JP2001503299A

JP2001503299A - ジェニピンによる生物医学的材料の化学改変

Info

Publication number: JP2001503299A
Application number: JP52172698A
Authority: JP
Inventors: リン，チン―クァン; チャウ―ジェンリー，トーマス; スン，シン―ウェン
Original assignee: チャレンジバイオプロダクツカンパニー，リミテッド
Priority date: 1996-11-05
Filing date: 1997-11-04
Publication date: 2001-03-13
Also published as: WO1998019718A1; CN1113672C; EP0941130A1; CA2270599A1; DE69720243T2; EP0941130B1; US6608040B1; CN1236324A; DE69720243D1; CA2270599C

Abstract

(57)【要約】インプラント、創傷用包帯、および代用血液での使用に適切な、生体適合性架橋材料が記載される。この材料は、例えばコラーゲン、キトサン、またはヘモグロビンのような生物学的材料と、天然に存在する架橋剤のジェニピンとを架橋させることによって調製される。該架橋剤は、従来用いられてきた試薬よりも非常に毒性が低く、ならびに架橋された生成物は、熱安定性、および力学的安定性、および生体適合生が良好である。

Description

【発明の詳細な説明】ジェニピンによる生物医学的材料の化学改変発明の分野本発明は、天然に存在する架橋試薬であるジェニピン（genipin）を用いたコラーゲン、キトサン、およびヘモグロビンのような生物医学的材料の化学的改変、ならびにジェニピンにより架橋されるかまたは重合される生物学的インプラント、接着物、創傷用の包帯、ならびに代用血液において有用である生体適合性材料に関する。参考文献発明の背景生物学的分子の架橋は、しばしば、生物医学的応用において最適な効果に対して所望される。例えば、生物学的組織の構造の枠組みを構成するコラーゲンは、生体的人工器官または血管インプラントのような別の移植された構造物を製造するために広く用いられている。ここで、それは細胞の浸潤および増殖に対して良好な媒体を提供する。コラーゲンシートはまた、水蒸気の高い透過性および迅速な治療の進展を提供する、創傷用の包帯としても用いられている。非架橋コラーゲンの欠点は、低い引っ張り強度およびコラゲナーゼによる容易な分解を含む。コラーゲン性組織の固定化すなわち架橋は、機械的強度を増加させ、コラゲナーゼによる切断を減少し、そして、抗原性と免疫性を減少する。脱アセチル化したキチンであるキトサンは遊離したアミノ基を含有し、これはまた、例えば、グルタルアルデヒドによっては架橋され得(Jameela)、そして移植した薬物送達デバイス、代用皮膚、創傷用の包帯、そして他の医用生体材料の使用において使用されてきているかまたは使用が提唱されてきている。それは、他の移植材料をコーティングする場合、石灰化の減少の有利な特徴を示す(Chand a)。種々の架橋試薬は、アミンを含有する生物医学的な材料の化学改変に使用されている。最も一般的なのは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン、グリコアルデヒド、シアンアミド、ジイミド、ならびにジイオシアネートのような合成化学材料である。これらの内、タンパク質と速やかに反応するグルタルアルデヒドが、最も一般的に使用されている。架橋したコラーゲンに関して遭遇する問題は、移植される場合の石灰化の傾向、ならびにインプラント周辺の硬直、最終的分解、および周囲組織への吸収をもたらすならびに架橋試薬との毒性反応をもたらすことを包含する。グルタルアルデヒドは、職業性皮膚炎を生じるアレルゲン特性を有することが知られており、そして、10〜25ppmを超える濃度で、および組織培養物では3ppmほどの低い濃度で毒性である。架橋した生物学的材料の別の有用な適用は、代用血液においてである。代用血液の１つである無細胞ヘモグロビンは、無抗原輸血に対して有効であるが、血液循環の間に四量体から二量体へ容易に変換する。高い酸素親和性および短い半減期は、この材料のさらなる限界である。これらの難解性、架橋試薬(例えば、Cha ng，Keipertを参照のこと)を用いるヘモグロビンの化学改変によって克服され得る。循環におけるヘモグロビンの半減期の増加およびその酸素親和性の減少は、分子内および分子外の両方の架橋によって達成され得る。