WO2017067295A1 - 一种人工生物带瓣膜血管及其制备方法 - Google Patents

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霍美俊
史欢欢
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Definitions

  • the invention belongs to the field of biomedical engineering, in particular to an artificial biological valve blood vessel and a preparation method thereof.
  • the object of the present invention is to provide an artificial biological valve blood vessel with good biocompatibility and anti-calcification performance, reasonable structural design, strong tensile strength and simple operation, and a preparation method thereof, and particularly provide a method for reconstruction and Repair of artificial bioflap tubing connected to the right ventricle-pulmonary artery.
  • a tannin cross-linking treatment method capable of preventing degradation of elastic fibers, significantly inhibiting the occurrence of calcification, and further improving the mechanical properties of the cross-linked tissue material is provided.
  • the tannic acid solution is prepared from Hepes liquid (Hepes solution) or phosphate buffer at a concentration of 0.1-0.6% and a pH of 4.0-7.0. Wherein the Hephas liquid has a concentration of 30-80 mM and a pH of 5.0-8.0.
  • the tannic acid solution is used in an amount corresponding to not less than 5 mL per cm of the blood vessel length.
  • a blood flow direction indicating arrow is sewn on a surface of the medical polymer material layer.
  • the design of the blood flow direction indicating arrow can visually mark the direction of blood flow when the valve is in working state, so that the direction of the blood vessel and the valve can be quickly and accurately recognized during the operation.
