CN110129367B - 一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110129367B
CN110129367B CN201910452287.4A CN201910452287A CN110129367B CN 110129367 B CN110129367 B CN 110129367B CN 201910452287 A CN201910452287 A CN 201910452287A CN 110129367 B CN110129367 B CN 110129367B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cationic
transfection
transfection reagent
cells
mixed solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910452287.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110129367A (zh
Inventor
刘立成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Botelong Immunization Technology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Botelong Immunization Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Botelong Immunization Technology Co ltd filed Critical Suzhou Botelong Immunization Technology Co ltd
Priority to CN201910452287.4A priority Critical patent/CN110129367B/zh
Publication of CN110129367A publication Critical patent/CN110129367A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110129367B publication Critical patent/CN110129367B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用，涉及基因工程领域。该阳离子型转染试剂包括聚乙烯亚胺、阳离子聚丙烯酰胺、阳离子脂质体、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵和维生素D。通过优化阳离子型转染试剂的组分，降低了细胞毒性，显著提高了转染效率，293FT细胞转染率达到95％以上。另外，可在贴壁细胞传代尚未贴壁时立即进行转染，能做到立传立转，转染操作简单、快速，可在一分钟内完成，可广泛用于各种哺乳动物细胞的快速大量瞬时转染。

Description

一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用。
背景技术
细胞转染是一种将外源基因导入真核细胞的技术，广泛应用于蛋白表达定位、基因功能研究、基因表达调控和基因治疗等方面，是基因工程领域重要的工具。细胞转染的方式可分为物理、化学和生物三类。其中物理介导方法有电穿孔法、显微注射和基因枪等；化学介导方法有阳离子脂质体法、磷酸钙共沉淀法和阳离子聚合物法等；生物介导方法主要是病毒介导的转染方法。虽然病毒介导的转染方法具有转染效率高，稳定性好，细胞毒性低等优点，但存在着在人体内有自我复制的风险，且实际操作程序复杂，成本较高。非病毒载体由于容易大规模制备、成本低、对外源基因无大小限制、具有低免疫原性和相对安全等优点，阳离子型转染试剂在实际应用中更是受关注。
阳离子脂质体法和阳离子聚合物法相比于其他转染方法，具有具有生物安全性高,细胞毒性小,操作简便等优点，也是目前比较常用的细胞转染方法。它们通过自身带有的阳离子可以快速的与阴离子(DNA、RNA)结合，形成带正电荷的聚合物，并与带负电荷的细胞膜融合，通过内吞作用将DNA、RNA导入细胞。在利用阳离子脂质体和阳离子聚合物进行细胞转染的过程中，转染试剂的选取及其转染条件的优化直接影响转染的效率。常用的阳离子聚合物有聚乙烯亚胺(PEI)、聚L-赖氨酸(PLL)和壳聚糖等。其中PEI是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子聚合物，每相隔两个碳原子就有质子化的氨基氮原子，使得该聚合物在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”。有研究表明，PEI的转染效率和细胞毒性主要是由分子量、支链化程度和阳离子电荷密度决定的，随着分子量的增大，转染效率逐渐提升，细胞毒性也上升；直链PEI分子与支链PEI分子相比细胞毒性更低，转染效率更高。PEI具有成本低，应用简便，可以在多种哺乳动物细胞中达到较高的转染效率，适用于无血清悬浮转染环境等优点。因此，PEI已经成为大规模基因瞬时表达领域最广泛使用的转染试剂。
