.在用100nM DICER siRNA转染Calu-1和A549细胞后DICER的下调。
图22C.DICER的敲低减少Calu-1和A549细胞的细胞迁移。照片显示通过测量595nm处的吸光度而定量的迁移通过transwell的细胞的绝对数目。
图22D.显示DICER沉默如何增加对吉非替尼诱导的细胞凋亡的敏感性的MTS和胱天蛋白酶3/7测定。结果代表至少3个独立实验。
图22E.显示DICER耗尽通过调节间充质和上皮标志物的表达影响间充质-上皮转化(MET)的qRT-PCR。误差棒描述c和d中4个独立实验的±s.d.。*P<0.005，**P<0.05。
图23.临床表1-110个肺癌样本的PKC-ε、SRC、APAF-1和BIM蛋白的体内检测。
图24.临床表2-40个具有注释的临床历史的独立肺肿瘤。
详述
在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明书。这些出版物、专利和公布的专利说明书的公开内容通过引用并入本公开内容以更全面地描述本发明所属领域的技术水平。
本发明至少部分地基于这样的研究发现：EGF和MET受体，通过调节特定miRNA，控制吉非替尼诱导的细胞凋亡和NSCLC肿瘤发生。本文中鉴定了代表NSCLC的致癌信号转导网络的受EGF-和MET-受体调节的miRNA。
如本文中可互换使用的，“miR基因产物”、"microRNA"、"miR"或“miRNA”是指来自miR基因的未加工的或加工的RNA转录物。由于miR基因产物不被翻译成蛋白质，因此，术语“miR基因产物”不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称为“miR前体”，并且通常包括长度约70-100个核苷酸的RNA转录物。miR前体通过用RNA酶(例如，DICER、Argonaut、RNA酶III，例如大肠杆菌(E.coli)RNA酶III)消化而被加工成19-25个核苷酸的活性RNA分子。该19-25个核苷酸的活性RNA分子也称为“加工的”miR基因转录物或"成熟"miRNA。
有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶例如分离的DICER、Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得。要理解，还可通过生物或化学合成直接产生有活性的19-25个核苷酸的RNA分子，而不必从miR前体加工获得。当在本文中通过名称提及microRNA时，除非另外指出，否则名称相应于前体和成熟形式。
如本文中所述，“受试者”可以是患有或怀疑患有癌症的任何哺乳动物。在优选实施方案中，受试者是患有或怀疑患有癌症的人。
可在获自受试者的生物样品的细胞中测量至少一种miR基因产物的水平。例如，可通过常规活组织检查技术从怀疑患有癌症的受试者取出组织样品。在另一个实施方案中，可从受试者取出血液样品，可通过标准技术分离白细胞以用于DNA提取。优选在开始放射疗法、化学疗法或其它治疗性治疗之前，从受试者获得血液或组织样品。对应的对照组织或血液样品或对照参照样品可获自受试者的未患病组织，获自正常人个体或正常个体的群体，或获自对应于受试者样品中的大部分细胞的培养细胞。随后将对照组织或血液样品与来自受试者的样品一起处理，以便可将受试者样品的细胞中从给定的miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的对应miR基因产物水平相比较。或者，可获得参照样品并且将其与测试样品分开地(例如，在不同时间)进行处理，可将测试样品的细胞中从给定的miR基因产生的miR基因产物的水平与参照样品的对应miR基因产物水平相比较。
样品的miR基因产物的水平可使用适合用于检测生物样品的RNA表达水平的任何技术来测量。用于测定生物样品(例如，细胞、组织)中的RNA表达水平的适当技术(例如，Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交)对于本领域技术人员来说是公知的。在特定的实施方案中，使用Northern印迹分析检测至少一种miR基因产物的水平。例如，可通过在核酸提取缓冲液存在的情况下进行匀浆，接着进行离心来从细胞纯化总的细胞RNA。沉淀核酸，然后通过用DNA酶处理和沉淀来除去DNA。然后按照标准技术在琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分离RNA分子，并将其转移至硝酸纤维素滤器。然后通过加热将RNA固定在滤器上。使用适当标记的与所述RNA互补的DNA或RNA探针进行特定RNA的检测和定量。参见，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等人,eds.,第2版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989,Chapter7,其全部公开内容通过引用合并入本文。
用于给定的miR基因产物的Northern印迹杂交的适当探针(例如，DNA探针、RNA探针)可从本文中提供的核酸序列产生，并且包括但不限于，与目标miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的互补性的探针，以及与目标miR基因产物完全互补的探针。用于制备标记的DNA和RNA探针的方法以及用于其与靶核苷酸序列的杂交的条件描述于Molecular Cloning:A LaboratoryManual,J.Sambrook等人,eds.,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989,Chapters10和11,其公开内容通过引用合并入本文。
例如，可用例如放射性核素例如3H、32P、33P、14C或35S；重金属；能够用作已标记的配体的特异性结合对成员的配体(例如,生物素、抗生物素蛋白或抗体)；荧光分子；化学发光分子；酶等来标记核酸探针。
可通过Rigby等人(1977),J.Mol.Biol.113:237-251的切口平移法或Fienberg等人(1983),Anal.Biochem.132:6-13的随机引物法(其全部公开内容通过引用合并入本文)将探针标记至高比放射性(specific activity)。后者是选择用于从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P-标记的探针的方法。例如，按照切口平移法通过用高放射性的核苷酸置换预先存在的核苷酸，可能制备具有大大超过108cpm/微克的比放射性的32P-标记的核酸探针。
然后可通过将杂交滤器暴露于照相胶片来进行杂交的放射自显影检测。暴露于杂交滤器的照相胶片的光密度扫描提供了miR基因转录物水平的精确测量。使用另一个方法，可通过计算机化的成像系统例如可从Amersham Biosciences,Piscataway,NJ获得的MolecularDynamics400-B2D Phosphorimager定量miR基因转录物水平。
当不能进行DNA或RNA探针的放射性核素标记时，可使用随机引物法将类似物例如dTTP类似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子。可通过与结合生物素的蛋白质例如偶联至荧光染料或产生颜色反应的酶的抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗体(例如抗生物素抗体)反应来检测生物素化的探针寡核苷酸。
除了Northern和其他RNA杂交技术外，可使用原位杂交技术来测定RNA转录物的水平。该技术需要比Northern印迹技术更少的细胞，其包括将整个细胞置于显微镜盖玻片上和用含有放射性标记的或另外标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的核酸含量。该技术特别适合用于分析来自受试者的组织活组织检查样品。原位杂交技术的实施在美国专利5,427,916(其全部公开内容通过引用合并入本文)中进行了更详细的描述。用于给定的miR基因产物的原位杂交的适当探针可从本文中提供的核酸序列产生，并且包括但不限于，与目标miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的互补性的探针，以及与目标miR基因产物完全互补的探针，如上文中描述的。
细胞中miR基因转录物的相对数目还可通过对miR基因转录物进行逆转录，然后通过聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增经逆转录的转录物来进行测定。可通过与内部标准例如来自存在于相同样品中的“持家”基因的mRNA的水平相比较来定量miR基因转录物的水平。用作内部标准的合适的“持家”基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于进行定量和半定量RT-PCR的方法以及其变型对于本领域技术人员来说是公知的。
在一些情况下，可能期望同时测定样品中多个不同miR基因产物的表达水平。在其他情况下，可能期望测定与癌症关联的所有已知miR基因的转录物的表达水平。评估数百种miR基因或基因产物的癌症特异性表达水平非常费时并且需要大量的总RNA(例如，对于每一个Northern印迹需要至少20μg)和需要放射性同位素的放射自显影技术。
为了克服这些限制，可构建以微芯片形式(即，微阵列)存在的寡核苷酸文库，该文库包含特异于一组miR基因的一组寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针。使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，将它们与微阵列上的探针(寡核苷酸)杂交以产生杂交或表达特征谱来测定生物样品中多个microRNA的表达水平。然后将受试样品的杂交谱与对照样品的杂交谱比较，从而确定在肺癌转移和/或复发细胞中具有改变的表达水平的microRNA。如本文中所使用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”是指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”是指待检测(例如，通过杂交)的分子。“miR-特异性探针寡核苷酸”或“特异于miR的探针寡核苷酸”是指具有选择用于与特定miR基因产物或特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。
特定样品的“表达特征谱”或“杂交特征谱”本质上是样品的状态指纹；虽然两种状态可能具有相似表达的任何特定基因，但同时评价大量基因允许产生对于细胞的状态是独特的基因表达特征谱。即，正常组织可与癌细胞相区别，并且在癌细胞类型内，可确定不同的预后状态(例如，良好的或不良的长期存活希望)。通过比较不同状态的细胞的表达特征谱，获得关于在这些状态的每一个状态中为重要的(包括基因的上调或下调)基因的信息。在癌细胞或正常细胞中差异表达的序列的鉴定以及导致不同预后结果的差异表达允许以许多方法使用该信息。例如，可评估特定的治疗方案(例如，确定化疗药物是否改善特定患者的长期预后)。类似地，可通过将患者样品与已知的表达特征谱比较来进行或确认诊断。此外，这些基因表达特征谱(或个体基因)允许筛选抑制miR或疾病表达特征谱或将不良预后特征谱转变成更好的预后特征谱的药物候选物。
