CN101161293A - 异种生物组织材料的抗钙化改性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其是使用丹宁酸溶液浸泡组织；所述的丹宁酸溶液的浓度为1～6％，溶液pH值为4.0～6.0，浸泡温度18～32℃，浸泡时间为24～96小时。本发明所述方法能同时交联组织材料细胞外基质中胶原纤维、弹力纤维和粘多糖，减少组织植入体内后降解，弥补现有戊二醛只交联胶原纤维的不足，显著提高材料抗钙化性能；且具有抗菌和减少蛋白抗原性的作用，有助于增强材料的抗钙化性能和生物相容性。本发明交联的组织材料生物稳定性好，生物力学性能增强，使用寿命长。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织材料的抗钙化改性方法，具体地说是用于同种或异种生物组织材料的抗钙化改性方法。
背景技术
在心脏外科手术治疗中，大多数情况下都需要植入各类修补材料，以替代病变的组织器官，恢复其功能。按照植入物材料的来源大致可以分为人工材料和生物材料两大类，而生物材料通常都需要化学改性处理以去除其免疫原性、增加抗酶解的能力从而提高材料在体内的耐久性。目前，异种材料的改性处理一直沿用戊二醛处理方法，该方法于1968年由法国人Carpentier首次用于心脏瓣膜材料的处理，可同时达到交联组织、去除免疫原性、增加稳定性、消毒的效果，且至今尚没有其他处理方法替代它的地位。
但是，戊二醛处理也有它自身的缺点，首先，其只对胶原纤维有一定交联作用，但对其它组分如弹性纤维和蛋白多糖等无交联作用；第二，其容易导致生物组织中钙盐沉积即钙化。钙化的组织会变硬变脆，影响组织的活动并容易撕裂、穿孔，导致生物材料耐久性差，患者必须接受二次手术将钙化的组织取出，这样不仅由一定的危险性而且给患者增加了不必要的痛苦，因此戊二醛改性处理方法很大程度上限制了生物材料的应用。如何减轻戊二醛交联的生物材料钙化是近二十年来人们研究的重点内容，从清除组织中引起钙化的脂质、细胞碎片，中和组织中残余的戊二醛和竞争抑制钙离子吸收等角度也找到了一些有效的处理方法，但其操作复杂，且其长期的效果仍在观察中。
发明内容
本发明是基于这样一种发现而完成的，即通过实验发现，生物组织中降解的弹性纤维碎片常常是钙化最多的地方如图1所示，若从防止弹性纤维降解的角度来减轻钙化效果将非常显著，同时经凡宁酸交联后组织材料的力学性能还能得到进一步提高。
因此，本发明的目的在于提供一种能防止弹性纤维降解，并显著地抑制钙化发生，且能进一步提高交联后组织材料力学性能的异种生物组织材料的抗钙化改性方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其是使用丹宁酸溶液浸泡组织材料进行抗钙化改性交联处理；所述的丹宁酸溶液的浓度为1～6％，溶液pH值为4.0～6.0，浸泡温度18～32℃，浸泡时间为24～96小时。
一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其是在常规化学抗钙化改性处理的过程中使用丹宁酸溶液协同处理组织材料。
上述的常规化学抗钙化改性处理方法为戊二醛交联处理或环氧化合物交联处理。
上述的与丹宁酸协同交联处理的常规化学交联处理方法最优为戊二醛交联处理。
上述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其具体交联处理步骤为：
用浓度为0.1％～1.5％戊二醛/0.1％～0.6％丹宁酸溶液的混合溶液，pH值为4.0～6.0，浸泡组织材料，浸泡温度18～32℃，浸泡时间为48小时以上。
上所述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其具体交联处理步骤为：
(1)用浓度为0.1～1.5％，pH值为4.0～9.0的戊二醛溶液浸泡组织材料，浸泡温度为为4℃，浸泡时间为48小时；
(2)浸泡后的组织材料再以浓度为0.1％～1.5％戊二醛/0.1％～0.6％丹宁酸的混合溶液，pH值为4.0～6.0，浸泡组织材料，浸泡温度18～32℃，浸泡时间为48小时以上。
上述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其具体处理步骤为：
