CN101979094A - 一种制备可控降解中药胶原方法及其制备的中药胶原 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备可控降解中药胶原方法及其所制得的可控降解中药胶原。该方法包括:将含有羧基团的中药与EDC/NHS浸入0.05M MES溶液中,控温37℃反应10min后加入胶原或明胶,挤出气泡,60次/min摇晃反应4h;滤去药液,加入0.1M Na2HPO4溶液,控温37℃反应2h后,过滤去除Na2HPO4溶液,加入4M氯化钠液,24h换液4次过滤去氯化钠液,用三蒸水洗5遍后,冻干机冻干,包装;以钴60或环氧乙烷消毒,常温保存即可。本发明的可控降解胶原制备方法,步骤少,操作简单,具有一定的通用性。所制备出的可控降解胶原,释放含有羧基团中药提高疗效,同时增加组织相容性。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药胶原,具体涉及一种可控降解中药胶原制备方法及其制备的中药胶原。
背景技术
胶原,尤其是一型胶原,是生物体各种结缔组织的主要组成分。具有促进组织愈合、可体内降解且降解碎片具有组织相容性的特性,已成为组织工程中应用最广的生物材料。胶原经过修饰后可以提高组织相容性及干预血管生成。应用胶原作为支架制造促血管生长生物材料植入促血管生长之生长因子为目前国际研究开发的前沿与热点之一。但是将胶原作为载药支架释药有效药物的研究尚处起步阶段。查阅文献有关将中药植物有效成分直接与胶原蛋白结合,完全去除交联剂,通过对胶原的可控降解来释放药物的研究,尚未见报道。
发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的不足,本发明的目的是提供一种可控降解中药胶原制备方法,以实现有效控制胶原的降解及药物的释放。本发明的另一目的是提供上述方法制备的中药胶原。
技术方案:为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种制备可控降解中药胶原方法,包括以下步骤:
(1)将含有羧基团的中药与EDC/NHS按重量比0.5~5∶1,浸入0.05M MES溶液中,控温37℃,反应10min后加入胶原或明胶,挤出气泡,60次/min摇晃反应4h,完成药物与胶原多肽的结合;其中,EDC与NHS的体积比为1∶0.6,中药与胶原或明胶的重量比为:1∶1;
(2)过滤去除步骤(1)中的EDC/NHS药液,加入0.1M Na2HPO4溶液,控温37℃,反应2h后,过滤去除Na2HPO4溶液,加入4M氯化钠液,每6h更换一次氯化钠液,24h换液4次,过滤去氯化钠液,用三蒸水洗5遍后,冻干机冻干,包装;其中,Na2HPO4溶液、氯化钠液和三蒸水与中药的体积比均为2∶1
(3)用钴60或环氧乙烷消毒4h,常温保存,即可。
步骤(1)中,所述的含有羧基团的中药为黄芪多糖。
一种采用上述的制备可控降解中药胶原方法制备出的可控降解中药胶原。
一种采用上述的制备可控降解中药胶原方法制备出的可控降解黄芪多糖胶原。
本发明的可控降解胶原,由含有羧基团中药与胶原组成,成分为中药有效成分与胶原蛋白,配比范围根据临床需要进行调整。含有羧基团中药胶原是一种随胶原降解而原位释放含有羧基团中药的可控降解释药系统。通过交联剂使含有羧基团中药的羧基团与胶原多肽链共价结合,胶原肽链之间亦互相交联,交联剂在反应完成后通过充分洗涤洗出。
目前,药物直接载入胶原,引起迅速释放,达不到长期释放的要求,胶原在体内降解迅速,通过交联剂修饰胶原可以控制胶原降解速率,但是目前临床应用的修饰胶原胶原一定的细胞毒性。本发明的可控降解胶原,采用水溶性交联剂将含有羧基团中药与胶原多肽共价结合,剩余的交联剂将胶原多肽共价结合,结合后交联剂将以原型通过洗涤洗出胶原,胶原内交联剂零残留。通过交联剂与胶原及含有羧基团中药的比例来控制胶原的降解及药物的释放。可控降解含有羧基团中药胶原涉及组织工程与药物可控释放制剂学。临床可用于创面覆盖促进组织修复、组织缺损填充、手术中创面填塞止血、抗肿瘤血管新生等。
