CN113984820A - 提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能的试剂组合和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物材料领域,特别涉及提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能的试剂组合和方法。本发明在现有戊二醛交联去细胞牛心包的基础上,进行脱细胞及醛基封闭,同时补充弹力蛋白和糖胺聚糖交联剂和钙离子抑制剂处理。对比现有的戊二醛交联,实验证明可以在有效保持力学性能的基础上,提升抗钙化性能,提升瓣膜材料的耐久性。

Description

提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能的试剂组合和方法
技术领域
本发明涉及生物材料领域,特别涉及提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能的试剂组合和方法。
背景技术
目前基于异种(猪或牛)心包膜交联制备的生物瓣膜是市场的主流产品。美国爱德华生命科学公司、美国美敦力公司以及国内杭州启明医疗器械有限公司生产的介入生物瓣膜的瓣叶材料都是采用猪或牛的心包膜原材料,并用戊二醛交联制备而成。而当前异种心包膜戊二醛交联的生物瓣膜使用寿命通常只有10-15年左右,极大地限制了生物瓣膜的应用范围和效果。
生物瓣膜的失效是多方面因素造成的,包括生物瓣膜的钙化、降解、微凝血以及内皮化困难等原因,因此,基于戊二醛交联的防钙化策略国内外也提出了很多新的思路;首先,针对戊二醛交联后瓣膜的钙化问题,国内外提出了许多改进戊二醛交联的方法:一是筛选出更为合适的戊二醛处理时间、浓度和交联固定的压力,一些研究认为可用0.5%浓度的戊二醛代替标准的0.625%的交联浓度,交联时间通常选择在室温下交联24-48小时。Hughes对于固定浓度下的戊二醛交联条件与效率进行了摸索,他认为在固定浓度下温度和缓冲液pH值是影响戊二醛进入心包组织的主要因素,并指出pH 9和37℃的温度是最合适的交联条件。同时,有研究表明,交联固定时的压力可影响瓣叶组织结构,改变或损害瓣叶胶原,影响瓣膜的耐久性与寿命;因此,应尽量采用零压或低压固定,以保证瓣叶组织结构的完整性和减轻固定压力损伤。同时,对于戊二醛交联后瓣膜的保存,有文献研究表明可以低温保存在甘油相对于保存在低浓度戊二醛中可以明显减轻钙化。
对于戊二醛交联生物材料植入体内的钙化问题,目前国际上主要有三点策略:一是提取或洗脱组织内可能钙化的物质,消除或减少促进钙化的因素,干扰磷酸钙结晶的生成,改变表面电荷的性质,减低组织间质的空隙,防止血清渗入瓣叶,恢复天然抑钙物等;二是充分漂洗洗脱去除残余醛基。有研究表明,使用PBS充分漂洗可明显减少吸附在材料表面未交联的游离醛基含量;三是应用氨基化合物再次交联封闭游离醛基,如采用甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、牛磺酸、半胱氨酸等氨基酸处理GA交联的瓣膜材料,或采用油酸(清洁剂)及引入二元胺,原理都是增加额外交联,用氨基中和残余醛基;四是通过还原反应,将醛基转化为羟基,用硼氢化钠还原醛基为羟基,使其变为无毒害的醇;四是通过缩醛反应来中和醛基,如Sang-Soo Kim使用10%柠檬酸与醛基反应中和降低了戊二醛的细胞毒性;五是通过加成反应去除醛基,周建业等人使用亚硫酸氢钠与醛基加成形成羟基磺酸钠沉淀来充分去除游离醛基;与仅用GA处理的材料相比,这些方法报道都有效地降低戊二醛残留的细胞毒性和改善生物相容性,具有一定的应用价值。而对于戊二醛交联不充分,只能交联胶原蛋白的问题,目前国内外也提出了一些解决方案,主要是通过加入其他的交联剂与戊二醛联合应用来减轻钙化,比如联合低剂量戊二醛和其他新型交联剂如京尼平、环氧化合物、碳二亚胺等交联,或加入新的弹力蛋白和糖胺聚糖交联剂,这些方法的远期效果有待进一步观察验证。