可从基因特异性寡核苷酸探针(所述探针从已知的miRNA序列产生)制备微阵列。对于各miRNA，阵列可包含两种不同的寡核苷酸探针，一种探针包含活性成熟序列，而另一种探针特异于miRNA的前体。阵列还可包含可用作杂交严格条件的对照的对照，例如与人直系同源物只相异于少数几个碱基的一个或多个小鼠序列。还可将来自两个物种的tRNA或其它RNA(例如，rRNA、mRNA)印制在微芯片上，从而为特异性杂交提供内部的、相对稳定的阳性对照。还可将用于非特异性杂交的一个或多个合适的对照包含在微芯片上。为了该目的，基于与任何已知的miRNA不存在任何同源性选择序列。
可使用本领域内已知的技术制备微阵列。例如，在位置C6上对合适长度例如40个核苷酸的探针寡核苷酸进行5'-胺修饰，并且使用可商购获得的微阵列系统例如GeneMachine OmniGridTM100Microarrayer和Amersham CodeLinkTM活化的载玻片进行印制。通过用标记的引物逆转录靶RNA来制备相应于靶RNA的标记的cDNA寡聚物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交物变性以降解RNA模板。然后将所制备的标记的靶cDNA在杂交条件(例如在25℃下于6X SSPE/30％甲酰胺中进行18小时，然后在37℃下于0.75X TNT中清洗40分钟)下与微阵列芯片杂交。在阵列上的其中固定的探针DNA识别样品中的互补靶cDNA的位置上，发生杂交。标记的靶cDNA标记阵列上的其中发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出信号由一列杂交事件组成，其标示了特定cDNA序列的相对丰度，从而标示了患者样品中相应的互补miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素蛋白-Alexa647缀合物直接检测包含生物素的转录物来处理微阵列，和使用常规扫描方法扫描微阵列。阵列上的各点的图像强度与患者样品中相应的miR的丰度成比例。
使用阵列对于miRNA表达的检测具有几个有利方面。第一，可在一个时间点上鉴定相同样品中的数百个基因的整体表达。第二，通过寡核苷酸探针的仔细设计，可鉴定成熟分子和前体分子的表达。第三，与Northern印迹分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用2.5μg总RNA可提供可重现的结果。数目相对有限的miRNA(每物种数百个)允许对数个物种构建共同的微阵列，其中对每一物种使用不同的寡核苷酸探针。这样的工具允许分析各已知的miR在不同条件下的跨物种表达。
除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于miRNome的大部分(优选整个miRNome)的miRNA-特异性探针寡核苷酸的微芯片可用于进行miR基因表达特征谱分析，以分析miR的表达模式。可使不同的miR特征与已建立的疾病标记关联或直接与疾病状态关联。
按照本文中描述的表达特征谱分析法，对来自怀疑患有癌症特征(例如转移或复发)的受试者的样品的总RNA进行定量逆转录以提供一组与样品中的RNA互补的标记的靶寡脱氧核苷酸。然后将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供样品的杂交特征谱。结果是显示样品中miRNA的表达模式的样品的杂交特征谱。杂交特征谱包括来自靶寡脱氧核苷酸(其来自样品)与微阵列中的miRNA-特异性探针寡核苷酸结合的信号。所述谱可记录为结合的存在或不存在(信号对0信号)。更优选地，记录的谱包括来自各杂交的信号的强度。将所述谱与从正常的(例如，非癌性)对照样品产生的杂交特征谱相比较。信号表示受试者中存在癌症特征或易于发生癌症特征。
用于测量miR基因表达的其它技术也在本领域技术人员的能力范围内，包括用于测量RNA转录和降解速率的各种技术。
本发明还提供了测定预后的方法。不良预后的实例包括但不限于低存活率和快速疾病进展。
在某些实施方案中，如下测量至少一种miR基因产物的水平：逆转录获自受试者的受试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将该靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供受试样品的杂交特征谱，然后将受试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较。
因此，本发明包括治疗受试者的癌症的方法。该方法包括施用有效量的至少一种分离的反义miR基因产物或其分离的变体或生物活性片段，以便受试者中癌细胞的转移、复发或增殖被抑制。给受试者施用的分离的反义miR基因产物可以与内源野生型miR基因产物互补或相同，或可以是其互补的变体或生物活性片段。
如本文中所定义的，miR基因产物的"变体"是指，与对应野生型miR基因产物具有少于100％的同一性并且具有对应野生型miR基因产物的一个或多个生物活性的miRNA。此类生物活性的实例包括但不限于，与肺癌转移或复发相关的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。这些变体包括物种变体和由于miR基因的一个或多个突变(例如，置换、缺失、插入)而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应野生型miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
如本文中所定义的，miR基因产物的"生物活性片段"是指，具有对应野生型miR基因产物的一个或多个生物活性的miR基因产物的RNA片段。如上文中所述，此类生物活性的实例包括但不限于，与肺癌转移或复发相关的细胞过程的抑制。在某些实施方案中，生物活性片段在长度上为至少约5、7、10、12、15或17个核苷酸。在具体的实施方案中，可将分离的miR基因产物与一种或多种另外的抗癌治疗组合来给受试者施用。适当的抗癌治疗包括但不限于，化学疗法、放射疗法以及组合(例如，放化疗)。
如本文中所使用的，术语“治疗”、“医治”和“疗法”是指改善与疾病或病况例如肺癌转移和/或复发相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作，和/或减少疾病或病况的症状的严重度或频率。术语“受试者”和“个体”在本文中定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种。在优选实施这群中，动物是人。
如本文中所使用的，分离的miR基因产物的“有效量”是足以在遭受肺癌转移和/或复发的受试者中抑制癌细胞增殖的量。通过考虑因素例如受试者的大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的miR基因产物的有效量。
例如，分离的miR基因产物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的大致重量。肿瘤块的大致重量可通过计算肿瘤块的大致体积来测定，其中1立方厘米的体积大致等于1克。基于肿瘤块的重量的分离的miR基因产物的有效量可在约10-500微克/克的肿瘤块的范围内。在某些实施方案中，有效量可以为至少约10微克/克的肿瘤块，至少约60微克/克的肿瘤块或至少约100微克/克的肿瘤块。
分离的miR基因产物的有效量可基于待治疗的受试者的大致或估计的体重。优选，如本文中所描述的，胃肠外或肠内施用这样的有效量。例如，对受试者施用的分离的miR基因产物的有效量可在大约5-3000微克/kg体重、大约700-1000微克/kg体重的范围内或大于大约1000微克/kg体重。
本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用分离的miR基因产物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用一次(例如，作为单次注射或沉积(deposition))miR基因产物。可选择地，可以每天1次或2次对受试者施用miR基因产物，进行大约3至大约28天，特别地大约7至大约10天的时期。在特定的给药方案中，每天1次施用miR基因产物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，应理解，对受试者施用的miR基因产物的有效量可包括在整个给药方案中施用的基因产物的总量。
如本文中使用的，“分离的”miR基因产物是合成的或通过人工介入从天然状态改变或取出的miR基因产物。例如，合成的miR基因产物，或部分或完全从其天然状态的共存材料分离的miR基因产物被认为是“分离的”。分离的miR基因产物可以以大体上纯化的形式存在，或可以存在于已将所述miR基因产物递送入其中的细胞中。因此，有意地被递送至细胞或在细胞中表达的miR基因产物被认为是“分离的”miR基因产物。在细胞内从miR前体分子产生的miR基因产物也被认为是“分离的”分子。根据本发明，本文中描述的分离的miR基因产物可用于制造用于治疗受试者(例如，人)的肺癌转移和/或复发的药物。
分离的miR基因产物可使用许多标准技术获得。例如，可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成miR基因产物。合成RNA分子或合成试剂的提供商包括例如Proligo(Hamburg,Germany)、Dharmacon Research(Lafayette,CO,U.S.A.)、Pierce Chemical(part of Perbio Science,Rockford,IL,U.S.A.)、Glen Research(Sterling,VA,U.S.A.)、ChemGenes(Ashland,MA,U.S.A.)和Cruachem(Glasgow,UK)。
可选择地，可使用任何合适的启动子从重组环形或线性DNA质粒表达miR基因产物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括例如U6或H1RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其他合适启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组质粒还可包括用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。还可将从重组质粒表达的miR基因产物递送至癌细胞并且在其中直接表达。下面更详细地论述重组质粒将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
