CN113893389A - 重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶软组织填充剂及其制备方法 - Google Patents
重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶软组织填充剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种重组胶原蛋白‑脱钙骨基质微粒双相凝胶软组织填充剂及其制备方法。动物骨组织粉粹后进行脱毒、脱脂和脱细胞处理，再经过脱钙和去抗原处理，将形成的骨基质微粒进行交联改性、抗钙化处理后与重组胶原蛋白磷酸盐凝胶混匀，形成双相凝胶软组织填充剂。本发明在保留骨基质的天然三维立体结构同时，提升了骨基质微粒的体内抗降解性能，避免骨基质微粒钙化形成硬结，结合重组胶原蛋白的润滑、填充和刺激胶原纤维再生的作用，可以实现组织的长效填充。本发明适用于在真皮层中层至皮下深层注射填充以修复中度至重度皱纹或褶皱，具有良好的美容效果。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，涉及医学整形、美容中使用的软组织填充剂，具体涉及一种重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶及其制备方法。
背景技术
软组织填充剂用于人工干预面部老化的问题。最早采用自体脂肪作为面部填充材料并通过注射实现微整形。随着可注射填充剂的发展，牛胶原蛋白成为注射微整形行业第一个由FDA批准的注射用填充剂，随后猪胶原蛋白、人胶原蛋白产品相继获得FDA批准，但因天然胶原类材料填充修复效果持续时间短和异种来源存在潜在免疫原性和病毒传染风险的问题，目前仅存在少量实际应用，并且主要用于修正透明质酸类填充剂取出后的问题和用于眼周浅表性皱纹等，例如双美生物科技股份有限公司的猪皮胶原类填充剂产品。
中国专利200810177082.7、201110227005.4中，利用动物胶原蛋白为原料，尽管通过交联可以提高抗降解性，但也存在免疫原性和病毒传染风险，并导致异物反应和钙化加剧(植入人体后钙化形成硬结)，钙化形成的硬结会导致皮肤组织活性降低及出现僵硬现象。
中国专利201310079688.2公开了一种异种脱细胞真皮基质微粒软组织填充剂，该填充剂由未经交联处理的异种脱细胞真皮基质微粒、经交联处理的异种脱细胞真皮基质微粒和医用胶原蛋白粉按一定配比组成，虽然弱化了免疫原性，但是异种脱细胞真皮基质微粒进入人体后会仍会产生一定的排异反应，并导致人体免疫炎症反应；此外微粒颗粒粒径较大，容易堵塞注射针，难于注射使用。
中国专利201910866386.7公开了一种异种生物组织材料的多联抗钙化处理方法。其先使用交联剂戊二醛、黄酰单宁和新霉素，交联处理异种生物组织材料，再使用去细胞剂去除细胞成分，然后使用交联剂进行二次交联处理，最后使用甘氨酸中和残余醛基。所处理的产品(生物瓣)虽然防钙化性能较好，但进入人体后仍存在导致免疫炎症反应的问题，而且并不具备在植入部位与周围组织进行融合的能力。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶软组织填充剂及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶，该双相凝胶包括含有重组胶原蛋白的凝胶相以及分散在该凝胶相中的固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒，所述双相凝胶中，固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒与重组胶原蛋白的质量比为10:1～1:50。经过多次实验论证，该质量比下的双相凝胶作为软组织填充剂具有最佳的抗降解性以及抗钙化性，并且满足注射要求，便于临床植入操作，同时植入人体后能够与植入部位周围的组织融合，实现填充部位的组织再生。
优选的，所述凝胶相是通过将重组胶原蛋白与生理缓冲溶液混合(使重组胶原蛋白溶解于生理缓冲溶液中)而得到的，或者通过将重组胶原蛋白、局部麻醉药与生理缓冲溶液混合而得到的，所述固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒是通过将动物骨组织颗粒粉碎后依次进行脱钙、去抗原(指去除骨基质微粒中的蛋白、脂肪等可引起免疫反应的物质，其中的某些蛋白类物质，例如BMP-2等成骨活性蛋白的去除，具有抗钙化作用)、交联改性及抗钙化处理(再次抗钙化)而得到的。