因此,优化目前主流的戊二醛交联制备牛心包瓣膜材料技术,解决其残余醛基毒性和交联不充分的问题,并进一步提升其生物相容性和抗钙化性能,具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了提升戊二醛交联牛心包瓣膜材料抗钙化性能的试剂组合和方法。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能的试剂组合,包括新霉素、戊二醛、谷胱甘肽、柚皮素和MgCl2
戊二醛交联处理是目前生物瓣膜化学交联的行业首选,具有操作简单,成本低以及胶原蛋白交联程度高的特点。但经戊二醛交联的生物瓣因游离醛基缓慢微量的释出仍可引起细胞毒性,不利于细胞粘附生长和内皮化。且戊二醛交联后残留的醛基带负电,容易静电吸附钙离子,富集形成钙核,引发钙化;且戊二醛不能交联生物材料中其他成分,如弹力蛋白、糖胺聚糖等,而断裂的弹力蛋白纤维恰好容易成为钙化位点,糖胺聚糖的损失则使瓣膜在开闭时剪切应力增加,影响瓣膜使用寿命;戊二醛交联不能去除磷脂,而磷脂残留是引发生物假体瓣膜钙化的重要原因。
本发明基于戊二醛交联制备生物瓣膜的钙化机制,首先进行脱细胞处理,补充了其他成分的交联,如弹力蛋白和糖胺聚糖的交联,并进行了力学性能强度、生物相容性、抗钙化性能进行了评估,结果表明,新发明的戊二醛复合交联技术对比单纯的戊二醛交联,不仅有更好的力学强度、细胞毒性更低,组织相容性更好,抗钙化性能更强,可以作为一种新型生物材料瓣膜的交联制备方法。
在本发明的一些具体实施方案中,所述新霉素的浓度为0.5~2mmol/L;所述戊二醛的浓度为0.625%(质量浓度,6.25mg/ml);所述谷胱甘肽的浓度为2~4mmol/L;所述柚皮素的浓度为0.1%~1%(质量浓度);所述MgCl2的浓度为0.1%~1%(质量浓度)。所述的试剂组合中,各组分的质量比为:新霉素:戊二醛:谷胱甘肽:柚皮素:氯化镁=(500~2000):6250:(600~1200):(1000~10000):(1000~10000)。
在本发明的一些具体实施方案中,以g/mL计,所述牛心包瓣膜材料与所述试剂组合的重量体积比为(0.5~1):(4~10)。
在本发明的一些具体实施方案中,以g/mL计,所述牛心包瓣膜材料与所述试剂组合的重量体积比为1:8。
基于上述,本发明还提供了所述的试剂组合在提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能中的应用。
本发明还提供了提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能的方法,包括如下步骤:
步骤1:获得牛心包瓣膜材料;
步骤2:脱细胞;
步骤3:采用本发明所述的试剂组合交联。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤3具体包括:NE交联、戊二醛交联、谷胱甘肽解毒、柚皮素交联和MgCl2处理的步骤。
在本发明的一些具体实施方案中,所述NE交联具体为:用pH5.5,50mMES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液,配置0.5~2mmol/L新霉素,在摇床上以120rpm震荡1h;
所述戊二醛交联具体为:0.625%戊二醛,交联4℃48h或20℃24h,每24h换液;
所述谷胱甘肽解毒具体为:2~4mmol/L谷胱甘肽,PBS溶液,37℃,120rpm震荡24h;
所述柚皮素交联具体为:0.1%~1%柚皮素,PBS溶液,37℃,24~48h,每24h换液;
所述MgCl2处理具体为:0.1%~1%的MgCl2,PBS溶液,37℃,6~24h。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤2中所述脱细胞包括如下步骤:
步骤①:0.1%新洁尔灭37℃处理30min,每10min搅拌一次;
步骤②:0.25%TritonX-100在37℃,120rpm震荡漂洗48h,每12h换液;
步骤③:3u/ml DNase-I/0.03mg/ml RNase-A 37℃120rpm震荡漂24h,每12h换液;
步骤④:蒸馏水漂洗48h,每8h换液;