miR基因产物可从分开的重组质粒表达，或它们可从相同的重组质粒表达。在一个实施方案中，miR基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后通过合适的加工系统(包括但不限于癌细胞中现有的加工系统)将该前体分子加工成功能性miR基因产物。其他合适的加工系统包括例如体外果蝇细胞裂解物系统(例如，如属于Tuschl等人的美国公开专利申请2002/0086356中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文)和大肠杆菌RNA酶III系统(例如，如属于Yang等人的美国公开专利申请2004/0014113中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文)。
适合用于表达miR基因产物的质粒的选择、用于将核酸序列插入质粒以表达基因产物的方法以及将重组质粒递送至目的细胞的方法在本领域技术人员的能力之内。参见，例如,Zeng等人(2002),Molecular Cell9:1327-1333；Tuschl(2002),Nat.Biotechnol,20:446-448；Brummelkamp等人(2002),Science296:550-553；Miyagishi等人(2002),Nat.Biotechnol.20:497-500；Paddison等人(2002),Genes Dev.16:948-958；Lee等人(2002),Nat.Biotechnol.20:500-505；和Paul等人(2002),Nat.Biotechnol.20:505-508,其全部公开内容通过引用合并入本文。
在一个实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在CMV立即早期启动子(intermediate-early promoter)控制下编码miR前体RNA的序列。如本文中所使用的，“在启动子的控制下”是指编码miR基因产物的核酸序列位于启动子的3'端，以便启动子可起始miR基因产物编码序列的转录。
miR基因产物还可从重组病毒载体表达。预期miR基因产物可从两个分开的重组病毒载体或从相同的病毒载体表达。可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组病毒载体表达的RNA或所述RNA可在癌细胞中直接表达。下面更详细地论述重组病毒载体将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
本发明的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括但不限于U6或H1RNA pol III启动子序列，或巨细胞病毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组病毒载体还可包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
可使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，来源于腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如,慢病毒(LV)、弹状病毒(Rhabdoviruses)、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白(如果合适)来改变病毒载体的趋向性。
例如，可用来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies)、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本发明的慢病毒载体。可通过对载体进行工程改造以表达不同的衣壳蛋白血清型来制备本发明的AAV载体，使之靶向不同的细胞。例如，表达血清型2型基因组上的血清型2型衣壳的AAV载体称为AAV2/2。AAV2/2载体中的该血清型2型衣壳基因可用血清型5型衣壳基因替换，从而产生AAV2/5载体。用于构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术人员的能力之内；参见，例如,Rabinowitz,J.E.,等人(2002),J.Virol.76:791-801,其全部公开内容通过引用合并入本文。
适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将用于表达RNA的核酸序列插入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法和表达的RNA产物的回收在本领域技术人员的能力之内。参见，例如,Dornburg(1995),Gene Therap.2:301-310；Eglitis(1988),Biotechniques6:608-614；Miller(1990),Hum.Gene Therap.1:5-14；和Anderson(1998),Nature392:25-30,其全部公开内容通过引用合并入本文。
特别合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达miR基因产物的合适的AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Xia等人(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010,其全部公开内容通过引用合并入本文。用于表达miR基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Samulski等人(1987),J.Virol.61:3096-3101；Fisher等人(1996),J.Virol,70:520-532；Samulski等人(1989),J.Virol.63:3822-3826；美国专利5,252,479；美国专利5,139,941；国际专利申请WO94/13788；和国际专利申请WO93/24641，其全部公开内容通过引用合并入本文。在一个实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV载体表达miR基因产物。
在某些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6RNA启动子控制下的与polyT终止序列有效连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文中所使用的，“与polyT终止序列有效连接”是指编码有义或反义链的核酸序列以5'方向与polyT终止信号紧密邻接。在从载体转录miR序列的过程中，polyT终止信号用于终止转录。
受试者体内的癌细胞数目可通过直接测量或通过对原发性或转移性肿瘤块的大小的估计来确定。例如，受试者中癌细胞的数目可通过免疫组织学方法、流式细胞术或经设计用于检测癌细胞的特征表面标记的其他技术来测量。
还可通过任何合适的肠内或胃肠外施用途径对受试者施用miR基因产物。用于本方法的合适的肠内施用途径包括例如口服、直肠或鼻内给药。合适的胃肠外施用途径包括例如血管内给药(例如，静脉内团注(bolus injection)、静脉内输注、动脉内团注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注)；组织外周(peri-tissue)和组织内注射(例如，肿瘤外周和肿瘤内注射，视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其他安置装置(例如，视网膜丸剂(retinal pellet)或栓剂或包含多孔的、无孔的或凝胶状材料的植入物)；以及吸入。特别适合的施用途径是注射、输注和至肿瘤内的直接注射。
在本方法中，miR基因产物可以以裸露的RNA形式、与递送试剂一起或以包含表达miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)的形式对受试者进行施用。合适的递送试剂包括例如Mirus Transit TKO亲脂试剂、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子(例如，多聚赖氨酸)和脂质体。
包含表达miR基因产物的序列的重组质粒和病毒载体、以及用于将此类质粒和载体递送至癌细胞的技术在本文中进行了论述和/或在领域是公知的。
在特定的实施方案中，脂质体用于将miR基因产物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体还可增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质形成用于本发明的合适的脂质体，所述脂质通常包括中性的或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素例如期望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期来进行指导。已知许多用于制备脂质体的方法，例如如Szoka等人(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(其全部公开内容通过引用合并入本文)中所描述的方法。
用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。
用于本方法的脂质体还可进行修饰以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类经修饰的脂质体在表面具有调理作用-抑制部分或所述部分被整合入脂质体结构。在特别优选实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用-抑制部分和配体。
用于制备本发明的脂质体的调理作用-抑制部分通常是与脂质体膜结合的巨大的亲水聚合物。如本文中所使用的，抑制调理作用的部分，当其通过化学或物理方式(例如通过将脂溶性锚嵌入膜本身或通过与膜脂质的活性基团的直接结合)附着至膜时，与脂质体膜“结合”。此类抑制调理作用的亲水聚合物形成了显著减少脂质体被MMS和RES吸收的保护性表面层；例如，如美国专利4,920,016中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文。
适合于修饰脂质体的抑制调理作用的部分优选是具有大约500至大约40,000道尔顿，更优选大约2,000至大约20,000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)或其衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG硬脂酸酯；合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性的、分支的或树枝状聚酰胺；聚丙烯酸；多元醇，例如与羧基或氨基化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚乙二胺、聚乙烯胺或多聚核苷酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是包含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、角叉菜胶(carrageenan)；胺化的多糖或低聚糖(线性或分支的)；或羧基化的多糖或低聚糖，例如与具有所得的羧基的连接的碳酸的衍生物反应的多糖或低聚糖。优选，抑制调理作用的部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