(1)用浓度为0.1～1.5％，pH值为4.0～9.0的戊二醛溶液浸泡组织材料，浸泡温度为为4℃，浸泡时间为48小时；
(2)浸泡后的组织材料再以浓度为0.1～0.6％、pH值为4.0～6.0的丹宁酸溶液浸泡48小时以上，浸泡温度18～32℃。
上述异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其中，所述的异种生物组织材料为可用于心血管植入的修补材料。
上述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其中，所述的可用于心血管植入的修补材料为异种牛颈静脉带瓣或不带瓣管道，牛颈静脉带瓣或不带瓣血管补片，牛心包以及猪的主动脉瓣，肺动脉瓣，动脉、静脉血管通道及小肠粘膜下层。
本发明所述的丹宁酸是一种植物多酚，属于galloyl-glucose家族，其水溶性好，适当剂量对人体无毒害作用。其分子结构上含有多个亲水性残基，能特异性结合到富含脯氨酸蛋白(如胶原蛋白和弹性蛋白)的疏水区域并形成多个氢键。丹宁酸可能通过这些氢键稳定组织材料细胞外基质中的胶原蛋白纤维、弹性蛋白纤维以及粘多糖等成分，一方面能显著降低由弹力纤维粘多糖等物质降解导致的钙化，一方面还能改善材料的生物力学性能，增强抗疲劳性，从而延长材料的在体内的使用寿命。另外，丹宁酸还具有抗菌和减少蛋白抗原性的作用，这些特性也有助于增强材料的抗钙化性能和生物相容性。
本研究还发现，单独使用丹宁酸溶液交联处理组织材料时，适当剂量、较高浓度的单宁酸溶液可一次性交联组织材料中的胶原纤维、弹力纤维及蛋白多糖，交联键以氢键为主，所得材料的生物相容明显较传统戊二醛处理的材料好。
戊二醛交联固定技术现广泛应用于心血管植入材料，其交联作用的位点正好与丹宁静酸的作用位点互补，键合的类型也不一样，所以当使用戊二醛与丹宁酸协同交联时，戊二醛交联材料上的胶原蛋白，而丹宁酸同时交联材料的胶原蛋白、弹蛋白纤维以及蛋白多糖，弥补了戊二醛交联的不足，材料各种组分均得到了有效地交联，交联键除氢键以外，还有共价键、络合键等形式，由于使用丹宁酸与戊二醛协同交联处理，材料的键合程度和力学性能均有较大幅度的提高，植入体内后不易被宿主组织中的酶降解，减少了弹性蛋白降解的数量，从而降低材料的钙化潜能，同时也能发挥戊二醛去除组织抗原性和消毒灭菌的作用。
本发明的优点是：经本发明戊二醛-丹宁酸协同交联方法和单独丹宁酸交联处理的组织材料与经传统戊二醛溶液交联处理的组织材料相比较，具有以下特点：
1、丹宁酸能同时交联组织材料细胞外基质中胶原纤维、弹力纤维和粘多糖，减少组织植入体内后降解，弥补戊二醛只交联胶原纤维的不足，从而显著提高材料的抗钙化性能；
2、丹宁酸还具有抗菌和减少蛋白抗原性的作用，这些特性也有助于增强材料的抗钙化性能和生物相容性。
3、用本发明处理的组织材料热皱缩温度比传统的戊二醛处理组高2℃左右，说明经本发明交联的组织材料生物稳定性增强。
4、用本发明处理的组织材料的最大拉伸强度和断裂伸长率高于传统戊二醛处理组，说明经本发明交联的组织材料生物力学性能增强，因此有助于延长组织材料在体内的使用寿命。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
附图说明
图1为弹性纤维显微镜照片(左)与降解钙化后的弹性纤维显微镜照片(右)比较；左图蓝色部分为弹性纤维，右图褐色部分为钙化点，可以看出弹性纤维降解的地方钙化严重。
图2为单独使用丹宁酸交联牛颈静脉管壁(左)弹性纤维与单独使用戊二醛交联牛颈静脉管壁(右)弹性纤维的显微镜照片比较；可以看出左图黑色部分比右图黑色部分多且完整，说明左图的弹性纤维(黑色部分)保存得较右图的弹性纤维完整。
图3为单独使用丹宁酸交联牛颈静脉管壁(左)与单独使用戊二醛交联牛颈静脉管壁(右)的钙化点显微镜照片比较；可以看出左图的褐色部分明显少于右图褐色部分，说明左图钙化点(褐色部分)明显少于右图。
图4为使用丹宁酸、戊二醛协同交联的牛颈静脉管壁(左)弹性纤维与单独使用戊二醛交联牛颈静脉管壁(右)弹性纤维的显微镜照片比较；可以看出左图深蓝色部分比右图深蓝色部分多且完整，说明左图的弹性纤维(深蓝色部分)保存得较右图的弹性纤维多且完整。