优选的，所述局部麻醉药选自盐酸利多卡因、苯佐卡因、丁卡因中的一种，局部麻醉药在所述凝胶相中的浓度为1～5mg/mL，按照此浓度范围可以调节凝胶相中局部麻醉药所需不同含量，从而满足临床使用过程中浅表至深层的填充需要，减少、缓解植入部位的疼痛感。
优选的，所述动物骨组织颗粒是通过将牛、猪、羊、牦牛、马、驴等哺乳动物的骨组织经粉粹后进行脱毒(杀灭病毒)、脱脂和脱细胞处理而得到的。
优选的，所述双相凝胶的总蛋白含量为20～600mg/mL。该总蛋白含量的双相凝胶可满足临床不同植入深度的填充需求，并且不会产生免疫反应。
优选的，所述重组胶原蛋白选自通过微生物基因重组或植物基因重组表达系统得到的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅶ型胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白或者纤连蛋白中的一种或多种，或者重组胶原蛋白选自含有所述I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅶ型胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白或者纤连蛋白的融合蛋白，以上重组胶原蛋白可以基于天然人胶原蛋白的特征和主要功能序列重新优化设计基因序列，并通过表达系统获得，具有良好的生物学相容性、可加工性以及无病毒传染风险等优点；所述重组胶原蛋白的分子量为5～200万道尔顿，该分子量的胶原蛋白性能更为稳定，降解后更容易被人体吸收。
优选的，所述凝胶相的pH值为6.0～8.0，该凝胶相的渗透压与人体渗透压保持一致，为250mOsmol/L～350mOsmol/L，可减少植入过程中的疼痛感，并使植入的填充剂在植入部位保持稳定。
上述重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将动物骨组织颗粒粉碎后依次进行脱钙、去抗原、交联改性及抗钙化处理，得到固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒；将重组胶原蛋白与生理缓冲溶液混合，或者将重组胶原蛋白、局部麻醉药与生理缓冲溶液混合，得到含有重组胶原蛋白的凝胶相；将所述凝胶相与固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒混合，得到重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶。
优选的，所述去抗原处理具体包括以下步骤：采用尿素溶液(处理浓度以质量分数计为0.05％～5％)浸泡经过粉碎、脱钙处理(例如，采用盐酸溶液浸泡)所得的骨基质微粒；所述交联改性处理采用的化学交联剂选自戊二醛、甲醛、碳二亚胺、环氧化物、京尼平、单宁酸、原花青素中的一种或多种；所述抗钙化处理采用的钙化抑制剂选自硼氢化钠、甘氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、肝素、乙醇、丁二醇、单宁酸中的一种或多种。
优选的，所述动物骨组织颗粒经粉粹后所得骨组织微粒的粒径为10～200μm，利用该粒径范围的骨组织微粒制备的双相凝胶不易堵塞注射针，并且使得植入部位外观圆润、无明显颗粒感。
优选的，所述凝胶相与固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒的混合比例按质量计为10:1～100:1，该凝胶相中重组胶原蛋白的浓度为50～300mg/mL。
优选的，所述双相凝胶的制备方法具体包括以下步骤：
1)动物骨组织颗粒的制备
将切割成块状的动物骨组织用水清洗后粉碎为颗粒，然后用所含SDS、NaOH和有机溶剂的质量分数分别为0.2％～2％、0.3％～4％和20％～80％的混合溶液，按照20～60分钟/次超声处理3～6次；然后用水清洗、干燥(低于60℃)，得到脱毒、脱脂和脱细胞的骨组织颗粒。
2)脱钙与去抗原处理
将所述骨组织颗粒粉碎成粒径10～200μm的骨组织微粒，用0.1～0.5mol/L盐酸溶液于2～8℃下浸泡骨组织微粒3～6次后用水洗至中性，得到脱钙骨基质微粒，其中，浸泡时间为2～24h/次，固液比为1:10～1:20(g/mL)，随着脱钙处理中盐酸溶液浸泡次数的增加，盐酸溶液浓度和浸泡时间按一定梯度降低；然后用尿素溶液(质量分数为0.05％～5％)于2～8℃下浸泡脱钙骨基质微粒1～6次，以去除成骨活性蛋白等，其中，浸泡时间为1～6h/次，固液比为1:10～1:20(g/mL)；最后用水清至中性。
3)交联改性与抗钙化处理