  • the percent "%" referred to in the present invention means a mass percentage unless otherwise specified; however, the percentage of the solution, unless otherwise specified, refers to the number of grams of the solute contained in the 100 mL solution.
  • the samples of the two groups were light brown, the wall of the tube was slightly harder than the glutaraldehyde group, the valve was soft, and the activity was not significantly different from that of the glutaraldehyde group.

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Abstract

一种人工生物带瓣膜血管及其制备方法，所述人工生物带瓣膜血管是以丹宁酸溶液作为交联剂对带有天然瓣膜的血管进行交联处理后得到。该血管生物相容性和抗钙化性能良好、结构设计合理、抗张能力较强，适用于重建和修复右心室-肺动脉连接的人工生物带瓣管道。该制备方法采用丹宁酸交联处理技术，能防止弹性纤维降解，显著地抑制钙化发生，并能进一步提高交联后组织材料的力学性能。

Description

一种人工生物带瓣膜血管及其制备方法
相关申请的交叉引用
本发明要求2015年10月19日提交、申请号为201510689956.1的中国专利申请的优先权，其所公开的内容作为参考全文并入本申请。
技术领域
本发明属于生物医学工程学领域，具体地说，涉及一种人工生物带瓣膜血管及其制备方法。
背景技术
我国先天性心脏病发病率约为6‰-9‰，居出生缺陷的首位，每年新发先心病患儿约20万，现存先心病患儿超过200万，其中复杂型先天性心脏病占20％。相当一部分复杂先天性心脏病病变累及右心室流出道，如严重法洛四联征、D-大动脉转位、共同动脉干、右心室双出口以及肺动脉闭锁等。应用带瓣膜管道建立或恢复右心室流出道－肺动脉连续性，是外科矫治上述心脏畸形的常规术式之一，目前已广泛应用于许多复杂型先天性心脏病右心室流出道重建以及Ross手术(罗斯手术)中。
右心室流出道重建术的临床疗效与其所选带瓣管道材料的种类和性能密切相关。以往已有多种类型的带瓣管道材料相继应用于临床，包括合成材料管道、猪主动脉瓣或肺动脉瓣管道、心包管道等。但受制于材料本身的局限性，现有带瓣管道的临床疗效并不十分理想，未能完全满足临床需求，如牛心包和猪心脏瓣膜的瓣叶较厚，质地偏硬，需要较大的压力使瓣膜充分打开，不适合静脉系统的低压环境；心包组织呈纤维状，心包材料的瓣叶易磨损等。
近年来，牛颈静脉因具有天然三叶瓣结构，抗返流性能良好，适合人体右心系统的低压环境，来源充足等优点而逐渐成为心脏外科右 室流出道重建替代材料之一，应用前景广阔。美国美敦力公司采用传统交联剂戊二醛固定牛颈静脉而成的Contegra管道是目前唯一获美国FDA(美国食品药品监督管理局)批准进入市场的牛颈静脉带瓣管道产品。虽然该产品具有血流动力学功能良好，易于外科操作且来源充足等优点而在国际上处于绝对垄断地位，但由于我国对境外牛源生物制品的限制因素，该产品一直未能在国内市场应用，加之国内市场尚无同类商业化产品可供选择，因此牛颈静脉管道材料未能在我国心脏外科领域正式应用。此外，近来越来越多的临床实践表明Contegra管道存在远期管壁钙化、远端吻合口狭窄及管道瘤样扩张致管道失功衰败等问题。
上述并发症可能与戊二醛处理有关，戊二醛作为异种材料交联剂有它自身的缺点。首先，其只对胶原纤维有一定交联作用，但对其它组分如弹性纤维和蛋白多糖等无交联作用；第二，其容易导致生物组织中钙盐沉积即钙化。钙化的组织会变硬变脆，影响组织的活动并容易撕裂、穿孔，导致生物材料耐久性差，患者必须接受二次手术将钙化的组织取出，这样不仅有一定的危险性，而且给患者增加了不必要的痛苦。如何减轻戊二醛交联的生物材料钙化是近二十年来人们研究的重点内容，从清除组织中引起钙化的脂质、细胞碎片，中和组织中残余的戊二醛和竞争抑制钙离子吸收等角度也找到了一些有效的处理方法，但其操作复杂，且其长期的效果仍在观察中。
