CN101385870A - 一种改良去细胞组织工程瓣膜/血管支架的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环氧氯丙烷联合RGD改良的去细胞组织工程瓣膜/血管支架的方法，该方法利用环氧氯丙烷的环氧基团将细胞黏附识别受体的功能域RGD(YGRGDSP)多肽交联固定在去细胞工程瓣膜/血管支架材料上，同时环氧氯丙烷的化学交联功能又可将去细胞支架材料的主体成分——胶原蛋白充分交联，以达到抗钙化和减缓支架材料体内酶解的速度，最终使改良后的去细胞组织工程瓣膜/血管支架较具有更加良好的生物学和力学性能，对种子细胞的高粘附率，在体外和体内的缓酶解性，抗钙化性，真正达到组织工程瓣膜的要求。

Description

一种改良去细胞组织工程瓣膜/血管支架的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种去细胞组织工程瓣膜/血管支架的改进，特别涉及一种改良去细胞组织工程瓣膜/血管支架的方法，该方法利用化学交联剂——环氧氯丙烷在将RGD多肽和去细胞组织工程瓣膜/血管支架连接同时，交联去细胞组织工程瓣膜/血管支架内胶原和弹性蛋白。

背景技术

研究与开发组织工程心脏瓣膜和血管是当前大趋势，其支架材料的选择是组织工程心脏瓣膜研究过程中的重要内容之一，但目前最受关注的去细胞支架材料，却因在去细胞过程中细胞外基质成分丢失殆尽，对种子细胞黏附功能差，此外，因为去细胞过程使支架中的胶原纤维疏松，各种生物基团暴露，而存在生物学和力学性能下降，降解过快，易于钙化等缺点。这些缺点对于组织工程瓣膜的构建和应用都是非常致命的。对种子细胞粘附率低使体外构建的组织工程瓣膜活性细胞含量低，导致瓣膜的生物活性低，基本无自身再生和修复能力，达不到使用要求，丧失了组织工程瓣膜的意义；生物学和力学性能下降使去细胞支架在构建过程和体内应用中，易于发生关闭不全和瓣叶穿孔，发生生命危险；降解过快使组织工程瓣膜在使用过程中，种子细胞产生新细胞外基质的速度远远赶不上原来支架成分的降解，新的瓣膜会越来越小或者穿孔，最终也会发生关闭不全和瓣叶穿孔，产生生命危险；易于钙化使组织工程瓣膜寿命短，和普通生物瓣膜相比无产品优势。因此，对于去细胞支架材料的改造成为当前研究的重点。

环氧氯丙烷是一种胶原交联剂，被用来对戊二醛交联处理后的传统普通生物瓣膜加以改性和再次交联，以减轻瓣膜中戊二醛的毒性和增加瓣膜的强度以及抗钙化能力。

生物活性分子RGD肽(精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸)作为天然ECM重要组成，是目前应用最广、最有效的促粘附肽，在去细胞支架材料的改造过程中已经成为本领域技术人员的一个常规选择。RGD肽在去细胞支架上的固定是当前尚未解决的问题。支架RGD肽固定包括物理吸附和化学偶联两大类。目前，对RGD多肽包被支架的研究虽属热点问题，已经有RGD多肽在去细胞支架上成功连接的报道。目前采用的方法有：光化学法，异双官能反应物Sulfo—LC—SPDP化学粘联法，以及戊二醛法。

上述方法有明显的缺点：

1.固定效率低；

2.易使RGD多肽功能失活；

3.无改善去细胞支架生物学和力学性能作用；

4.不能改变去细胞支架易降解和钙化的缺点；

5.相对而言，戊二醛虽然可以增强抗降解能力和力学性能，连接RGD效率也高一些，但细胞毒性太大，种子细胞难以粘附和成活，失去了组织工程瓣膜的研制意义。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种采用环氧氯丙烷联合RGD(YGRGDSP)肽改良去细胞组织工程瓣膜/血管支架的方法，该方法利用环氧氯丙烷的环氧基团将细胞黏附识别受体的功能域RGD多肽交联固定在去细胞支架工程瓣膜/血管材料上，同时环氧氯丙烷的化学交联功能又可将去细胞支架工程瓣膜/血管材料的主体成分——胶原蛋白充分交联，以达到抗钙化和减缓支架材料体内酶解的速度，最终使改良后的去细胞工程瓣膜/血管支架材料较改良以前具更加良好的生物学和力学性能，对种子细胞的高粘附率，在体外和体内的缓酶解性，抗钙化性，真正达到组织工程瓣膜的要求。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种改良去细胞组织工程瓣膜/血管支架的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)去细胞组织工程瓣膜/血管支架的制备

选取新鲜家猪完整主动脉瓣，热缺血时间小于2小时，浸入存4℃ PBS液中保存，剔除血管外膜、附着的脂肪及肌肉部分，瓣根血管长4.0cm±0.5cm，血管外径1.2cm±0.01cm，保留完整的主动脉瓣叶，避免损伤；修剪完毕后，经无菌10mM PBS液漂洗2～3次后，装入广口瓶中，瓣膜置于含10g/L胰蛋白酶+0.02％EDTA及双抗溶液的PBS液中，24℃，持续振荡消化24h，期间每12h换上述溶液一次；继而换用含1％TritonX-100及双抗的高渗液，24℃下持续振荡洗涤24h，期间每12h换液一次，必要时重复一次；脱细胞、去垢完成后，无菌含双抗PBS振荡洗涤24h，期间每6h换液一次，以清除残留的细胞碎片和DNA、RNA片段；振荡洗涤完毕后，置于灭菌广口瓶中，封口后送钴源室辐照消毒备用；

2)制备线型YGRGDSP多肽：

以多肽合成仪制备线型YGRGDSP序列，并于多肽链-NH₂末端氨基酸应用丹磺酰氯标记，并进行荧光显色测定；

3)使用磷酸盐缓冲液配制2％环氧氯丙烷，加入YGRGDSP多肽制成多肽液，使多肽液中的YGRGDSP多肽的终浓度为2.0mg/ml；

4)将去细胞组织工程瓣膜/血管支架置入多肽液交联反应12小时，使YGRGDSP多肽连接于去细胞组织工程瓣膜/血管支架的胶原和弹性蛋白上。

本发明采用环氧氯丙烷(C₃H₅Cl)通过交联反应在交联去细胞支架本身胶原和弹性蛋白的同时，将RGD(YGRGDSP)多肽连接于作为组织工程瓣膜/血管支架的去细胞异种瓣膜/血管支架的胶原和弹性蛋白上。用环氧氯丙烷作为交联剂将YGRGDSP多肽连接在去细胞支架中的胶原蛋白、弹性蛋白上，不仅可以使YGRGDSP多肽均匀牢固的分布于整个去细胞瓣膜支架，以增强种子细胞和支架的粘附能力、刺激细胞增殖，而且同时可以使去细胞支架内的自体胶原蛋白、弹性蛋白发生交联反应改善去细胞支架的生物学和力学性能，增强抗钙化和抗降解能力(在前期实验中已得到证实)。RGD多肽的活性顺序为RGD<RGD-NH2<RGDS<GRGDSP，且在RGD的前端加残基将不影响细胞的粘附。

附图说明

图1是哑铃型试件的制备图；

图2是五种不同瓣叶含水量比较；

图3是五种不同瓣叶热皱缩温度比较；

图4是去细胞前/后猪主动脉瓣可溶性蛋白含量(％)；

图5是去细胞前/后瓣膜胶原蛋白含量；

图6是血浆蛋白吸附实验结果；

图7是血小板粘附实验结果；

图8是各组不同时间点瓣叶失重率的变化；

图9是不同时间点各实验组降解液蛋白含量变化；

图10是不同时间点各实验组降解液羟脯氨酸含量的变化；

图11是MS鉴定合成肽分子量；

图12是合成肽的HPLC洗脱图及数据；

图13是RGD浓度为1.0mg/ml时不同反应时间各组交联度(％)比较；

图14是反应时间为12h时各RGD浓度组交联度(％)比较；

图15是1.5mg/ml RGD反应12h时不同pH值各组比较。

图16是各组去细胞瓣细胞粘附率比较。

以下结合附图和具体试验对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

一、理论依据

1)细胞外基质粘附蛋白的细胞结合位点在种子细胞粘附、生长中的作用

研究发现，种子细胞和支架可以通过细胞表面的整合素(integrin)和细胞外基质中粘附蛋白的结合位点特异性结合而使粘附力大大增加，已知的粘附蛋白主要都是细胞外基质中的可溶性蛋白：如纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(laminin，LN)等。研究发现这些蛋白的细胞粘附位点仅仅是数个氨基酸组成的(RGD，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)。因此这些氨基酸组成的多肽被广泛人工合成，用来包被材料，以提高对细胞的粘附性。RGD多肽不但稳定性好，无免疫源性，还可以在体外进行修饰，因而现在应用最多的多肽是含RGD序列的。