步骤⑤:PBS漂洗24h,换液后保存。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤1具体为:获得牛心包,热缺血时间30分钟内,分离脂肪和外膜,用含抗生素无菌PBS液,即青霉素和链霉素,浓度均为100U/ml,清洗多次,浸入0.1%新洁尔灭30min,含抗生素无菌PBS冲洗心包内侧和外侧10min×3次,4℃保存。
基于上述研究,本发明还提供了所述的方法制得的牛心包瓣膜材料。
本发明在现有戊二醛交联去细胞牛心包的基础上,进行脱细胞及醛基封闭,同时补充弹力蛋白和糖胺聚糖交联剂和钙离子抑制剂处理。对比现有的戊二醛交联,实验证明可以在有效保持力学性能的基础上,提升抗钙化性能,提升瓣膜材料的耐久性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示效果例3中实验组的扫描电镜结果;
图2示效果例3中戊二醛组的扫描电镜结果;
图3示效果例4中的HE染色结果;
图4示效果例4中的Masson染色结果;
图5示效果例4中的EVG染色结果;
图6示SD大鼠皮下包埋8周结果,其中,D示戊二醛组;J示本发明的实验组。
具体实施方式
本发明公开了提升戊二醛交联牛心包瓣膜材料抗钙化性能的试剂组合和方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明所述的制备方法中,其关键点在于戊二醛、新霉素、柚皮素、氯化镁的结合使用顺序,首先去除细胞成分,去除大部分抗原及磷脂;再应用新霉素(-NH2供体)交联羧基(-COOH),稳定糖胺聚糖;然后用戊二醛(-CHO)交联氨基(-NH2),保证力学性能,并封闭抗原和固定新霉素;随后用谷胱甘肽结合封闭残余醛基(-CHO),清除戊二醛交联的残余毒性;然后加入多酚交联稳定弹力蛋白(交联-OH、-C=O、-NH2),降低免疫和炎症反应;最后使用金属离子稳定弹力蛋白并封闭多酚的钙离子结合位点,同时改变材料表面电荷性质,竞争性抑制钙离子沉积;通过这一系列的交联处理,逐步去除材料磷脂及抗原成员,封闭材料可能的钙化位点,提高材料交联程度和组织强度,并提高抗钙化性能。其交联剂之间可以达到相互配合,互不干扰的效果
本发明所述的制备方法中,其关键点在于谷胱甘肽的使用条件,温度必须得保证37℃,这样才能充分发挥解毒效果。同时用PBS配置的谷胱甘肽PH值为6.8,接近于中性,对于戊二醛的交联影响较小。本发明中,谷胱甘肽可以起到较好的解毒效果,通过细胞毒性实验及细胞增殖实验均得到了验证。同时,封闭醛基也进一步降低了钙化,这一点,也通过大鼠皮下包埋进行了验证。
本发明所述的制备方法中,其关键点在于柚皮素的提出及使用条件;柚皮素作为一种多酚,首次尝试应用于生物材料交联,在交联过程中,对于如何提高柚皮素溶解度、通过提高反应温度、时间和浓度来提升交联效果,这些参数的调整取决去所选材料的种类和材料的部位,对于生物材料的细胞含量不同,组织结构致密程度的不同,可以相应的上调或下调反应时间、浓度,达到最佳的交联效果。
本发明所述的制备方法中,抗钙化的关键点之一在于氯化镁的补充。通过加入氯化镁,改变材料表面电荷,可进一步降低钙离子沉积可能性,通过封闭多酚的阴离子位点,对于氯化镁的使用,可以根据材料特性,相应的上调或下调反应时间、浓度,达到最佳的交联效果。
本发明中,我们采用基于戊二醛交联制备生物瓣膜的钙化机制,首先进行脱细胞处理,补充了弹力蛋白和糖胺聚糖的交联。达到操作流程简单,力学效果及抗钙化效果满意。
在整个交联流程结束后,生物材料的组织力学强度、生物相容性及抗钙化性能,与目前行内主流的单纯戊二醛交联比较,均有较大提升;因此,该交联方法可以作为一种新的生物材料交联制备瓣膜方法。
本方案中,化学洗涤剂Triton X-100可以被其他洗涤剂替换掉,可取得相似的实验结果;本方案主要为一种新的交联方案,其去细胞的方式可以被其他方法替代,可取得相似的实验结果;对于戊二醛的交联条件,在我们的流程中改变交联时间或者温度,也可取得相似的结果。
本发明提供的提升戊二醛交联牛心包瓣膜材料抗钙化性能的试剂组合和方法中,所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1前期处理