丹宁酸(tannic acid，TA)是一种植物多酚(药典上又称蹂酸)，属于galloyl-glucose家族，其水溶性好，适当剂量对人体无毒害作用。近年来，丹宁酸逐渐在生物医学工程领域用于异种材料的制备。丹宁酸可通过氢键结合稳定弹力纤维等。牛颈静脉管壁含大量弹力纤维(主要分布在管壁内膜下层与中层)，弹力纤维降解可引起管壁瘤样扩张改变与钙化。对经戊二醛固定的牛颈静脉带瓣管道进行丹宁酸改性处理，有望提高其抗钙化性能。
此外，前期研究中还发现，牛颈静脉血管壁的弹性较大，抗张能力较弱，若对瓣膜处管壁不加以约束，对于肺动脉压力较高的患者，存在管壁过度扩张而导致瓣膜关闭不全、返流的风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物相容性和抗钙化性能良好、结构设计合理、抗张能力较强、手术操作简便的人工生物带瓣膜血管及其制备方法，特别提供一种用于重建和修复右心室－肺动脉连接的人工生物带瓣管道。还特别提供一种能防止弹性纤维降解，显著地抑制钙化发生，并能进一步提高交联后组织材料力学性能的丹宁酸交联处理方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的一种人工生物带瓣膜血管的制备方法，以丹宁酸溶液作为交联剂对带有天然瓣膜的血管进行交联处理后得到。
前述的方法，将所述带有天然瓣膜的血管浸泡丹宁酸溶液中，于18-40℃，0-200rpm转速条件下交联24-96小时。
在本发明的一个具体实施方式中，所述丹宁酸溶液由赫佩斯液(Hepes液)或磷酸盐缓冲液配制而成，浓度为0.1-0.6％，pH值为4.0-7.0。其中，所述赫佩斯液的浓度为30-80mM，pH值为5.0-8.0。所述丹宁酸溶液以每厘米血管长度对应不少于5mL的量使用。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述丹宁酸溶液为丹宁酸和戊二醛的混合液，由赫佩斯液或磷酸盐缓冲液溶解配制而成；其中，丹宁酸浓度为0.1-0.6％，戊二醛浓度为0.2-1.0％，pH值为4.0-7.0(优选pH值为5.5-6.0)。所述赫佩斯液的浓度为30-80mM，pH值为5.0-8.0。所述丹宁酸溶液以每厘米血管长度对应不少于5mL的量使用。
前述的方法，交联处理前，还包括预先用戊二醛溶液对所述带有天然瓣膜的血管进行固定处理的步骤。
所述固定处理的步骤具体如下：
S1、用浓度为0.5-1.0％、pH值为5.0-8.0的戊二醛溶液浸泡所述带有天然瓣膜的血管，浸泡温度为4-25℃，浸泡时间为2天；
S2、将S1所得血管再使用浓度为0.2-0.5％、pH值为5.0-8.0的戊二醛溶液浸泡，浸泡温度为4-25℃，浸泡时间为7天以上。
优选地，所述戊二醛溶液由赫佩斯液配制而成。更优选地，所述赫佩斯液的浓度为30-50mM(优选50mM)，pH值为5.0-7.4。
前述的方法，还包括在交联处理后的血管外包覆的医用高分子材料层的步骤。
优选地，在所述医用高分子材料层的表面缝制血流方向指示箭头。
更优选地，所述血流方向指示箭头由医用缝合线缝制而成。
本发明中使用的医用高分子材料层为医用聚酯编织物，所述血流方向指示箭头由医用缝合线缝制而成。
本发明中使用的带有天然瓣膜的血管来源于四足动物的动脉血管或静脉血管，其中包括一个或多个瓣膜。所述带有天然瓣膜的血管长度为4-16cm，直径为6-28mm。
优选地，所述静脉血管为牛颈静脉，所述静脉血管具有完整的天然瓣膜结构，其中包括两瓣叶结构或三瓣叶结构。
前述的方法，所述医用高分子材料层采用医用缝合线缝合或生物粘合剂粘结的方式包覆在所述带有天然瓣膜的血管的瓣膜部位外侧。
优选地，所述医用高分子材料层包覆所述带有天然瓣膜的血管的长度为1.5-6cm。