可通过许多熟知的技术中的任一种将抑制调理作用的部分结合至脂质体膜。例如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯与磷脂酰乙醇胺脂质可溶性锚结合，然后再与膜结合。类似地，可使用Na(CN)BH3和溶剂混合物(例如以30:12比例的四氢呋喃和水)在60℃下通过还原胺化作用，用硬脂酰胺脂质可溶性锚衍生葡聚糖(dextran)聚合物。
用调理作用-抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体保持更长时间。因此，此类脂质体有时称为“隐形(stealth)”脂质体。已知隐形脂质体在通过多孔或“渗漏”微脉管系统饲喂的组织中积累。因此，由此类微脉管系统缺陷表征的组织例如实体瘤(例如，肺癌转移或复发)将有效地积累这些脂质体；参见Gabizon,等人(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,18:6949-53。此外，减少的通过RES的吸收通过阻止脂质体在肝和脾中的大量积累来降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用-抑制部分修饰的脂质体特别适合用于将miR基因产物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。
可在将它们给受试者施用之前，按照本领域已知的技术将miR基因产物配制为药物组合物，有时称为“药物”。因此，本发明包括用于治疗肺癌转移或复发的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，以及药学上可接受的载体。在具体的实施方案中，至少一种miR基因产物对应于与适当的对照细胞相比，在癌细胞中具有降低的表达水平的miR基因产物。
实施例
本发明的某些实施方案定义于本文的实施例中。应当理解，这些实施例，虽然显示了本发明的优选实施方案，但是仅以举例说明的方式给出。根据上述论述和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和变动，以使其适合各种用途和条件。
受EGFR和MET调节的MiRNA
为了鉴定受EGFR-和MET-调节的miRNA，我们使用shRNA慢病毒颗粒(图1A)稳定地沉默来自美国典型培养物保藏中心(ATCCC)的Calu-1细胞的EGFR和MET，并检查全局miRNA表达特征谱。在EGFR-和MET敲低(EGFR-KD和MET-KD)的Calu-1细胞中，我们分别鉴定了35和44个显著(P<0.05)失调的miRNA(图1B和图7A)。
显示了具有大于1.5倍(对于EGFR)或大于1.7倍(对于MET)的变化的miRNA。在比较这两列miRNA后，发现仅8个受EGFR和MET二者调节的miRNA(图1C)：miR-21、miR-221和miR-222、miR-30b和miR-30c、miR-29a以及miR-29c和miR-100。
miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222在MET和EGFR沉默后下调，并且显示最高的表达倍数变化。基于显示在对TKI的从头和获得的抗性中MET过表达的证据，还调查了2个在MET沉默后最差异地诱导的miRNA，miR-103和miR-203。使用定量RT-PCR(qRT-PCR)(图7B)和northern印迹(图1D)分析评估这6个miRNA在EGFR-KD和MET-KD Calu-1细胞中的表达。
酪氨酸-激酶-调节的miRNA靶
MET和EGFR RTK在肺癌肿瘤发生和进展中具有至关重要的作用。研究分析显示，miR-103和miR-203(其在MET敲低后增加)是肿瘤抑制因子，miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c(其在MET和EGFR沉默后减少)是致癌的。
人APAF1、BCL2L11(也称为BIM)、PRKCE(也称为PKC-ε)和SRC的3'非翻译区(3'UTR)包含分别特异于miR-221和miR-222、miR-30b和miR-30c、miR-103和miR-203的进化上保守的结合位点(图8A)。部分地基于它们在TKI敏感性中(BCL2L11(BIM)和AP3或TKI抗性(SRC)或在EGFR信号转导的负变构调节中(PRKCE(PKC-ε))的作用，调查这些基因。为了确定miRNA是否与这4个假定的靶基因直接相互作用，我们共转染pGL33'UTR萤光素酶报道分子载体与合成的miR-103、miR-203、miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c。
萤光素酶活性的减弱表明miRNA与PRKCE(PKC-ε)、SRC、APAF1和BCL2L11(BIM)3'UTR之间的直接相互作用(图1E)，并且靶基因抑制被互补种子位点中的突变或缺失所拯救(图1E和图8A)。
Western印迹分析显示miR-221、miR222、miR-103、miR-203、miR-30b和miR-30c表达与NSCLC细胞小组中靶蛋白质的量之间的反相关(P<0.05)(图8B,8C)，这通过测定皮尔逊相关系数来确认(图1F和图8D)。
来自免疫印迹分析的结果与使用报告基因测定获得的数据完全一致。H460细胞中miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c的异位表达显著减少BIM和APAF-1表达，miR-103和miR-203的加强表达明确地减少PKC-ε和SRC蛋白的浓度(图1G，图1H)。相反地，miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c的敲低增加APAF-1和BIM蛋白的浓度(图1-I)。由于MET敲低的Calu-1细胞显示APAF-1和BIM浓度的增加以及PKC-ε和SRC浓度的减少(图1J)，因此miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c在MET敲低的Calu-1细胞中的加强表达强烈地减少APAF-1和BIM表达(图9A)，而miR-103和miR-203的敲低增加SRC和PKC-ε表达(图9B)。
总体上，这些数据显示，在NSCLC细胞的MET沉默后，PKC-ε、SRC、APAF-1和BIM蛋白的表达的变化与这些特定miRNA之间的正相关(图1G-1J和图9A，9B)。使用miRNA原位杂交(ISH)，随后通过免疫组织化学(IHC)在110个肺癌样本中检测体内PKC-ε、SRC、APAF-1和BIM蛋白(图23-临床表1)，结果显示人肿瘤中这些蛋白质与miR-103、miR-203、miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c之间的更加显著的负相关(图10B)。
在大多数肺癌组织中在miR-203与SRC表达、miR-30c与BIM表达、miR-103与PKC-ε表达以及miR-222与APAF-1表达之间存在负相关(图10A，10B)。
此外，在52％(57/110)的相同的110个肺肿瘤样品(使用miRNA ISH和MET IHC显示的；图11A)中存在MET过表达，在过表达MET的肿瘤中存在低的miR-103和miR-203表达以及高的miR-222和miR-30c表达(图2A和图11A)中；相反地，在无MET表达的肿瘤中存在高miR-103和miR-203以及低miR-222和miR-30c表达。值得注意地，大部分过表达MET的肿瘤伴随转移(图11B)，这显示了，MET-调节的miRNA在肺癌细胞的转移扩散中具有作用。
将分析扩展至40个具有注释的临床史的独立肺肿瘤(图24-临床表2)，基于qRT-PCR分析，将所述肺肿瘤分成‘低’和‘高’MET及EGFR表达的两个组(图2和图11C)。
方差分析确认，miRNA(miR-30b和miR-30c以及miR-221和miR-222)在低和高的组之间差异表达，且使用皮尔逊系数，鉴定了MET与miR-103之间以及MET与miR-203之间的反相关(图2B,2C)。
使用针对MET和EGFR的IHC分析确认了qRT-PCR结果(图11D)。此外，相较于非转移性肿瘤，在具有远距离转移的肿瘤中观察到MET过表达，但在这40个肺癌中，在转移与EGFR表达之间不存在相关性(图2D和图11E)。
酪氨酸-激酶-调节的miRNA控制吉非替尼敏感性
现已发现，EGFR调节miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c，测定这些miRNA在具有野生型EGFR的NSCLC(Calu-1和A549细胞)(与具有外显子19缺失的EGFR的那些NSCLC(PC9和HCC827细胞)相比较)的吉非替尼诱导的细胞凋亡中的作用。Calu-1和A549细胞对所有测试的吉非替尼浓度(达到20μM)具有完全抗性；相反地，PC9和HCC827EGFR突变型细胞的生长即使在低剂量(0.1μM)的吉非替尼下亦被显著抑制(图3A)。值得注意地，在吉非替尼处理后，仅在PC9和HCC827吉非替尼敏感性细胞中存在显著的miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的下调和增加的量的BIM和APAF-1蛋白(图3B，3C)。磷酸化ERK的浓度在HCC827和PC9细胞中但非Calu-1细胞中相较于未处理的细胞显著更低(图3C)。
为了直接评估miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222在吉非替尼诱导的细胞凋亡中的关联性，就长期暴露于递增的药物浓度后获得的获得性吉非替尼抗性分析这些miRNA在NSCLC细胞中的表达：具有EGFR Thr790改变的抗吉非替尼PC9(PC9GR)细胞和具有MET扩增的抗吉非替尼HCC827(HCC827GR)细胞。与吉非替尼响应性亲代细胞相反，我们在用吉非替尼处理后未观察到更低的miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的表达或它们的相关靶的调节(图3D和图12A)。
值得注意的是，miR-30c、miR-221和miR-222在吉非替尼敏感性HCC827和PC9细胞中的过表达使得这些细胞相较于亲代PC9和HCC827细胞对利用吉非替尼的处理更不具有反应性(图4A和图13A)，miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的敲低导致Calu-1、HCC827GR和PC9GR细胞的增加的吉非替尼敏感性(图4A和图14B)，这显示，这些miRNA是TKI抗性的关键调节剂。