有益效果:本发明的可控降解胶原制备方法,步骤少,操作简单,具有一定的通用性。所制备出的可控降解胶原,释放含有羧基团中药提高疗效,同时增加组织相容性。临床可用于创面覆盖促进组织修复、组织缺损填充、手术中创面填塞止血、抗肿瘤血管新生等。
附图说明
图1是可控降解中药胶原的结构示意图。其中,1为胶原,2为中药,3为EDC/NHS交联剂。
图2是实施例3的各组微血管的计数图。从图中明显看出,20μg/ml黄芪多糖+胶原组微血管密度明显高于其他各组,存在显著差异:D与C、E组比较P<0.05;D与A、B组比较P<0.01。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的解释。
以下实施例所使用到的药品和试剂如下:
EDC为碳化二亚胺,交联剂;NHS为N-羟基琥珀酰亚胺;MES为脂肪醇醚琥珀酸酯磺酸盐。
0.05M MES为采用500ml蒸馏水加5.3325gMES配置;0.1M Na2HPO4为采用蒸馏水500ml加Na2HPO45.5g配置;4M NaCl为采用蒸馏水500ml加117g NaCl配置。
实施例1
一种制备可控降解中药胶原方法,包括以下步骤:
(1)将含有羧基团的中药与EDC/NHS按重量比0.5~5∶1,浸入0.05M MES溶液中,控温37℃,反应10min后加入胶原或明胶,挤出气泡,60次/min摇晃反应4h,完成药物与胶原多肽的结合;其中,EDC与NHS的体积比为1∶0.6,中药与胶原或明胶的重量比为:1∶1;
(2)过滤去除步骤(1)中的EDC/NHS药液,加入0.1M Na2HPO4溶液,控温37℃,反应2h后,过滤去除Na2HPO4溶液,加入4M氯化钠液,每6h更换一次氯化钠液,24h换液4次,过滤去氯化钠液,用三蒸水洗5遍后,冻干机冻干,包装;其中,Na2HPO4溶液、氯化钠液和三蒸水与中药的体积比均为2∶1
(3)用钴60或环氧乙烷消毒4h,常温保存,即可。
该可控降解中药胶原的结构如附图1所示,1为胶原,2为中药,3为EDC/NHS交联剂
实施例2
控温37℃,在0.05mol/L MES缓冲液中(pH5.6),以交链剂EDC/NHS(1∶0.6)活化黄芪多糖中羟基团,反应10min,将胶原浸入反应液,60次/min轻微晃动,反应4h,反应前,轻微挤压以排出胶原内气体。反应完成后,用0.1mol/L Na2HPO4洗涤2h,以中止反应。过滤去除Na2HPO4溶液,用4mol/L NaCl溶液洗涤,24h换液4次,过滤去除氯化钠溶液,用三蒸水洗涤,24h换液5次。接着将标本消毒后备用。
实施例3
以黄芪多糖均匀分布于I型胶原中,接着行低温(-20℃)冻干形成黄芪多糖胶原海绵(直径1cm,厚度:0.2cm)。空白胶原组即为I型胶原,接着行低温(-20℃)冻干形成胶原海绵。分组情况如表1所示。
表1分组情况表
其中,A0E0:4mg胶原仅与缓冲液反应;A1E1:1mg黄芪多糖与1mgEDC/0.6mgNHS反应;A0.5E1:0.5mg黄芪多糖与1mgEDC/0.6mgNHS反应;A2E1:2mg黄芪多糖与1mgEDC/0.6mgNHS反应。
一、对鸡胚CAM微血管生成的影响
(1)种蛋孵育于电热培养箱中,温度37.5-37.8℃,相对湿度40-70%,并保证氧气的供应。每天转蛋两次以促进羊膜运动,防止胚胎发生粘连,每日观察,随时淘汰死弱精、死胎及胚胎发育不良的种蛋。孵育第7天,酒精消毒种蛋气室(大头端)表面2×3cm区域,用牙科砂轮在蛋壳表面刻划出凹痕,用眼科弯镊小心揭去蛋壳1.5×1.5cm小窗,然后用一次性注射器在CAM上滴一滴生理盐水,用注射器针头透过盐水滴在气室膜上轻轻点刺一下,然后用针头小心推开气室膜并及时用眼科弯镊夹住,在注射针头协助下,轻轻揭去气室膜,使CAM完全暴露。
(2)制备假气室后,取配制的胶原置于中央血管稀少区,用透明胶带密封窗后继续孵育,观察鸡胚的存活情况。
