CN113730656A - 一种生物瓣膜材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医用材料技术领域，公开了一种生物瓣膜材料及其制备方法。本发明所述生物瓣膜材料由非人哺乳动物的心包膜经D(‑)‑核糖交联后获得。本发明采用非戊二醛的核糖交联技术方法，利用核糖能够对胶原蛋白上的氨基形成共价键结合，有效的提高生物材料的力学强度和抗钙化能力，同时明显降低了细胞毒性，提高了生物相容性。同时经过制备后的生物瓣膜材料，相对于目前临床应用的戊二醛制备的材料，具有更薄，更适用于TAVR技术的要求，完整的保护了细胞外基质的主要成分，有利于宿主细胞的浸润、粘附和内皮化。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体的说是涉及一种生物瓣膜材料及其制备方法。
背景技术
每年有超过30万例的心脏瓣膜置换手术在全球范围发生，其中生物瓣膜的应用比例为78.3％。经导管主动脉瓣置换(TAVR)技术的迅速普及，对生物瓣膜的需求也越来越迫切。虽然TAVR现阶段主要被应用于高龄、高危人群，但因其具有更小的侵袭性、更快的恢复时间、更少的并发症，为更年轻的患者打开了大门。适用于TAVR的生物瓣膜在释放前被折叠在镍钛合金的网状框架内，经导管输送到主动脉瓣环的锚定区之后，网状合金框架可自动膨胀展开，固定方式无需缝合，显著的减少了体外循环的时间和手术的创口。这也决定了TAVR技术对生物材料的厚度有更高的要求，所以如何寻找更薄的心脏瓣膜材料，成为了生物医学工程领域的热点。
目前临床使用的生物瓣膜材料大部分经由戊二醛固定技术制备而成，戊二醛本身具有细胞毒性，且易于发生瓣叶组织钙化。钙和磷酸盐在特定位点沉积，形成钙磷结晶并逐渐扩大，使得瓣叶僵硬、活动度受限。因为生物瓣膜的钙化，发生结构性瓣膜衰败，导致瓣膜失功，使得生物瓣膜的耐久性降低。
现有的TAVR技术应用的生物瓣膜，存在易钙化、有细胞毒性、材料偏厚，以及生物力学强度不够的缺点，所以提高生物瓣膜材料生物力学强度、减小材料厚度、降低细胞毒性和减少钙化，一直是生物医学工程领域的重点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生物瓣膜材料及其制备方法，使得所述生物瓣膜材料能够提高生物材料的力学强度、减少钙化、减小材料厚度、降低材料含水量，同时具有较高的抗酶解能力和热皱缩温度。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种生物瓣膜材料，由非人哺乳动物的心包膜经D(-)-核糖交联后获得。
D(-)-核糖为五碳单糖，化学式C5H10O5，分子量150.1，CAS号:50-69-1，白色结晶性粉末，熔点87℃。在本发明中，所述非人哺乳动物主要指目前经常用来制备生物瓣膜材料的哺乳动物，例如牛、羊、马、驴、猪等等，这些哺乳动物的心包膜可从屠宰场获取，心包膜在热缺血时间内，先分离心包表层的脂肪，后用含抗生素无菌PBS液清洗，浸入消毒液，置入含抗生素无菌PBS，在低温4℃保存。
与Glut(戊二醛交联)技术、EDC/NHS(碳二亚胺交联)技术、PC(环氧化合物交联)技术、Genipin(京尼平交联)技术、光氧化技术以及DHT技术相比，本发明所述生物瓣膜材料在材料的厚度、力学性能、含水量等方面和现有的其他技术相比，可以同时将各个指标性能控制在较佳程度，具有显著优势；而且，与Glut(戊二醛交联)技术和Genipin(京尼平交联)技术相比，可以避免钙化现象的产生。因此，本发明提出了D(-)-核糖作为交联剂在制备生物瓣膜材料中的应用。
同时，本发明还提供了所述生物瓣膜材料的制备方法，将非人哺乳动物的心包膜置于D(-)-核糖溶液中进行交联反应，然后灭菌保存获得所述生物瓣膜材料。
核糖溶液碱性太强会对生物瓣膜材料有腐蚀；核糖溶液浓度继续增加无法实现核糖的完全溶解，即定量的溶液中无法完全溶解的核糖便无法充分发挥交联作用。因此作为优选，所述D(-)-核糖溶液的pH值为8-9，可使用HCL和NaOH来调整pH，D(-)-核糖浓度为90-110mM。在本发明具体实施方式中，所述D(-)-核糖溶液的pH值为8.5左右，D(-)-核糖浓度为100mM左右，
在本发明具体实施方式中，所述交联反应的温度为37±0.5℃，时间为7天或以上。该反应温度可以更好的适应后续生物瓣膜材料植入人体，同时在保证消毒灭菌要求下，可以延长反应时间，例如7-14天或10-14天。
此外，优选地，在制备过程中还包括将心包膜用模具铺展后固定。在本发明具体实施方式中，所述模具包括A环与B环，A环和B环铰接并能够对位扣合形成整体环状模具，固定过程先将心包膜平整、均匀的放置在模具的A环或B环上，优选较小的环，然后扣合模具完成心包膜的固定。本发明实施例中的模具呈圆环形，能保证心包膜在360度的每个方向上均匀受力，不出现撕裂、过度牵拉、皱褶，避免过度增厚，结构示意图见图1。
作为优选，所述模具的材质为能够使模具固定心包膜后悬浮在D(-)-核糖溶液中的材质，例如聚丙烯，这样可以减少与容器内壁不必要的接触，同时最大程度上和核糖溶液进行交联反应。
由以上技术方案可知，本发明采用非戊二醛的核糖交联技术方法，利用核糖能够对胶原蛋白上的氨基形成共价键结合，有效的提高生物材料的力学强度和抗钙化能力，同时明显降低了细胞毒性，提高了生物相容性。同时经过制备后的生物瓣膜材料，相对于目前临床应用的戊二醛制备的材料，具有更薄，更适用于TAVR技术的要求，完整的保护了细胞外基质的主要成分，有利于宿主细胞的浸润、粘附和内皮化。
附图说明
图1所示为本发明所述模具的结构示意图以及固定心包膜的示意图；
图2所示为Fresh新鲜组、Glut戊二醛技术组、本发明Ribose核糖不同浓度组的热皱缩温度结果(℃)；
图3所示为Fresh新鲜组、Glut戊二醛技术组、本发明Ribose核糖不同浓度组的生物力学性能结果；*p<0.05；
图4所示为Fresh新鲜组、Glut戊二醛技术组、本发明Ribose核糖组的抗胶原酶能力结果；
图5所示为SD大鼠体内植入生物瓣膜材料的模型；
图6所示为肉眼宏观评价SD大鼠体内植入的Glut技术生物瓣膜材料的钙化情况；
图7所示为肉眼宏观评价SD大鼠体内植入的Genipin技术生物瓣膜材料的钙化情况；
图8所示为肉眼宏观评价SD大鼠体内植入的本发明Ribose核糖生物瓣膜材料的钙化情况；
图9所示为Glut技术生物瓣膜材料的VonKossa染色结果；
图10所示为Genipin技术生物瓣膜材料的VonKossa染色结果；
图11所示为本发明Ribose核糖生物瓣膜材料的VonKossa染色结果；
图12所示为Glut技术、Genipin技术以及本发明Ribose核糖生物瓣膜材料的ICP-OES钙离子定量检测结果；*p<0.05；****p<0.0001；
图13所示为不同交联温度参数的比较；在37摄氏度时，心包材料的生物力学性能最好(**p<0.01)；
图14所示为核糖溶液不同PH参数的比较：在PH 8.5时，心包材料的生物力学性能最好(*p<0.05)；
图15所示为不同交联时间参数的比较：在交联10天后，心包材料的生物力学性能最好，且显著优于Glut组(***p<0.001)。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种生物瓣膜材料及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述生物瓣膜材料及其制备方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的生物瓣膜材料及其制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
1)材料获取保存：将非人哺乳动物的心包膜在热缺血时间15分钟内，先分离心包表层的脂肪，后用含抗生素的无菌PBS液(青霉素和链霉素，浓度分别为100U/ml,100ug/ml)清洗4-5次，浸入0.1％新洁尔灭30min，置入含抗生素的无菌PBS，在低温4℃保存。
2)模具固定：将心包材料裁剪成适当大小，光滑面朝上，置于本发明所描述的模具中固定(见图1)，模具呈圆环形，能方便有效的固定心包材料，同时保证心包材料在每个方向上均匀受力，不出现撕裂、过度牵拉、皱褶和反折。
3)交联处理：配制浓度范围90-110mM的核糖溶液，调整pH参数范围8-9，加入容器中待用。将固定在模具上的心包膜置入容器中开始交联，模具材质的密度能够保证心包膜悬浮在核糖溶液中，减少与容器内壁不必要的接触，同时最大程度上和核糖进行反应。交联反应的技术条件：环境温度参数范围：37±0.5摄氏度，震荡摇晃速度为60-80RPM；反应时间1天-10天(优选7-10天)，其间定期换液，以保证核糖有效的对心包生物材料进行交联，达到改性的目的。
本发明采用了基于非戊二醛的核糖交联技术方法，利用核糖对心包膜中胶原蛋白的有效作用，使得胶原蛋白侧链上的功能基团(主要是氨基)之间，形成不可逆的、稳定的、共价键相互连结，有效的提高生物材料的力学强度和抗酶解能力、降低其溶解性。同时明显降低了细胞毒性，提高了生物相容性，达到符合临床应用生物瓣膜的要求。此外也极大程度的避免和钙化现象和降低材料的厚度。
在本发明实施例中，现有各交联技术参照如下文献：
1.Glut技术文献：
Tam H,Zhang W,Feaver KR,Parchment N,Sacks MS,Vyavahare N.A novelcrosslinking method for improved tear resistance and biocompatibility oftissue based biomaterials.Biomaterials.2015Oct；66:83-91.doi:10.1016/j.biomaterials.2015.07.011.Epub 2015Jul 14.PMID:26196535；PMCID:PMC4522354.
2.EDC/NHS技术文献：
Tam H,Zhang W,Infante D,Parchment N,Sacks M,Vyavahare N.Fixation ofBovine Pericardium-Based Tissue Biomaterial with Irreversible ChemistryImproves Biochemical and Biomechanical Properties.J Cardiovasc TranslRes.2017Apr；10(2):194-205.doi:10.1007/s12265-017-9733-5.Epub 2017Feb 17.PMID:28213846；PMCID:PMC5903689.
3.Genipin技术文献：
Lim HG,Kim SH,Choi SY,Kim YJ.Anticalcification effects ofdecellularization,solvent,and detoxification treatment for genipin andglutaraldehyde fixation of bovine pericardium.Eur J CardiothoracSurg.2012Feb；41(2):383-90.doi:10.1016/j.ejcts.2011.05.016.Epub 2011Dec12.PMID:21683607.
4.光氧化技术文献：
M.K.AKENS，B.VON RECHENBERG，P.BITTMANN，D.NADLER，K.ZLINSZKY andJ.A.AUER.In Vitro Studies of a Photo-oxidized Bovine ArticularCartilage.J.Vet.Med.A 49,39-45(2002).
5.DHT技术文献(参数选择180℃，48h)：
Haugh MG,Jaasma MJ,O'Brien FJ.The effect of dehydrothermal treatmenton the mechanical and structuralproperties of collagen-GAG scaffolds.J BiomedMater Res A.2009May；89(2):363-9.doi:10.1002/jbm.a.31955.PMID:18431763.
6.PC技术文献：
Zhuravleva IY,Karpova EV,Oparina LA,Poveschenko OV,Surovtseva MA,Titov AT,Ksenofontov AL,Vasilieva MB,Kuznetsova EV,Bogachev-Prokophiev AV,Trofimov BA.Cross-linking method using pentaepoxide for improving bovine andporcine bioprosthetic pericardia:A multiparametric assessment study.Mater SciEng C Mater Biol Appl.2021Jan；118:111473.doi:10.1016/j.msec.2020.111473.Epub2020Sep 3.PMID:33255052.
如未特别说明，各组除去应有的技术差别外，其他实验环境和检测方法保持一致，同时各现有方法均采用本发明模具固定。各组心包膜材料均来源于湖南省长沙市红星屠宰场的黄牛体内(牛龄1岁，雄性、体重约400-450kg)。
以下就本发明所提供的一种生物瓣膜材料及其制备方法做进一步说明。
实施例1：制备本发明所述生物瓣膜材料
1)获取材料：由湖南省长沙市红星屠宰场的黄牛体内(牛龄1岁，雄性、体重约400-450kg)提供或购买心包膜，热缺血时间15分钟内，先分离心包表层的脂肪，后用含抗生素无菌PBS液(青霉素和链霉素，浓度分别为100U/ml,100ug/ml)清洗4-5次，浸入0.1％新洁尔灭30min，置入含抗生素无菌PBS，在低温4℃保存。
2)模具固定：将心包材料裁剪成约8×6cm矩形大小，光滑面朝上，置于本发明所述模具中固定(见图1)。
3)交联处理：配制浓度为100mM的核糖溶液400ml，调整pH为8.5，加入容器中待用。将固定在模具上的心包膜置入容器中开始交联。交联反应的技术条件：环境温度37℃，震荡摇晃速度为60-80RPM；反应时间10天，其间每隔3天换液一次。
4)保存灭菌：交联完成后，用含抗生素无菌PBS漂洗心包膜5min×3次，去除残留的杂质；置入75％酒精中保存，密闭封口，25KGyγ射线照射灭菌保存。
实施例2：本发明生物瓣膜材料检测结果
1、热皱缩温度
将各组材料裁剪成1cm*5cm长条状(n＝6)，以蒸馏水为介质，从20℃开始加热，每分钟升高2℃，应用HG-1皮革收缩温度测试仪(四川成都大承兴数字系统公司)测定。
图2结果显示，经本发明技术交联制备的生物瓣膜材料，其热皱缩温度均有所提升，具有随浓度提高而提高的趋势，体现材料中胶原纤维的稳定性增加。
2、生物力学性能
将各组材料裁剪成1cm＊6cm长条状(n＝10)，应用电子拉力测验机(美国，Instron，电子万能材料试验机)，测量并记录每个样品的厚度和拉伸长度。设定拉伸速率为50mm/min，得到每个样品的应力-应变曲线图，再计算出材料的杨氏模量(Young’smodulus)(MPa)。
图3结果显示，经本发明技术交联制备的生物瓣膜材料，其生物力学性能有显著提升，具有随浓度提高而提高的趋势，从50mM开始力学性能超越Glut组，100mM浓度时明显优于Glut组(*p<0.05)。
3、抗胶原酶解能力
裁剪心包膜材料为2x1cm，冻干24h，称重W1；
Tris 100mM+10mM CaCl PH7.4+collagenase 125U/ml.37℃作用24h；
去离子水冲洗3次x5min，冻干24h，称重W2；
计算重量损失百分比(W1-W2)/W1％；
图4结果显示，经本发明技术交联制备的生物瓣膜材料，抗胶原酶解的能力相比新鲜的心包膜有明显提升，与Glut组无显著差异。
4、与多种现有技术对比
Glut(戊二醛交联)技术、EDC/NHS(碳二亚胺交联)技术、PC(环氧化合物交联)技术、Genipin(京尼平交联)技术、光氧化技术、DHT技术以及本发明Ribose技术进行多种指标的检测和对比，结果见下表1；
表1
| 厚度mm | 热皱缩温度 | 力学性能杨氏模量 | 抗酶解 | 含水量 | |
| Fresh | 0.42 | 65.4±3.2 | 132.5±28.3 | 81％ | 83％ |
| Glut技术 | 0.61 | 83.3±1.9 | 227.6±23.9 | 5％ | 75％ |