转染试剂是影响转染效果主要因素，不同的宿主细胞适用的转染试剂也不同。在现有技术中，中国专利CN109136270A公开了一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用，该转染试剂包括阳离子聚合物、重组多肽和阳离子脂质体，利用该阳离子聚合物基因转染试剂转染48h后的细胞存活率为93.66％，毒性较低。中国专利CN102399809A公开了一种非病毒型转染试剂、其与质粒DNA复合物制备方法及应用，将PEI与磷酸钙组合转染细胞，转染后24小时的存活率大于90％。虽然转染试剂在不断完善，但仍存在一定的缺陷，比如：转染效率较低；转染后细胞存活率仍需提高；对于贴壁细胞传代时不能做到立传立传(即在贴壁细胞传代尚未贴壁时立即进行转染)；转染操作耗时较长等。因此，亟需开发一种高效、低毒、可快速大量瞬时转染表达目的蛋白，或大量制备各种病毒载体和假病毒的转染试剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种阳离子型转染试剂及其制备方法和在细胞转染中的应用。克服了现有技术存在的缺陷，该阳离子型转染试剂具有高效、低毒和易于使用等优点。
本发明一方面提供了一种阳离子型转染试剂，所述的阳离子型转染试剂包括聚乙烯亚胺、阳离子聚丙烯酰胺、阳离子脂质体、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵和维生素D；
所述的阳离子脂质体包括但不限于二油酰磷脂酰乙醇胺、双十二烷基二甲基溴化铵和双十八烷基氨基甘氨酰羧精胺中的任一种。
优选地，所述的阳离子脂质体为二油酰磷脂酰乙醇胺。
优选地，所述的阳离子型转染试剂包括聚乙烯亚胺5-15ng/mL、阳离子聚丙烯酰胺3-10ng/mL、阳离子脂质体10-30ng/mL、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵0.1-10ng/mL和维生素D1-5ng/mL。
进一步优选地，所述的阳离子型转染试剂包括聚乙烯亚胺10ng/mL、阳离子聚丙烯酰胺5ng/mL、阳离子脂质体20ng/mL、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵3ng/mL和维生素D 2ng/mL。
优选地，所述的聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺的终浓度比为0.5-5:1；进一步优选地，聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺的终浓度比为2:1。
优选地，所述的阳离子脂质体和维生素D的终浓度比为2-30:1；进一步优选地，所述的阳离子脂质体和维生素D的终浓度比为10:1。
本发明另一方面提供了一种上述的阳离子型转染试剂的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺按比例溶于PBS缓冲液中，搅拌混合均匀，过滤，得到混合液1；
(2)将阳离子脂质体和维生素D按比例溶于85％的乙醇水溶液中，搅拌混合均匀，过滤，得到混合液2；
(3)将步骤(1)得到的混合液1和步骤(2)得到的混合液2等体积混匀，加入脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵，搅拌混合均匀，过滤，灭菌，得到阳离子型转染试剂。
具体地，一种阳离子型转染试剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺按比例溶于PBS缓冲液中，室温搅拌15min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，得到混合液1，其中聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺的浓度分别为10-30ng/mL和6-20ng/mL；
(2)将阳离子脂质体和维生素D按比例溶于85％的乙醇水溶液中，室温搅拌20min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，得到混合液2，其中阳离子脂质体和维生素D的浓度分别为20-60ng/mL和2-10ng/mL；
(3)将步骤(1)得到的混合液1和步骤(2)得到的混合液2等体积混匀，加入终浓度为0.1-10ng/mL的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵，室温搅拌10min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，121℃灭菌40min，得到阳离子型转染试剂。
本发明另一方面还提供了一种上述的阳离子型转染试剂在细胞转染中的应用。
具体地，所述的应用包括以下步骤：
A.备转细胞的处理：吸去备转细胞的培养基，用PBS清洗细胞，加入无血清培养基，得到处理后的备转细胞；
B.转染试剂-核酸复合物的制备：将上述阳离子型转染试剂和核酸混合，得到混合液，用无血清培养基稀释混合液，震荡混匀，得到转染试剂-核酸复合物；
C.细胞转染：将步骤A得到的处理后的备转细胞和步骤B得到的转染试剂-核酸复合物混合均匀，培养，将培养基更换为完全培养基进行传代培养，得到转染后的细胞。
优选地，所述步骤A中备转细胞浓度为1-3×105个/mL；进一步优选地，备转细胞浓度为2×105个/mL。
优选地，所述步骤B中阳离子型转染试剂和核酸的体积质量比为1-5:1；进一步优选地，阳离子型转染试剂和核酸的体积质量比为3:1。
优选地，所述的备转细胞为哺乳动物细胞，包括但不限于293FT细胞、Hela细胞、BHK-21细胞、COS-7细胞、CHO-K1细胞、A549细胞、AD293细胞、MCF-7细胞和MRC-5细胞。
更具体地，所述的应用包括以下步骤：