(3)标本的肉眼观察:死亡率、标本降解情况、尿囊膜血管生长状况、尿囊膜“吞噬”标本状况。于标本30cm处固定照相机,调焦后行大体标本照相记录。
(4)加药3天,剪开透明胶带纸,计数鸡胚的存活个数,并由观察窗加入甲醇∶丙酮(1∶1)的固定液固定15min,剪下CAM,将其平铺于载玻片上,风干。固定好的尿囊膜玻片以光镜下,50倍放大,格子法行微血管(直径在20um一40um之间)计数,每个标本选两个不重叠的视野,由两个人计数,结果取均值,在计数同时,行显微镜照相。观察解剖显微镜下以相同放大倍数计数血管,以实验部位边缘(即微孔滤膜载体边缘)1mm范围内为一级血管,以实验部位边缘5mm处为二级血管。凡属趋向性生长的血管,即为载体从中心发出,与滤膜半径的夹角小于45°者均予计数,而穿行、绕行的血管则不算在内。
结果如附图2所示,A1E1组黄芪多糖胶原可以明显促进血管生长,显著高于其他各组,有统计学差异。
二、大鼠胶原标本中血红蛋白含量
(1)大鼠损伤模型的制备及分组
SD大鼠饲养于江苏省中医院动物实验室,动物饲料由本院动物室提供,室温22℃。将SD大鼠20只(雌雄各半,每只200~250g)常规饲养3d后,用剃刀剃去背部区域的毛,于大鼠腹腔内注射3%戊巴比妥钠0.15ml/100g麻醉,麻醉成功后,碘附消毒,用外科方法纵形切开背部皮肤全层1.5cm,皮下形成2cm×2cm的口袋。将大鼠随机分为2组(每组10只):空白胶原组;黄芪多糖胶原(A1E1)组。各组大鼠分别置入相应的胶原标本,每只大鼠置入4个,缝合切口,无菌敷料包扎创面,待清醒后单笼饲养。每组死亡大鼠均重新造模补充至10只完成实验。共进行3批次实验。
分别于造模及分组处理后第3d(每组取3只)、7d(每组取3只)、14d(每组取4只)处死大鼠,解开缝线,取出胶原。每只大鼠取2个标本,精确称各样本质量,采用氰化正铁血红蛋白(hemiglobincyanide,HICN)比色法,测定各管吸光度(A)值。
(2)具体操作步骤:取氰化高铁血红蛋白试剂1ml,用蒸馏水稀释至100ml,备用;取稀释应用液2ml加胶原块(称重)置旋涡混合器上振荡,10分钟后取下,静置5分钟;以蒸馏水或稀释应用液调零,于540nm波长下,用1cm光径比色杯比色,测各管吸光度A值;计算:血红蛋白(g/L)=A值×367.7,计算出各组样本中血红蛋白的含量。
(3)结果如表2所示。
表2组样本中血红蛋白的含量表
注:大鼠胶原标本中血红蛋白含量:空白胶原组与黄芪多糖胶原组存在显著差异(#***p<0.05)
三、羟脯氨酸含量
(1)分别于造模及分组处理后第3d(每组取3只)、7d(每组取3只)、14d(每组取4只)处死大鼠,解开缝线,取出胶原附近的肉芽组织,每只大鼠取2处,精确称各样本质量,采用大鼠羟脯氨酸试剂盒进行检测,计算出羟脯氨酸的含量,以此反映大鼠结缔组织的胶原代谢情况。
(2)具体检查步骤如下:
组织匀浆:取肉芽组织块1g,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,放入5或10ml的小烧杯;用移液管量取预冷的匀浆介质(ph7.4,0.01mol/LTris-HCL,0.0001mol/L EDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化钠溶液),匀浆介质体积总量为组织块重量的9倍,移液器取总量的2/3的匀浆介质于烧杯中,用眼科小剪尽快剪碎组织块(操作在冰水浴中进行);将制备好的10%匀浆用低温低速离心机3000r/min离心15分钟,取上清转管,-70℃保存备用。
匀浆的方式:超声匀浆
超声粉碎:超声粉碎机进行粉碎,Soniprep150型超声波发生器以40安培,5秒/次,间隙10秒反复3~5次使细胞破碎,取少量组织匀浆做涂片,显微镜下观察细胞是否磨破。