2)整合素的作用

RGD的作用是通过和整合素特异性结合来实现的，整合素主要参与细胞附着和跨膜信号转导。

整合素是一组细胞表面与细胞骨架相结合的跨膜糖蛋白受体，整合素和ECM粘附后，继而活化信号通路，调节细胞骨架，促进黏着斑相关基因表达或蛋白活性改变，引起细胞的形态变化、铺展、迁移、增殖、分化、存活等效应。整合素有两种信号转导途径：胞内信号外传(inside-out signaling)和胞外信号内传(outside-in signaling)，前者使整合素受体和配体亲和性增高，后者导致细胞内部效应，即细胞通过整合素及其辅助受体，结合ECM成分，随后受体在细胞表面丛集成簇，诱导黏着斑形成，由此细胞粘附在材料基质上。整合素在介导这一锚定过程的同时，还介导跨膜信号的传递，在粘附斑形成后，一系列的酶会被激活，包括粘附斑激酶、有丝分裂原激活蛋白激酶途径的某些因子等，启动了胞内外信号的传递。黏着斑激酶是组成黏着斑蛋白复合物的枢纽，磷酸化后募集踝蛋白、纽带蛋白等，激活Src、Grb2、CrK等信号传导，调节骨架张力纤维，促进细胞增殖、抑制凋亡。

3)整合素与生长因子的信号通路关系

表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)等受体主要介导Ras/Raf/MAPK信号通路，而正常细胞Ras只有接收来自整合素和生长因子受体两方面刺激，MAPK才增至引起c-fos转录的阈值水平，使细胞从G1期进入S期。

这种关联性部分解释了正常细胞锚定依赖性生长的特征，及细胞粘附ECM后才出现生长因子促增殖的现象。实验证明正常细胞分化、迁移也需生长因子受体和整合素信号通路的协同。因而RGD多肽不仅对种子细胞粘附有重要作用，而且对随后细胞的生长、分化、迁移和功能实现也是非常关键的。

4)采用粘附蛋白的结合位点RGD多肽包被去细胞支架的必要性和方法

去细胞支架是指采用一定的方法脱去组织中的细胞和ECM中的可溶性性成分，而保留的以非可溶性细胞外胶原纤维、弹性纤维等为主的纤维支架，该支架基本保持了原有的三维结构和理化特性。去细胞猪瓣支架以来源广泛、低免疫源性、有良好的力学和生物学特性等成为TEHV相对理想的支架材料。但研究发现去细胞支架和其它支架材料一样也存在种子细胞粘附不理想、易于脱落的问题，原因之一是：在去细胞过程中，包括粘附蛋白在内的可溶性ECM已基本从支架中完全丢失，缺少可以和种子细胞胞膜上的整合素相结合的粘附蛋白。因此要增加种子细胞和支架的粘附，必须对去细胞支架加以改良。考虑到粘附蛋白的结合位点RGD多肽的优点，本发明采用RGD(YGRGDSP)多肽包被去细胞支架作为增强种子细胞对去细胞支架粘附的一条的途径，此前无相关报道。

本发明采用活性最强的Y-GRGDSP(酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸)序列，Y(酪氨酸)是用来连接放射性碘使之伴随固定材料，再计算出fmol/cm²级的RGD肽表面修饰密度，以加强对反应条件的监控。

二、实验

第一部分：去细胞猪主动脉瓣膜的制备及环氧氯丙烷改性后的理化性能和生物相容性实验

1.材料和试剂

1.1 试剂

胰蛋白酶(美国，Gibco公司)，细胞培养专用青、链霉素、两性霉素B混合液，TritonX-100(美国，Sigma公司)，PBS(中国，中山生物技术有限公司)，戊二醛(中国，保泰克公司)，环氧氯丙烷(中国，保泰克公司)，牛血清白蛋白(美国，Sigma公司)，846合剂(中国，长春农牧大学兽医研究所)，考马斯亮蓝G-250(中国，华美公司)，人新鲜冰冻血浆(中国，第四军医大学西京医院中心血站)，人血小板液(中国，第四军医大学西京医院中心血站)。

1.2 仪器

倒置相差显微镜(德国，Leica公司)，DG5031型ELISA仪(中国，华东电子集团)，扫描电镜(日本，Hitachi S-520)，透射电镜(日本，JEM-2000EX)，Instron 1122万能电子强力仪(美国，Instron)，CA950超净工作台(中国，上海净化仪器厂)，高温烤箱(日本，JEM-2000EX)，紫外分光光度计、紫外透射仪(美国，Biorad公司，)，CO2培养箱(德国，Thermo公司)，倒置偏振光显微镜(日本，Nikon公司)，普通光学显微镜(日本，Nikon公司)，振荡摇床(中国，上海医用仪器厂)，电子分析天平(日本，NUAIRE)。

1.3 动物

新西兰大白兔10只，雌雄不限，兔龄5周(第四军医大学实验动物中心提供)。

1.4 猪主动脉瓣的采集

取新鲜屠宰的家猪猪心，剪下完整主动脉瓣，热缺血时间小于2小时，浸入存4℃PBS液中保存，1小时内带回实验室处理，剔除血管外膜、附着的脂肪及肌肉部分，瓣根血管长4.0cm±0.5cm，血管外径1.2cm±0.01cm。

1.5 试剂配制

(1)1％TritonX-100液：TritonX-100 10ml加下述低渗Tris·Cl缓冲液至1000ml；

(2)PBS缓冲液：成品包装的PBS(2000ml规格)，每袋溶于2000ml去离子水，混匀后调整pH至7.4，分装后高压灭菌，4℃保存；

(3)10g/L胰蛋白酶：10g胰蛋白酶溶于1000mlPBS液中，0.22μm过滤分装备用；

(4)低渗Tris·Cl缓冲液(0.01M)：

A：Tris 6.07g+500ml去离子水溶解；

B：37％HCL 4.2ml+500ml去离子水溶解；

取250mlA液+192.5mlB液+去离子水至500ml(pH 8.0)，用时1:5稀释，高压灭菌备用；

①高渗液：0.75M KCL56g+500ml去离子水溶解，用时1:5稀释，高压灭菌备用；

②PMSF溶液：0.5g PMSF溶于100ml异丙醇，4℃保存；

③考马斯亮蓝：10mg考马斯亮蓝G-250溶解于质量分数为95％的乙醇中，加入10ml质量分数为85％的磷酸，加水到100ml；

④柠檬酸缓冲液：柠檬酸50g，冰醋酸12ml，醋酸钠(3H₂O)120g，NaOH 34g，900ml蒸馏水溶解，调pH至6.0，补充蒸馏水至1000ml；

⑤0.05M氯胺T：1.41g氯胺T溶于20ml水中，加入30ml乙二醇甲醚，再加入柠檬酸缓冲液50ml；

(5)0.3％戊二醛液：戊二醛3ml加入PBS缓冲液(pH＝7.4)至1000ml；

(6)2％环氧氯丙烷液：环氧氯丙烷20ml加入PBS缓冲液(pH＝7.4)至1000ml；

(7)新鲜主动脉瓣保存液：PBS液内加至青霉素(100U/ml)，链霉素(100μg/ml)，于4℃保存备用；

(8)蛋白标准品：62.4g/L蛋白标准浓缩品，0.002ml加三蒸水1：50稀释至0.1ml；

(9)羟脯氨酸标准储备液：标准品1支三蒸水充分溶解，定容至50ml，配成0.1mg/ml标准储备液，4℃保存；

(10)羟脯氨酸标准应用液：0.1mg/ml标准储备液，0.2ml加三蒸水定容至10ml，配成0.002mg/ml标准应用液，现用现配；

(11)消化液：3ml备用溶剂，充分溶解，4℃保存备用；

(12)降解液

A.胶原酶降解液：0.05mg/ml胶原酶I，PBS溶液配制，4℃保存备用；

B.弹性蛋白酶降解液：0.05mg/ml弹性蛋白酶，PBS溶液配制，4℃保存备用；

(13)水解液：PBS；

2.方法

2.1 去细胞猪主动脉瓣基质支架材料的制备

取新鲜屠宰猪完整主动脉瓣，热缺血时间小于2h，立即浸于4℃ PBS液中保存，速带回实验室修剪，无菌PBS液冲洗后尽量剔除血管外膜、附着的脂肪及肌肉部分，瓣根血管长4.0cm±0.5cm，血管外径1.2cm±0.01cm，注意保留完整的主动脉瓣叶，避免损伤。修剪完毕，经无菌10mM PBS液漂洗2-3次后，装入广口瓶中，瓣膜置于含10g/L胰蛋白酶+0.02％EDTA(博士德公司)及双抗溶液(100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素)的PBS液中，24℃，持续振荡消化24h，期间每12h换上述溶液一次。而后置入配制好的含1％TritonX-100(pH 7.4)及双抗的Tris低渗液，24℃下持续振荡洗涤24h，期间每12h换液一次；继而换用含1％TritonX-100(pH 7.4)及双抗的高渗液，24℃下持续振荡洗涤24h，期间每12h换液一次，必要时重复一次。上述脱细胞、去垢完成后，无菌含双抗PBS振荡洗涤24h，期间每6h换液一次，以清除残留的细胞碎片和DNA、RNA片段。振荡洗涤完毕后，置于灭菌广口瓶中，封口后送钴源室辐照消毒(Co⁶⁰ 12000Gy照射12h～14h)备用。