A.备转细胞的处理：吸去备转细胞的培养基，用PBS清洗细胞3次，加入无血清培养基，调节备转细胞浓度为1-3×105个/mL，得到处理后的备转细胞，置于培养箱内备用；
B.转染试剂-核酸复合物的制备：将上述阳离子型转染试剂和含有荧光蛋白报告基因的核酸按照体积质量比为1-5:1混合，得到混合液，用无血清培养基30倍稀释混合液，震荡混匀，得到转染试剂-核酸复合物，-20℃保存，备用；
C.细胞转染：将步骤A得到的处理后的备转细胞和步骤B得到的转染试剂-核酸复合物混合均匀，37℃，5％CO2培养箱培养2h，将培养基更换为完全培养基进行传代培养，得到转染后的细胞。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
本发明提供了一种阳离子型转染试剂及其制备方法和在细胞转染中的应用。优化了阳离子型转染试剂的组分，降低了细胞毒性，显著提高了转染效率，293FT细胞转染率达到95％以上，其他哺乳动物细胞转染率均能达到85％以上；另一方面，可在贴壁细胞传代尚未贴壁时立即进行转染，能做到立传立转，转染操作简单、快速，可在一分钟内完成，可广泛用于各种哺乳动物细胞的快速大量瞬时转染。
附图说明
图1是本发明实验例1中的细胞转染结果图；
图2是本发明实验例1中的细胞转染效率图；
图3是本发明实验例2中CCK-8试剂处理后OD值柱状图。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1：一种阳离子型转染试剂及其制备
一种阳离子型转染试剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺按比例溶于PBS缓冲液中，室温搅拌15min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，得到混合液1，其中聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺的浓度分别为10ng/mL和20ng/mL；
(2)将双十二烷基二甲基溴化铵和维生素D按比例溶于85％的乙醇水溶液中，室温搅拌20min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，得到混合液2，其中双十二烷基二甲基溴化铵和维生素D的浓度分别为20ng/mL和10ng/mL；
(3)将步骤(1)得到的混合液1和步骤(2)得到的混合液2等体积混匀，加入终浓度为0.1ng/mL的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵，室温搅拌10min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，121℃灭菌40min，得到阳离子型转染试剂。
该阳离子型转染试剂包括：聚乙烯亚胺5ng/mL、阳离子聚丙烯酰胺10ng/mL、双十二烷基二甲基溴化铵10ng/mL、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵0.1ng/mL和维生素D 5ng/mL。
实施例2：一种阳离子型转染试剂及其制备
一种阳离子型转染试剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺按比例溶于PBS缓冲液中，室温搅拌15min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，得到混合液1，其中聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺的浓度分别为20ng/mL和10ng/mL；
(2)将二油酰磷脂酰乙醇胺和维生素D按比例溶于85％的乙醇水溶液中，室温搅拌20min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，得到混合液2，其中二油酰磷脂酰乙醇胺和维生素D的浓度分别为40ng/mL和4ng/mL；
(3)将步骤(1)得到的混合液1和步骤(2)得到的混合液2等体积混匀，加入终浓度为3ng/mL的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵，室温搅拌10min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，121℃灭菌40min，得到阳离子型转染试剂。
该阳离子型转染试剂包括：聚乙烯亚胺10ng/mL、阳离子聚丙烯酰胺5ng/mL、二油酰磷脂酰乙醇胺20ng/mL、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵3ng/mL和维生素D2ng/mL。
实施例3：一种阳离子型转染试剂及其制备
一种阳离子型转染试剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺按比例溶于PBS缓冲液中，室温搅拌15min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，得到混合液1，其中聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺的浓度分别为30ng/mL和6ng/mL；
(2)将双十八烷基氨基甘氨酰羧精胺和维生素D按比例溶于85％的乙醇水溶液中，室温搅拌20min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，得到混合液2，其中双十八烷基氨基甘氨酰羧精胺和维生素D的浓度分别为60ng/mL和2ng/mL；