ELISA检测:实验开始前,各试剂均平衡至室温,实验前对样品进行稀释,使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围。加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl(防止气泡,加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁),轻轻晃动混匀,酶标板加上覆膜,37℃温育2小时;弃去液体,甩干。每孔加检测溶液A工作液100μl(临用前配制),酶标板加上覆膜,37℃温育1小时;弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约400μl/每孔,甩干(也可轻拍将孔内液体拍干);每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μl,加上覆膜,37℃温育1小时;弃去孔内液体,甩干,洗板5次,方法同以上步骤;每孔加底物溶液90μl,酶标板加上覆膜37℃避光显色(反应时间控制在15-30分钟,当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显时,即可终止);每孔加终止溶液50μl,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同;立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值),在加入终止溶液15分钟以内检测。
(3)结果如表3所示
表3大鼠肉芽组织中羟脯氨酸含量表
注:大鼠创面肉芽组织中羟脯氨酸含量:空白胶原组与黄芪多糖胶原组存在显著差异(#***p<0.05)
实施例3可控降解黄芪、脉络宁胶原促鸡胚尿囊膜血管新生的协同作用
操作方法:实验分空白组、控制组(单纯胶原)、黄芪组(黄芪注射液1mL胶原)、脉络宁组(脉络宁注射液1mL胶原)、黄芪脉络宁组(黄芪注射液及脉络宁注射液各0.5mL胶原),各组植入鸡胚尿囊膜孵化7d后取出,测定鸡胚尿囊膜内微血管数、各组胶原内微血管数、血红蛋白含量、rhVEGF165阳性细胞数。
各实验组鸡胚尿囊膜内血管呈轮辐状生长及鸡胚尿囊膜包裹标本率高于空白组与控制组,鸡胚尿囊膜内微血管数、胶原内微血管数、血红蛋白含量、rhVEGF165阳性细胞数均高于控制组,差异有显著性意义(P<0.01);其中黄芪脉络宁组又高于黄芪组与脉络宁组,差异有显著性意义(P<0.05),黄芪脉络宁组鸡胚尿囊膜血管长入胶原内疗效有好于鸡胚尿囊膜内血管新生。提示黄芪、脉络宁胶原后可以促进鸡胚尿囊膜内血管新生并刺激血管长入胶原内,黄芪与脉络宁合用具有协同作用,机制之一为刺激血管内皮细胞血管内皮生长因子的表达。
Claims (4)
1.一种制备可控降解中药胶原方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将含有羧基团的中药与EDC/NHS按重量比0.5~5∶1,浸入0.05M MES溶液中,控温37℃,反应10min后加入胶原或明胶,挤出气泡,60次/min摇晃反应4h,完成药物与胶原多肽的结合;其中,EDC与NHS的体积比为1∶0.6,中药与胶原或明胶的重量比为:1∶1;
(2)过滤去除步骤(1)中的EDC/NHS药液,加入0.1M Na2HPO4溶液,控温37℃,反应2h后,过滤去除Na2HPO4溶液,加入4M氯化钠液,每6h更换一次氯化钠液,24h换液4次,过滤去氯化钠液,用三蒸水洗5遍后,冻干机冻干,包装;其中,Na2HPO4溶液、氯化钠液和三蒸水与中药的体积比均为2∶1
(3)用钴60或环氧乙烷消毒4h,常温保存,即可。
2.根据权利要求1所述的制备可控降解中药胶原方法,其特征在于,步骤(1)中,所述的含有羧基团的中药为黄芪多糖。
3.一种采用权利要求1所述的制备可控降解中药胶原方法制备出的可控降解中药胶原。
4.一种采用权利要求1所述的制备可控降解中药胶原方法制备出的可控降解黄芪多糖胶原。
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