图5为使用丹宁酸、戊二醛协同交联的牛颈静脉管壁(左)与单独使用戊二醛交联牛颈静脉管壁(右)的钙化点显微镜照片比较；可以看出左图的褐色部分明显少于右图褐色部分，说明左图钙化点(褐色部分)明显少于右图。
图6为单独使用丹宁酸交联牛心包(左)与单独使用戊二醛交联牛心包(右)的钙化点显微镜照片比较；可以看出左图的褐色部分明显少于右图褐色部分，说明左图钙化点(褐色部分)明显少于右图。
图7为使用丹宁酸、戊二醛协同交联的牛心包(左)与单独使用戊二醛交联牛心包(右)的钙化点显微镜照片比较；可以看出左图的褐色部分明显少于右图褐色部分，说明左图钙化点(褐色部分)明显少于右图。
图8为单独使用丹宁酸交联猪主动脉管壁(左)弹性纤维与单独使用戊二醛交联猪主动脉管壁(右)弹性纤维的显微镜照片比较；可以看出左图绿色部分明显比右图绿色部分多且完整，说明左图的弹性纤维(绿色部分)保存得较右图的弹性纤维多且完整。
图9为单独使用丹宁酸交联猪主动脉管壁(左)与单独使用戊二醛交联猪主动脉管壁(右)的钙化点显微镜照片比较；可以看出左图的褐色部分明显少于右图褐色部分，说明左图钙化点(褐色部分)明显少于右图。
图10为使用丹宁酸、戊二醛协同交联的猪主动脉管壁(左)弹性纤维与单独使用戊二醛交联猪主动脉管壁(右)弹性纤维的显微镜照片比较；可以看出左图绿色部分明显比右图绿色部分多且完整，说明左图的弹性纤维(绿色部分)保存得较右图的弹性纤维多且完整。
图11为使用丹宁酸、戊二醛协同交联的猪主动脉管壁(左)与单独使用戊二醛交联猪主动脉管壁(右)的钙化点显微镜照片比较；可以看出左图的褐色部分明显少于右图褐色部分，说明左图钙化点(褐色部分)明显少于右图。
具体实施方式
本发明较佳实施例中使用的仪器和试剂为：
牛颈静脉带瓣管道及牛心包的来源：取自河北大厂华安肉制品有限公司屠宰现场；
猪主动脉瓣来源：取自北京昌平第五肉联厂屠宰现场；
丹宁酸：sigma公司，分子生物学级别纯度＞99.9％；
戊二醛：北京化学试剂公司，分析纯浓度：50％
Na2HPO4：北京化学试剂公司，分析纯级别纯度＞99.5％；
D-HanK′s液：此液体为自配，配方如下：NaCl 8.0g/L，KCL 0.4g/LNa2HPO4.12H2O 0.12g/L，KH2PO4 0.06g/L，D-Glucose 1.00g/L NaHCO30.35g/L，以双蒸水配制，所用试剂均购自北京化学试剂公司，分析纯级别；
生理盐水：北京双鹤药业有限公司医用级别 浓度：0.9％；
SD大鼠来源：北京维通利华实验动物技术有限公司
多聚甲醛：工作浓度4％，北京化学试剂公司，分析纯级别 纯度＞99.9％；
二甲苯：北京化学试剂公司，分析纯级别 纯度＞99.5％；
乙醇：北京化学试剂公司，分析纯级别；
维多利亚蓝：北京化学试剂公司，生物染料级别。
I型胶原纤维酶溶液(自配)：I型胶原纤维酶(sigma公司，纯度＞99.9％)，CaCl2(sigma公司，分子生物等级，纯度＞99.9％)，Tris buffer(Progema公司，分子生物等级，纯度＞99.9％)；
弹力纤维酶溶液(自配)：I型胶原纤维酶(sigma公司，纯度＞99.9％)，CaCl2(sigma公司，分子生物等级，纯度＞99.9％)，Tris buffer(Progema公司，分子生物等级，纯度＞99.9％)
离心机：日立型号：CR21G；
皮革收缩温度测定仪：中国皮革和制鞋工业研究院型号：PS-03；
原子吸收分光光度计：日立，型号：Z-8000；
所涉及的试剂有：
HCl：北京化学试剂公司，分析纯级别；
氮气：北京燕化高新催化剂有限公司高纯；
氯化锶：sigma公司分析纯；
钙标准品：sigma公司 纯度＞99.9％。
具体效果的评价方法：
1、组织形态学检查：取本发明方法交联后的组织材料，用4％多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切成4微米厚的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，做HE染色、Masson染色、van Gieson或维多利亚蓝行弹力纤维染色，观察细胞及基质中胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质的结构；弹性纤维多且完整的说明该方法交联效果好。