(3)将步骤(1)得到的混合液1和步骤(2)得到的混合液2等体积混匀，加入终浓度为10ng/mL的脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵，室温搅拌10min，混合均匀，用0.2μm的滤膜过滤，121℃灭菌40min，得到阳离子型转染试剂。
该阳离子型转染试剂包括：聚乙烯亚胺15ng/mL、阳离子聚丙烯酰胺3ng/mL、双十八烷基氨基甘氨酰羧精胺30ng/mL、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵10ng/mL和维生素D 1ng/mL。
实施例4：细胞转染的方法
A.备转细胞的处理：吸去备转细胞(待传代的293FT细胞)的培养基，用PBS清洗细胞3次，加入无血清DMEM培养基，调节293FT细胞浓度为1×105个/mL，得到处理后的293FT细胞，置于37℃，5％CO2的培养箱内备用；
B.转染试剂-核酸复合物的制备：将阳离子型转染试剂和含有绿色荧光蛋白EGFP报告基因的真核表达载体pEGFP-N1(购自美国Clontech公司)按照体积质量比为1:1混合，得到混合液，用无血清DMEM培养基30倍稀释混合液，震荡混匀，得到转染试剂-核酸复合物，-20℃保存，备用；
C.细胞转染：取步骤A得到的处理后的293FT细胞接种于细胞培养板，加入等体积的步骤B得到的转染试剂-核酸复合物，边加边晃动培养板摇匀，37℃，5％CO2培养箱培养2h，将培养基更换为完全培养基进行传代培养，得到转染后的细胞。
实施例5：细胞转染的方法
与实施例4的区别仅在于，步骤A中的293FT细胞浓度为2×105个/mL；步骤B中阳离子型转染试剂和含有绿色荧光蛋白EGFP报告基因的真核表达载体pEGFP-N1(购自美国Clontech公司)的体积质量比为3:1。
实施例6：细胞转染的方法
与实施例4的区别仅在于，步骤A中的293FT细胞浓度为3×105个/mL；步骤B中阳离子型转染试剂和含有绿色荧光蛋白EGFP报告基因的真核表达载体pEGFP-N1(购自美国Clontech公司)的体积质量比为5:1。
对比例1：一种阳离子型转染试剂及其制备
该阳离子型转染试剂与实施例2的区别仅在于，不加入阳离子聚丙烯酰胺。
对比例2：一种阳离子型转染试剂及其制备
该阳离子型转染试剂与实施例2的区别仅在于，不加入维生素D。
对比例3：细胞转染的方法
与实施例5的区别仅在于，步骤B中阳离子型转染试剂和含有绿色荧光蛋白EGFP报告基因的真核表达载体pEGFP-N1(购自美国Clontech公司)的体积质量比为6:1。
实验例1：转染效率的测定
细胞转染24h后，在荧光显微镜下观察各孔的细胞转染情况，每组细胞观察10个视野，计算转染效率，转染效率(％)＝绿色荧光细胞数/总细胞数×100％，实验设置具体如表1所示，其中市售1和市售2分别为阳离子脂质体Lipofectamine2000细胞转染试剂(购自Invitrogen公司)和阳离子聚合物jetPEI细胞转染试剂(购自法国PolyPlus transfection公司)，所用的转染方法参考购买试剂的说明书。以不做转染的正常的293FT细胞为对照组，各组的转染效率如表2所示。
表1：细胞转染实验设置
实验编号 转染试剂 转染方法
1 实施例1 实施例5
2 实施例2 实施例5
3 实施例3 实施例5
4 对比例1 实施例5
5 对比例2 实施例5
6 市售1 说明书1
7 市售2 说明书2
8 实施例2 实施例4
9 实施例2 实施例6
10 实施例2 对比例3
表2：各组的转染效率
实验编号 转染效率
1 97.6％
2 98.1％
3 96.9％
4 92.8％
5 89.9％
6 67.3％
7 61.2％
8 95.7％
9 95.3％
10 83.4％
对照组 0.0％
检测结果表明，利用本发明提供的阳离子型转染试剂及其应用方法转染293FT细胞，相比于市售的阳离子脂质体Lipofectamine 2000细胞转染试剂和阳离子聚合物jetPEI细胞转染试剂，其转染效率更高，可以做到立传立转。
除了293FT细胞，本发明还对各种常见的哺乳动物细胞进行了细胞转染实验，包括：Hela细胞、BHK-21细胞、COS-7细胞、CHO-K1细胞、A549细胞、AD293细胞、MCF-7细胞和MRC-5细胞，所用的转染试剂为实施例2所述的阳离子型转染试剂，所用的转染方法为实施例5所述的方法。细胞转染24h后，在荧光显微镜下观察各孔的细胞转染情况，每组细胞观察10个视野，计算转染效率。细胞转染结果如图1所示，转染效率如图2所示。
检测结果表明，利用本发明提供的阳离子型转染试剂及其应用方法可用于转染各种常见的哺乳动物细胞，其转染效率高，均达到了85％以上。
实验例2：细胞毒性试验
在96孔板中分别接种处理后的备转细胞293FT细胞，用表1中的实验设置转染细胞，对照组不进行转染，在转染48h后，用CCK-8法测定细胞存活率，向每孔加入10μl CCK-8试剂，在培养箱内培养4小时，用酶标仪测定在450nm处的OD值(吸光度)，OD值越大表示细胞活性越高，结果如图3所示，并计算细胞存活率，细胞存活率％＝实验组OD值/对照OD值×100％，结果如表3所示。
表3：细胞存活率
实验编号 细胞存活率
1 94.94％
2 98.31％
3 93.26％
4 88.76％
5 84.83％
6 77.53％
7 80.90％
8 97.75％
9 97.19％
10 98.31％
对照组 100.00％