2.2 实验分组

实验分为4组，去细胞猪瓣支架材料共40个，随机取材，每组10个，分别进行如下处理：

①新鲜瓣叶(FV)组：取获取的新鲜猪主动脉瓣叶，不加任何处理。

②去细胞瓣叶(AV)组：取经上述脱细胞方法处理而获取的去细胞猪主动脉瓣。

③GA处理去细胞瓣叶(GA)组：将去细胞瓣叶置于0.3％的GA溶液中浸泡48h，PBS溶液摇床反复漂洗后备用。

④EC处理去细胞瓣叶(EC)组：将去细胞瓣叶置于预先配置好的2％的EC溶液中室温浸泡48h，经PBS反复漂洗后备用。

以上处理均在室温条件下进行。

2.3 去细胞瓣的组织学和超微结构观察

2.3.1 HE染色：取上述制备的去细胞瓣叶，4％多聚甲醛/PBS(pH＝7.4)固定24h，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察。

2.3.2 超微结构观察：取上述制备的去细胞瓣叶，切成约3mm×3mm大小，4％多聚甲醛固定、1％锇酸固定、丙酮逐级脱水，醋酸异戊酯置换、临界点干燥后行铂、钯合金离子喷涂，扫描电镜观察。

标本4％戊二醛4℃固定2h，4℃ PBS漂洗10min×3次，1％四氧化锇4℃固定30min，4℃PBS漂洗10min×3次，系列丙酮脱水，常规包埋、切片。透射电镜观察。

2.4 材料的力学实验

用模具将各组取样的瓣叶(沿瓣周方向，长轴)，管壁横向和纵向管壁制成哑铃状试件各6片(管壁宽度均为5mm、长度10mm)，制备图参见图1，刻度显微镜下测量试件的厚度后，固定于Instron 1122型万能强力仪，以10mm/min的速度加载至试件破坏，计算材料的断裂强度。

标本断裂强度根据σ＝F/A计算，F指应力(N)，A指横截面积，根据A＝宽度×厚度，厚度是由HD-10厚度仪检测。

2.5 瓣膜含水量的测定

取制备的各组瓣膜基质材料6片，将每个瓣膜的瓣叶剪下，管壁平均剪成3块，分别用滤纸吸干水份后放入烧杯称重，得每片瓣叶和管壁湿重；真空冻干机中冻干后称量得瓣叶干重；按下述公式计算含水量：

含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％

2.6 热皱缩温度测定

取制备的各组瓣膜6枚，将每个瓣膜的瓣叶，管壁平均剪成3块，采用实验室自制的热皱缩温度测定仪，以蒸馏水为介质，温度每分钟上升2℃，以指针开始上抬时的温度为准，测定瓣膜热皱缩温度。

2.7 可溶性蛋白和胶原含量的测定

2.7.1 可溶性蛋白的测定

新鲜及去细胞猪主动脉瓣各6枚，将每个瓣膜的瓣叶剪下，管壁平均剪成3块，每2片为一组。滤纸吸干水分后分别称取瓣叶湿重；将瓣叶剪碎，加10ml PBS，置于匀浆器中4℃匀浆，4℃离心12000g×60min。取上清液20ul，加考马斯亮蓝染液200ul混匀，振荡10min后室温放置5min，分光光度计在波长595nm比色测定。以空白溶剂为对照，牛血清白蛋白(0.01-0.06mg/ml)为标准品，求直线回归方程，从而推算样品中蛋白含量，以下述公式表示可溶性蛋白含量：

可溶性蛋白含量＝(样品蛋白含量/湿重)×100％；

2.7.2 胶原含量的测定

新鲜及去细胞猪主动脉瓣各6枚，将组织剪碎，加入6mmol/L HCl 0.5ml，130℃烤箱2h烤干，加蒸馏水溶解，预冷至4℃。取样品10μl，加入3ml的蒸馏水，冰醋酸-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)及0.05mmol/L氯胺-T，温和混匀。加入3.15mmol/L过氯酸1.0ml，10％对氨基苯甲酸1.0ml，于波长560nm测定样本OD值，计算胶原蛋白含量。

2.8 材料相容性实验

2.8.1 组织相容性

取制备的各组瓣膜材料，裁剪成1.0×1.0cm²大小，Co⁶⁰ 12000Gy照射消毒备用。

新西兰大白兔，用846合剂0.2ml/kg腿部肌肉注射麻醉，俯卧位固定于手术台上。背部两侧备皮，碘伏消毒，铺巾。在兔背胸腰段脊柱两侧各做4个切口，钝性分离皮下组织，成皮下腔隙。每只兔分别植入预设材料，横向间距4cm，纵向间距3cm。分层缝合皮下和皮肤。术后每2周各取材料(直至14周)，常规石蜡包埋切片，行HE染色。

2.8.2 血液相容性

2.8.2.1 血浆蛋白吸附实验：各实验组每组取样品6个，均PBS溶液(pH＝7.2)漂洗10min×3次，置入10ml血浆(西京医院输血科提供)，37℃振荡12h，标本取出后冻干，称重，匀浆，置于Tris缓冲液中37℃离心，12000g×30min，Bradford方法测定上清液中蛋白含量。

蛋白吸附率＝(吸附蛋白(μg)/标本质量(mg))×100％

2.8.2.2 血小板粘附实验

取人单采血小板成分10ml(西京医院输血科提供)，通过Sysmex K-4500全自动血液分析仪测定血小板浓度，加入适量的胎牛血清稀释成浓度为1.0 x 10⁹/L血小板液，置入4℃冰箱备用。各实验组每组取样品6个瓣叶，制成1.0×1.0cm²片状，均PBS溶液(pH＝7.2)漂洗10min×3次，浸入PBS液37℃水浴30min，置入24孔细胞培养板中，加入上述稀释后的血小板液，轻微晃动混匀后置入5％CO₂孵箱中37℃条件下孵育，3h后PBS溶液轻轻漂洗，4％多聚甲醛固定、1％饿酸固定、丙酮逐级脱水，醋酸异戊酯置换、临界点干燥后行铂、钯合金离子喷涂，扫描电镜观察。

2.9 体外胶原酶消化溶解实验

取制备好的瓣膜材料每组10个，降解液用量：试样(mg)/降解液用量(ml)＝1/1，降解实验于37℃恒温箱中进行，降解后第3、6、9、15、30天取样进行观察。

2.9.1 失重率

降解前取制备的各组瓣膜试样，真空冻干后称量得瓣叶干重W₀；降解的不同时间点，取降解试样冻干后称量得瓣叶重量W₁，按下述公式计算失重率：

失重率＝((W₀—W₁)/W₀)×100％

2.9.2 降解液蛋白含量

取去细胞支架胶原酶消化不同时间点的降解液，用考马斯亮蓝试剂盒检测降解液中可溶性蛋白含量。12000g×60min，4℃离心，取上清液20μl，加考马斯亮蓝染液200μl混匀，振荡10min，用可见光分光光度计在570nm测光吸收值。以空白溶剂为对照，牛血清白蛋白(0.005-0.06mg/L)为标准品绘制标准曲线。依据标准曲线推算样品中蛋白含量。

2.9.3 降解液羟脯氨酸含量

与上一实验同时取各时间点降解液，采用羟脯氨酸试剂盒(南京建成公司)进行检测。按试剂盒说明，550nm处1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度，计算羟脯氨酸含量。

3.0 统计学分析：实验数据以平均数±标准差(x±s)表示，SPSS 13.0软件进行统计分析，P<0.05为差异显著。

3.结果

3.1 材料的组织形态学观察

3.1.1 大体观察结果

FV组主动脉瓣充分冲洗后，瓣根动脉管壁呈淡黄色，弹性良好，管腔无塌陷，内膜光滑，瓣叶乳白色，柔软，肌肉组织红色；经胰酶+TritonX-100法脱细胞处理后的AV组，血管壁及瓣叶组织完好，瓣根管壁内膜层呈透明状，血管壁、瓣叶呈乳白色，管壁较脱细胞前稍变薄，无塌陷，弹性良好，内膜光滑，半透明，肌肉组织淡黄色，与FV组外观上无显著差异。而相继经过戊二醛、环氧氯丙烷处理后的去细胞主动脉瓣相对颜色变化较明显，GA组瓣膜偏黄色，瓣叶厚；EC组去细胞瓣经EC处理后瓣膜乳白色，瓣叶略厚，组织韧性较好。