本发明中所用丹宁酸是一种植物多酚，其分子结构上含有多个亲水性残基，能特异性结合到富含脯氨酸蛋白(如胶原蛋白和弹性蛋白)的疏水区域并形成多个氢键。丹宁酸可通过这些氢键稳定组织材料细胞外基质中的胶原蛋白纤维、弹性蛋白纤维以及粘多糖等成分，一方 面能显著降低由弹力纤维粘多糖等物质降解导致的钙化，一方面还能改善材料的生物力学性能，增强抗疲劳性，从而延长材料的在体内的使用寿命。另外，丹宁酸还具有抗菌和减少蛋白抗原性的作用，这些特性也有助于增强材料的抗钙化性能和生物相容性。
戊二醛交联固定技术现广泛应用于心血管植入材料，其交联作用的位点恰好与丹宁酸的作用位点互补，键合的类型也不一样，所以当使用戊二醛与丹宁酸协同交联时，戊二醛交联组织材料上的胶原蛋白，而丹宁酸同时交联组织材料上的胶原蛋白、弹蛋白纤维以及蛋白多糖，弥补了戊二醛交联的不足，材料各种组分均得到了有效地交联，交联键除氢键以外，还有共价键、络合键等形式，由于使用丹宁酸与戊二醛协同交联处理，材料的键合程度和力学性能均有较大幅度的提高，植入体内后不易被宿主组织中的酶降解，减少了弹性蛋白降解的数量，从而降低材料的钙化潜能，同时也能发挥戊二醛去除组织抗原性和消毒灭菌的作用。
本发明提供一种人工生物带瓣膜血管，包括一段经所述丹宁酸溶液交联处理过的带有天然瓣膜的血管；在所述带有天然瓣膜的血管的瓣膜部位外包覆的医用高分子材料层；以及在所述医用高分子材料层的表面缝制的血流方向指示箭头。
其中，所述天然瓣膜应结构完整、形态良好、大小均匀，可以是两瓣叶结构，也可以是三瓣叶结构。
所述带有天然瓣膜的血管可由包含一个或多个瓣膜的血管制备而成，可以是动脉血管，也可以是静脉血管。可采用牛、马、山羊、绵羊等四足动物的颈静脉血管，优选牛颈静脉血管。所述牛颈静脉长度为4-16cm，直径为6-28mm。
所述医用高分子材料层可采用医用缝合线缝合或生物粘合剂粘结的方式包覆在所述带有天然瓣膜的血管的瓣膜部位外。
所述医用高分子材料层可以为医用聚酯编织物，均匀、平整地包 覆在瓣膜外部，不改变血管的内径和瓣叶的开闭。包覆长度通常为1.5-6cm，保证瓣窦正常充盈又不会过度扩张，从而有效地保持瓣膜的形态和功能，使其耐受较高的血压。
所述血流方向指示箭头可以由医用缝合线缝制而成，箭头的尖端均指向血管流出端。所述血流方向指示箭头可以包括开放式线型箭头、开放式点状箭头和闭合式线型箭头。
本发明具有以下优点：
(一)采用丹宁酸溶液交联处理技术，增强生物组织力学强度和稳定性，并提高抗钙化性能；
(二)天然的瓣膜结构，具有良好的血液动力学性能和抗返流性能；
(三)血管的瓣膜部位外覆医用高分子材料层，限制瓣窦过度扩张，可以有效保持瓣膜的形态和功能，使其耐受较高的血压；
(四)血流方向指示箭头的设计，可以直观地标记出瓣膜工作状态时的血流方向，便于术中快速、准确地辨认血管及瓣膜的方向。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的人工生物带瓣膜血管的结构示意图。
图2A为本发明实施例1中制备的人工生物带瓣膜血管的剖视图；其中，瓣膜为打开状态。
图2B为本发明实施例1中制备的人工生物带瓣膜血管的剖视图；其中，瓣膜为闭合状态。
图3A-图3D为本发明实施例1中制备的人工生物带瓣膜血管的血流方向指示箭头的实施方式示意图。
图4A为本发明实施例1中将人工生物带瓣膜血管用于右心室-肺动脉连接的重建手术时放置状态示意图。
图4B为本发明实施例1中将人工生物带瓣膜血管用于Ross手术时 放置状态示意图。
图4C为本发明实施例1中将人工生物带瓣膜血管以带瓣膜补片形式用于右心室-肺动脉连接的修复手术时放置状态示意图。
图中：1、带有天然瓣膜的血管；2、医用高分子材料层；3、血流方向指示箭头；4、天然瓣膜；M代表血管流入端；N代表血管流出端。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1 人工生物带瓣膜血管的制备
本实施例提供的人工生物带瓣膜血管的制备方法，该方法包括使用丹宁酸溶液作为交联剂对所述人工生物带瓣膜血管的生物组织进行交联处理的步骤，且在所述丹宁酸交联处理步骤前可包括使用戊二醛溶液对所述生物组织进行固定处理的步骤。
具体步骤如下：