从屠宰场的黄牛(体重约400-500Kg)体内取出心包,热缺血时间30分钟内,分离脂肪和外膜,用含抗生素无菌PBS液(青霉素和链霉素,浓度均为100U/ml)清洗多次,浸入0.1%新洁尔灭30min,含抗生素无菌PBS冲洗心包内侧和外侧10min×3次,低温4℃保存。
实施例2脱细胞
步骤1:0.1%新洁尔灭37℃处理30min,每10min搅拌一次;
步骤2:0.25%TritonX-100在37℃,120rpm震荡漂洗48h,每12h换液;
步骤3:3u/ml DNase-I/0.03mg/ml RNase-A 37℃120rpm震荡漂24h,每12h换液;
步骤4:蒸馏水漂洗48h,每8h换液;
步骤5:PBS漂洗24h,换液后保存。
通过上述步骤,去除细胞成分,去除大部分抗原及磷脂。
实施例3交联
以g/mL计,步骤2制得的牛心包瓣膜材料与本发明提供的试剂组合的重量体积比为1:8。
步骤1、NE交联:1mmol/L新霉素,120rpm震荡1h,PH5.5,50mMES缓冲液
步骤2、戊二醛交联:0.625%戊二醛,交联4℃48h,每24h换液;
步骤3、谷胱甘肽解毒:4mmol/L谷胱甘肽,PBS溶液,37℃,120rpm震荡24h;
步骤4、柚皮素交联:0.1%柚皮素,PBS溶液,37℃,24h,每24h换液;
步骤5、MgCl2交联:0.1%的MgCl2,PBS溶液,37℃,6h。
通过上述步骤,新霉素(-NH2供体)交联羧基(-COOH),稳定糖胺聚糖;戊二醛(-CHO)交联氨基(-NH2),保证力学性能,并封闭抗原和固定新霉素;谷胱甘肽结合封闭残余醛基(-CHO),清除戊二醛交联的残余毒性;加入多酚交联稳定弹力蛋白(交联-OH、-C=O、-NH2),降低免疫和炎症反应;金属离子稳定弹力蛋白并封闭多酚的钙离子结合位点,同时改变材料表面电荷性质,竞争性抑制钙离子沉积。
效果例1力学拉伸试验及热皱缩温度
实验方法:
1、力学单轴拉伸试验
将各组材料裁剪成1cm*5cm长条状(n=20),应用电子拉力测验机(美国,Instron,电子万能材料试验机),测量并记录每个样品的厚度和拉伸长度。设定拉伸速率为50mm/min,得到每个样品的应力-应变曲线图,再计算出材料的弹性模量(MPa)、最大拉伸应力(MPa)、最大值载荷(N)、最大值载荷位移值(mm)、断裂载荷(N)、拉伸断裂应变(MPa)和断裂应变率(%)。
2、热皱缩温度
将各组材料裁剪成1cm*5cm长条状(n=5),以蒸馏水为介质,从20℃开始加热,每分钟升高5℃,应用HG-1皮革收缩温度测试仪(四川成都大承兴数字系统公司)测定。
结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003239087670000081
以SPSS 25进行统计学分析,以P<0.05认为有统计学差异
对于两组力学数据可知,戊二醛复合组的弹性模量及热皱缩温度均好于单纯的戊二醛交联组,且对比具有统计学意义,说明戊二醛复合交联较于戊二醛交联进一步增强了交联强度和组织力学性能。
效果例2酶解实验
每个处理过的心包(每个约10mg)用去离子水冲洗,冷冻干燥,并称重。然后将组织置于0.5ml 50cdu/mLⅠ型胶原酶或30单位/mL猪胰弹性蛋白酶或GAG酶中37℃孵育24h,在摇床上以120rpm振荡,5份消化后的组织用去离子水洗涤30min,冻干,称重。重量损失百分比计算为重量损失百分比=(酶降解前的重量-酶降解后的重量)/酶降解前的重量×100%。消化后的组织也留作组织学检查;结果如表2所示。
表2
组别 实验组 GLUT组 P值
胶原酶解 5.21±1.05 6.53±3.27 P>0.05
弹力酶解 3.76±1.59 8.08±2.45 P<0.05
SPSS25进行统计学分析,P<0.05代表差异具有统计学意义;
表3
Figure BDA0003239087670000091
通过胶原酶解和弹力酶解实验可以看出交联方案对于胶原蛋白和弹力蛋白的交联强度,从上述数据对比可知,戊二醛复合交联组的抗胶原酶解能力和戊二醛组没有统计学差异,说明复合技术其他试剂的加入对于原有戊二醛的交联没有影响,而弹力酶解实验好于戊二醛组,说明柚皮素及氯化镁的加入增强了弹力蛋白的抗酶解能力。