3.1.2 光镜观察结果

新鲜猪主动脉瓣管壁和瓣叶组织中含有大量的细胞，包括成纤维细胞、内皮细胞等。去细胞瓣HE染色在瓣叶、管壁及瓣环等部位均未见完整细胞及细胞残片，纤维层清晰、较为松散，经EC处理后去细胞瓣叶HE染色，纤维层清晰、较致密，纤维网架结构保持完整，胶原纤维和弹力纤维波浪状排列整齐，结构完整。

3.1.3 电镜观察结果

扫描电镜：去细胞处理后，瓣膜表面未见任何细胞成分，胶原卷曲呈波浪状，排列松散；经GA或EC处理后去细胞瓣胶原卷曲呈波浪状，排列致密、整齐。

透射电镜：去细胞处理后，瓣叶及血管壁中均未见残存细胞及细胞器碎片，胶原纤维界限明确，周期性横纹清楚，排列规整。瓣叶以胶原成分为主，管壁含有大量弹性蛋白。

3.2 材料的力学实验

去细胞处理后瓣叶在周长方向上的断裂强度与新鲜瓣叶比较，没有显著的差异；经EC或GA处理后去细胞瓣的厚度及断裂强度较单纯去细胞瓣增加显著。结果见表1。

表1 四种不同瓣叶厚度(mm)和断裂强度(g/mm²)测定(x±s，n＝5)

 

	厚度	断裂强度
			FV组	0.669±0.006	637.4±4.7
AV组	0.645±0.016#	628.4±5.3#
			GA组	0.732±0.024*	767.2±4.7*
EC组	0.711±0.020	785.8±13.2

与FV组比较^*P<0.05，与EC组比较#P<0.05

3.3 瓣膜含水量的测定

新鲜瓣叶经去细胞处理后，瓣叶中的含水量有明显的增加；经EC处理后的去细胞瓣的含水量较单纯去细胞瓣明显增加；而经GA+EC联合处理后的去细胞瓣含水量较仅EC处理的去细胞瓣叶稍有增加，但无显著差异(p>0.05)，具体结果见表2、图2。

表2 四种不同瓣叶含水量比较(％)(x±s，n＝6)

与FV组比较^*P<0.05，与EC组比较#P<0.05

3.3 热皱缩温度

去细胞后瓣叶的热皱缩温度与新鲜瓣叶没有明显区别；经GA或EC处理后热皱缩温度较去细胞组瓣叶显著增加。具体结果见表3、图3。

表3 四种不同瓣叶热皱缩温度比较(℃)(x±s，n＝9)

 

组别	瓣叶	管壁
			FV组	69.02±1.02	65.62±0.87
AV组	65.17±0.67#	60.54±1.64#
			GA组	76.57±1.47*	73.12±0.58*
EC组	73.39±1.57	71.04±0.67

与FV组比较^*P<0.05，与EC组比较#P<0.05

3.4 可溶性蛋白和胶原含量的测定

3.4.1 可溶性蛋白的测定(表5、图4)

表4：线性回归方程

 

	0.0000	0.0100	0.0200	0.0300	0.0400	0.0500	0.0600
								OD值	0.0000	0.0095	0.02507	0.0420	0.0531	0.0769	0.0889

Y(蛋白含量/ml)＝0.00181+0.69166X(OD值)

可溶性蛋白百分比＝Y×匀浆体积÷湿重×100％

表5 去细胞前/后猪主动脉瓣可溶性蛋白含量(％)比较(x±s，n＝9)

 

	瓣叶(％)	管壁(％)
			FV组	0.498±0.12	0.387±0.05
AV组	0.192±0.04*	0.162±0.03*

与FV组比较^*P<0.05

3.4.2 胶原含量的测定

新鲜与去细胞猪主动脉瓣的胶原含量比较无显著性差异(P>0.05)(表6、图5)。

表6 去细胞前/后瓣膜胶原蛋白含量(％)比较(x±s，n＝9)

 

	瓣叶	管壁
			FV组	3.81±0.12	4.63±0.32
AV组	3.78±0.03*	4.59±0.27*

与FV组比较^*P>0.05

3.5 材料相容性

3.5.1 组织相容性

3.5.1.1 大体观察

FV组，2周后瓣叶、管壁体外均可触及，轮廓清晰，质地稍硬。纤维包膜较厚，不易分离包膜，周围可见较多新生血管，瓣叶、管壁外观呈粉红色；6周后仍可触及，包膜明显增厚，难分离，外观无明显改变；10周后管壁组也开始变小，部分新鲜猪瓣瓣叶组体积明显变小，但外观仍表现为有明显的炎症反应；12周后，部分管壁也开始明显变小，部分瓣叶组2/3已经吸收；14周后，部分管壁体外仍触及，瓣叶完全吸收。炎症反应伴随该组标本包埋的全过程。

AV组瓣叶、管壁包埋2周后，体外均可触及，轮廓清晰，质地软。纤维包膜较薄，易与瓣膜分离，未发现有明显血管增生等炎症反应现象；6周后包膜增厚，较易剥离，质地软。瓣叶及管壁外观仍呈白色，体积减小，表面光滑；12周后，瓣叶组包膜薄，体积明显变小。整个实验过程中，材料周围组织无坏死，及明显血管增生等明显炎症反应现象。

GA组2周后瓣叶、管壁体外均可触及，轮廓清晰，质地硬。纤维包膜较厚，不易分离包膜，周围可见较多新生血管、钙化灶，瓣叶、管壁外观呈粉红色；6周后仍可触及，包膜明显增厚，难分离，外观无明显改变；10周后管壁组也开始变小，部分新鲜猪瓣瓣叶组体积明显变小，但外观仍表现为有明显的炎症反应；12周后，管壁、瓣叶无明显吸收；14周后，部分管壁体外仍触及，炎症反应伴随该组标本包埋的全过程。

EC组瓣叶、管壁包埋各时期与AV组无明显差异，未见明显钙化灶，外被少量纤维包裹，整个实验过程中，材料周围组织无坏死及明显血管增生等明显炎症反应现象。

3.5.1.2 镜下观察

FV组：2周包膜中有中性粒细胞、大量淋巴细胞、浆细胞浸润和增生的少许成纤维细胞。6周后包膜明显增厚，伴嗜酸性粒细胞、大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润以及包膜内的血管增生，炎性细胞向组织内浸润深度明显加深；10周后，炎症有所减低，部分瓣叶开始出现网状全吸收，12周后炎细胞明显减少。

AV组：2周后瓣叶、管壁纤维包膜疏松，少量中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞浸润和增生的少许成纤维细胞，明显少于FV组；6周后，去细胞管壁浸润的炎细胞数量明显减少，瓣叶组织结构模糊、疏松，有溶解吸收现象，各组包膜进一步增厚，成纤维细胞增加；12周后，瓣叶、管壁开始呈网状吸收。

GA组表现与FV组相似；EC组各时期变化较AV组无明显差异，纤维组织增生较少，少量淋巴细胞浸润。

3.5.2 血液相容性

3.5.2.1 血浆蛋白吸附

AV组去细胞猪瓣血浆蛋白吸附较FV组猪瓣有所增加，但无显著差异；GA组蛋白质吸附率较AV组显著增高(P<0.05)；EC处理组蛋白吸附率较AV组高，但两者比较无显著差异。具体结果见表7、图6。

表7 血浆蛋白吸附实验结果比较(x±s，n＝10)

 

分组	血浆蛋白吸附率(g.kg-1)	P值
			FV组	0.118±0.02
AV组	0.121±0.04	*>0.05
			GA组	0.314±0.78	**，#<0.05
EC组	0.127±0.06	*>0.05

^*与FV组瓣膜相比，^**与FV处理瓣膜相比，#与EC组相比

3.5.2.2 血小板粘附

去细胞猪主动脉瓣血小板粘附较新鲜猪瓣有所增加，但无显著差异(P>0.05)；EC处理组血小板粘附率较AV组低，但无显著差异；而GE组经GA处理后血小板粘附率显著增高。具体结果见表8、图7，血小板粘附率为10¹².kg^-1。

表8 血小板粘附实验结果(x±s，n＝10)

 

分组	血小板粘附率(1012.kg-1)	P值
			FV组	0.518±0.02
AV组	0.843±0.121	*>0.05

 

GA组	4.153±0.121	**，#<0.05
			EC组	0.746±0.096	*>0.05

^*与FV组瓣膜相比，^**与FV处理瓣膜相比，#与EC组相比

3.6 体外胶原酶消化溶解实验

FV和AV组在胶原酶作用下，随着降解时间的延长试样逐渐变得菲薄、透明、韧性差、缩小及卷曲，降解液逐渐出现浑浊、絮状物；而GA、EC组始终未见明显的外观改变，降解液始终清亮。