(1)取约13cm长的新鲜牛颈静脉血管(已清除脂肪等杂物，并使用生理盐水或Hank’s液等等渗溶液冲洗干净)，从血管流出端向管腔内注入0.6％戊二醛溶液(由Hepes液配制，pH7.4)，使瓣叶呈闭合状态，管壁保持一定张力，结扎此血管末端；再使用同一溶液注满该血管瓣膜另侧管腔(保持腔内无张力)，结扎此血管末端；最后将充盈满溶液的血管完全浸泡于同一溶液中，4℃下固定48小时，每根血管对应不少于100mL的0.6％戊二醛溶液。
(2)取出步骤(1)所得的血管，松开血管两端结扎线，倒去管腔内液体，采用步骤(1)的方法，向管腔内注入0.3％戊二醛溶液(由 Hepes液配制，pH7.4)，并将血管完全浸泡于同一溶液中，4℃下固定7天以上。
(3)取出步骤(2)所得的血管，倒去管腔内液体，修剪血管两末端使血管长度为10cm，将血管完全浸泡于0.3％丹宁酸溶液(由磷酸盐缓冲液配制，pH4.0-7.0)中，18-25℃下避光保存4天。
将上述方法制得的牛颈静脉记为戊二醛/丹宁酸组，将仅进行戊二醛固定处理步骤的牛颈静脉血管记为戊二醛组，并从以下几个方面对两组样品进行了对比研究：
1.外观
戊二醛组牛颈静脉呈淡黄色，戊二醛/丹宁酸组呈浅褐色，且其管壁较戊二醛组稍硬，两组牛颈静脉瓣膜均柔软，活动能力亦无明显区别。
2.管壁热皱缩温度
如表1所示，戊二醛/丹宁酸组牛颈静脉管壁材料热皱缩温度稍高于戊二醛组，统计学分析显示差别有显著意义(P<0.01)，说明丹宁酸交联处理能进一步增强经戊二醛固定的牛颈静脉血管的热稳定性。
表1 戊二醛组和戊二醛/丹宁酸组牛颈静脉管壁的热皱缩温度
Figure PCTCN2016094016-appb-000001
*P<0.01
3.管壁拉伸强度及断裂伸长率
如表2所示，戊二醛/丹宁酸组牛颈静脉管壁与戊二醛组比较，其抗拉强度、断裂伸长率均有所提高(P<0.05)，说明丹宁酸交联处理能进一步增强经戊二醛固定的牛颈静脉血管的物理强度。
表2 戊二醛组和戊二醛/丹宁酸组牛颈静脉管壁的最大拉伸强度和断裂伸长率
Figure PCTCN2016094016-appb-000002
*P<0.01，#P<0.05
4.抗胶原纤维酶降解试验和弹力纤维酶降解试验
戊二醛组和戊二醛/丹宁酸组的牛颈静脉管壁分别行胶原纤维酶降解和弹力纤维酶降解试验，被酶解组织占组织总重量百分比见表3，提示戊二醛/丹宁酸组牛颈静脉管壁的抗酶解能力高于戊二醛组，统计学分析有显著意义(P<0.01)。
表3 戊二醛组和戊二醛/丹宁酸组牛颈静脉管壁酶降解后被酶解组织占总重量的百分比
Figure PCTCN2016094016-appb-000003
*P<0.01，#P<0.01
5.大鼠皮下埋植实验
经大鼠皮下埋植21天和60天后，戊二醛组牛颈静脉管壁变硬、变脆，部分样品肉眼可见管腔面存在钙化灶(尤其埋植60天后)；而戊二醛/丹宁酸组牛颈静脉管壁柔软，肉眼未见任何钙化灶，颜色变深。
ET+VG染色显示，戊二醛组牛颈静脉管壁经大鼠皮下埋植21天后管壁内弹力纤维崩解断裂，排列紊乱；60天后，此组弹力纤维破坏程度更加明显。相反，在戊二醛/丹宁酸组，牛颈静脉管壁内弹力纤维在21及60天两个时间点均基本保存完好。血管壁组织弹性蛋白定量分析显示戊二醛组弹性蛋白丢失明显。结果表明,戊二醛不能固定牛颈静脉管壁弹力纤维，而丹宁酸能有效地保护弹力纤维，以免除其在体内降解。
Masson染色显示，两组牛颈静脉管壁在大鼠皮下埋植21天后，胶原纤维结构基本保存完整；在第60天，戊二醛组胶原纤维结构紊乱，而戊二醛/丹宁酸组保持不变。结果提示丹宁酸交联处理有助于稳定牛颈静脉管壁胶原纤维结构。
Van Kossa染色结果显示，经大鼠皮下埋植21天及60天后，戊二醛组牛颈静脉管壁钙化明显，且呈时间依赖性，而戊二醛/丹宁酸组管壁在埋植第21天未见钙化灶，第60天只见微量散在钙化点；钙定量 分析结果与Van Kossa染色结果一致，说明丹宁酸交联处理能有效地防止戊二醛固定的牛颈静脉管壁在体钙化。此外，戊二醛组钙化灶与弹力纤维空间位置重叠，提示两者密切相关。
戊二醛组和戊二醛/丹宁酸组的牛颈静脉管壁，分别进行原子吸收光谱法测定组织钙含量，结果见表4，提示戊二醛/丹宁酸组牛颈静脉管壁的抗钙化能力高于戊二醛组，统计学分析有显著意义(P<0.01)。
表4 戊二醛组和戊二醛/丹宁酸组牛颈静脉管壁钙含量