效果例3扫描电镜
分组:
①实验组:将去细胞牛心包置于pH5.5,1mmol/L的新霉素(50mmol/L的MES缓冲液)震荡交联1h,再用0.625%戊二醛交联固定(固定方法与去细胞戊二醛组相同);戊二醛交联结束后,用4mmol/L的谷胱甘肽在pH7.2的PBS中120rpm震荡漂洗24h;随后用0.05%的柚皮素,在37℃,pH7.4的PBS中交联24h,交联完成后充分漂洗,用0.1%的MgCl2,pH7.2的PBS交联24h,交联结束后置入PBS中4℃保存;
②戊二醛组:去细胞戊二醛交联组:将去细胞牛心包置入0.625%戊二醛,4℃,PH7.4 PBS中,120rpm震荡交联48h,交联结束后置入PBS中4℃保存;
4℃下在含3%戊二醛的PBS(PH7.4)缓冲液中固定2小时。固定后,用PBS缓冲液中洗涤30分钟,通过乙醇系列脱水至100%乙醇,并用冷冻干燥机-55℃干燥24h;干燥后,使用双棒碳胶带(Scotch牌胶带,3M,St.PaulyMN,USA)将样品小心地安装在铝短柱上。然后将样品引入溅射镀膜机的腔室,并涂上金(溅射镀膜机SCD 005(Bal Tech Inc.),使其导电。用扫描电子显微镜对每组心包表面进行扫描。
本发明的实验组如图1所示,戊二醛组如图2所示。
从电镜图对比可以看出,戊二醛复合交联组的组织微观结构对比戊二醛组明显更加致密,组织结构更为紧凑。
效果例4组织学染色
组织学染色方法:
1、HE染色:
脱蜡前,应将组织切片放置50-56℃恒温箱中烘烤30分钟。
1)组织切片置于松节油中浸泡10分钟*2次;
2)无水乙醇中浸泡5分钟;
3)95%乙醇中浸泡5分钟;
4)75%乙醇中浸泡5分钟;
5)蒸馏水洗5分钟*2次。
6)苏木精液染色5-15min;
7)流水稍洗去苏木精液1-3s
8)1%盐酸乙醇1-3s;
9)流水或温水冲洗20-30min;
10)蒸馏水过洗1-2s
11)0.5%伊红液染色1-3min;
12)蒸馏水稍洗1-2s;
13)95%乙醇3-5min;
14)无水乙醇5-10min;
15)中性树胶封固
结果:细胞浆(胞质、肌纤维、胶原纤维)红色,细胞核蓝紫色。
2、Masson染色:
1)各组样本常规脱水包埋,切取4~6μm薄石蜡切片。
2)切片脱蜡水化(参考HE染色)。
3)Weiger氏铁苏木素染5-10分钟。
4)流水稍洗。
5)1%盐酸酒精分化。
6)流水冲洗数分钟。
7)丽春红酸性品红液染5-10分钟。
8)蒸馏水稍冲洗。
9)1%磷钼酸水溶液处理约5分钟。
10)不用水洗,直接用苯胺蓝液或绿液复染5分钟。
11)1%冰醋酸处理1分钟。
12)95%酒精脱水多次。
13)无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
EVG(弹力纤维)染色
1.各组样本常规脱水包埋,切取4~6μm薄石蜡切片。
2.切片脱蜡水化(参考HE染色)。
3.Verhoeff’s苏木精室温染色30min。
4.自来水冲洗。
5.2%三氯化铁溶液分化,直至镜检见黑色纤维灰色背景。
6.蒸馏水稍洗。
7.5%硫代硫酸钠清除碘1min。
8.蒸馏水稍洗。
9.VanGieson’s液复染5min。
10.95%酒精脱水多次。
11.无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
HE染色结果如图3所示,Masson染色结果如图4所示,EVG染色结果如图5所示。
从HE染色可以看出,复合交联技术组的去细胞效果良好,未发现细胞核以及细胞结构,去除细胞后通过后续的交联对于去细胞造成的组织结构的破坏有一定的修复作用。
从Masson以及EVG染色可以看出,牛心包组织经过复合交联技术处理后胶原组织和弹力纤维结构致密。
效果例5 SD大鼠皮下包埋8周实验
大鼠真皮下植入
所有处理过的组织(每个1*1厘米)用50毫升无菌蒸馏水彻底清洗三次,每次1小时。然后,用75%乙醇浸泡组织24小时进行消毒。然后用50ml无菌PBS缓冲液冲洗组织,准备植入。雄性(SD)大鼠,每只200-300克,腹腔注射10%水合氯醛(1毫升/300克大鼠)。做一个背部手术切口,两边都有两个皮下口袋。每个口袋里放一个心包膜。用7号丝线缝闭切口,植入20天后将标本与纤维胶囊一起移植,保留一半组织作组织学检查。另一半冷冻后进行钙含量分析,用电感离子耦合法(Thermofisher,ICP7400)分析钙含量。