3.6.1 失重率

各瓣膜组失重率变化参见图8，由图8可见，随着观察时间推移，在降解液的作用下，FV、AV组的失重率都不断的增大，而GA、EC组几乎没有变化。

3.6.2 降解液蛋白含量

各瓣膜组降解液蛋白含量变化参见图9。由图9可见，各实验组的降解液蛋白含量增加趋势与失重率改变趋势相似。

3.6.3 降解液羟脯氨酸含量

各瓣膜组降解液羟脯氨酸含量变化参见图10。羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸，且含量恒定，约为胶原蛋白质量的12.7％。因此可通过检测降解液中羟脯氨酸含量了解胶原蛋白降解的情况。由图10可见，各实验组的降解液羟脯氨酸含量增加趋势与失重率、降解液蛋白含量改变趋势相似。

3.讨论

组织工程是以工程学、细胞分子生物学、临床医学等原理为基础，将分离、扩增的高密度种子细胞，接种在三维多孔支架材料上，经体外培养植入体内缺损部位，原支架被降解、吸收同时细胞分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，逐步形成新的具特定形态和功能的组织、器官，达到修复损伤、替代缺损、重建功能目的。因此支架材料的选择是组织工程心脏瓣膜研究过程中的重要内容之一，目前用于组织工程瓣的支架材料主要有人工合成的高分子材料和天然形成的材料两种。利用去细胞瓣构建组织工程心脏瓣膜，具有任何高分子可降解材料无法替代的优越性。同种/异种移植瓣膜组织里细胞和/或残留的细胞碎片均有抗原性，且是瓣膜早期钙化的好发部位。生物组织工程支架完全去除细胞成分，可以显著减轻排斥反应。由此去细胞瓣支架明显降低了宿主对材料的免疫反应，保存有被周围宿主瓣膜内皮细胞内皮化和被瓣膜间质细胞再细胞化的生理性基质模板，被认为是目前组织工程瓣较理想的支架材料。目前去细胞的方法包括机械法、化学法、酶消化法和声波处理等。

既往认为组织工程瓣膜的去细胞过程由于去除了免疫原性和钙化始动的细胞成分，剩余的胶原纤维和弹性蛋白支架材料大大降低了其钙化的可能性。但是在进一步的研究和应用中，相继报道了去细胞瓣膜支架移植后发生严重的变性、钙化、穿孔等导致失败的病例和实验。其原因可能是去细胞过程对包膜胶原纤维和弹性蛋白结构产生了易于发生钙盐沉积的影响，也可能是由于瓣膜去细胞后抵抗胶原和蛋白酶消化能力降低，使其易于发生钙化、穿孔等。因此对去细胞瓣膜支架材料选择合适的交联剂进行预处理，以提高支架材料的生物学和力学性能、抗酶解能力、维持结构的完整，可能有利于支架材料的抗钙化作用。

戊二醛作为交联剂虽然可以在去除瓣膜免疫原性，交联胶原氨基端，增加机械强度，以及在瓣膜的保存过程中保持无菌等方面具有极其重要的作用，但瓣膜易于发生钙化和衰败。同时，戊二醛的生物毒性一直为各种试验所证实，使被交联的生物瓣膜表面难以有细胞生长。

环氧氯丙烷(EC)是本实验室筛选出的化学改性生物瓣的交联剂，它能有效的封闭胶原末端羧基，明显减轻生物瓣膜的钙化，研究表明应用EC处理去细胞猪瓣支架材料毒性低。本实验应用较低浓度的戊二醛(0.3％)和2％环氧氯丙烷预处理去细胞猪主动脉瓣，观察比较其理化性能及细胞相容性。

实验应用本实验室筛选的联合应用去垢剂(TritonX-100)、胰蛋白酶消化和高、低渗溶液交替法制备去细胞猪瓣支架。实验中首先用胰酶对血管壁中的基质进行溶解和对细胞的完整性加以破坏，同时交替的高、低渗溶液进一步使细胞膜破裂，再用TritonX-100对猪主动脉瓣进行脱细胞处理。TritonX-100通过其上的亲水基团溶解细胞膜及细胞器表面结构的蛋白质，并且清除磷脂类核物质，从而达到清除血管壁细胞成分的目的。当TritonX-100达到一定浓度时，其结合位点已饱和，脱净细胞的时间不随浓度升高而缩短。结果显示HE染色血管壁及瓣膜中内皮细胞、成纤维细胞等细胞成分去除彻底，无细胞碎片，胶原纤维和弹力纤维排列整齐、完整，纤维支架结构保存完好；扫描电镜示无细胞成分，基质纤维呈波浪状，排列整齐、致密。表明细胞去除基本完全，符合组织工程支架要求，是适当的猪主动脉瓣和血管壁去细胞的方法。

本实验结果显示，经GA和EC的处理均显著的提高了去细胞组织工程心脏瓣膜的力学性能和抗酶消化能力，增加去细胞支架材料的机械性能和组织稳定性。

经去细胞处理后，瓣叶的含水量较新鲜瓣有所增加，而经EC处理以及GA处理后含水量相应降低。其原因可能为瓣叶中部分疏水性脂质的去除使瓣叶的亲水性增加，同时细胞和可溶性蛋白等组织占据的部位被水填充所致。而经GA和EC交联后产生使胶原和弹性纤维致密，相对单纯去细胞瓣的含水量有所减低，更接近于新鲜猪瓣。

热皱缩温度(shrinkage temperature ST)是反应胶原交联度及其热稳定性的重要指标。热皱缩温度越高，说明胶原交联度越高，组织的热稳定性越好。本实验新鲜瓣膜与去细胞瓣膜两组热皱缩温度无显著性差异，而经EC处理以及GA处理后去细胞瓣叶的热皱缩温度均有明显的增加，说明此去细胞过程对瓣膜胶原纤维结构损伤小，保持了瓣膜正常的结构和力学稳定性，EC以及GA处理均对去细胞的胶原纤维支架有一定的交联作用，进一步提高了瓣叶的力学性能，通过断裂强度的测定进一步证实了EC和GA的这种交联效果。

本实验结果显示，去细胞猪瓣中的可溶性蛋白含量较新鲜猪瓣组明显降低。Herrero等研究表明可溶性蛋白与瓣叶的抗原性相关。本实验采用的去细胞方法较好的去除了瓣叶内的细胞及其碎片和可溶性抗原成分，对降低瓣叶的抗原性和减少其钙化衰坏程度具有一定的意义。

材料的相容性，是选择组织工程瓣支架材料时首要考虑的因素。本实验结果显示，本实验得到的去细胞猪瓣以及经过EC预处理过的去细胞瓣在兔皮下包埋过程中，早期以少量中性粒细胞侵润为主，纤维膜厚、疏松。中期有少量淋巴细胞出现，纤维膜变致密，胶原成分增多。晚期炎细胞很少，以淋巴细胞为主，纤维膜进一步变薄、致密，成纤维细胞多转化为纤维细胞，表现了良好的生物相容性，免疫反应均远远低于新鲜猪瓣组。说明良好的去细胞手段确实可以在保持胶原纤维、弹性纤维结构稳定的同时又大大降低了其抗原性和钙化，符合医用植入生物材料的要求。心脏瓣膜内皮层的剥脱及GA处理的生物瓣膜表面的损伤，易使血浆成分渗入瓣膜内部及在瓣膜表面形成血栓可能是引起组织钙化合衰败的先行条件，在选择组织工程瓣支架材料时其表面性状亦是应当考虑的重要因素。

本研究结果显示，GA处理的去细胞瓣蛋白质吸附率和血小板粘附率较未处理组明显增高，而经EC处理后蛋白质吸附率和血小板粘附率均明显下降，与AV及FV组无显著差异。分析可能的原因为GA处理后的瓣膜组织，蛋白质结构由于其强烈的交联作用而皱缩，使表面结构粗糙，表面理化性质变差，容易形成血浆蛋白吸附和血小板粘附。

上述实验结果表明经EC处理后，组织含水量增加，表面光滑，因而吸附较少的蛋白质和粘附较少的血小板。另一种可能的机制是EC的改性改变了瓣膜组织中蛋白质侧链基团的结构以及表面的电荷性质，继而影响了对蛋白质和血小板的吸附。因为上述因素均影响瓣膜的防钙化效果，因此可以很好的解释研究中EC处理的去细胞支架材料钙化明显减少的结果。

本组试验的结果表明，采用胰蛋白酶+TritonX-100法制备的去细胞猪瓣支架，完全去除了组织内的细胞，保存了天然细胞外基质成分，而且弹力、胶原纤维保存完整，排列整齐，其间空隙大，这样既保存了与天然瓣膜相似的力学性能，同时又为组织工程化时种子细胞的种植提供了足够的渗入空间，并最终形成生理形态的瓣膜创造了先决条件。同时去除了高抗原性的蛋白质，免疫反应很轻。而进一步的应用EC预处理，进一步改善去细胞猪瓣支架材料生物学和理化性能，提高了去细胞猪瓣的力学性能和抵御蛋白酶消化分解的能力，没有改变其细胞相容性，可增强其抗钙化能力，制备的去细胞瓣膜血管壁弹性良好、无塌陷，为组织工程瓣膜及带瓣管道的研制提供了更为理想的支架材料。