2、胶原纤维酶降解试验：取本发明方法交联后的组织材料，在100ml的双蒸水中漂洗3次(每次1小时)，冷冻干燥；取20mg标本置入1.2ml I型胶原纤维酶溶液(150U/ml I型胶原纤维酶溶于50mm Tris buffer，10mmCaCl2中，pH 7.4)中，37℃恒温振浴(振频650rpm)24小时，然后低温高速离心(10000rpm，4℃)10分钟，1ml双蒸水洗涤3次，冻干后准确称取干重，计算被胶原纤维酶降解的组织占降解前组织干重的百分比，酶解后的部分标本做组织形态学检查；被胶原纤维酶讲解组织占讲解前组织干重的百分比越小，说明组织材料抗酶解能力越高。
3、弹力纤维酶降解试验：取本发明方法交联后的组织材料，在100ml的双蒸水中漂洗3次(每次1小时)，冷冻干燥；取20mg标本置入1.0ml弹力纤维酶溶液(20U/ml弹力纤维酶溶于100mm Tris buffer，1mm CaCl2，0.02％NaN3，pH 7.8)中，37℃恒温振浴(振频650rpm)48小时，然后取出样品低温高速离心(10000rpm，4℃)10分钟，1ml双蒸水洗涤3次，冻干后准确称取干重，计算被弹力纤维酶降解的组织占降解前组织干重的百分比，酶解后的部分标本做组织学检查；被弹力纤维酶讲解组织占讲解前组织干重的百分比越小，说明组织材料抗酶解能力越高。
4、热皱缩温度测定：取本发明方法交联后的组织材料，裁剪成长3cm、宽1cm的试条。用皮革收缩温度测定仪测定热皱缩温度，温度从40℃开始，升高速度为2℃/分钟，每种标本做3份，取平均值作为热皱缩温度；热皱缩温度越高，说明组织材料生物稳定性越强。
5、血管壁拉伸强度及断裂伸长率的测定：取本发明方法交联后的组织材料，裁剪成3cm长，0.5cm宽的片状(n＝6)，测定材料的厚度，在力学测试平台上进行拉伸负荷及断裂伸长率的测试，并计算断裂强度；其中断裂强度表示材料的抗拉能力，断裂伸长率表示材料的变形能力；其血管壁拉伸强度值越高，伸长率值越高，说明组织材料生物力学性能好。
6、大鼠皮下埋植实验：观察材料在体内的炎性反应程度和钙化程度。取本发明方法交联后的组织材料，裁成1平方厘米大小的片状，埋植前以生理盐水洗涤；取3周龄的雄性SD大鼠麻醉，消毒，在其腹部皮下切四个小口，放入待测试片，缝合；3周及2月后处死大鼠，取出试片，取一小块用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，做常规苏木素-伊红染色、Masson染色或von Kossa染色，观察炎性细胞浸润和钙化情况；其余试片在105～110℃下烘干4小时，水解，原子吸收分光光度法测定钙元素的含量，钙元素含量越低，说明组织材料抗钙化性能越好。
本发明所用的生物材料，其中牛颈静脉带瓣管道、牛颈静脉不带瓣管道、牛颈静脉带瓣血管补片、牛颈静脉不带瓣血管补片、猪的主动脉瓣、猪肺动脉瓣、猪动脉、猪静脉血管通道及猪小肠粘膜下层及牛心包为同一性质的生物材料；相同性质的生物材料应用于本发明所述方法，其所用试剂、具体操作步骤及达到的效果均相同，现以牛颈静脉带瓣管道、牛心包及猪的主动脉瓣为例详细说明本发明，其余材料在此不一一赘述。
传统戊二醛方法交联处理牛颈静脉带瓣管道、牛心包及猪的主动脉瓣三种组织材料方法步骤一样，试剂用量浓度相同，所以在此只以牛颈静脉带瓣管道材料为例，戊二醛方法交联处理其余材料就不一一举例说明了。
对比例1 戊二醛方法交联处理牛颈静脉带瓣管道
(一)试剂配制
0.6％戊二醛溶液：配制50mmol/L HEPES缓冲液至500ml，调PH值为7.4，再取市售50％戊二醛溶液6ml溶于上述溶液。
0.3％戊二醛溶液：配制50mmol/L HEPES缓冲液至500ml，调PH值为7.4，再取市售50％戊二醛溶液3ml溶于上述溶液。
(二)材料准备
采集管径为12～24mm的牛颈静脉管道长约10cm，修剪表面的脂肪和多余的疏松结缔组织，并置于D-Hank’s液中漂洗后备用。
(三)交联处理过程
1、先以0.6％戊二醛溶液润洗牛颈静脉管腔内外各一遍，再向腔内注满0.6％戊二醛溶液，然后置入含300ml 0.6％戊二醛溶液的容器中在4℃下浸泡48小时。
2、取出经步骤1处理的材料，倒去腔内的0.6％戊二醛溶液，以0.3％戊二醛溶液润洗腔内外各一遍，再向腔内注满0.3％戊二醛溶液然后置入含300ml 0.3％戊二醛溶液的容器中在4℃下浸泡7天以上。
3、在使用前将上述经本方法处理的材料置入生理盐水漂洗多次，去除组织材料尚未结合的戊二醛。
(四)结果评价
1、组织形态学检查：如图2所示，在SD大鼠皮下埋植3周后，经vanGieson染色证实，传统戊二醛交联的牛颈静脉管壁(右)血管壁内侧弹性纤维(黑色部分)降解明显。
2、大鼠皮下埋植实验：如图3所示，在SD大鼠皮下埋植2月后，VanKossa染色证实，传统戊二醛交联的牛颈静脉管壁(右)钙化(褐色部分)严重。
3、胶原纤维酶降解试验和弹力纤维酶降解试验：传统戊二醛交联的牛颈静脉管壁的抗酶解能力较低，见表1。
实施例1 单独使用丹宁酸交联处理牛颈静脉带瓣管道；
(一)试剂配制
2.5％pH4.0丹宁酸溶液：取市售丹宁酸12.5克溶于50mmol/LNa2HPO4溶液至500ml，用盐酸调节pH到4.0。
(二)材料准备
采集管径为12～24mm的牛颈静脉管道长约10cm，修剪表面的脂肪和多余的疏松结缔组织，并置于D-Hank’s液中漂洗后备用。
(三)交联处理过程
1、先以2.5％pH4.0丹宁酸溶液润洗牛颈静脉管腔内外各一遍，再向腔内注满2.5％pH4.0丹宁酸溶液，然后置入含300ml 2.5％pH4.0丹宁酸溶液的容器中在32℃下浸泡48小时。
2、在使用前将上述经本方法处理的材料置入生理盐水漂洗多次，去除组织材料尚未结合的残留丹宁酸。
(四)结果评价
1、组织形态学检查：如图2所示，在SD大鼠皮下埋植3周后，经vanGieson染色证实，单独使用丹宁酸交联牛颈静脉管壁(左)血管壁内侧弹性纤维(黑色部分)明显较单独使用戊二醛交联的管壁(右)弹性纤维保存完整。
2、大鼠皮下埋植实验：如图3所示，在SD大鼠皮下埋植2月后，VanKossa染色证实，单独使用丹宁酸交联牛颈静脉管壁(左)血管壁钙化程度(褐色部分)明显较单独使用戊二醛交联牛颈静脉管壁(右)钙化程度轻。
3、胶原纤维酶降解试验和弹力纤维酶降解试验：丹宁酸单独交联的牛颈静脉管壁的抗酶解能力高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表1。
表1
*P＜0.01 #P＜0.01
4、热皱缩温度的测定：丹宁酸单独交联组的热皱缩温度稍高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表2。
表2
*P＜0.01
5、拉伸强度及断裂伸长率的测定：丹宁酸交联组的最大拉伸强度和断裂伸长率均高于戊二醛交联组，且统计学分析有显著意义，见表3。
表3
*P＜0.0 1 #P＜0.05
6、钙含量测定：丹宁酸交联组在3周和2月后的组织钙含量均显著低于戊二醛交联组，且统计学分析有非常显著意义，见表4。
表4
*P＜0.01 #P＜0.01
实施例2 丹宁酸与戊二醛协同交联处理牛颈静脉带瓣管道；
(一)试剂配制
0.3％戊二醛/0.3％丹宁酸混合溶液pH5.5：市售50％戊二醛溶液3ml溶于50mmol/L Na2HPO4溶液至500ml，再取市售丹宁酸0.5克溶于上述溶液，用盐酸调节pH5.5。
(二)材料准备
采集管径为12～24mm的牛颈静脉长约10cm，修剪表面的脂肪和多余的疏松结缔组织，并置于D-Hank’s液中漂洗后备用。
(三)交联处理过程
1、以0.3％戊二醛/0.3％丹宁酸pH5.5混合溶液润洗腔内外各一遍，再向腔内注满0.3％戊二醛/0.3％丹宁酸混合溶液然后置入含300ml 0.3％戊二醛/0.3％丹宁酸pH5.5混合溶液的容器中在22℃下浸泡96小时。
2、使用前将上述经本方法处理的材料置入生理盐水漂洗多次，去除组织材料尚未结合的残留戊二醛及丹宁酸。
(四)结果评价
1、组织形态学检查：如图4所示，在SD大鼠皮下埋植3周后，经vanGieson染色证实，丹宁酸戊二醛协同交联牛颈静脉管壁(左)血管壁内侧弹性纤维(黑色部分)明显较单独使用戊二醛交联的管壁(右)弹性纤维保存完整。
2、大鼠皮下埋植实验：如图5所示，在SD大鼠皮下埋植2月后，VanKossa染色证实，丹宁酸戊二醛协同交联牛颈静脉管壁(左)血管壁钙化程度(褐色部分)明显较单独使用戊二醛交联牛颈静脉管壁(右)钙化程度轻。
3、胶原纤维酶降解试验和弹力纤维酶降解试验：丹宁酸戊二醛协同交联的牛颈静脉管壁的抗酶解能力高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表5。
表5
*P＜0.01 #P＜0.01
4、热皱缩温度的测定：丹宁酸戊二醛协同交联组的热皱缩温度稍高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表6。
表6
*P＜0.01
5、拉伸强度及断裂伸长率的测定：丹宁酸戊二醛协同交联组的最大拉伸强度和断裂伸长率均高于戊二醛交联组，且统计学分析有显著意义，见表7。
表7
P＜0.01 #P＜0.05
6、钙含量测定：丹宁酸戊二醛协同交联组在3周和2月后的组织钙含量均显著低于戊二醛交联组，且统计学分析有非常显著意义，见表8。
表8
P＜0.01 #P＜0.01
实施例3 单独使用丹宁酸交联处理牛心包；
(一)试剂配制
1％pH5.5丹宁酸溶液：配置50mmol/L Na2HPO4缓冲液至500ml，再取市售丹宁酸5克溶于上述溶液，用盐酸调pH值为5.5。
(二)材料准备
采集面积约8×8cm2的牛心包，修剪表面的脂肪和多余的疏松结缔组织，并置于D-Hank’s液中漂洗后备用。
(三)交联处理过程
1、先以1％pH5.5丹宁酸溶液润洗牛心包材料一遍，然后置入含300ml1％pH5.5丹宁酸溶液的容器中在22℃下固定96小时。
2、使用前将上述经本方法处理的材料置入生理盐水漂洗多次，去除组织材料尚未结合的残留丹宁酸。
(四)结果评价
1、大鼠皮下埋植实验：如图6所示，在SD大鼠皮下埋植2月后，VanKossa染色证实，丹宁酸单独交联牛心包(左)血管壁钙化程度(褐色部分)明显较单独使用戊二醛交联牛心包(右)钙化程度轻。
2、胶原纤维酶降解试验：丹宁酸单独交联的牛心包的抗酶解能力高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表9。
表9
*P＜0.05
3、热皱缩温度的测定：丹宁酸单独交联组的热皱缩温度稍高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表10。
表10
*P＜0.05
4、拉伸强度及断裂伸长率的测定：丹宁酸单独交联组的最大拉伸强度和断裂伸长率均高于戊二醛交联组，且统计学分析有显著意义，见表11。
表11
*P＜0.05 #P＜0.05
5、钙含量测定：丹宁酸单独交联组在3周和2月后的组织钙含量均显著低于戊二醛交联组，且统计学分析有非常显著意义，见表12。
表12
*P＜0.01 #P＜0.01
实施例4 丹宁酸与戊二醛协同交联处理牛心包；
(一)试剂配制
0.1％pH4戊二醛溶液：1)、50mmol/L HEPES缓冲液：市售HEPES粉末11.92克溶于1000ml蒸馏水中，调节PH到4.0；2)、0.1％戊二醛溶液：市售50％戊二醛溶液1ml溶于50mmol/L HEPES缓冲液中至500ml。
0.6％戊二醛/0.3％丹宁酸混合溶液pH5.5：市售50％戊二醛溶液6ml溶于50mmol/L Na2HPO4溶液至500ml，再取市售丹宁酸1.5克溶于上述溶液，用盐酸调节pH5.5。
(二)材料准备
采集面积约8×8cm2的牛心包，修剪表面的脂肪和多余的疏松结缔组织，并置于D-Hank’s液中漂洗后备用。
(三)交联处理过程
1、先以0.1％pH4戊二醛溶液润洗牛心包材料一遍，然后置入含300ml0.1％pH4戊二醛溶液的容器中在4℃下固定48小时。
2、取出经步骤1处理的材料，以0.6％戊二醛/0.3％丹宁酸pH5.5混合溶液润洗一遍，然后置入含300ml 0.6％戊二醛/0.3％丹宁酸混合溶液的容器中在32℃下固定72小时。
3、使用前将上述经本方法处理的材料置入生理盐水漂洗多次，去除组织材料尚未结合的残留戊二醛及丹宁酸。
(四)结果评价
1、大鼠皮下埋植实验：如图7所示，在SD大鼠皮下埋植2月后，VanKossa染色证实，丹宁酸戊二醛协同交联牛心包(左)血管壁钙化程度(褐色部分)明显较单独使用戊二醛交联牛心包(右)钙化程度轻。
2、胶原纤维酶降解试验：丹宁酸戊二醛协同交联组的牛心包的抗酶解能力高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表13。
表13
*P＜0.01
3、热皱缩温度的测定：丹宁酸戊二醛协同交联组的热皱缩温度稍高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表14。
表14
*P＜0.01
4、拉伸强度及断裂伸长率的测定：丹宁酸戊二醛协同交联组的最大拉伸强度和断裂伸长率均高于戊二醛交联组，且统计学分析有显著意义，见表15。
表15
*P＜0.01 #P＜0.05
5、钙含量测定：丹宁酸戊二醛协同交联组在3周和2月后的组织钙含量均显著低于戊二醛交联组，且统计学分析有非常显著意义，见表16。
表16
P＜0.01 #P＜0.01
实施例5 单独使用丹宁酸交联处理猪主动脉瓣管壁；
(一)试剂配制
6％pH6丹宁酸溶液：取市售丹宁酸30.0克溶于50mmol/L Na2HPO4溶液至500ml，用盐酸调节pH到6.0。
(二)材料准备
采集管径为12～24mm的猪主动脉带瓣管道长约6cm，修剪表面的脂肪和多余的疏松结缔组织，并置于D-Hank’s液中漂洗后备用。
(三)固定过程
1、先以6％pH6丹宁酸溶液润洗腔内外各一遍，再向腔内注满6％pH6丹宁酸溶液，然后置入含300ml 6％pH6丹宁酸溶液的容器中在18℃下固定24小时。
2、使用前将上述经本方法处理的材料置入生理盐水漂洗多次，去除组织材料尚未结合的残留丹宁酸。
(四)结果评价
1、组织形态学检查：如图8所示，在SD大鼠皮下埋植3周后，经维多利亚蓝染色证实，丹宁酸单独交联猪主动脉管壁(左)血管壁弹性纤维(绿色部分)明显较单独使用戊二醛交联猪主动脉管壁(右)弹性纤维保存完整。
2、大鼠皮下埋植实验：如图9所示，在SD大鼠皮下埋植2月后，VanKossa染色证实，丹宁酸单独交联猪主动脉管壁(左)血管壁钙化程度(褐色部分)明显较单独使用戊二醛交联猪主动脉管壁(右)钙化程度轻。
3、胶原纤维酶降解试验和弹力纤维酶降解试验：丹宁酸单独交联的猪主动脉管壁的抗酶解能力高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表17。
表17
*P＜0.01 #P＜0.01
4、热皱缩温度的测定：丹宁酸单独交联组的热皱缩温度稍高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表18。
表18
*P＜0.01
5、拉伸强度及断裂伸长率的测定：丹宁酸单独交联组的最大拉伸强度和断裂伸长率均高于戊二醛交联组，且统计学分析有显著意义，见表19。
表19
*P＜0.05 #P＜0.05
6、钙含量测定：丹宁酸单独交联组在3周和2月后的组织钙含量均显著低于戊二醛交联组，且统计学分析有非常显著意义，见表20。
表20
*P＜0.01 #P＜0.01
实施例6 丹宁酸与戊二醛协同交联处理猪主动脉瓣管壁；
(一)试剂配制
1.5％pH9戊二醛：1).50mmol/L HEPES缓冲液：市售HEPES粉末11.92克溶于1000ml蒸馏水中，调节PH到9.0；2).1.5％戊二醛溶液：市售50％戊二醛溶液18ml溶于50mmol/L HEPES缓冲液中至500ml。
0.6％pH6丹宁酸溶液：取市售丹宁酸30.0克溶于50mmol/L Na2HPO4溶液至500ml，用盐酸调节pH到6.0。
(二)材料准备
采集管径为12～24mm的猪主动脉带瓣管道长约6cm，修剪表面的脂肪和多余的疏松结缔组织，并置于D-Hank’s液中漂洗后备用。
(三)固定过程
1、先以1.5％pH9戊二醛溶液润洗腔内外各一遍，再向腔内注满1.5％pH9戊二醛溶液，然后置入含300ml 1.5％ pH9戊二醛溶液的容器中在4℃下固定48小时。
2、取出经步骤1处理的材料，倒去腔内的1.5％ pH9戊二醛溶液，以0.6％ pH6丹宁酸溶液润洗腔内外各一遍，再向腔内注满0.6％ pH6丹宁酸溶液然后置入300ml 0.6％ pH6丹宁酸溶液的容器中在22℃下固定96小时。
3、使用前将上述经本方法处理的材料置入生理盐水漂洗多次，去除组织材料尚未结合的残留戊二醛及丹宁酸。
(四)结果评价