实验结果如图6和表3所示。其中,D:戊二醛组;J:实验组。
分组:
①实验组:将去细胞牛心包置于PH5.5,1mmol/L的新霉素(50mmol/L的MES缓冲液)震荡交联1h,再用0.625%戊二醛交联固定(固定方法与去细胞戊二醛组相同);戊二醛交联结束后,用4mmol/L的谷胱甘肽在PH7.2的PBS中120rpm震荡漂洗24h;随后用0.05%的柚皮素,在37℃,PH7.4的PBS中交联24h,交联完成后充分漂洗,用0.1%的MgCl2,PH7.2的PBS交联24h,交联结束后置入PBS中4℃保存;
②戊二醛组:去细胞戊二醛交联组:将去细胞牛心包置入0.625%戊二醛,4℃,PH7.4 PBS中,120rpm震荡交联48h,交联结束后置入PBS中4℃保存。
表4钙含量定量
组别 实验组 GLUT组 P值
钙含量(ug/mg干重) 1.31±0.45 2.97±1.64 P<0.05
SPSS25进行统计学分析,P<0.05具有统计学意义;
表5
Figure BDA0003239087670000131
大鼠皮下包埋是模拟体内生理环境抗钙化能力的验证,通过钙含量定量,可以看出戊二醛复合交联组的钙含量对于戊二醛组下降60%,且具有统计学差异,说明本研究发明的戊二醛复合交联技术可以有效提高戊二醛交联后牛心包材料的抗钙化性能。
综上,通过力学性能、酶解实验、热皱缩温度结果以及电镜和组织学染色,均证明了新的复合技术比原有的戊二醛交联更好,通过体内钙化实验,也证明这种复合技术有着良好的抗钙化性能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能的试剂组合,其特征在于,包括新霉素、戊二醛、谷胱甘肽、柚皮素和MgCl2
2.如权利要求1所述的试剂组合,其特征在于,所述新霉素的浓度为0.5~2mmol/L;所述戊二醛的使用质量浓度为0.625%;所述谷胱甘肽的浓度为2~4mmol/L;所述柚皮素的使用质量浓度为0.1%~1%;所述MgCl2的使用质量浓度为0.1%~1%;所述的试剂组合中,各五分的质量比为:新霉素:戊二醛:谷胱甘肽:柚皮素:氯化镁=(500~2000):6250:(600-1200):(1000~10000):(1000~10000)。
3.如权利要求1或2所述的试剂组合,其特征在于,以g/mL计,所述牛心包瓣膜材料与所述试剂组合的重量体积比为(0.5~1):(4~10)。
4.如权利要求1至3任一项所述的试剂组合在提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能中的应用。
5.提升牛心包瓣膜材料抗钙化性能的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:获得牛心包瓣膜材料;
步骤2:脱细胞;
步骤3:采用如权利要求1至3任一项所述的试剂组合交联。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤3具体包括:NE交联、戊二醛交联、谷胱甘肽解毒、柚皮素交联和MgCl2处理的步骤。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述NE交联具体为:用pH5.5,50mmol/L,MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液,配置0.5~2mmol/L新霉素,在摇床上120rpm震荡1h;
所述戊二醛交联具体为:0.625%戊二醛,交联4℃48h或20℃24h,每24h换液;
所述谷胱甘肽解毒具体为:2~4mmol/L谷胱甘肽,PBS溶液,37℃,120rpm震荡24h;
所述柚皮素交联具体为:0.1%~1%柚皮素,PBS溶液,37℃,24~48h,每24h换液;
所述MgCl2处理具体为:0.1%~1%的MgCl2,PBS溶液,37℃,6~24h。