第二部分：环氧氯丙烷联合RGD对去细胞猪主动脉瓣修饰的实验研究

实验一：线性多肽的合成和检测

1.材料和方法

1.1 多肽制备

本实验与上海生工生物工程有限公司(上海生工)合作，采用委托合成的方式，多肽合成仪制备线型YGRGDSP(酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸)，并于多肽链-NH₂末端氨基酸应用丹磺酰氯(Dansyl chloride)标记，以进行荧光显色测定(在紫外光激发后发黄色荧光)。制备采用Fmoc固相合成法获得目的肽。

1.2 多肽的鉴定

利用上海生工的LCMS-2010型液相色谱质谱联用仪(Shimadzu公司)进行检测。

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)纯化并分析：对YGRGDSP粗肽物，先经4.6×250nm(3-10μm)KromasilC18-5凝胶柱过滤、脱盐，然后0.1％TFA的乙腈甲烷水溶液作为洗脱液，以1ml/min流速梯度洗脱，在波长220nm下检测。将初步判断的目标峰物质冻干，取小样作色谱分析确定合成肽纯度。

质谱分析(mass spectrum，Ms)确证：将HPLC初步判断的目标峰物质冻干，取小样以电子轰击源作为离子源，喷雾气体流速1.5L/min，200-250℃温度范围内，1.5kv探头作检测，以确定分子量。

2.结果

2.1 多肽性状

肉眼观察，合成肽呈白色冻干粉状，丹磺酰氯标记的多肽呈淡黄色冻干粉末状。通常在—20℃密闭保存，易溶于双蒸水及PBS溶液。

2.2 多肽鉴定

MS鉴定该肽主峰位于751.6m/z，平均分子量为750.8g/mol，与预设计YGRGDSP肽分子量一致；HPLC鉴定所合成的多肽纯度>95％，主峰保留时间在11.374min，峰高468.979mv(图11、图12)。

3.讨论

Pierschbacher等人首次报道了Arg-Gly-Asp(RGD)三肽是纤粘连蛋白(FN)与其受体的特异性结合位点。其后，相继发现细胞外基质(ECM)中很多糖蛋白如纤粘连蛋白(Fibronectin，FN)、纤维蛋白原(Fibrinogen，Fb)、胶原蛋白(Collagen)和骨桥蛋白(Osteopontin，Opn)等均含高度保守的RGD序列，并证实了RGD在介导细胞与细胞、细胞与胞外基质蛋白的相互作用中发挥重要作用。虽然经实验证实，RGD肽与整合素的亲和力小于FN、LM及胶原，但整体蛋白往往具有免疫原性和无关序列，不仅需提前加工纯化，应用中需补充以减少蛋白降解，而且对材料的表面结构和细胞的粘附定位等产生不利影响。因此从材料学、工程学角度，RGD肽比整体蛋白可控性更强，人工合成后修饰材料，能够按需调节细胞和ECM的生长，故将RGD结合在生物材料表面的技术，已经开始应用于人造血管、生物传感器、伤口修复等组织工程领域。

实验二：RGD与去细胞瓣的共价连接实验

1 材料和试剂

1.1 试剂

环氧氯丙烷(中国，保泰克公司)，戊二醛(中国，保泰克公司)，YGRGDSP多肽(中国，上海生工生物有限公司)，PBS(中国，中山生物技术有限公司)，OCT冰冻切片包埋剂(美国，SAKURA公司)，茚三酮、还原茚三酮、乙二醇甲醚、乙醇(中国，保泰克公司)，YGRGDSP多肽、Dan—YGRGDSP(中国，上海生工生物工程有限公司)。

1.2 仪器

X射线光电子能谱仪(日本，Hitachi S-520)，Olympus BM200倒置光学显微镜(日本，Olympus)，电子分析天平(日本，NUAIRE)，紫外分光光度计(中国，上海第三分析仪器厂)，低温恒冷冰冻切片机(德国，Leica)。

1.3 材料：去细胞猪主动脉瓣(经第一部分实验获得)。

1.4 试剂配制

(1)PBS缓冲液：成品包装的PBS(2000ml规格)，每袋溶于2000ml去离子水，混匀后调整pH至7.4，分装后高压灭菌，4℃保存；

(2)0.3％戊二醛液：戊二醛3ml加入PBS缓冲液(pH＝7.4)至1000ml；

(3)2％环氧氯丙烷液：环氧氯丙烷20ml加入PBS缓冲液(pH＝7.4)至1000ml；

(4)2mol/L醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL2mol/L乙酸混合而成。用pH检查校正至pH＝5.4；

(5)茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解；

(6)60％乙醇：95％乙醇60ml加三蒸水35ml配制。

2.方法

2.1 分组

实验分为3组，取上述制成的去细胞猪瓣瓣叶，随机取材，裁剪为大小约2×2mm，分为以下三组：

①去细胞瓣叶(AV)组；

②EC处理去细胞瓣叶(EC)组；

③GA处理去细胞瓣叶(GA)组。

2.2 YGRGDSP肽交联反应条件筛选

Fmoc固相法合成YGRGDSP多肽，分装为1.5mg/管，—20℃储存。室温下无菌2％EC或2％GA溶解YGRGDSP多肽，配至浓度为2.0mg/ml的标准液，微孔滤膜(孔径0.22μm)过滤除菌，立即使用。

使用时按照不同浓度需要稀释，用3mol/LNaHCO₃、1mol/L HCL调节溶液pH值。

按照YGRGDSP多肽的浓度、反应时间、反应pH值进行分组(n＝5)：

YGRGDSP浓度：0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml；

反应时间：4h、8h、12h、24h；

反应pH值：7.0、7.4、8.0；

将各组瓣叶片编号后放置于48孔板内，每孔加样0.5ml，室温(20℃—25℃)，振荡条件下进行反应，反应完毕后吸取各孔反应后溶液，进行茚三酮实验测定计算多肽浓度差值，以此推测各反应条件下YGRGDSP多肽与材料的交联度。

2.3 茚三酮实验

2.3.1 茚三酮实验的标准曲线

标准氨基酸溶液：YGRGDSP多肽配制成0.3mmol/L溶液。

分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，用三蒸水补足至1mL。各加入1mL pH5.4、2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加入3mL、60％乙醇稀释，充分摇匀，分光光度计570nm测定OD_570nm值，以OD_570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

2.3.2 反应溶液中剩余氨基酸含量测定

取各组反应后样品液0.2mL，加入pH5.4、2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL、60％乙醇稀释，摇匀后测定OD_570nm。

将样品测定的OD_570nm与标准曲线对照，可确定样品中多肽浓度。

2.4 X射线光电子能谱分析

从上述各反应条件组内随机选取三组瓣叶样品，冷冻真空干燥仪内充分干燥，装入玻璃小瓶密闭，室温条件送检，X射线光电子能谱仪(X—ray photoelectron spectroscopy，XPS)作表面元素的定性分析，各组未反应的为阴性对照。

2.5 交联多肽的荧光成像

2.5.1 超薄切片的制备

取上述各组瓣叶，裁剪为大小约2×2mm，每组10片，分别平整的放置于冰冻切片机的支撑器上并滴加包埋剂，—20℃恒冷切片，切片厚度为20μm，附贴于常温盖玻片上。切片完成后平置于48孔板内并标记，无菌PBS轻柔振荡漂洗5min×3次，去除包埋剂，4℃保存备用。

2.5.2 荧光标记多肽显色实验

取合成标记有丹磺酰氯(Dansyl chloride)的YGRGDSP多肽(Dan—YGRGDSP)，分装为1.5mg/管，—20℃储存。室温下无菌PBS溶解，配至浓度为2.0mg/ml的标准液，微孔滤膜(孔径0.22μm)过滤除菌，4℃储存，使用时按照不同浓度需要PBS稀释。

取上述置有各组瓣叶超薄切片的48孔板，根据上一实验所选获得的最佳反应pH值及反应时间，按照0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml四个多肽浓度，每孔加样0.5ml，室温(20—25℃)，振荡条件下进行反应。反应结束后，荧光显微镜激发波为360nm下，随机选取5个视野进行观察照相。

3.结果

3.1 茚三酮实验

AV、EC、GA三组去细胞瓣叶，在相同的反应条件下表现出YGRGDSP与之不同的交联能力。其中以EC组在各个条件下均较AV、GA组的YGRGDSP交联度明显高，具有显著差异，并在pH7.4、多肽浓度为1.5mg/ml、反应12h时多肽与材料间的交联度达到峰值，较其他组具有显著差异(表9～表11，图13～图15)。

表9 RGD浓度为1.0mg/ml时不同反应时间各组比较(x±s，n＝5)

EC组与AV组各时段相比P<0.01，与GA组各时段相比P<0.05；

EC组12h组与8h组相比P<0.05，与24h组相比P>0.05

表10 反应时间为12h时不同YGRGDSP浓度各组比较(x±s，n＝5)