Figure PCTCN2016094016-appb-000004
*P<0.01，#P<0.01
本发明提供一种人工生物带瓣膜血管，包括一段经所述丹宁酸溶液交联处理过的带有天然瓣膜的血管；在所述带有天然瓣膜的血管的瓣膜部位外包覆的医用高分子材料层；以及在所述医用高分子材料层的表面缝制的血流方向指示箭头。
图1为本发明所述人工生物带瓣膜血管的结构示意图。人工生物带瓣膜血管包括一段带有天然瓣膜4的血管，血管1的瓣膜部位外缝合医用高分子材料层2，医用高分子材料层表面缝制有血流方向指示箭头3，箭头尖端指向血管流出端N，另一端为血管流入端M。
带有天然瓣膜的血管具有完整的天然瓣膜结构，由包含一个或多个瓣膜的血管化学改性处理后制备而成。制备时应去除多余组织和瓣膜，仅保留一组结构完整、形态良好、大小均匀的瓣膜及一定长度的血管壁。该瓣膜可以是两瓣叶结构，也可以是三瓣叶结构；该血管可以是动脉血管，也可以是静脉血管。静脉血管可采用牛、马、山羊、绵羊等四足动物的颈静脉血管，一般情况下，以牛颈静脉血管最为常用。具体实施时，带有天然瓣膜的血管的长度和直径可根据患者瓣膜病变部位相应血管的长度和直径而定，通常长度为4-16cm，直径为6-28mm。
医用高分子材料层2可选用医用聚酯编织物，采用缝合或粘合的方式，均匀、平整地包覆在瓣膜4外部，包覆长度通常为1.5-6cm，保证瓣窦正常充盈又不会过度扩张，从而有效地保持瓣膜的形态和功能，使其耐受较高的血压。图2A-2B为本发明人工生物带瓣膜血管的剖视图。在正常血流方向下，瓣膜充分打开，血流顺畅地通过瓣膜(图2A)；在较小的回流压下，瓣膜完全闭合，血液充盈整个瓣窦内腔，升高的血压使瓣窦开始扩张，但医用高分子材料层限制其过度扩张，避免由瓣膜关闭不全引起返流(图2B)。
图3A-3D为本发明人工生物带瓣膜血管所述血流方向指示箭头的具体实施方式示意图。血流方向指示箭头3由医用缝合线缝制而成，外观形态包括开放式线型箭头(图3A，3B)、开放式点状箭头(图3C)和闭合式线型箭头(图3D)。其中点状箭头可采用打结的方式缝制，也可采用缝合线穿梭于医用高分子材料层2的内部及外部来缝制。上述各实施例中，箭头的尖端均指向血管流出端N，直观地标记出瓣膜工作状态时的血流方向，便于术中快速、准确地辨认血管及瓣膜的方向。
图4A-4C为本发明人工生物带瓣膜血管用于手术时放置状态的示意图。在重建右心室-肺动脉连接的手术中，将本发明的流入端M与右心室流出道出口吻合，流出端N与肺动脉干吻合(图4A)。在Ross手术中，将患者自体肺动脉瓣连同部分肺动脉一起植入到主动脉瓣位置后，再将本发明的流入端M、流出端N分别与右心室流出道出口、肺动脉干吻合(图4B)。此外，将本发明纵向裁剪，去除多余瓣叶和血管壁，以带瓣膜补片的形式修复右心室-肺动脉连接，可最大程度地保留患者自身的肺动脉瓣(图4C)。
实施例2 人工生物带瓣膜血管的制备
本实施例提供的人工生物带瓣膜血管的制备方法，该方法包括使用丹宁酸和戊二醛的混合液作为交联剂对所述人工生物带瓣膜血管的生物组织进行交联处理的步骤，且在交联处理步骤前可包括使用戊 二醛溶液对所述生物组织进行固定处理的步骤。
具体步骤如下：
(1)取约13cm长的新鲜牛颈静脉血管(已清除脂肪等杂物，并使用生理盐水或Hank’s液等等渗溶液冲洗干净)，从血管流出端向管腔内注入0.6％戊二醛溶液(由Hepes液配制，pH 7.4)，使瓣叶呈闭合状态，管壁保持一定张力，结扎此血管末端；再使用同一溶液注满该血管瓣膜另侧管腔(保持腔内无张力)，结扎此血管末端；最后将充盈满溶液的血管完全浸泡于同一溶液中，4℃下固定48小时，每根血管对应不少于100mL的0.6％戊二醛溶液。
(2)取出步骤(1)所得的血管，松开血管两端结扎线，倒去管腔内液体，采用步骤(1)的方法，向管腔内注入0.3％戊二醛溶液(由Hepes液配制，pH7.4)，并将血管完全浸泡于同一溶液中，4℃下固定7天以上。
(3)取出步骤(2)所得的血管，倒去管腔内液体，修剪血管两末端使血管长度为10cm，将血管完全浸泡于丹宁酸和戊二醛的混合液中，18-25℃下避光保存4天。