检测结果表明，本发明提供的阳离子型转染试剂相比于市售细胞转染试剂，降低了细胞毒性，提高了转染后细胞存活率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种阳离子型转染试剂，其特征在于，所述的阳离子型转染试剂包括聚乙烯亚胺5-15ng/mL、阳离子聚丙烯酰胺3-10ng/mL、阳离子脂质体10-30ng/mL、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵0.1-10ng/mL和维生素D1-5ng/mL；
所述的阳离子脂质体为二油酰磷脂酰乙醇胺、双十二烷基二甲基溴化铵和双十八烷基氨基甘氨酰羧精胺中的任一种。
2.根据权利要求1所述的阳离子型转染试剂，其特征在于，所述的阳离子脂质体为二油酰磷脂酰乙醇胺。
3.一种权利要求1-2任意一项所述的阳离子型转染试剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙烯亚胺和阳离子聚丙烯酰胺按比例溶于PBS缓冲液中，搅拌混合均匀，过滤，得到混合液1；
(2)将阳离子脂质体和维生素D按比例溶于85％的乙醇水溶液中，搅拌混合均匀，过滤，得到混合液2；
(3)将步骤(1)得到的混合液1和步骤(2)得到的混合液2等体积混匀，加入脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸铵，搅拌混合均匀，过滤，灭菌，得到阳离子型转染试剂。
4.一种权利要求1-2任意一项所述的阳离子型转染试剂在细胞转染中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用包括以下步骤：
A.备转细胞的处理：吸去备转细胞的培养基，用PBS清洗细胞，加入无血清培养基，得到处理后的备转细胞；
B.转染试剂-核酸复合物的制备：将权利要求1-2任意一项所述的阳离子型转染试剂或由权利要求3制备得到的阳离子型转染试剂和核酸混合，得到混合液，用无血清培养基稀释混合液，震荡混匀，得到转染试剂-核酸复合物；
C.细胞转染：将步骤A得到的处理后的备转细胞和步骤B得到的转染试剂-核酸复合物混合均匀，培养，将培养基更换为完全培养基进行传代培养，得到转染后的细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤A中备转细胞浓度为1-3×105个/mL。
CN201910452287.4A 2019-05-28 2019-05-28 一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用 Active CN110129367B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910452287.4A CN110129367B (zh) 2019-05-28 2019-05-28 一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910452287.4A CN110129367B (zh) 2019-05-28 2019-05-28 一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110129367A CN110129367A (zh) 2019-08-16
CN110129367B true CN110129367B (zh) 2020-04-07

Family

ID=67582482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910452287.4A Active CN110129367B (zh) 2019-05-28 2019-05-28 一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110129367B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7271026B1 (ja) * 2021-12-28 2023-05-11 株式会社Hyperion Drug Discovery 遺伝子導入細胞の免疫応答を回避させるための剤
CN114686520B (zh) * 2022-05-05 2022-12-06 广州蕊特生物科技有限公司 一种转铁蛋白细胞转染方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011133617A1 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nano-hybrid delivery system for sequential utilization of passive and active targeting
CN103360531A (zh) * 2013-07-30 2013-10-23 中国科学院上海有机化学研究所 一类侧基天然精氨酸修饰的聚(甲基)丙烯酰胺阳离子聚合物、制备方法及用途
CN109136270A (zh) * 2018-08-06 2019-01-04 广州辉园苑医药科技有限公司 一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102477439B (zh) * 2010-11-22 2014-11-26 苏州瑞博生物技术有限公司 三元复合物和含有三元复合物的液体及制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011133617A1 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nano-hybrid delivery system for sequential utilization of passive and active targeting