为了研究由miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222介导的APAF-1和BIM下调对细胞TKI响应的贡献，在抗吉非替尼A549细胞中过表达APAF-1和BIM。在过表达BIM和APAF-1的细胞中而非用空载体质粒转染的细胞中观察到吉非替尼诱导的聚-(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的切割(图4B)。相反地，在吉非替尼敏感性HCC827和PC9细胞中对吉非替尼的响应被BIM和APAF-1沉默减少(图4C)。克隆在BIM和APAF-1编码序列下游的BIM和APAF-1的野生型和突变的3'UTR(其用于萤光素酶测定；图1E)；和进行胱天蛋白酶-3/7和活力测定。在用吉非替尼处理A549细胞后细胞死亡未增加，共转染的突变或缺失恢复对吉非替尼的细胞凋亡响应，这显示，APAF-1和BIM对吉非替尼敏感性的作用与这些受miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222调节的蛋白质的敲低直接相关(图4D和图11C)。
因为MET过表达与吉非替尼抗性相关以及因为miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222也受MET调节，因此分析结果表明，MET可通过这些miRNA的调节介导对吉非替尼处理的抗性。因此，MET和EGFR的同时抑制可克服NSCLC的吉非替尼抗性。在MET敲低或用MET抑制剂SU11274处理后，观察到miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222在过表达MET的Calu-1和A549细胞中的下调(图14A，14B)。
此外，在暴露于不同浓度的吉非替尼的、SU11274处理的Calu-1和MET-KD Calu-1细胞中存在增加的胱天蛋白酶-3/7活性和减弱的细胞活力(图14C，14D)。综合起来，这些结果显示，MET过表达通过miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的上调诱导抗TKI Calu-1细胞对吉非替尼处理的抗性，以及需要EGFR和MET的抑制来关闭这些miRNA及其存活作用。
被EGFR和MET共同失调的其它miRNA，包括miR-21、miR-29a、miR-29c和miR-100(图1C)，在用吉非替尼处理的HCC827和PC9细胞中下调(图15A)。值得注意的是，在吉非替尼处理后在HCC827GR和PC9GR细胞中未观察到miR-21、miR-29a、miR-29c和miR-100的下调(图15B)；然而，miR-21、miR-29a、miR-29c和miR-100的加强表达增加HCC827和PC9细胞的吉非替尼抗性(图16A)。
因此，EGFR和MET通过共同的miRNA控制致癌信号转导网络。分析通过miRNA的寡核苷酸抑制剂产生的miR-21敲低是否可恢复具有从头或获得性抗性的NSCLC细胞的吉非替尼敏感性。miR-21的敲低增加A549、HCC827GR和PC9GR细胞对吉非替尼诱导的细胞凋亡的敏感性，这显示该miRNA在EGFR-MET信号转导途径中具有主要作用(图17A，17B)。
还研究在表达MET的Calu-1细胞中被强下调的miR-103和miR-203(图1D)。利用SU11274对Calu-1细胞的处理增加(P<0.05)miR-103和miR-203的表达(图18A)。
它们的靶，SRC和PKC-ε，通过激活AKT和ERK信号转导途径发挥促存活作用和促成吉非替尼抗性。因此，miR-103和miR-203在A549细胞中的过表达与AKT及其底物糖原合酶激酶3P(GSK3p)的减少的磷酸化和ERK的减少的磷酸化相关(图19A)。MET通过持久PI3K-AKT和ERK信号转导活化而诱导吉非替尼抗性。这些结果显示，MET过表达通过AKT-ERK途径的活化控制吉非替尼抗性，且至少部分地由miR-103和miR-203介导。
miR-103或miR-203的加强表达或PKC-E和SRC的沉默增加Calu-1细胞对吉非替尼的敏感性(如通过胱天蛋白酶-3/7和活力测定评估的；(图19B,19C)。值得注意地，相较于HCC827亲代细胞，在具有获得性MET扩增和吉非替尼抗性的抗吉非替尼HCC827细胞中，miR-103和miR-203表达减少，因而SRC和PKC-ε表达增加；因此显示了，MET至少部分通过miR-103、miR-203及其各自的靶控制对TKI的响应(图19D，19E)。
为了分析对吉非替尼的体内敏感性，本发明人用包含全长miR-103或miR-203或miR-221(抗-miR-221)和miR-30c(抗-miR-30c)的全长抑制剂的GFP慢病毒构建体稳定地转染A549细胞。miR-103和miR-203的过表达或miR-221和miR-30c的敲低在2周的处理后导致裸小鼠的肿瘤生长的显著抑制和增加的对吉非替尼诱导的细胞凋亡的敏感性(图4E、4F和20A)。通过qRT-PCR显示了，异种移植肿瘤中miR-221和miR222的下调以及miR-103和miR-203的上调(图20B)。
MiR-103和miR-203减少NSCLC细胞的迁移和增殖
为了进一步研究miR-103和miR-203在NSCLC肿瘤发生中的功能作用，评估miR-103和miR-203的功能获得以及PKC-ε和SRC的功能丧失对细胞迁移和细胞周期动力学的影响。在具有增加的miR-103和miR-203表达或减少的PRKCE(PKC-ε)和SRC表达的细胞中，相较于对照，迁移减少约60％(图5A)。使用伤口愈合测定进一步确认这些结果(图5B)。此外，用miR-103、miR-203或PRKCE(PKC-ε)和SRC siRNA转染的A549和Calu-1细胞显示增加的G1细胞分数和相应减少的S和G2-M期的细胞数目，miR-203和SRC siRNA相较于miR-103和PRKCE(PKC-ε)siRNA具有略微更强的作用(图5C)。
MiR-103和miR-203促进间充质-至-上皮的转化
在上皮-间充质转化(EMT)与导致疾病和转移的复发的化学抗性(包括对EGFR靶向疗法的抗性)的产生之间存在关联性。虽然鉴定作为EMT的基础的分子事件是被广泛研究的领域，但触发EMT在肿瘤细胞中的发作的事件未得到证明。本文中现已显示，在MET敲除后存在Calu-1细胞从成纤维样细胞形态至上皮极化表型的细胞形状的变化(图6A)。本文中现已显示，该形态学变化可以是间充质至上皮的转化的结果。测定至关重要的EMT相关标志物的表达；并且，在Calu-1MET敲低细胞中，相较于Calu-1Sh对照，减少的间充质标志物表达和增加的E-钙粘蛋白表达(图6B、6C、6D)，强烈地显示Calu-1细胞在MET敲低后至上皮表型的回复。值得注意地，在MET-KD细胞中，Snail蛋白表达比不具有MET敲低的细胞中的更低，定位于细胞质(图6B)，并且蛋白质本身假定为无功能的。未观察到EGFR-KD Calu-1细胞的形态学变化，其中miR-200c、miR-103和miR-203未被上调，如在MET敲低的细胞中那样(图7A)。
为了确定miR-103和miR-203是否参与间充质-上皮转化，将这些miRNA在Calu-1细胞中过表达，并且观察到几种间充质标志物的下调和增加的E-钙粘蛋白表达，这表明这些miRNA在间充质-上皮转化中起作用(图6E、6F、6G和图21A、21B)。此外，PRKCE(PKC-ε)和SRC在Calu-1细胞中的沉默，相较于用siRNA对照转染的细胞，增加E-钙粘蛋白的量和降低SNAIL、ZEB1(编码锌指E框结合1)、ZEB2(编码锌指E框结合2)、波形蛋白和纤连蛋白的mRNA的水平(图21C)。
miR-103靶向Dicer；因此，分析研究Dicer敲低对NSCLC的肿瘤发生和吉非替尼诱导的细胞凋亡的作用。值得注意地，几乎完全的Dicer敲低不仅减小吉非替尼抗性而且还减少NSCLC细胞的迁移和间充质标志物的表达，这显示，miR-103也可通过Dicer下调参与间充质-上皮转化过程(实施例3和图21)。
通过调节特定miRNA的表达，MET协调几个EMT相关途径包括Dicer、SRC、PKC-ε和AKT途径的会聚，从而支持了MET靶向可以是控制EMT和NSCLC进展的策略的可能性。
实施例1的讨论
EGFR和MET受体酪氨酸激酶，通过调节特定miRNA的表达，控制NSCLC的转移行为和吉非替尼抗性。
MET是miR-221和miR-222表达的调节剂。为了测定参与NSCLC肿瘤发生和药物抗性的途径，我们研究了受EGFR和MET酪氨酸激酶调节的miRNA。具体地，在本文中检查了miR-30b,miR-30c,miR-221和miR-222(它们受EGFR和MET二者调节)以及miR-103和miR-203(它们仅受MET调节)。
本文中现已显示，吉非替尼处理通过吉非替尼敏感性HCC827和PC9细胞中miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的下调和从而APAF-1和BIM的上调而触发程序化细胞死亡。同样地，作为MET过表达的结果，吉非替尼处理不减少抗吉非替尼的Calu-1、A549和HCC827GR细胞的miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222表达。因此，过表达MET的细胞中单独的EGFR抑制不足以诱导这些miRNA的下调，和从而诱导细胞死亡。
还显示了吉非替尼抗性可被MET抑制剂(其下调miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222并且使NSCLC对吉非替尼敏感)或被抗-miR-221、抗-miR-222和抗-miR-30c(其在体外和在异种移植小鼠模型中在体内强烈地增强吉非替尼敏感性)克服。综上所述，这些结果显示，特定miRNA例如miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的调节具有使肺肿瘤对TKI疗法敏感的治疗性应用。
PTEN丢失(通过使突变的EGFR与下游信号转导部分地解偶联和通过激活EGFR)促成埃罗替尼抗性。PTEN为miR-221和miR-222的靶。这两种miRNA不仅通过APAF-1而且还通过PTEN调节在NSCLC细胞的吉非替尼抗性中起作用。值得注意地，另一种靶向PTEN的miRNA(miR-21)的过表达诱导HCC827和PC9吉非替尼敏感性细胞的吉非替尼抗性。
本文中还显示了，miR-103和miR-203(其在MET沉默或用MET抑制剂SU11274处理后被上调)，通过下调PKC-ε、SRC和Dicer的表达诱导抗吉非替尼NSCLC的细胞凋亡，减少间充质标志物并增加上皮细胞连接蛋白(相较于野生型Calu-1细胞)。