8.如权利要求5至7任一项所述的方法,其特征在于,步骤2中所述脱细胞包括如下步骤:
步骤①:0.1%新洁尔灭37℃处理30min,每10min搅拌一次;
步骤②:0.25%TritonX-100在37℃,120rpm震荡漂洗48h,每12h换液;
步骤③:3u/ml DNase-I/0.03mg/ml RNase-A 37℃120rpm震荡漂24h,每12h换液;
步骤④:蒸馏水漂洗48h,每8h换液;
步骤⑤:PBS漂洗24h,换液后保存。
9.如权利要求5至8任一项所述的方法,其特征在于,步骤1具体为:获得牛心包,热缺血时间30分钟内,分离脂肪和外膜,用含抗生素无菌PBS液,即青霉素和链霉素,浓度均为100U/ml,清洗多次,浸入0.1%新洁尔灭30min,含抗生素无菌PBS冲洗心包内侧和外侧10min×3次,4℃保存。
10.如权利要求5至9任一项所述的方法制得的牛心包瓣膜材料。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1371750A (zh) * 2002-02-28 2002-10-02 中南大学湘雅二医院 生物心脏瓣膜2,3-丁二醇防钙化改性的方法
CN101161293A (zh) * 2006-10-12 2008-04-16 胡盛寿 异种生物组织材料的抗钙化改性方法
CN109651627A (zh) * 2018-12-18 2019-04-19 中国医学科学院生物医学工程研究所 天然聚合物交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用
CN110694112A (zh) * 2019-09-12 2020-01-17 厉忠逵 一种异种生物组织材料的多联抗钙化处理方法
CN111166938A (zh) * 2020-02-17 2020-05-19 四川大学 一种非戊二醛可预装干燥生物瓣膜材料及制备方法和应用
WO2020234845A1 (en) * 2019-05-22 2020-11-26 Biocompatibility Innovation Srl Method for preventing the formation of calcified deposits and for inactivating xenoantigens in biological matrices

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1371750A (zh) * 2002-02-28 2002-10-02 中南大学湘雅二医院 生物心脏瓣膜2,3-丁二醇防钙化改性的方法
CN101161293A (zh) * 2006-10-12 2008-04-16 胡盛寿 异种生物组织材料的抗钙化改性方法
CN109651627A (zh) * 2018-12-18 2019-04-19 中国医学科学院生物医学工程研究所 天然聚合物交联剂及其在制备抗钙化生物瓣膜中的应用
WO2020234845A1 (en) * 2019-05-22 2020-11-26 Biocompatibility Innovation Srl Method for preventing the formation of calcified deposits and for inactivating xenoantigens in biological matrices
CN110694112A (zh) * 2019-09-12 2020-01-17 厉忠逵 一种异种生物组织材料的多联抗钙化处理方法
CN111166938A (zh) * 2020-02-17 2020-05-19 四川大学 一种非戊二醛可预装干燥生物瓣膜材料及制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
宋学营 等: "酒精对戊二醛固定牛心包影响的实验研究", 《生物医学工程与临床》 *

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