其中，丹宁酸和戊二醛的混合液由赫佩斯液或磷酸盐缓冲液溶解配制而成；丹宁酸浓度为0.3％，戊二醛浓度为0.3％，pH值为4.0-7.0。所用赫佩斯液的浓度为30-80mM，pH值为5.0-8.0。
实施例3 人工生物带瓣膜血管的制备
本实施例提供的人工生物带瓣膜血管的制备方法，该方法包括使用丹宁酸和戊二醛的混合液作为交联剂对所述人工生物带瓣膜血管的生物组织进行交联处理，在交联处理前不使用戊二醛溶液对所述生物组织进行预处理。
具体步骤如下：
取约13cm长的新鲜牛颈静脉血管(已清除脂肪等杂物，并使用生理盐水或Hank’s液等等渗溶液冲洗干净)，从血管流出端向管腔内 注入丹宁酸和戊二醛的混合液，使瓣叶呈闭合状态，管壁保持一定张力，结扎此血管末端；再使用相同溶液注满该血管瓣膜另侧管腔(保持腔内无张力)，结扎此血管末端；最后将充盈满溶液的血管完全浸泡于相同溶液中，18-25℃下避光保存4天。
其中，丹宁酸和戊二醛的混合液由赫佩斯液或磷酸盐缓冲液溶解配制而成；丹宁酸浓度为0.3％，戊二醛浓度为0.3％，pH值为4.0-7.0。所用赫佩斯液的浓度为30-80mM，pH值为5.0-8.0。
将实施例2-3中制备的人工生物带瓣膜血管样品与仅做戊二醛固定处理的牛颈静脉血管进行了以下几个方面的对比研究：
1.外观
两组实施例样品均呈浅褐色，管壁较戊二醛组稍硬，瓣膜柔软，活动能力与戊二醛组无明显区别。
2.管壁热皱缩温度
如表5所示，两组实施例样品的牛颈静脉管壁材料热皱缩温度相近，无统计学差异，且均稍高于戊二醛组，统计学分析显示差别有显著意义(P<0.01)，说明丹宁酸交联处理能进一步增强经戊二醛固定的牛颈静脉血管的热稳定性。
表5 牛颈静脉管壁的热皱缩温度
Figure PCTCN2016094016-appb-000005
*P<0.01，#P<0.01
3.管壁拉伸断裂力
如表6所示，实施例2样品的牛颈静脉管壁与戊二醛组相比，其周向和轴向的抗拉断裂力均有所提高(P<0.05)，说明丹宁酸交联处理能进一步增强经戊二醛固定的牛颈静脉血管的物理强度。实施例3样品的牛颈静脉管壁与戊二醛组比较，其周向和轴向的抗拉断裂力虽略有提高，但不具有统计学意义。实施例2和3之间所表现出的性能差异， 提示丹宁酸交联处理前使用戊二醛溶液对牛颈静脉血管进行预处理能增强管壁的物理强度。
表6 牛颈静脉管壁的周向和轴向拉伸断裂力
Figure PCTCN2016094016-appb-000006
#P<0.05
4.抗胶原纤维酶降解试验和弹力纤维酶降解试验
对两组实施例样品和戊二醛组的牛颈静脉管壁分别行胶原纤维酶降解和弹力纤维酶降解试验，被酶解组织占组织总重的百分比见表7，提示实施例样品牛颈静脉管壁的抗酶解能力高于戊二醛组，统计学分析有显著意义(P<0.01)。
表7 牛颈静脉管壁酶降解后被酶解组织占总重的百分比
Figure PCTCN2016094016-appb-000007
*P<0.01，#P<0.01
5.大鼠皮下埋植实验
经大鼠皮下埋植21天和60天后，戊二醛组牛颈静脉管壁变硬、变脆，部分样品肉眼可见管腔面存在钙化灶(尤其在埋植60天后)；而两组实施例样品牛颈静脉管壁柔软，肉眼未见任何钙化灶，颜色变深。
ET+VG染色显示，戊二醛组牛颈静脉管壁经大鼠皮下埋植21天后管壁内弹力纤维崩解断裂，排列紊乱；60天后，该组弹力纤维破坏程度更加明显。相反，两组实施例样品的牛颈静脉管壁内弹力纤维在21及60天两个时间点均基本保存完好。血管壁组织弹性蛋白定量分析显示戊二醛组弹性蛋白丢失明显。结果表明，戊二醛不能固定牛颈静脉管壁弹力纤维，而丹宁酸能有效地保护弹力纤维，以免除其在体内降解。
Masson染色显示，戊二醛组牛颈静脉管壁在大鼠皮下埋植60天 后，胶原纤维结构紊乱，而实施例样品牛颈静脉管壁的胶原纤维结构在21及60天两个时间点均基本保存完整，结果提示丹宁酸交联处理有助于稳定牛颈静脉管壁胶原纤维结构。
Van Kossa染色结果显示，经大鼠皮下埋植21天及60天后，戊二醛组牛颈静脉管壁钙化明显，且呈时间依赖性，而实施例样品管壁在埋植第21天未见钙化灶，第60天只见微量散在钙化点；钙定量分析结果与Van Kossa染色结果一致，说明丹宁酸交联处理能有效地防止戊二醛固定的牛颈静脉管壁在体钙化。此外，戊二醛组钙化灶与弹力纤维空间位置重叠，提示两者密切相关。
