CN102671242B

CN102671242B - 一种脱细胞心包材料的制备方法

Info

Publication number: CN102671242B
Application number: CN201210165409.XA
Authority: CN
Inventors: 莫秀梅; 董教明; 李�雨
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: CN102671242A

Abstract

本发明涉及一种脱细胞心包材料的制备方法，包括：（1）取健康成年动物的心脏，割取心包膜，然后反复冲洗所得心包膜，在无菌条件下剥离外周脂肪，取无损伤、厚度均匀的前壁部分修剪为片状，充分漂洗后得到处理后的包心组织；（2）将上述处理后的心包组织加入到含有烷基糖苷APG的溶液中，然后通过低渗处理或高渗处理，再经过核酶处理，最后清洗即可。本发明的制备方法简单，原料来源广泛，成本低，便于批量生产，所用的表面活性剂烷基糖苷无毒无害，且能彻底脱除存在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片；本发明得到的脱细胞基质的免疫原性大幅降低且细胞毒性低，生物相容性好，具有较好的力学性能和生物学特性，是一种良好的组织工程支架材料。

Description

一种脱细胞心包材料的制备方法

技术领域

本发明属于心包材料的制备领域，特别涉及一种脱细胞心包材料的制备方法。

背景技术

组织工程研究是制造人体器官和组织的科学，由于其广阔的应用前景和逐年以几何级数递增的产业效益，各国政府和产业界都投入巨资进行研究和产业建设。世界每年的研究经费都在几十亿美元以上。组织工程研究包括两个主要方面：一方面是用来构建成器官和组织形态的支架；另一方面是种植在支架上可以生长并发挥生理作用的细胞。而对于组织工程支架，它必须具备两个特点：（1）对细胞具有良好的亲和性；（2）对人体无毒害、无免疫反应，可在人体内降解。

细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）是各种组织器官的主要组成成分，构成了各种组织器官的三维空间结构和营养物质的储存，其三维结构与体内细胞生长的天然环境接近，不仅可以起着支架材料的作用，而且包含的多种生长因子在组织修复和重建中有重要促进作用，即使经过脱细胞处理仍有活性，是细胞生长的理想环境，这是其他人工聚合物（如胶原、壳聚糖、聚乳酸和聚羟基乙酸等）所不能比拟的。心包是包裹心和出入心大血管根部的纤维浆囊膜，可分为纤维层、浆膜层和外结缔组织层，主要由细胞和ECM组成，其中的细胞成分作为抗原被宿主识别后会引发炎症或免疫排斥反应，需要通过脱细胞处理来去除抗原物质，ECM由Ⅰ、Ⅲ型纤维胶原蛋白构成，含有少量的弹性纤维、氨基聚糖和糖蛋白等，其组分在不同物种间通常是受保护的而且耐受性良好，是一种理想的组织工程生物支架材料。

目前脱细胞处理方法主要包括物理法、化学法和酶处理法。物理的处理方法有很多，主要是通过物理的作用如冻融、液体高压、超声波和电击等脱除细胞，但物理方法对ECM的破坏作用较大。化学方法就是使用一些特定的化学试剂如酸、碱和去污剂等破碎细胞达到去除细胞的目的，但化学试剂的残留会对机体产生毒害作用。酶处理方法主要是指用酶试剂来裂解细胞，例如脱细胞方法中通常会用到胰蛋白酶，但胰蛋白酶对ECM有降解的作用。且这些脱细胞方法过程繁琐，处理时间长，不利于批量生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种脱细胞心包材料的制备方法，该方法简单，成本低，彻底脱除存在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片，制备出具有较好的力学性能和生物学特性的生物支架材料。

本发明的一种脱细胞心包材料的制备方法，包括：

（1）前置处理：取健康成年动物的心脏，割取心包膜，热缺血时间小于1小时；然后在0-37℃下用无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液反复冲洗所得心包膜，以去除血凝块后，在无菌条件下剥离外周脂肪，取无损伤、厚度均匀的前壁部分修剪为片状，用无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液充分漂洗，得到处理后的包心组织；

（2）脱细胞处理及清洗：将上述处理后的包心组织加入到含有烷基糖苷APG的溶液中，然后通过低渗处理或高渗处理，破坏细胞膜结构和抽提细胞膜的脂质和膜蛋白；再经过核酶处理，以降解细胞中各类DNA和/或RNA成分，最后清洗即可。