EC组与AV组各浓度相比P<0.01，与GA组各浓度相比P<0.05；

EC组1.5mg/ml组与1.0mg/ml组相比P<0.05，与2.0mg/ml组相比P>0.05；

表11 1.5mg/ml RGD反应12h时不同pH值各组比较(x±s，n＝5)

EC组与AV组各浓度相比P<0.01，与GA组各浓度相比P<0.05；

EC组pH7.4组与pH7.0组相比P<0.05，与pH8.0组相比P>0.05

3.2 X射线光电子能谱分析

XPS法分析显示，各组瓣叶未与YGRGDSP反应前未检出硫元素；AV组在各种不同条件下与YGRGDSP多肽溶液反应后在电子结合能163eV～165eV范围可检出微量硫元素及二硫键；而EC与GA组在各个反应条件下在电子结合能163eV～165eV范围均可检出较高的硫元素峰及二硫键，特别是EC组在pH7.4、多肽浓度为1.5mg/ml、反应12h时多肽与材料间的交联度达到峰值，较其他组具有显著差异。

3.3 荧光标记多肽显色实验

根据上述实验中E组在pH7.4、多肽浓度为1.5mg/ml、反应12h时多肽与材料间的交联度可达到峰值，选取在该条件下进行带有荧光标记多肽反应，同时设立0.5mg/ml与2.0mg/ml两个对照组。结果显示各浓度组在相同观察面积下，1.5mg/ml组较0.5mg/ml组荧光颗粒的数量及荧光亮度均明显占优；而1.5mg/ml组与2.0mg/ml两组相比，荧光颗粒的数量及荧光亮度无明显差异。

4 讨论

利用去细胞瓣构建组织工程心脏瓣膜，具有高分子可降解材料无法替代的优越性。但是由于在支架去细胞过程中会同时去除大量细胞外可溶性基质，其中包括目前已知的调控细胞粘附的蛋白分子。因此在利用去细胞瓣构建组织工程心脏瓣膜时，如何调控、促进种子细胞的粘附、增殖和ECM新生，是丞待解决的重要问题。已证明RGD肽被固定到高分子材料表面后，特异性结合整合素，显著提高细胞粘附效率^[3]，与传统的促进生物材料内皮化方法(如材料表面预衬粘附蛋白)相比，这一方法的主要优点是人工合成短肽稳定性好，不易变性、水解。但RGD肽作用具有双重性，即固态时类似基质蛋白，能启动细胞粘附、迁移，而当处于游离状态，溶于水时则与胞膜表面整合素配体相竞争，抑制细胞与天然ECM结合，促进细胞凋亡。构建组织工程心脏瓣膜时应用合成RGD肽，主要利用其促粘附效应，因此需对材料进行表面改性，使RGD处于固态，与支架材料稳定连接。

常用的材料改性方法有表面修饰法、化学改性法、等离子体法、杂化改性法等。其中表面修饰法最常用，指在材料表面固定某些蛋白质或活性分子，或改变材料局部结构特征，以提高其生物相容性。材料表面修饰主要有物理和化学两种方法。前者多利用非共价键作用力(如疏水性、电荷分布、范德华力、氢键等)，将靶分子吸附于支架表面或包埋于材料内部，应用虽广但机制不确切，重复性差，而且这种结合的程度可随温度、pH值等变化；后者则通过改变材料表面化学特征，引入能够与靶分子(如RGD肽)键合的官能团，如羟基—OH、羧基—COOH、氨基—NH₂、巯基—SH、活性氢等，然后利用交联剂使材料与该分子共价键合，在化学反应基础上建立靶分子、多肽和支架之间的稳定结合。

环氧氯丙烷是多聚环氧化合物的一种，因其作为生物瓣膜交联剂具有以下优点：防钙化性能强；无细胞毒作用，且生物相容性好；机械强度不亚于戊二醛，而且材料更加透明柔软。其与胶原分子游离氨基酸反应形成共价键。环氧氯丙烷是本实验室筛选的普通生物瓣膜防钙化剂，动物实验证明环氧氯丙烷(EC)能使戊二醛(GA)处理的普通生物瓣膜钙化明显减轻，仅为对照组的1/317，且瓣膜的力学性能和组织稳定性良好。过去的研究表明EC处理生物支架材料毒性小，细胞生长好，是构建组织工程瓣有前途的支架材料处理方法。本实验采用YGRGDSP与环氧氯丙烷共价接枝的方法，尝试将YGRGDSP固定于去细胞瓣，检测该类型支架被YGRGDSP肽修饰的可行性及结构表征。

茚三酮反应是：茚三酮和α—氨基酸起氧化脱氨反应，蛋白质和多肽的游离氨基也能够发生这一反应，反应生成紫色的化合物在570nm处有强烈的吸收峰，其强度与参加反应的氨基酸的量成正比。任何与蛋白质游离氨基反应的化合物都会影响茚三酮的显色反应，多肽如果与GA、EC发生交联反应使其不再处于游离状态，就会降低该显色反应，所以可以通过茚三酮实验测定YGRGDSP多肽与去细胞瓣膜支架材料的交联度。通过测定，YGRGDSP与单纯去细胞瓣的交联度很低，而在EC、GA的作用下RGD与材料的交联度极大的提高，特别是在室温，持续振荡下，pH7.4、多肽浓度为1.5mg/ml、反应12h，达到交联的峰值。

XPS是材料学领域结构表征分析的重要技术之一，它运用单色软X射线轰击样品，后者表面电子受激发后发射逸出。通过测定逸出光电子能量分布，可确定物质表层十纳米左右深度的原子或离子的组成、状态及元素含量。XPS谱图上各种元素都有特征性的电子结合能，理论上可在不破坏样品情况下，对样品表层除氢以外所有元素作定性或定量分析。本实验应用XPS进行定性分析，结果提示去细胞瓣膜以及经过EC、GA处理后的均不含有硫元素。YGRGDSP肽与支架直接混合(单纯吸附)，未能达到二者间化学结合，而与经EC、GE组支架反应后，不仅检出S元素，而且S_2p中间峰位接近164eV，后者是二硫键的电子结合能。进一步的，我们又用标记有丹磺酰氯的YGRGDSP肽，以直观的方式观察到在优选的条件下，YGRGDSP多肽很好的接枝到了EC及GA组瓣叶上。故提示在环氧氯丙烷介导下，成功地将YGRGDSP肽通过以共价键为主的方式接枝到去细胞主猪主动脉瓣叶上。

实验三：去细胞猪主动脉瓣RGD表面修饰对细胞粘附影响的实验

1.材料和试剂

1.1 试剂

DMEM-LG培养基、新生牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美国，Gibco公司)，细胞培养专用青、链霉素、两性霉素B混合液(中国，中山生物技术有限公司)，PBS(北京，中山生物技术有限公司)，PolyHEMA(美国，Sigma公司)。

1.2 仪器

倒置相差显微镜(德国，Leica公司)，CO₂细胞培养箱(HERAcell，德国，Heraeus公司)，超净工作台(中国，苏州)。

1.3 材料：去细胞猪主动脉瓣(经第一部分实验获得)

1.4 动物：SD大鼠200—300g清洁级(第四军医大学实验动物中心提供，雌雄不限)

1.5 试剂配制

(1)10g/L胰蛋白酶：10g胰蛋白酶溶于1000mlPBS液中，0.22μm过滤分装备用；

(2)PBS缓冲液：购置成品包装的PBS，一袋溶于2000ml去离子水中，混匀后调整PH至7.4，250ml盐水瓶分装，高压灭菌，4℃保存；

(3)高渗液：0.75M KCl 56g+500ml去离子水溶解，用时1：5稀释，可稀释500ml高压灭菌备用；

(4)低渗液：A：Tris　6.07g+500ml去离子水溶解；

　　　　　 B：37％HCl 4.2ml+500ml去离子水；

取250ml A液+192.5ml B液+去离子水至500ml，用时1∶5稀释，可稀释至500ml高压灭菌备用；

2.方法

2.1 肌成纤维细胞(myofibroblasts，MFBs)体外分离和扩增

无菌条件取大鼠胸主动脉，去除外膜PBS冲洗，裁剪至约1×1mm²组织块，置25cm²培养瓶间隔1mm排列，培养液为含10％FBS+1％双抗(青霉素+链霉素)的高糖DMEM培养基，37℃、5％CO₂孵育箱中培养。5～7天成纤维细胞和平滑肌细胞移出组织块，3～4周上述两种细胞融合形成单层MFBs，0.25％胰蛋白酶溶液消化、传代培养，每3～4天更换培养液，使细胞扩增至第4～5代备用。