用化学交联剂溶液(质量分数0.01％～5％)于2～40℃下浸泡经过步骤2)处理后的骨基质微粒30～600分钟，然后用水清洗3～6次，得到交联脱钙骨基质微粒；再用钙化抑制剂溶液(质量分数0.05％～2％)于2～40℃下浸泡交联脱钙骨基质微粒2～8小时，最后用水清洗、冷冻干燥，得到固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒。
4)双相凝胶的制备
将配制的磷酸盐生理平衡盐水与重组胶原蛋白混合，或将配制的磷酸盐生理平衡盐水与重组胶原蛋白及局部麻醉药混合，得到不含或含局部麻醉药(麻药)的重组胶原蛋白磷酸盐凝胶，将所述重组胶原蛋白磷酸盐凝胶作为含有重组胶原蛋白的凝胶相，与固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒混合，得到双相凝胶。
优选的，所述步骤1)中，有机溶剂选自乙醇、正丙醇、异丙醇、丙酮、乙醚中的一种或多种。
优选的，所述步骤2)中，交联改性处理在一定的交联处理时间(30～600分钟)内可以采用同一化学交联剂进行单次交联、多次交联，或采用不同化学交联剂进行多重交联。
优选的，所述磷酸盐生理平衡盐水为pH为6～8的PBS。
一种重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶软组织填充剂，该软组织填充剂是通过将上述双相凝胶灭菌而得到的。
本发明的有益效果体现在：
本发明的双相凝胶中，固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒保留了天然骨组织的三维立体结构，结合重组胶原蛋白的润滑、填充和刺激胶原纤维再生的作用，在植入人体后不仅可以避免人体免疫炎症反应、钙化的发生，而且能够与植入部位周围的组织融合，实现填充部位的组织再生，从而实现长效填充。本发明的双相凝胶可制成注射用软组织填充剂，适用于在真皮层中层至皮下深层填充以纠正(修复)中度至重度皱纹或褶皱，具有良好的美容(除皱)效果。
进一步的，本发明所用骨组织原料来源广泛，加工工艺所需设备简单，有利于实现产业化。
进一步的，本发明采用的重组胶原蛋白磷酸盐凝胶，以重组胶原蛋白为主要组分，降低了动物源胶原的使用量，降低了免疫原性和病毒传染风险。
进一步的，本发明采用的重组胶原蛋白磷酸盐凝胶作为分散载体和润滑剂，有利于软组织填充剂的注射，避免注射针堵塞。
进一步的，本发明在利用盐酸溶液脱钙基础上，利用尿素溶液进行去抗原处理，可以从完全脱钙的骨基质微粒中去除存在的成骨活性蛋白，解决了脱钙骨基质微粒在经过化学交联剂和钙化抑制剂处理并植入人体后诱导成骨及在填充部位形成硬结的问题。即本发明通过去抗原、交联改性和抗钙化处理，在保证双相凝胶发挥填充作用的同时避免硬结形成，填充效果更自然。
附图说明
图1a为实例1制备的抗钙化交联脱钙骨基质微粒(冻干后固相)。
图1b为实例1中骨基质微粒去抗原前后总蛋白含量比对结果。
图1c为图1a所示抗钙化交联脱钙骨基质微粒的扫描电镜照片(I：×50；II：×5000)。
图2为实例1制备的含麻药的重组胶原蛋白磷酸盐凝胶外观。
图3为实例1制备的双相凝胶除皱填充剂外观。
图4为实例1制备的双相凝胶除皱填充剂在大鼠皮下植入6个月时的外观观察结果。
图5为实例1制备的双相凝胶除皱填充剂在大鼠皮下植入6个月时的组织学检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，所描述的实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
本发明以动物骨组织为原料制备第一相，即抗钙化交联脱钙骨基质微粒，第一相制备过程包括骨颗粒的制备和粉粹以及脱钙、去抗原、交联改性和抗钙化处理；以重组胶原蛋白、磷酸盐等为原料制备第二相，即含麻药或不含麻药的重组胶原蛋白磷酸盐凝胶；将第一相和第二相混合、均质后灌装、灭菌，即制得可用于除皱的双相凝胶软组织填充剂(简称双相凝胶除皱填充剂)。
实例1
步骤一、牛骨颗粒的制备
取新鲜牛骨切割成块，纯化水振荡清洗至无色，以去除骨髓和血渍等异物。采用中药粉碎机将清洗后牛骨粉碎成颗粒(粒径0.25～2mm)，然后用含2wt％SDS、4wt％NaOH和80wt％异丙醇的混合溶液(余量是纯化水)浸泡，同时采用超声波清洗机强化处理，每次处理时间为60分钟，重复处理3次(每次重复需更换混合溶液)。处理完成后通过纯化水振荡清洗去除混合溶液残留，50℃烘箱中烘干。
步骤二、脱钙与去抗原处理