CN103360531A (zh) * 2013-07-30 2013-10-23 中国科学院上海有机化学研究所 一类侧基天然精氨酸修饰的聚(甲基)丙烯酰胺阳离子聚合物、制备方法及用途
CN109136270A (zh) * 2018-08-06 2019-01-04 广州辉园苑医药科技有限公司 一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110129367A (zh) 2019-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fus-Kujawa et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro
US8507270B2 (en) Method of transfecting cells with nucleic acids using acidified polyethylenimine
Xie et al. PEI/DNA formation affects transient gene expression in suspension Chinese hamster ovary cells via a one-step transfection process
CN110129367B (zh) 一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用
Sun et al. High‐density transient gene expression in suspension‐adapted 293 EBNA1 cells
WO2019228108A1 (zh) 用于提高细胞转染效率的试剂组合物
Park et al. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide–conjugated polyethylenimine
Kadlecova et al. Hyperbranched polylysine: a versatile, biodegradable transfection agent for the production of recombinant proteins by transient gene expression and the transfection of primary cells
KR20190039021A (ko) 대규모 pei-매개된 플라스미드 형질도입
WO2022170835A1 (zh) 可电离的阳离子脂质类似物材料在作为核酸药物递送载体或转染试剂中的应用
Chen et al. The transient expression of CHIKV VLP in large stirred tank bioreactors
Geisse et al. Large-scale transient expression of therapeutic proteins in mammalian cells
CN111154805B (zh) 阳离子多聚体dna复合物及促进目标质粒转染细胞及表达的方法
You et al. Enhancement of transfection efficiency by protamine in DDAB lipid vesicle-mediated gene transfer
US20230272416A1 (en) Method and system for delivering nucleic acid
CN108034676B (zh) 一种基因载体系统及其构建方法
CN106086069B (zh) 一种转基因复合物及其制备方法与应用
Cao et al. Linear-branched poly (β-amino esters)/DNA nano-polyplexes for effective gene transfection and neural stem cell differentiation
Wang et al. Cell compatibility of an eposimal vector mediated by the characteristic motifs of matrix attachment regions
CN105018527B (zh) 一种慢病毒转染鱼类或两栖类细胞系的方法
Desai et al. Transfecting CHO-K1 cells: Comparison of CaPO4, electroporation and lipoplex method with in-house prepared polyplex
Mishra et al. Combinatorial library of biodegradable polyesters enables delivery of plasmid DNA to polarized human RPE monolayers for retinal gene therapy
CN110438162B (zh) 一种改良型非脂质体转染试剂盒及其应用方法
CN110218701B (zh) 一种筛选miRNA调控剂的细胞模型及应用
CN118109518B (zh) 基于mRNA-LNP的诱导多能性干细胞的重编程方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant