CN107488700B - 模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法，涉及生物模型构建技术领域，包括以下步骤：S1，从主动脉瓣组织中采用胶原酶消化法提取瓣膜间质细胞制成细胞上清培养基；S2，将磁珠与RGD肽原液混合制得附着有RGD肽的磁珠；S3，将附着有RGD肽的磁珠加入步骤S1制得的细胞上清培养基中，弃上清，PBS清洗后加入第一培养基中培养；将所述第一培养基放入磁力扭曲仪中，通过调节磁力扭曲仪的磁力大小、频率和磁力作用时间模拟异常血流对瓣膜间质细胞的力学刺激，观察瓣膜间质细胞的钙化状态。本发明可实现微观模拟异常血流力学刺激在瓣膜钙化中的作用，同时，缩短单纯钙化培养基构建钙化模型所需时间。

Description

模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法
技术领域
本发明涉及生物模型构建技术领域，具体涉及一种模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法。
背景技术
目前在对主动脉瓣钙化的力学刺激研究中，以生物反应器为主，诸如拉伸力生物反应器、弯曲力生物反应器、剪切力生物反应器、复合生物反应器，均研究宏观异常力学刺激对瓣膜组织或瓣膜细胞的钙化作用，只能模拟部分宏观力学，如单纯层流剪切力、湍流剪切力，没有办法做到完全模拟外界异常的力学刺激。
具体的说，正常钙化过程中，力学刺激只能直接作用于瓣膜内皮细胞，通过瓣膜内皮细胞和细胞外间质将力学刺激传导至瓣膜间质细胞，或通过瓣膜内皮细胞分泌细胞因子影响瓣膜间质细胞的钙化。宏观的力学模型没有办法排除瓣膜内皮细胞分泌细胞因子对瓣膜间质细胞钙化的影响以单纯研究力学刺激对瓣膜间质细胞的影响；同时，宏观的力学模型也没有办法完全模拟细胞外间质或是瓣膜内皮细胞将力学刺激传递给瓣膜间质细胞的过程。
同时，研究宏观力学刺激受体对钙化的影响，操作复杂，需要将复杂的装置放入培养箱中持续培养，宏观力学刺激培养钙化周期作用周期较长。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法，实现微观模拟异常血流力学刺激在瓣膜钙化中的作用。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法：
S1，从主动脉瓣组织中采用胶原酶消化法提取瓣膜间质细胞制成细胞上清培养基；
S2，将磁珠与RGD肽原液混合制得附着有RGD肽的磁珠；
S3，将附着有RGD肽的磁珠加入步骤S1制得的细胞上清培养基中，弃上清，PBS清洗后加入第一培养基中培养；将所述第一培养基放入磁力扭曲仪中，通过调节磁力扭曲仪的磁力大小、频率和磁力作用时间模拟异常血流对瓣膜间质细胞的力学刺激，观察瓣膜间质细胞的钙化状态。
在上述方案的基础上，所述第一培养基为血清浓度1％的普通培养基或钙化培养基。
在上述方案的基础上，步骤S1包括：
S101，取猪心，尽量无菌条件下剪下主动脉瓣，泡在高糖溶液中；
S102，用添加舒普深和两性霉素的无菌PBS反复冲洗瓣膜后，将瓣膜至于含舒普深和两性霉素的I型胶原酶中消化，无肉眼可观的组织残渣后，离心去除上清，加入血清浓度10％的完全培养基中培养；
S103，取瓣膜间质细胞，采用胰酶消化法消化，待大部分细胞漂起后，用血清浓度10％的完全培养基中和，离心去除上清，再加入血清浓度1％的培养基制成细胞上清培养基。
在上述方案的基础上，步骤S2包括：
S201，取置于无水乙醇中的磁珠于EP管中，离心去除上清；
S202，加入无水乙醇，并用超声清洗；
S203，置于旋转仪中，在4摄氏度条件下保存过夜；
S204，离心去除上清，打开EP管盖，待剩余酒精自然挥发；
S205，加入碳酸盐缓冲液；
S206，加入RGD肽原液，制得附着有RGD肽的磁珠，置于旋转仪中，在4摄氏度条件下保存。
在上述方案的基础上，步骤S3包括：
S301，取步骤S2制得的附着有RGD肽的磁珠，离心去除上清，用PBS重悬；