将烘干后的牛骨颗粒采用超低温冷冻粉碎机进行再次粉碎，颗粒粉碎至粒径在10～50μm，获得脱毒、脱脂和脱细胞的骨组织微粒。用0.5mol/L盐酸溶液于4℃下浸泡所述骨组织微粒进行脱钙处理；其中，骨组织微粒与盐酸溶液的固液比为1:10(g/mL)，脱钙处理3次，第一次浸泡时间为24h(随处理次数增加盐酸浓度每次下降0.05mol/L，浸泡时间缩短6小时)；通过测定骨组织微粒钙磷含量确定完全脱钙后，纯化水清洗至中性，得到脱钙骨基质微粒。然后用1wt％尿素溶液于4℃下浸泡脱钙骨基质微粒以去除成骨活性蛋白等；其中，脱钙骨基质微粒与尿素溶液的固液比为1:20(g/mL)，浸泡时间为6h/次，共3次，每次浸泡后更换新鲜尿素溶液(更换的原因：浸泡后溶液中含有大量的抗原物质，而且尿素溶液的作用效果明显降低)。最后用纯化水清洗至中性。
参见图1b，通过比较1wt％尿素溶液浸泡前后骨基质微粒的总蛋白含量，发现骨基质微粒中主要引起免疫反应的蛋白类物质(包括BMP-2等成骨活性蛋白)得到了有效的去除。
步骤三、交联改性与抗钙化处理
将经过步骤二处理后的骨基质微粒加入到0.5wt％的戊二醛溶液中于室温下交联240分钟，纯化水清洗3次去除残留。然后采用0.25wt％的甘氨酸溶液于室温下浸泡4小时，纯化水清洗后冷冻干燥，获得抗钙化交联脱钙骨基质微粒(图1a)，该骨基质微粒具备天然骨组织的三维立体结构(图1c)。
步骤四、双相凝胶的制备
重组胶原蛋白：参照现有文献(高力虎.重复序列类人胶原蛋白表达载体的构建及在毕赤酵母中的分泌表达.江苏:南京理工大学,2007.)构建表达载体并进行诱导表达、纯化，获得的重组胶原蛋白表观分子量为112kD(理论分子量为55kD)。
配制磷酸盐生理平衡盐水：pH为6.8～7.6的PBS。
向配制的磷酸盐生理平衡盐水中加入盐酸利多卡因(终浓度为3mg/mL)和重组胶原蛋白(终浓度为200mg/mL)，搅拌至完全溶解，即得含麻药的重组胶原蛋白磷酸盐凝胶(图2)，再将抗钙化交联脱钙骨基质微粒加入该凝胶中(微粒与重组胶原蛋白质量比例为9:1)，采用均质机匀浆，使得抗钙化交联脱钙骨基质微粒均匀混悬于上述凝胶之中，经无菌灌装或辐照灭菌，即制得双相凝胶除皱填充剂(图3)。
参见图4及图5，经过对大鼠注射填充和长期观察发现，双相凝胶除皱填充剂的植入部位始终保持圆润，且无明显颗粒感，组织学检测证明植入部位中骨颗粒周围可见新生毛细血管形成。
实例2
步骤一、猪骨颗粒的制备
取新鲜猪骨切割成块，纯化水清洗至无骨髓和血液，再采用中药粉碎机粉碎成颗粒(粒径0.25～2mm)，然后用含1wt％SDS、0.3wt％NaOH和75wt％乙醇的混合溶液(余量是纯化水)浸泡，同时采用超声波清洗机强化处理，处理时间为60分钟，重复处理6次(每次更换混合溶液)。然后用纯水清洗去除混合溶液残留，50℃烘箱中烘干。
步骤二、脱钙与去抗原处理
将烘干后的猪骨颗粒采用超低温冷冻粉碎机进行再次粉碎，颗粒粉碎至粒径在50～100μm，获得脱毒、脱脂和脱细胞的骨组织微粒。用0.2mol/L盐酸溶液于4℃下浸泡所述骨组织微粒进行脱钙处理；其中，骨组织微粒与盐酸溶液的固液比为1:20(g/mL)，脱钙处理3次，第一次浸泡时间为12h(随处理次数增加盐酸浓度每次下降0.05mol/L，浸泡时间缩短4小时)；通过测定骨组织微粒钙磷含量确定完全脱钙后，纯化水清洗至中性，得脱钙骨基质颗粒。然后用0.5wt％的尿素溶液于4℃下浸泡脱钙骨基质微粒以去除成骨活性蛋白等；其中，脱钙骨基质微粒与尿素溶液的固液比为1:10(g/mL)，浸泡时间为6h/次，共3次。最后用纯化水清洗至中性。
步骤三、交联改性与抗钙化处理
将经过步骤二处理后的骨基质微粒加入到2wt％的甲醛溶液中于37℃下交联30分钟，纯化水清洗6次去除残留。然后采用0.5wt％的硼氢化钠溶液于室温下浸泡6小时，纯化水清洗后冷冻干燥，获得抗钙化交联脱钙骨基质微粒。
步骤四、双相凝胶的制备
向配制的磷酸盐生理平衡盐水中加入盐酸利多卡因(终浓度为3mg/mL)和重组胶原蛋白(终浓度为300mg/mL)，搅拌至完全溶解，得到含麻药的重组胶原蛋白磷酸盐凝胶。再将抗钙化交联脱钙骨基质微粒加入该凝胶中(微粒与重组胶原蛋白质量比例为1:4)，震荡或搅拌混合，采用均质机匀浆，使得抗钙化交联脱钙骨基质微粒均匀混悬于上述凝胶之中。经无菌灌装或辐照灭菌，即制得双相凝胶除皱填充剂。
实例3
不加局部麻醉药盐酸利多卡因，其他与实例1相同。
Claims (10)
1.一种重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶，其特征在于：该双相凝胶包括含有重组胶原蛋白的凝胶相以及分散在该凝胶相中的固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒，所述固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒与重组胶原蛋白的质量比为10:1～1:50。