在A549细胞的对吉非替尼的获得性抗性中起作用的EMT，显示间充质状态与NSCLC对吉非替尼或埃罗替尼的“固有抗性”相关。如图6H中的模型所示，MET表达下调miR-103和miR-203并且上调miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c，诱导NSCLC的吉非替尼抗性，和上皮-间充质转化。与对抗EGFR试剂的敏感性或抗性相关的预后和预测因子的鉴定是非常重要的，且异常的关键信号转导蛋白，包括RAS-MEK、雷帕霉素的AKT-哺乳动物靶(mTOR)和MET激酶，是至关重要的靶。
由于MET信号转导的活化或扩增通过多个独立机制促成TKI抗性和导致药物抗性的快速进化，因此，基于MET表达或MET调节的miRNA对NSCLC进行的分层现允许治疗的个体化。这样的分层可通过消除未从特定治疗方案受益的NSCLC患者的该特定方案的不必要的副作用来增强治疗功效。
此外，对肺肿瘤样本的临床验证研究显示，MET过表达和随后miR-103和miR-203的不存在可用于鉴定具有转移能力的原发性肺肿瘤。
此外，miR-103和miR-203的减少的表达预示着更具侵袭性的早期转移性肿瘤。
此外，与TKI组合的miRNA提供了治疗NSCLC的新策略。
实施例2
TaqMan阵列MicroRNA卡
TaqMan阵列人MicroRNA卡(Applied Biosystem)Set v3.0是包含总共384个TaqMan MicroRNA测定/卡的两个卡的组，其使得能够准确地定量754个人miRNA。每一个阵列上包含3个TaqMan MicroRNA测定(作为内源对照，以帮助数据标准化)和一个与人无关的TaqManMicroRNA测定(作为阴性对照)。通过使用Megaplex PreAmp Primers,Human Pool Set v3.0(对于其中敏感性是最重要的或其中样品是有限的情况)，能够进行另外的扩增前步骤。
体内实验
用对照miRNA、miR-103和miR-203或用miRNA的对照抑制剂或miR-221和miR-30c的慢病毒抑制剂(SBI)稳定地感染A549细胞。我们将5×106个活细胞皮下注射入6周龄雄性裸小鼠(Charles RiverBreeding Laboratories)的右胁腹。在肿瘤细胞接种后7天开始处理。通过口服强饲法，以200mg/kg体重的浓度(在无菌Milli-Q水中的1％Tween80(Sigma)中)(媒介物对照为无菌Milli-Q水中的0.5％Tween80)从周一至周五施用吉非替尼，进行2周。使用数字测径器每周评估肿瘤尺寸2次。通过测量肿瘤的长度(l)和宽度(w)和计算体积(V＝lw2/2)来测定肿瘤体积。我们在注射后35天杀死小鼠。使用学生氏t检验来评价对照与处理的小鼠之间的统计显著性。在俄亥俄州大学的动物维护管理及使用委员会批准后，进行小鼠实验。
迁移测定
具有8-μm多孔膜的Transwell插入室(Greiner Bio One)用于测定。用PBS洗涤细胞3次，将其添加至顶部小室的无血清培养基中。底部小室充满包含10％FBS的培养基。将细胞在37℃于5％CO2潮湿培养箱中温育24小时。为了定量迁移细胞，通过使用棉签去除顶部小室中的细胞，将迁移的细胞于PBS,25％戊二醛中固定，并用结晶紫进行染色，在相差显微镜下可视化并照像。随后将结晶紫染色的细胞溶解在醋酸和甲醇(1:1)中，测量在595nm处的吸光度。
免疫荧光
将细胞生长在Lab-Tek II CC2腔室载玻片(Nunc)上，用4％多聚甲醛固定，用0.2％Triton X-100/PBS进行透化，随后用10％绵羊血清(Caltag Laboratories)进行封闭。所有一抗来自Abcam。二抗为偶联于Alexa488的针对小鼠或兔的山羊抗体(Invitrogen)。使用鬼笔环肽试剂(Invitrogen)对F-肌动蛋白进行染色。利用DAPI(Sigma)显现细胞核。用SlowFade Gold抗衰退剂(Invitrogen)固定载玻片。
细胞死亡和细胞增殖定量。
为了检测胱天蛋白酶3/7活性，以一式三份将细胞培养在96孔板中，用5μM、10μM或15μM吉非替尼进行处理，随后按照制造商的说明书使用胱天蛋白酶-Glo3/7测定试剂盒(Promega)进行分析。连续变量表达为平均值±s.d。按照制造商的方案，用溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑(MTS)-Cell Titer96AQueous OneSolution Cell Proliferation测定(Promega)检查细胞活力。通过添加20μl MTS至每一个孔中来检测代谢上具有活性的细胞。在1小时的温育后，在Multilabel计数器(Bio-Rad Laboratories)中分析板。
统计分析
将学生氏t检验、单因素方差分析和Fisher's精确检验用于测定统计显著性。计算皮尔逊相关系数以测试miR-103、miR-203、miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c与它们假定的靶之间以及MET与miR-103和miR-203之间的反相关。对于所有检验，通过计算P值评估的统计显著性定义为P<0.05。
实施例3
通过miR-103耗尽Dicer减少了细胞迁移并促进吉非替尼敏感性。
miR-103对Dicer的部分减弱促进细胞迁移，然而更完全的Dicer敲低减弱细胞活力和减少细胞迁移。在MET沉默或miR-103加强表达后存在Dicer的显著下调(图22A)，这显示该系统中miR-103对Dicer的几乎完全沉默可促进癌细胞运动的减少和诱导程序化细胞死亡。为了在实验上阐明该现象，我们用Dicer siRNA转染A549和Calu-1细胞，诱导Dicer显著敲低至与通过miR-103表达实现的水平相似的水平(图22B)。相较于对照细胞，A549和Calu-1细胞的Dicer的全局性减弱对细胞迁移和吉非替尼抗性具有显著作用(图22C,22D)。此外，Dicer沉默减少Calu-1细胞的间充质标志物的表达和升高E-钙粘蛋白的表达水平，这显示miR-103不仅通过PKC-ε而且还通过Dicer下调诱导间充质上皮转化(图22E)。
萤光素酶测定
使用下列引物(分别地，按出现的顺序，SEQ ID NO1-12)PCR扩增人APAF-1、BIM(BCL2L11、PKC-ε和SRC基因的3'-UTR：
APAF-1Fw5'TCT AGA CTA ATG AAA CCC TGA TAT CAA C3’
APAF-1Rw5’TCT AGA ACTGCTACCCTGAGGCACAGCCT3’
BIM FW：5’TCTAGACTGGATGGGACTACCTTTCTGTTC3’
BIM RW：5’TCTAGACATAATCCTCTGAGAATAGGCCG3’
PKC-εFW D5’TCTAGAGTGACATGCAATGGCAACTCATGTGGAC3’
PKC-εRW D5’TCTAGAACAAAGAATCCCCAACACACCCCCCCAT3’
PKC-εFW S5’TCTAGATGATGCCCTGAGAGCCCACTGCAGTT3’
PKC-εRW S5’TCTAGATTGCTTCACTGCCAGGAGCCCCTGA3’
SRC-1-21Fw5’-GCT CTA GAG CGC AGC ACA AGG CCT TGC CTG GCC TGA TGA T-3’
SRC-1-2Rw5’-GCT CTA GAG CCA TGG CAG TGG GTA ACA CGT CCT CTT TCA C-3’
SRC-3-4Fw5’-GCTCTAGATCCCTGTGTGTGTGTATGTGTGTGCATGTGTGCGT3’
SRC-3-4Rw5’-GCT CTA GAG CGG AGA GGG ATT TGA GAG CTC GCT GGG GTG A-3’
并将其克隆在pGL3对照载体(Promega)中海肾萤光素酶终止密码子的下游。使用下列引物(分别地，按出现的顺序，SEQ ID NO13-24)通过反向PCR将这些构建体用于产生p3'-UTR-突变体-质粒：
APAF-1Mut FW5’GTGGTTGGATGAATAATATTAATCTCCTTTTTCCC3’
APAF-1 Mut Rw5’GGGAAAAAGGAGATTAATATTATTCATCCAACCAC3’
BIM MUT FW：5’GTGTAAGAATGGTGCAGTGTGTTTTCCCCCTG3’
BIM MUT RW5’GAGGGGGAAAACACACTGCACCATTCTTACAC3’
PKC-εFW MUT15’GAGA TTTTTGTATA TAGTGTTAGGCCT GTGGAATTAA TTCG3’
PKC-εRW MUT1 5’CGAATTAATTCCACAGGCCTAACACTATATACAAAAATCTC3’
PKC-εFW MUT2 5’CGTTGCATATAGAGGTATCAATGTTCAGGCATATTATAAAAC3’
PKC-εRW MUT25’GTTTTATAATATGCCTGAACATTGATACCTCTATATGCAACG3’
SRC-3°Mut Fw5’CCAAACATGTTGTACCATGGCCCCCTCATCATAG3’
SRC-3°Mut Rw5’CTATGATGAGGGGGCCATGGTACAACATGTTTGG3’
SRC-4°mut Fw5’GGCCAAGCAGTGCCTGCCTATGAACTTTTCCTTTCATACG3’
SRC-4°mut RW5’CGTATGAAAGGAAAAGTTCATAGGCAGGCACTGCTTGGCC3’
使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，用1μg的p3'UTR-APAF-1、p3'UTR-BIM、p3'UTR-PKCε、p3'UTR-SRC和用p3'UTRmut-APAF-1、p3'UTRmut-BIM、p3'UTRmut-PKCε、p3'UTRmut-SRC质粒和1μg的海肾萤光素酶表达构建体pRL-TK(Promega)共转染MeG01细胞。转染后24小时收获细胞，按照制剂商的说明书，利用Dual Luciferase Assay(Promega)对其进行测定。以一式三份进行3个独立的实验。
Western印迹分析
用放射免疫沉淀测定(PIRA)缓冲液(0.15mM NaCl,0,05mMTris-HCl,pH7.5,1％Triton,0.1％SDS,0.1％脱氧胆酸钠和1％Nonidet P40)从NSCLC提取总蛋白质。使用微型胶装置(Bio-RadLaboratories)将样品提取物(50μg)在7.5-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGS)上进行分离，随后转移至Hybond-C extra硝酸纤维素。膜用5％的在包含0.05％Tween20的Tris缓冲盐溶液中的脱脂乳封闭1小时，随后用一抗温育过夜，洗涤，用二抗温育，并通过化学发光来进行显现。
使用下列一抗：Apaf-1、Snail、Slug(abcam)、Src、Met、Dicer、波型蛋白、E-钙粘蛋白、Zeb1、Zeb-2(Santa Cruz)、Bim、pErks、总Erks、pAkt、总Akt、GAPDH、Parp(cell signaling)、Pkc-ε(BDtransduction lab)、β-肌动蛋白抗体、纤连蛋白(Sigma)。使用第二抗-兔或抗-小鼠免疫球蛋白G(IgG)抗体过氧化酶缀合物(Chemicon)。