S302，将附着有RGD肽的磁珠加入步骤S1制得的细胞上清培养基中培养，弃上清并进行PBS清洗后，加入所述第一培养基中培养；
S303，将步骤S302培养后的所述第一培养基放入MTC仪器，通过调节磁力扭曲仪的磁力大小、频率和磁力作用时间模拟异常血流对瓣膜间质细胞的力学刺激，观察瓣膜间质细胞的钙化状态。
在上述方案的基础上，所述第一培养基为血清浓度1％的普通培养基或钙化培养基。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明将附着有RGD肽的磁珠与瓣膜间质细胞共同放入第一培养基中培养，将第一培养基放入磁力扭曲仪中施加磁力以模拟力学刺激，实现微观模拟异常血流力学刺激在瓣膜钙化中的作用；同时，第一培养基采用钙化培养基时可以同时模拟钙磷沉积和异常血流动力学二者在钙化中的作用，更好地模拟瓣膜钙化的过程，缩短单纯钙化培养基构建钙化模型所需时间。
附图说明
图1为本发明实施例中模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法中瓣膜间质细胞与磁珠(磁珠外包被RGD肽)结合的镜下示意图(放大40倍)；
图2为本发明实施例中模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法作用后的瓣膜间质细胞中的钙化反应的验证结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法
本发明实施例提供一种模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法：
S1，从主动脉瓣组织中采用胶原酶消化法提取瓣膜间质细胞制成细胞上清培养基，具体包括以下过程：
S101，取猪心，尽量无菌条件下剪下主动脉瓣，泡在高糖溶液中；
S102，用添加舒普深和两性霉素的无菌PBS反复冲洗瓣膜后，将瓣膜至于含舒普深和两性霉素的I型胶原酶中消化，无肉眼可观的组织残渣后，离心去除上清，加入血清浓度10％的完全培养基中培养；
S103，取瓣膜间质细胞，采用胰酶消化法消化，待大部分细胞漂起后，用血清浓度10％的完全培养基中和，离心去除上清，再加入血清浓度1％的培养基制成细胞上清培养基。
S2，将磁珠与RGD肽原液混合制得附着有RGD肽的磁珠，具体包括以下过程：
S201，取置于无水乙醇中的磁珠于EP管中，离心去除上清；
S202，加入无水乙醇，并用超声清洗；
S203，置于旋转仪中，在4摄氏度条件下保存过夜；
S204，离心去除上清，打开EP管盖，待剩余酒精自然挥发；
S205，加入碳酸盐缓冲液；
S206，加入RGD肽原液，制得附着有RGD肽的磁珠，置于旋转仪中，在4摄氏度条件下保存。
S3，将附着有RGD肽的磁珠加入步骤S1制得的细胞上清培养基中，弃上清，PBS清洗后加入第一培养基中培养；第一培养基为血清浓度1％的普通培养基或钙化培养基；将第一培养基放入磁力扭曲仪中，通过调节磁力扭曲仪的磁力大小、频率和磁力作用时间模拟异常血流对瓣膜间质细胞的力学刺激，参见图1所示，观察瓣膜间质细胞的钙化状态，具体包括以下过程：
S301，取步骤S2制得的附着有RGD肽的磁珠，离心去除上清，用PBS重悬；
S302，将附着有RGD肽的磁珠加入步骤S1制得的细胞上清培养基中培养，弃上清并进行PBS清洗后，加入第一培养基中培养；
S303，将S302中培养后的第一培养基放入磁力扭曲仪中，通过调节磁力扭曲仪的磁力大小、频率和磁力作用时间模拟异常血流对瓣膜间质细胞的力学刺激，观察瓣膜间质细胞的钙化状态。
实施例2：模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法中蛋白印记验证法
本实施例用于验证通过模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法作用后的瓣膜间质细胞中的钙化反应