2.2 去细胞瓣的RGD修饰

实验分为5组，取上述制成的去细胞猪瓣瓣叶，随机取材，裁剪为大小约5×5mm，室温条件下分别进行如下处理：

①AV组：单纯去细胞瓣叶

②EC(纯)组：将去细胞瓣叶置于预先配置好的2％的EC溶液中室温浸泡48h，再经PBS反复漂洗后备用。

③GA(纯)组：将去细胞瓣叶置于0.3％的GA溶液中浸泡48h，PBS溶液摇床反复漂洗后，转入2％的EC溶液中室温浸泡48h，再经PBS反复漂洗后备用。

④EC+RGD组：上述EC组瓣叶制备完毕后，置于24孔板内，密封，Co⁶⁰ 12000Gy照射12-14h消毒。无菌条件下，室温，1.5mg/ml RGD溶液1ml、pH7.4、持续振荡反应12h，进行反应，反应结束后无菌PBS溶液漂洗5min×3次，4℃保存备用；

⑤GA+RGD组：上述GE组瓣叶制备完毕后，置于24孔板内，密封，Co⁶⁰ 12000Gy照射12-14h消毒。无菌条件下，室温，1.5mg/ml RGD溶液1ml、pH7.4、持续振荡反应12h，进行反应，反应结束后无菌PBS溶液漂洗5min×3次，4℃保存备用。

2.3 肌成纤维细胞的种植粘附实验

将各组瓣叶平铺置于经PolyHEMA预处理的24孔板内，每组6个。无血清培养液调整MFBs细胞密度至5×10⁵个/cm²，每孔滴加0.5ml细胞悬液至瓣叶，37℃、5％CO：培养箱内孵育2h，无血清培养液轻轻冲洗瓣膜，使未粘附细胞落在培养孔板上。取出各组瓣叶，0.25％胰酶充分消化所粘附的细胞，倒置显微镜观察，细胞计数板计数(S_粘附)。

3.结果

细胞粘附各组去细胞瓣2h后，胰蛋白酶洗脱法计数粘附细胞数显示：GE、EC组与AV组比较，大鼠MFBs粘附去细胞瓣的数量均明显增加，差异显著(P<0.05)；而GE组与EC组相比较，虽然粘附细胞数有所增加，但统计学上无显著差异(P>0.05)(参见表12，图16)。

表12 各组去细胞瓣细胞粘附率比较(x±s，n＝6)

 

分组	粘附细胞数(104个/ml)	P值
			AV组	5.21±1.21
纯EC组	6.13±1.01
			纯GA组	1.43±1.42
EC+RGD组	18.12±4.32	*<0.05，**<0.01
			GA+RGD组	7.36±5.17

^*EC+RGD组与AV、GE+RGD组比较，^**EC+RGD组与GA组比较

4.讨论

种子细胞、生物材料和组织器官再生构成组织工程三大要素，其中细胞和材料间相互作用是主要研究内容。将某些生物活性分子固定在高分子或生物源性材料的表面，修饰其结构特征，提高材料的生物相容性和细胞亲和力，为种子细胞粘附、增殖、扩展和分化提供良好界面，促进细胞外基质(ECM)产生，是构建组织工程产品的重要措施。生物活性分子以生长因子和多肽最常用，其中精氨酸—甘氨酸—天门冬氨酸(Arg—Gly—Asp，RGD)三肽是许多粘附蛋白所共有的细胞间识别的最小序列，这一序列在介导细胞粘附、迁移和生长方面起重要的作用。已证明含RGD肽被固定到高分子材料表面后，特异性结合整合素，显著提高细胞粘附效率，而且不改变材料表面理化特征，且较其它修饰方法(如外加血清、白蛋白、多聚赖氨酸、FN)可控性更强。

去细胞瓣以其仿生的机械性能和优良的组织相容性等优点，现已成为一种很有临床应用前景的组织工程心脏瓣膜支架。经胰蛋白酶、去污剂等处理，在去除细胞成分同时保留以胶原纤维为主的3D纤维支架结构，为种子细胞的生长、迁移提供了良好微环境。但同时也发现，去细胞处理和低温保存也使其机械强度有所下降，而且某些ECM成分(如可溶胶原、葡胺聚糖)的丢失，胶原纤维部分断裂，均不同程度影响到种子细胞的粘附和增殖。本实验首先应用申请人筛选和鉴定的环氧氯丙烷处理和改性经戊二醛交联固定的去细胞猪主动脉瓣，协同戊二醛加强去细胞瓣的柔韧性、机械强度，同时降低了其生物毒性，也明显减轻瓣膜的钙化。其次，在进一步的实验中发现，环氧氯丙烷及戊二醛两者均可显著的促进YGRGDSP多肽以共价键的方式牢固、稳定的结合在去细胞瓣膜上。

目前离体研究细胞粘附最常用的是沉淀法和微吸管吸吮法，前者应用细胞沉积支架原理，适合分析大量细胞对支架的粘附，后者用于测定单个细胞对基质材料的粘附力，对实验条件要求较高，不如前者简便。本实验选择前者，通过对单纯去细胞瓣、经环氧氯丙烷、戊二醛处理以及粘附YGRGDSP多肽各组的比较，初步证实了YGRGDSP多肽修饰去细胞瓣，可以明显促进细胞的在瓣膜支架的粘附性。

本实验证明了环氧氯丙烷联合YGRGDSP多肽对去细胞瓣的表面修饰，在改善了支架材料的理化性能的基础上，更进一步的提高了支架材料的细胞粘附性，更适合运用于去细胞组织工程心脏瓣膜的研制中。GA虽然也可以改善支架材料的理化性能，但其细胞毒性太大，使种子细胞无法粘附生长。

第三部分：结论

本实验结果表明，利用环氧氯丙烷(EC)可以将RGD(YGRGDSP)多肽和去细胞支架组织高效连接在一起，同时对去细胞支架组织加以充分交联。去细胞过程可以明显减轻异种(猪)主动脉瓣的免疫炎性反应，减轻由此而引起的体内瓣叶破坏和钙化，但这一过程同时对瓣叶胶原纤维支架的完整性有一定的破坏作用，使游离羧基含量增加，仍然存在钙盐沉积的机会，细胞外基质成分丢失殆尽，对种子细胞黏附功能差。经EC和RGD联合处理改良后，一方面有效封闭了去细胞瓣叶游离羧基的暴露，减缓了钙盐的沉积，另一方面也与氨基有一定的交联作用，使去细胞瓣叶的力学性能有所改善，另一方面YGRGDSP多肽被EC连接在去细胞支架上大大提高了种子细胞的粘附和生长。

1.通过环氧氯丙烷、戊二醛的对比研究，证实了EC处理能够增加瓣膜的含水量，提高支架材料的力学性能、抗酶解能力，维持瓣膜结构的完整性，增加去细胞支架材料的机械性能和组织稳定性，可为组织工程瓣膜的构建提供更为理想的支架材料。

2.利用化学交联剂EC，可将YGRGDSP(酪氨酸—甘氨酸—精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸—丝氨酸—脯氨酸)肽通过共价接枝的方式成功固定到去细胞猪主动脉瓣支架进行表面修饰。

3.YGRGDSP肽联合EC对去细胞瓣的表面修饰，在维持瓣膜的良好理化性能基础上，同时增强了去细胞支架材料力学性能和防钙化能力，并可显著改善去细胞瓣支架材料对肌成纤维细胞的粘附性能，有利于TEHV构建。

Claims (2)

1.一种改良去细胞组织工程瓣膜/血管支架的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)去细胞组织工程瓣膜/血管支架制作：

选取新鲜家猪完整主动脉瓣，热缺血时间小于2小时，浸入存4℃PBS液中保存，剔除血管外膜、附着的脂肪及肌肉部分，瓣根血管长4.0cm±0.5cm，血管外径1.2cm±0.01cm，保留完整的主动脉瓣叶，避免损伤；修剪完毕后，经无菌10mM PBS液漂洗2～3次后，装入广口瓶中，瓣膜置于含10g/L胰蛋白酶+0.02％EDTA及双抗溶液的PBS液中，24℃，持续振荡消化24h，期间每12h换上述溶液一次；继而换用含1％TritonX-100及双抗的高渗液，24℃下持续振荡洗涤24h，期间每12h换液一次，必要时重复一次；脱细胞、去垢完成后，无菌含双抗PBS振荡洗涤24h，期间每6h换液一次，以清除残留的细胞碎片和DNA、RNA片段；振荡洗涤完毕后，置于灭菌广口瓶中，封口后送钴源室辐照消毒备用；

2)制备线型YGRGDSP肽序列：

以多肽合成仪制备线型YGRGDSP序列，并于多肽链-NH₂末端氨基酸应用丹磺酰氯标记，并进行荧光显色测定；

3)使用磷酸盐缓冲液配制2％环氧氯丙烷，加入YGRGDSP多肽制成多肽液，使多肽液中的YGRGDSP多肽的终浓度为2.0mg/ml；

4)将去细胞组织工程瓣膜/血管支架置入多肽液交联反应12小时，使YGRGDSP多肽连接于去细胞组织工程瓣膜/血管支架的胶原和弹性蛋白上。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的钴源室辐照消毒时间为12小时～14小时。

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