实时PCR
使用标准TaqMan PCR试剂盒方案在Applied Biosystems7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)上进行实时PCR。10pl PCR反应包括0.67pl RT产物、1pl TaqMan通用PCR预混合物(AppliedBiosystems)、0.2mM TaqMan探针、1.5mM正向引物和0.7mM反向引物。将反应物在96孔板中于95℃温育10min，随后进行40个循环的(在95℃进行15s和在60℃进行1min)。以一式三份进行所有反应。阈值循环(CT)被定义为荧光超过固定阈值时的循环数目。将用于基因表达的相对定量的比较CT法(Applied Biosystems)用于测定miRNA和基因表达水平。y轴代表2(-ΔCT)，或不同miR和基因的相对表达。相对于U44和U48rRNA(对于microRNA)以及相对于GAPDH(对于基因)计算MiR表达。对于每一个数据点以一式三份进行实验，且使用软件(Bio-Rad)进行数据分析。
shRNA慢病毒颗粒转导
在病毒感染之前24小时将细胞涂板在12孔板中，并用l ml的完全最优化培养基(具有血清和抗生素)温育过夜。次日，除去培养基，添加1ml的含有凝聚胺(5μg/ml)的完全培养基。次日，通过添加50μl的对照shRNA、shEGFR、shMET慢病毒颗粒(Santa Cruz)至培养物来感染细胞。通过1pg/ml的二盐酸嘌呤霉素来选择稳定的克隆。
RNA提取和Northern印迹
按照制造商的说明书，用TRIzol ZL溶液(Invitrogen)提取总的RNA，利用Agilent BioAnalizer2100(Agilent,Palo Alto,CA,USA)评估RNA的完整性。进行Northern印迹。用作探针的寡核苷酸(分别地，按照出现的顺序，SEQ ID NO25-30)是成熟miRNA(miRNA登记)的互补序列：
miR-103：5’TCATAGCCCTGTACAATGCTGCT3’；
miR-203：5’CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC3’；
miR-30b：5’AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA
miR-30c：5’GCTGAGAGTGTAGGATGTTTACA3’；
miR-221：5’GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT3’；
miR-221：5’ACCCAGTAGCCAGATGTAGTAGCT3’
PKCε、SRC、BIM、APAF-1siRNA转染
将细胞培养至50％汇合，使用Lipofectamine2000，用100nM抗-PKC-H、抗-SRC、抗-BIM、抗-APAF-1或对照siRNA(Santa Cruz)、被设计用于敲低基因表达的3个靶特异性20-25nt siRNA的混合物进行瞬时转染。
福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片的MiRNA锁核酸原位杂交
使用包括在胃蛋白酶(1.3mg/ml)中消化30分钟的方案对脱蜡的人肺组织进行原位杂交(ISH)。具有缀合于5'末端的地高辛的、包含分散的锁核酸(LNA)修饰的碱基的探针的序列为：
miR-222(5’)ACCCAGTAGCCAGATGTAGCT(SEQ ID NO：31)；
miR103-(5’)AGCAGCATTGTACAGGGCTATGA(3’)(SEQ ID NO：32)；
miR-203-(5’)CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC(SEQ ID NO：33)
在60℃对探针混合物和组织miRNA进行共变性5分钟，随后在37℃杂交过夜，在4℃于0.2X SSC和2％牛血清白蛋白中进行严格洗涤10分钟。因碱性磷酸酶对色原体氮蓝四唑和溴氯吲哚磷酸(NBT/BCIP)的作用而观察到探针-靶复合物。阴性对照包括应当在此类组织中产生阴性结果的探针(混杂miRNA)的使用。不使用复染，以有利于PKC-ε、APAF-1、SRC、BIM和MET蛋白的共标记。
在miRNA的原位杂交后，使用SRC(1:100，细胞条件化30分钟)、PKC-ε(1:10，蛋白酶消化4分钟)、BIM(1:100，细胞条件化30分钟)、APAF-1(1:25，细胞条件化30分钟)和MET(1:50，细胞条件化30分钟)的最佳条件来分析载片的免疫组织化学(IHC)。使用MET(1:50，细胞条件化30分钟)和EGFR(1:100，细胞条件化30分钟)的最佳条件通过IHC分析30个独立的肿瘤样本。
为了进行免疫组织化学，使用来自Ventana Medical Systems的Ultrasensitive Universal Fast Red or DAB系统。随后分析表达PKC-ε、SRC、BIM、APAF-1、MET和miR-103、miR-203、miR-30c、miR-221/miR-222的肿瘤细胞的百分比，强调各自靶的定位。按照制造商的推荐，利用Nuance系统(Cambridge Research Institute)进行共表达分析。
肺癌样品和细胞系
110个肺癌组织购自US Biomax,Inc。40个肺肿瘤组织样品由俄亥俄州立大学的病理系提供。按照Ohio State Institutional ReviewBoard批准的方案获得所有人组织。将人Calu-1细胞系生长在含有10％热灭活胎牛血清(FBS)以及2mM L-谷氨酰胺和100U ml-1青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基中。将A549、H460、H1299、H1573、H292、HCC827、PC9、HCC827GR、PC9GR细胞系生长在含有10％热灭活的FBS以及2mM L-谷氨酰胺和100U ml-1青霉素-链霉素的RPMI中。
生物信息学分析
通过使用这些特定程序：Targetscan、Pictar、RNhybrid进行生物信息学分析。
具有miR-103和miR-203过表达和miR-221、miR-30c下调的稳定克隆的产生
用包含在两个不同启动子的控制下的全长miR-103、miR-203或抗-miR-221、miR-30c和GFP基因的人pre-microRNA表达构建体Lenti-miR表达质粒(System Biosciences)稳定地转染A549细胞。空载体用作对照。在293TN包装细胞系中用pPACKH1Lentivector包装质粒混合物(System Biosciences)包装Pre-miR表达和对照构建体。使用PEGit病毒沉淀溶液浓缩病毒，随后使用UltraRapid LentiviralTiter试剂盒(System Biosciences)分析滴度。通过FACS分析(FACScalibur；BD Bioscience)选择感染的细胞。通过荧光显微镜验证高于90％的感染效率，通过实时PCR确认miR表达。
miR-30b/c-和221/222-不敏感的BIM和APAF-1cDNA的产生
通过使用下列引物(分别地，按照出现序列，SEQ ID NO34-37)，扩增Bim以及APAF-1WT和突变的3'UTR，将其克隆在APAF-1和BIM编码序列(Origene)的下游：
APAF-1 FW 5’GGCCGGCC CTA ATG AAA CCC TGA TAT CAA C3’
APAF-1RW5’GGCCGGCC ACTGCTACCCTGAGGCACAGCCT3
BIM FW：5’GGCCGGCCCTGGATGGGACTACCTTTCTGTTC3’
BIM RW：5’GGCCGGCCCATAATCCTCTGAGAATAGGCCG3’
随后将构建体用于进行活力和胱天蛋白酶3/7测定。以一式三份进行实验至少3次。
划痕实验
用对照miR，miR-103或miR-203转染A549细胞，进行72小时。转染后24小时，用培养基5％FBS温育转染的细胞。在划痕后立即(0小时)获取图像和在24小时后获取图像。使用Image J软件定量迁移距离。通过将像素转化成毫米计算覆盖的距离。
细胞周期分析
为了进行细胞周期分析，将细胞涂板在6cm培养皿中，如图中所示进行转染，进行胰蛋白酶处理，于PBS中洗涤，在涡旋的条件下用冰冻的70％乙醇进行固定。将细胞于PBS中再水化，在进行流式细胞术分析之前在RT下用碘化丙啶(50mg/ml PI，0.5mg/ml RNA酶，于PBS中)染色30min。每一个实验独立地重复5次，对于每一个样品进行两次重复。
本说明书中引用的所有出版物，包括专利和非专利文献明确地通过引用并入本文。本文中对任何文献的引用不意味着承认，任何此类文献是相关现有技术水平。关于日期的所有记载或关于这些文献内容的陈述基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。
虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。
因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。

Claims (65)

1.一种组合物，其包含选自下列的核酸：APAF-1的miR-221/222结合位点的分离的核苷酸154至160(5'-ATGTAGC-3')；BIM的miR-30b结合位点的分离的核苷酸288至294(5'-TGTTTACA-3')；与PKC-ε的miR-103结合位点的27至33互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG-5')；与PKC-ε的miR-103结合位点的核苷酸1517至1523互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG)；与PKC-ε的miR-103结合位点的核苷酸1564至1570互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸656至662互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1116至1122互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1595至1601互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；和与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1706至1712互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')。
2.一种分离的核酸，其包含选自下列的核酸：5'-ATGTAGC-3'；5'-TGTTTACA-3'；3'-ACGACG-5'和3'-UAAAGU-5'。