步骤（1）中所述的成年动物为猪或牛。

步骤（1）所述的片状的尺寸为6cm×8cm。

步骤（1）得到的处理后的包心组织于4℃下保存在含双抗溶液的无菌的生理盐水中。

上述的双抗溶液为100倍工作浓度的青霉素和硫酸链霉素溶液（配制的双抗溶液为100倍的浓缩液，实际工作浓度为稀释100倍后的浓度，青霉素的工作浓度范围为50-5000U/ml，硫酸链霉素的工作浓度范围为1-100mg/ml）。

步骤（2）中所述的含有烷基糖苷APG的溶液中APG的体积浓度小于50%。

上述的烷基糖苷（也称为烷基葡萄糖苷、烷基多糖甘）通常为50%含量的水溶液，有0810、0814、1214、0816、1216、1618等型号，可以是烷基糖苷系列中的任一种或一种以上。

步骤（2）中所述的低渗处理为采用浓度为0.01M且pH值为6.8-8.6的无菌的Tris-HCI缓冲液，在1℃-25℃中振荡处理1-96小时，振荡速率为80-360rpm。

步骤（2）中所述的高渗处理为采用浓度为0.05M且pH值为6.8-8.6的无菌的Tris-HCI缓冲液，在1℃-25℃中振荡处理1-96小时，振荡速率为80-360rpm。

步骤（2）中所述的核酶处理为在37℃下，在含有100-10000u/ml的脱氧核糖核酸酶（DNase）、100-10000u/ml核糖核酸酶（RNase）、0.15M NaCl、1-5mM MgCl₂的无菌的0.05M Tris-HCl缓冲液（pH 6.8-8.6）中，于60-360rpm转速下振荡处理6-72小时；其中所述的双抗为青霉素和硫酸链霉素。

步骤（2）中所述的清洗是指用无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液在1℃-25℃条件下对所得脱细胞基质进行清洗，清洗时间为6-48小时。

上述的无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液中含有抗生素。

经过一下多项实验证实，本发明得到的脱细胞心包材料效果好，达到了发明的目的：

1.残留细胞：脱细胞猪心包经常规苏木素一伊红染色，证实无细胞结构存在。（图2）

2.基质纤维结构：脱细胞猪心包经Weigert染色，可观察到经本发明的脱细胞方法处理后，猪心包组织中的胶原纤维排列整齐，无明显断裂，仍呈波浪状平行排列，结构紧凑，弹性纤维结构清晰。（图4）

3.脱细胞基质DNA含量的测定：经DNA检测试剂盒测得未脱细胞的猪心包DNA含量是607.34±47.26ng/mg干重组织，经过本发明的脱细胞处理后的DNA含量为8.24±1.31ng/mg干重组织，统计学分析有显著差异，证实本发明的脱细胞方法能显著降低组织核酸含量，进一步说明该方法能完全去除细胞。

4.脱细胞基质含水量的测定：新鲜猪心包组织的含水量是77.75±0.57%，经脱细胞处理后的猪心包组织的含水量是83.98±1.64%，统计学处理无显著差异。

5.胶原蛋白含量测定：由测得羟脯氨酸换算得未脱细胞的猪心包组织的胶原蛋白含量是48.34±1.01%，经脱细胞处理的猪心包组织的胶原蛋白含量是47.6±0.67%，统计学处理无显著差异。

6.弹性蛋白含量测定：由猪a-弹性蛋白试剂盒测定的未脱细胞的猪心包组织的弹性蛋白含量是0.233±0.0128μg/g，经脱细胞处理的猪心包组织的弹性蛋白含量是0.129±0.0132μg/g，统计学处理无显著差异。

7.力学性能检测：（1）拉伸强度的测定：在万能材料试验机上测得基质材料的拉伸强度，新鲜猪心包的最大拉伸强度为19.92±1.94MPa，经脱细胞处理的猪心包的最大拉伸强度为15.9±0.81MPa，统计学处理无显著差异。（2）断裂伸长率的测定：在万能材料试验机上测得基质材料的断裂伸长率，新鲜猪心包的断裂伸长率为65.54±3.96%，经脱细胞处理的猪心包的断裂伸长率为76.48±1.23%，统计学处理有显著差异。（3）弹性模量的测定：在万能材料试验机上测得基质材料的弹性模量，新鲜猪心包的弹性模量为77.17±4.77MPa，经脱细胞处理的猪心包的弹性模量为73.56±3.8MPa，统计学处理无显著差异。由此证实本发明的脱细胞方法对基质的力学性能影响较小，能够保持支架材料的机械性能。