戊二醛组和两组实施例样品的牛颈静脉管壁，分别行原子吸收光谱法测定组织钙含量，结果见表8，提示实施例样品管壁的抗钙化能力高于戊二醛组，统计学分析有显著意义(P<0.01)。
表8 牛颈静脉管壁钙含量
Figure PCTCN2016094016-appb-000008
*P<0.01，#P<0.01
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
工业实用性
本发明涉及一种人工生物带瓣膜血管及其制备方法，该血管生物相容性和抗钙化性能良好、结构设计合理、抗张能力较强，适用于重建和修复右心室－肺动脉连接的人工生物带瓣管道。本发明采用丹宁酸交联处理技术，能防止弹性纤维降解，显著地抑制钙化发生，并能进一步提高交联后组织材料的力学性能。

Claims (10)

  1. 一种人工生物带瓣膜血管的制备方法，其特征在于，以丹宁酸溶液作为交联剂对带有天然瓣膜的血管进行交联处理后得到。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述带有天然瓣膜的血管浸泡丹宁酸溶液中，于18-40℃，0-200rpm转速条件下交联24-96小时。
  3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述丹宁酸溶液由赫佩斯液或磷酸盐缓冲液配制而成，浓度为0.1-0.6％，pH值为4.0-7.0；优选地，所述赫佩斯液的浓度为30-80mM，pH值为5.0-8.0。
  4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述丹宁酸溶液为丹宁酸和戊二醛的混合液，由赫佩斯液或磷酸盐缓冲液溶解配制而成；其中，丹宁酸浓度为0.1-0.6％，戊二醛浓度为0.2-1.0％，pH值为4.0-7.0；优选地，所述赫佩斯液的浓度为30-80mM，pH值为5.0-8.0。
  5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，交联处理前，还包括预先用戊二醛溶液对所述带有天然瓣膜的血管进行固定处理的步骤；优选地，所述戊二醛溶液由赫佩斯液配制而成；更优选地，所述赫佩斯液的浓度为30-50mM，pH值为5.0-7.4。
  6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固定处理的步骤具体如下：
    S1、用浓度为0.5-1.0％、pH值为5.0-8.0的戊二醛溶液浸泡所述带有天然瓣膜的血管，浸泡温度为4-25℃，浸泡时间为2天；
    S2、将S1所得血管再使用浓度为0.2-0.5％、pH值为5.0-8.0的戊二醛溶液浸泡，浸泡温度为4-25℃，浸泡时间为7天以上。
  7. 根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，还包括在交联处理后的血管外包覆的医用高分子材料层的步骤；优选地，在所述医用高分子材料层的表面缝制血流方向指示箭头；更优选地，所 述医用高分子材料层为医用聚酯编织物，所述血流方向指示箭头由医用缝合线缝制而成。
  8. 根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述带有天然瓣膜的血管来源于四足动物的动脉血管或静脉血管，其中包括一个或多个瓣膜；优选地，所述静脉血管为牛颈静脉，所述静脉血管具有完整的天然瓣膜结构，其中包括两瓣叶结构或三瓣叶结构。
  9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述带有天然瓣膜的血管长度为4-16cm，直径为6-28mm，所述医用高分子材料层包覆所述带有天然瓣膜的血管的长度为1.5-6cm；优选地，所述医用高分子材料层采用医用缝合线缝合或生物粘合剂粘结的方式包覆在所述带有天然瓣膜的血管的瓣膜部位外侧。
  10. 由权利要求1-9任一项所述方法制备的人工生物带瓣膜血管。
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