3.本文权利要求的任一项的分离的核酸或组合物，其还包含选自启动子、增强子、重复序列、标志物和报道基因的元件。
4.本文权利要求的任一项的分离的核酸，其为探针、引物、miRNA、质粒、载体、病毒、细胞或修饰的生物。
5.一种物质组合物，其包含至少一种选自下列的miR：miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221。
6.本文权利要求的任一项的组合物，其包含至少2种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
7.本文权利要求的任一项的组合物，其包含至少3种选自miR-103；miR-203；抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
8.本文权利要求的任一项的组合物，其包含miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221。
9.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含化学疗法治疗。
10.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含肺癌化学疗法治疗。
11.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。
12.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。
13.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含选自西妥昔单抗；帕木单抗；扎芦木单抗；尼妥珠单抗和马妥珠单抗的单克隆抗体。
14.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含选自吉非替尼；埃罗替尼；拉帕替尼；AP26113和马铃薯羧肽酶抑制剂的小分子。
15.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含吉非替尼。
16.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含PKC-ε表达激动剂。
17.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含MET抑制剂。
18.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含SU11274。
19.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含DICER抑制剂。
20.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含E-钙粘蛋白表达激动剂。
21.本文权利要求的任一项的组合物，其还包含佐剂、赋形剂和/或其它药学上可接受的组合物。
22.本文权利要求的任一项的组合物，其被配制用于注射、输注、摄入或跨膜运输。
23.一种下调哺乳动物细胞的DICER的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物细胞中的可用度，和下调哺乳动物细胞的DICER。
24.一种减少哺乳动物癌细胞的迁移的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减少哺乳动物癌细胞的迁移。
25.一种减小哺乳动物癌细胞的EGFR化学疗法抗性的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减小哺乳动物癌细胞的EGFR化学疗法抗性。
26.一种减小哺乳动物癌细胞的吉非替尼抗性的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减小哺乳动物癌细胞的吉非替尼抗性。
27.一种减少间充质标志物在哺乳动物癌细胞中的表达的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减少哺乳动物癌细胞的间充质标志物的表达。
28.一种增加E-钙粘蛋白在哺乳动物癌细胞中的表达的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和增加哺乳动物癌细胞的E-钙粘蛋白的表达。
29.一种诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化。
30.权利要求26的方法，其中通过PKC-ε和/或DICER诱导间充质-上皮转化。
31.一种诱导哺乳动物癌细胞的程序化细胞死亡的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的程序化细胞死亡。
32.一种下调哺乳动物癌细胞的AKT/ERK的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化。
33.一种增加哺乳动物癌细胞的吉非替尼敏感性的方法，包括增加miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和增加哺乳动物癌细胞的吉非替尼敏感性。
34.本文权利要求的任一项的方法，其中所述癌细胞是肺癌细胞。
35.本文权利要求的任一项的方法，其中所述癌细胞是非小细胞肺腺癌细胞。
36.本文权利要求的任一项的方法，其中所述癌细胞是表皮癌细胞。
37.一种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的至少一种核酸，所述核酸选自：APAF-1的miR-221/222结合位点的分离的核苷酸154至160(5'-ATGTAGC-3')；BIM的miR-30b结合位点的分离的核苷酸288至294(5'-TGTTTACA-3')；与PKC-ε的miR-103结合位点的27至33互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG-5')；与PKC-ε的miR-103结合位点的核苷酸1517至1523互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG)；与PKC-ε的miR-103结合位点的核苷酸1564至1570互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-ACGACG-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸656至662互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1116至1122互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1595至1601互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')；和与SRC的miR-203结合位点的核苷酸1706至1712互补的分离的核苷酸(互补序列：3'-UAAAGU-5')。
38.一种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的选自5'-ATGTAGC-3'、5'-TGTTTACA-3'、3'-ACGACG-5'和3'-UAAAGU-5'的核酸。
39.一种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
40.一种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
41.一种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
42.一种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生长的量的miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221。
43.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用化学疗法治疗。
44.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用肺癌化学疗法治疗。
45.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。
46.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。
47.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用选自西妥昔单抗、帕木单抗、扎芦木单抗、尼妥珠单抗和马妥珠单抗的单克隆抗体。
48.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用选自吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、AP26113和马铃薯羧肽酶抑制剂的小分子。
49.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用吉非替尼。
50.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用PKC-ε表达激动剂。
51.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用MET抑制剂。
52.本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用SU11274。
53.本文权利要求的任一项的方法，其还包施用DICER抑制剂。
54.本文权利要求的任一项的方法，其还包施用E-钙粘蛋白表达激动剂。
55.本文权利要求的任一项的方法，其还包施用佐剂、赋形剂和/或其它药学上可接受的组合物。
56.本文权利要求的任一项的方法，其中施用是通过注射、输注、摄入或跨膜运输进行的。
57.本文权利要求的任一项的方法，其中所述肿瘤是肺肿瘤。
58.本文权利要求的任一项的方法，其中所述肿瘤是肺癌。
59.本文权利要求的任一项的方法，其中所述肿瘤是肺腺癌。
60.本文权利要求的任一项的方法，其中所述肿瘤是非小细胞肺癌。
61.本文权利要求的任一项的方法，其中肿瘤生长相较于对照减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％和至少60％。
62.一种促进需要伤口愈合促进的哺乳动物的伤口愈合的方法，包括施用促进伤口愈合的量的本文权利要求的任一项的组合物。
63.一种包括本文权利要求的任一项的组合物的试剂盒。
64.一种包含本文权利要求的任一项的组合物的细胞。
65.一种包含本文权利要求的任一项的组合物的小鼠。
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