8.体外细胞毒性检测：根据浸提液和MTT的方法测得未脱细胞的猪心包组织的相对增值率是97.23±4.5%，细胞毒性级别为1级，经培养后加入染料在倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状况，如图5所示，细胞生长良好，无细胞毒性；经脱细胞处理的猪心包组织的相对增值率是97.03±3.45%，细胞毒性级别为1级，统计学处理无显著差异，经培养后加入染料在倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状况，如图6所示，细胞生长良好，无细胞毒性。由此可证实经本发明的脱细胞方法对支架材料无明显毒性。

本发明选用烷基糖苷对所用组织器官进行脱细胞处理，其优点在于，烷基糖苷是由可再生资源天然脂肪醇和葡萄糖合成的，是一种性能较全面的新型非离子表面活性剂，且易于生物降解不会造成对环境的污染，具有无毒易降解的特点，对人体无害。性能温和，对细胞外基质的超微结构和功能蛋白几乎没有损伤。为进一步增强烷基糖苷脱细胞效果，可以联合物理方法共同处理待用的组织器官。本发明中主要采用物理法中的低渗和高渗溶液浸泡，振荡和调节温度的方式，增加烷基糖苷的脱细胞效果。

本发明首先对异种生物组织进行前置处理，然后通过含有烷基糖苷的低渗和高渗的进行脱细胞，再以核酸酶降解细胞中的核酸，最后用等渗溶液清洗。

本发明使用的烷基糖苷（alkyl polyglucoside，APG）是一种新型无毒无刺激可生物降解且降解产物无毒的试剂，脱细胞方法简单，成本低，克服传统上化学毒性试剂残留等问题，在生物支架材料的制备中有重要的应用意义。

有益效果：

（1）本发明的制备方法简单，原料来源广泛，成本低，便于批量生产，所用的表面活性剂烷基糖苷无毒无害，且能彻底脱除存在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片；

（2）本发明得到的脱细胞基质的免疫原性大幅降低且细胞毒性低，生物相容性好，具有较好的力学性能和生物学特性，是一种良好的组织工程支架材料。

附图说明

图1为含有细胞的新鲜猪心包组织的显微镜照片（HEx200）；

图2为经脱细胞处理后的猪心包组织的显微镜照片（HEx200）；

图3为新鲜猪心包组织的显微镜照片（Weigert x400）；

图4为经脱细胞处理后的猪心包组织的显微镜照片（Weigert x400）；

图5为新鲜猪心包组织的细胞毒性实验倒置显微镜照片（200x）；

图6为经脱细胞处理后的猪心包组织的细胞毒性实验倒置显微镜照片（200x）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法：

（1）前置处理：猪心包取自当地屠宰厂，健康成年猪宰杀后取出心脏，割取心包膜,热缺血时间小于1小时。磷酸缓冲液(PBS)（pH值为7.3）反复冲洗去除血凝块后置于保存液中，带回实验室，无菌条件下剔除外周脂肪，取无损伤、厚度均匀的前壁部分修剪为6cm×8cm的片状，PBS溶液（pH值为7.3）充分漂洗，4℃保存含抗生素的无菌的PBS溶液中。

（2）猪心包的脱细胞处理：将4片6cm×8cm的心包分别放入4瓶1%烷基糖苷（APG0810）的含双抗的0.01M Tris-HCl缓冲溶液中进行振荡消化24h，4℃，150rpm/min。之后在无菌的PBS（pH7.30）进行清洗，清洗完后依次将心包放在核酸消化溶液中37℃振荡消化24h。核酸消化溶液为：2.0KU/ml DNase Ⅰ、7.0KU/ml RNase、0.15M NaCl、5mMMgCl₂·6H₂O和1%双抗的无菌的0.05M Tris-HCl缓冲液（pH7.60）。