2.如权利要求1所述的重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶，其特征在于：所述凝胶相是通过将重组胶原蛋白与生理缓冲溶液混合而得到的，或者所述凝胶相是通过将重组胶原蛋白、局部麻醉药与生理缓冲溶液混合而得到的，所述固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒是通过将动物骨组织颗粒粉碎后进行脱钙、去抗原、交联改性及抗钙化处理而得到的。
3.如权利要求2所述的重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶，其特征在于：所述局部麻醉药选自盐酸利多卡因、苯佐卡因、丁卡因中的一种。
4.如权利要求2所述的重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶，其特征在于：所述动物骨组织颗粒是通过将哺乳动物的骨组织经粉粹后进行脱毒、脱脂和脱细胞处理而得到的。
5.如权利要求1所述的重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶，其特征在于：所述双相凝胶的总蛋白含量为20～600mg/mL。
6.如权利要求1所述的重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶，其特征在于：所述重组胶原蛋白选自通过微生物基因重组表达系统或植物基因重组表达系统得到的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅶ型胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白或者纤连蛋白中的一种或多种，或者重组胶原蛋白选自含有所述I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅶ型胶原蛋白、弹性蛋白、粘连蛋白或者纤连蛋白的融合蛋白；所述重组胶原蛋白的分子量为5～200万道尔顿。
7.如权利要求1所述的重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶，其特征在于：所述凝胶相的pH值为6.0～8.0，渗透压为250mOsmol/L～350mOsmol/L。
8.一种重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将动物骨组织颗粒粉碎后进行脱钙、去抗原、交联改性及抗钙化处理，得到固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒；将重组胶原蛋白与生理缓冲溶液混合，或者将重组胶原蛋白、局部麻醉药与生理缓冲溶液混合，得到含有重组胶原蛋白的凝胶相；将所述凝胶相与固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒混合，得到重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶，所述固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒与重组胶原蛋白的质量比为10:1～1:50。
9.如权利要求8所述的重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶的制备方法，其特征在于：所述去抗原处理具体包括以下步骤：采用质量分数0.05％～5％的尿素溶液浸泡经过粉碎、脱钙处理所得的骨基质微粒；所述交联改性处理采用的化学交联剂选自戊二醛、甲醛、碳二亚胺、环氧化物、京尼平、单宁酸、原花青素中的一种或多种；所述抗钙化处理采用的钙化抑制剂选自硼氢化钠、甘氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、肝素、乙醇、丁二醇、单宁酸中的一种或多种。
10.如权利要求8所述的重组胶原蛋白-脱钙骨基质微粒双相凝胶材料的制备方法，其特征在于：所述动物骨组织颗粒经粉粹后所得骨组织微粒的粒径为10～200μm；所述凝胶相与固相抗钙化交联脱钙骨基质微粒的混合比例按质量计为10:1～100:1，该凝胶相中重组胶原蛋白的浓度为50～300mg/mL。
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