S401，利用实施例1中所示方法，分别在钙化培养基中用F＝0Pa，F＝2.185Pa，F＝4.375Pa，F＝8.75Pa，F＝17.5Pa，F＝26.25Pa刺激瓣膜间质细胞(F表示磁力，频率为1Hz，时间为20分钟)，同时设置单纯普通培养基和钙化培养基培养培养的瓣膜间质细胞作为对照组，在37摄氏度，5％二氧化碳培养箱中培养3天；
S402，三天后，用RIPA裂解瓣膜间质细胞并从瓣膜间质细胞中提取蛋白；
S403，用BCA法检测步骤S402提取的蛋白浓度，并根据蛋白浓度计算30ug蛋白的体积；
S404，使用凝胶试剂盒配置凝胶，将分别从普通培养基、钙化培养基、钙化培养基+F＝0，钙化培养基+F＝2.185Pa，钙化培养基+F＝4.375Pa，钙化培养基+F＝8.75Pa，钙化培养基+F＝17.5Pa和钙化培养基+F＝26.25Pa提取出的蛋白各加入一份凝胶中，每份凝胶中均需加入30ug蛋白，在80V电压下进行电泳；
S405，待蛋白电泳至凝胶底部，停止电泳，并在35V电压下转膜8小时；
S406，将PVDF封闭、洗涤，加入一抗并孵育过夜、洗涤，加入二抗并孵育、洗涤；
S407，将PVDF膜放入化学发光仪，滴加ECL显影液曝光；
S408，进行结果分析，得出图2所示结果，其中：
从左到右依次为普通培养基、钙化培养基、钙化培养基+F＝0，钙化培养基+F＝2.185Pa，钙化培养基+F＝4.375Pa，钙化培养基+F＝8.75Pa，钙化培养基+F＝17.5Pa和钙化培养基+F＝26.25Pa；RUNX2和BMP2为蛋白指标，表示发生钙化。GAPDH为蛋白内参，表示加入蛋白等量。
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (1)

1.一种模拟异常血流力学刺激对瓣膜细胞钙化作用的方法，其特征在于：
S1，从主动脉瓣组织中采用胶原酶消化法提取瓣膜间质细胞制成细胞上清培养基；
S2，将磁珠与RGD肽原液混合制得附着有RGD肽的磁珠；
S3，将附着有RGD肽的磁珠加入步骤S1制得的细胞上清培养基中，弃上清，PBS清洗后加入第一培养基中培养；将所述第一培养基放入磁力扭曲仪中，通过调节磁力扭曲仪的磁力大小、频率和磁力作用时间模拟异常血流对瓣膜间质细胞的力学刺激，观察瓣膜间质细胞的钙化状态；所述第一培养基为血清浓度1％的钙化培养基；所述磁力大小为为2.185Pa～26.25Pa；
具体地：
步骤S1包括：
S101，取猪心，尽量无菌条件下剪下主动脉瓣，泡在高糖溶液中；
S102，用添加舒普深和两性霉素的无菌PBS反复冲洗瓣膜后，将瓣膜至于含舒普深和两性霉素的I型胶原酶中消化，无肉眼可观的组织残渣后，离心去除上清，加入血清浓度10％的完全培养基中培养；
S103，取瓣膜间质细胞，采用胰酶消化法消化，待大部分细胞漂起后，用血清浓度10％的完全培养基中和，离心去除上清，再加入血清浓度1％的钙化培养基制成细胞上清培养基；
步骤S2包括：
S201，取置于无水乙醇中的磁珠于EP管中，离心去除上清；
S202，加入无水乙醇，并用超声清洗；
S203，置于旋转仪中，在4摄氏度条件下保存过夜；
S204，离心去除上清，打开EP管盖，待剩余酒精自然挥发；
S205，加入碳酸盐缓冲液；
S206，加入RGD肽原液，制得附着有RGD肽的磁珠，置于旋转仪中，在4摄氏度条件下保存；
步骤S3包括：
S301，取步骤S2制得的附着有RGD肽的磁珠，离心去除上清，用PBS重悬；
S302，将附着有RGD肽的磁珠加入步骤S1制得的细胞上清培养基中培养，弃上清并进行PBS清洗后，加入所述第一培养基中培养；
S303，将步骤S302培养后的所述第一培养基放入MTC仪器，通过调节磁力扭曲仪的磁力大小、频率和磁力作用时间模拟异常血流对瓣膜间质细胞的力学刺激，观察瓣膜间质细胞的钙化状态。
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磁钮力刺激人肺微血管内皮细胞模型的建立;王彬;《临床麻醉学》;20110531;第27卷(第5期);摘要部分、431页左栏第1-2段和第431页右栏第2段 *

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