1、组织形态学检查：如图10所示，在SD大鼠皮下埋植3周后，经维多利亚蓝染色证实，丹宁酸戊二醛协同交联猪主动脉管壁(左)血管壁弹性纤维(绿色部分)明显较单独使用戊二醛交联猪主动脉管壁(右)弹性纤维保存完整。
2、大鼠皮下埋植实验：如图11所示，在SD大鼠皮下埋植2月后，Van Kossa染色证实，丹宁酸戊二醛协同交联猪主动脉管壁(左)血管壁钙化程度(褐色部分)明显较单独使用戊二醛交联猪主动脉管壁(右)钙化程度轻。
3、胶原纤维酶降解试验和弹力纤维酶降解试验：丹宁酸戊二醛协同交联的猪主动脉管壁的抗酶解能力高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表21。
表21
*P＜0.01 #P＜0.01
4、热皱缩温度的测定：丹宁酸戊二醛协同交联组的热皱缩温度稍高于戊二醛交联组，统计学分析有显著意义，见表22。
表22
*P＜0.01
5、拉伸强度及断裂伸长率的测定：丹宁酸戊二醛协同交联组的最大拉伸强度和断裂伸长率均高于戊二醛交联组，且统计学分析有显著意义，见表23。
表23
*P＜0.05 #P＜0.05
6、钙含量测定：丹宁酸戊二醛协同交联组在3周和2月后的组织钙含量均显著低于戊二醛交联组，且统计学分析有非常显著意义，见表24。
表24
*P＜0.01 #P＜0.01
Claims (9)
1.一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其特征在于：使用丹宁酸溶液浸泡组织；所述的丹宁酸溶液的浓度为1～6％，溶液pH值为4.0～6.0，浸泡温度18～32℃，浸泡时间为24～96小时。
2.一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其特征在于：在常规化学抗钙化改性处理的过程中使用丹宁酸溶液协同处理组织材料。
3.根据权利要求2所述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其特征在于，所述的常规化学抗钙化改性处理为戊二醛交联处理或环氧化合物交联处理。
4.根据权利要求3所述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其特征在于，所述的常规化学抗钙化改性处理为戊二醛交联处理。
5.根据权利要求2所述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其特征在于，具体步骤为：
用浓度为0.1％～1.5％戊二醛/0.1％～0.6％丹宁酸的混合溶液，pH值为4.0～6.0，浸泡组织材料，浸泡温度18～32℃，浸泡时间为48小时以上。
6.根据权利要求2所述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)用浓度为0.1～1.5％，pH值为4.0～9.0的戊二醛溶液浸泡组织材料，浸泡温度为为4℃，浸泡时间为48小时；
(2)浸泡后的组织材料再以浓度为0.1％～1.5％戊二醛/0.1％～0.6％丹宁酸混合溶液，pH值为4.0～6.0，浸泡48小时以上，浸泡温度18～32℃。
7.根据权利要求2所述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)用浓度为0.1～1.5％，pH值为4.0～9.0的戊二醛溶液浸泡组织材料，浸泡温度为为4℃，浸泡时间为48小时；
(2)浸泡后的组织材料再以浓度为0.1～0.6％、pH值为4.0～6.0的丹宁酸溶液浸泡48小时以上，浸泡温度18～32℃。
8.根据权利要求1～7中任意一项所述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其特征在于，所述的异种生物组织材料为可用于心血管植入的修补材料。
9.根据权利要求8所述的一种异种生物组织材料的抗钙化改性方法，其特征在于，所述的可用于心血管植入的修补材料为异种牛颈静脉带瓣或不带瓣管道，牛颈静脉带瓣或不带瓣血管补片，牛心包以及猪的主动脉瓣，肺动脉瓣、动脉、静脉血管通道及小肠粘膜下层。
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