| EDC技术 | 0.65 | 80.1±0.9 | 207.0±27.6 | 6％ | 77％ |
| Genipin技术 | 0.62 | 79.3±1.1 | 216.7±25.4 | 7％ | 74％ |
| 光氧化技术 | 0.51 | 69.1±0.4 | 160.5±29.8 | 60％ | 79％ |
| DHT技术 | 0.32 | 65.5±0.3 | 121.7±29.0 | 8％ | 47％ |
| PC技术 | 0.69 | 76.1±2.2 | 187.3±42.5 | 15％ | 80％ |
| Ribose技术 | 0.44 | 78.6±1.7 | 245.2±51.3 | 9％ | 62％ |
注：DHT技术需要经过脱水加热处理，所以含水量和厚度会比新鲜组更低；
由上表可以看出，在材料厚度上(各组心包膜起始厚度与Fresh新鲜组误差在±0.01mm)，虽然DHT技术厚度最小，但是其热皱缩温度、力学性能明显较差；相比其他各组的材料厚度，本发明制备的材料厚度更接近新鲜组，且在抗酶解和热皱缩温度上与Glut技术、EDC技术和Genipin技术没有明显差异，但是在力学性能上本发明技术获得的材料是最佳的；
本发明技术，对新鲜组有明显提升；在材料的厚度、力学性能、含水量(材料组织结构紧密程度越紧密，越不容易被水分渗透，则表现为含水量越低)等方面和现有的其他技术相比，具有显著的优势。
5、SD大鼠体内植入的钙化检测
对4周龄的雄性SD大鼠，皮下包埋模型，经120天后取出标本，观察得出结论：
经戊二醛Glut交联制备的生物瓣膜材料有明显的钙化灶，现有其他技术Genipin钙化轻微，而本发明Ribose核糖未见钙化(图5-12)。
实施例3：本发明制备方法不同参数的生物力学性能对比
①反应的环境温度37摄氏度(见图13)：模拟人体内部最佳的内环境稳态，保证反应的速率。其他参数：核糖溶液浓度为100mM、PH8.5，交联时间10天；
②核糖溶液的PH保持在8.5左右(见图14)：以确保胶原侧链上的氨基功能基团被活化，最大程度的参与反应。其他参数：核糖溶液浓度为100mM，交联反应温度37度、时间10天；
③反应时间7天-10天(见图15)：过短的时间内难以形成稳定的、不可逆的共价键产物。其他参数：核糖溶液浓度为100mM、PH8.5，交联反应温度37度；
根据图13-15的结果可以看出，在37℃、pH8.5环境下反应7-10天可以获得最佳的生物力学性能。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。
Claims (10)
1.一种生物瓣膜材料，其特征在于，由非人哺乳动物的心包膜经D(-)-核糖交联后获得。
2.根据权利要求1所述生物瓣膜材料，其特征在于，所述非人哺乳动物包括牛、猪、马、驴和羊。
3.D(-)-核糖作为交联剂在制备生物瓣膜材料中的应用。
4.权利要求1所述生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，将非人哺乳动物的心包膜置于D(-)-核糖溶液中进行交联反应，然后灭菌保存获得所述生物瓣膜材料。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述D(-)-核糖溶液的pH值为8-9，D(-)-核糖浓度为90-110mM。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物包括牛、猪、马、驴和羊。
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述交联反应的温度为37±0.5℃，时间为7天或以上。
8.根据权利要求4-7任意一项所述制备方法，其特征在于，还包括将心包膜用模具铺展后固定。
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述模具包括A环与B环，A环和B环铰接并能够对位扣合形成整体环状模具。
10.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述模具的材质为能够使模具固定心包膜后悬浮在D(-)-核糖溶液中的材质。
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