（3）清洗：在无菌的含双抗的PBS缓冲液（pH7.30）进行振荡清洗24h，转速为150rpm，清洗完后依次将心包在4℃保存含双抗的无菌的PBS溶液中。

实施例2

按上述前处理猪心包组织后，将4片6cm×8cm的心包分别放入4瓶2%烷基糖苷（APG0810）的含双抗的0.01M Tris-HCl缓冲溶液中进行振荡消化16h，4℃，150rpm/min。之后在无菌的PBS（pH7.30）进行清洗，清洗完后依次将心包放在核酸消化溶液中37℃振荡消化24h。核酸消化溶液为：2.0KU/ml DNase Ⅰ、7.0KU/ml RNase、0.15M NaCl、5mMMgCl₂·6H₂O和1%双抗的无菌的0.05M Tris-HCl缓冲液（pH7.60）。在无菌的含双抗的PBS缓冲液（pH7.30）进行振荡清洗24h，转速为150rpm，清洗完后依次将心包在4℃保存含双抗的无菌的PBS溶液中。

实施例3

按实施例1方法制取猪心包组织后，将4片6cm×8cm的心包分别放入4瓶1%（v/v）烷基糖苷（APG1214）的含双抗的0.01M Tris-HCl缓冲溶液中进行振荡消化24h，4℃，150rpm/min，之后在无菌的PBS（pH7.30）进行清洗，清洗完后依次将心包放在核酸消化溶液中37℃振荡消化24h。核酸消化溶液为：2.5KU/ml DNase Ⅰ、7.5KU/ml RNase、0.15MNaCl、2mM MgCl₂·6H₂O和1%双抗的无菌的0.02M Tris-HCl缓冲液（pH7.60）。在无菌的含双抗的PBS缓冲液（pH7.30）进行振荡清洗24h，转速为150rpm，清洗完后依次将心包在4℃保存含双抗的无菌的PBS溶液中。

Claims

1.一种脱细胞心包材料的制备方法，包括：

（1）取宰杀后的健康成年猪的心脏，割取心包膜，热缺血时间小于1小时；然后在0-37℃下用无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液反复冲洗所得心包膜，在无菌条件下剥离外周脂肪，取无损伤、厚度均匀的前壁部分修剪为片状，用无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液充分漂洗，得到处理后的心包组织；

（2）将上述处理后的心包组织加入到含有烷基糖苷APG的溶液中通过低渗处理或高渗处理，再经过核酶处理，最后清洗即可；

步骤（2）中所述的低渗处理为采用含有烷基糖苷APG的浓度为0.01M且pH值为6.8-8.6的无菌的Tris-HCI缓冲液，在1℃-25℃中振荡处理1-96小时，振荡速率为80-360rpm；所述的高渗处理为采用含有烷基糖苷APG的浓度为0.05M且pH值为6.8-8.6的无菌的Tris-HCI缓冲液，在1℃-25℃中振荡处理1-96小时，振荡速率为80-360rpm。

2.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的片状的尺寸为6 cm×8 cm。

3.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于：步骤（1）得到的处理后的心包组织于4℃下保存在含双抗溶液的无菌的生理盐水中。

4.根据权利要求3所述的一种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于：所述的双抗溶液为100倍工作浓度的青霉素和硫酸链霉素溶液，其中青霉素的工作浓度范围为50-5000U/ml，硫酸链霉素的工作浓度范围为1-100mg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的含有烷基糖苷APG的溶液中APG的体积浓度小于50%；所述的烷基糖苷为0810、0814、1214、0816、1216、1618中的一种或几种。

6.根据权利要求3所述的一种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的核酶处理为在37℃下，在含有100-10000u/ml的脱氧核糖核酸酶、100-10000u/ml核糖核酸酶、0.15M NaCl、1-5 mM MgCl₂的无菌的pH值 6.8-8.6为0.05M Tris-HCl缓冲液中，于60-360rpm转速下振荡处理6-72小时；其中所述的双抗为青霉素和硫酸链霉素。

7.根据权利要求1所述的一种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的清洗是指用无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液在1℃-25℃条件下进行清洗，清洗时间为6-48小时。

8.根据权利要求7所述的一种脱细胞心包材料的制备方法，其特征在于：所述的无菌的生理盐水或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液中含有抗生素。