しかし、グルタルアルデヒドを用いる架橋は、ヘモグロビン重合化の間、二量体形成を誘導することが見い出されている。従って、低毒性、形態安定性、生体適合架橋産物であり、そして移植の際に安定性を保持する、生物医学適用に適した架橋材を提供することが好ましい。発明の要旨１つの局面において、本発明は生体適合性インプラントまたは創傷用の包帯を提供する。インプラントまたは包帯は、キトサンまたはこの生体分子はジェニピンと架橋する結合性組織タンパク質から選択された生体適合性架橋アミンを含有する生体分子を含む材料からなる。ここで生体分子が結合性組織タンパク質である場合には、このタンパク質は好ましくはコラーゲンである。また提供される、このゼラチンはジェニピンと架橋するコラーゲン性供給源生物適合性架橋ゼラチンを含む生物適合性接着物もまた提供される。別の局面では、本発明は生体適合性の生体インプラントまたは創傷用包帯の製造方法を提供する。この方法は、キトサンまたは結合組織タンパク質から選択されるアミン含有生体分子を含む材料を、インプラントまたは包帯に適した構造で製造する工程、ならびにこの材料をジェピニン架橋する工程を包含する。その材料が結合組織性タンパク質を含む場合、そのタンパク質は好ましくはコラーゲンである。他の局面では、本発明は、ジェニピンで架橋したヘモグロビンを含む代用血液における使用に適した組成物、ならびにヘモグロビンを架橋するのに効果的な量のジェニピンでヘモグロビンを処理することにより、この組成物を処理する方法を提供する。好ましくは、架橋したヘモグロビンは、１を超えかつ約９未満の平均重合度を有する。図の簡単な説明図1A-Hは、それぞれコラーゲナーゼ分解の前および後に非架橋、または新鮮な組織(1A-B)、ならびにグルタルアルデヒド(GA)(1C-D)、エポキシ(EX-810)(1E-F) 、およびジェニピン(IG-H)と架橋した組織の顕微鏡写真(×200)から得た、コンピュータ生成画像である。図２および３は、それぞれ、コラゲナーゼ分解またはプロナーゼ分解の前および後で得られた図１の試験サンプルの変性温度を示す；図４は、コラゲナーゼ分解の前および後の新鮮な、グルタアルデヒド固定の、エポキシ固定の、およびジェニピン固定の組織の引っ張り強度を示す；図５は、成長期ラットモデルにおいて皮下移植前(t=0)および後(t=1週間;t=4 週間)の、新鮮な、グルタアルデヒド固定の(GA)、エポキシ固定の(EX-810)、およびジェニピン固定の心膜組織の変性温度を示す。図６は移植前および後の図５からのサンプルの引っ張り強度を示す；図７は移植の前および後の図５からのサンプルのカルシウム含量を示す。図8A-8Dは、(A)コントロール培地ならびに(B)1ppmのグルタルアルデヒド、(C) 5ppmのエポキシ化合物、および(D)1,000ppmのジェニピンを補充した培地中で培養した細胞の顕微鏡写真(倍率×100)から得られたコンピュータ生成画像である。図9A-9Hは、(A)新鮮な組織、(B)グルタアルデヒド固定の組織、(C)エポキシ固定の組織、および(D)ジェニピン固定の組織（これらはすべて移植前の）写真によるスキャンから得られたコンピュータ生成画像であり、また(E)移植後１週間で取り出した新鮮な組織、ならびに移植の12週間後に取り出した(F)グルタアルデヒド固定の組織、(G)エポキシ固定の組織、および(H)ジェニピン固定の組織の電子顕微鏡写真(倍率×1,500)によるスキャンから得られたコンピュータ生成画像である。図10A-Cは、移植の12週間後に取り出された、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した、(A)グルタアルデヒド固定の組織、(B)エポキシ固定の組織、および (C)ジェニピン固定の組織の顕微鏡写真(倍率×200)から得られたコンピュータ生成画像である；そして、図11は重合化したヘモグロビンおよび非重合化ヘモグロビンのHPLCから得られたクロマトグラフィー上の痕跡である。発明の詳細な説明Ｉ．定義以下の用語は、他で示される場合を除いては、次の意味を有する。「ジェニピン」は構造式Ｉで示されるような天然に存在する化合物ならびにその立体異性体およびそれらの混合物をいう。「コラーゲン性材料」または「コラーゲン性供給源」とは、哺乳動物結合組織のサンプルのような、主にコラーゲンを含有する材料をいう。そして、これは生体的人工器官、インプラント、移植片、または創傷用の包帯の製造に適する。「生物学的移植」は、長期放出薬物送達デバイス、血管性移植片もしくは皮膚移植片または義肢のような身体組織へ挿入され（すなわち、移植され）て、一定の期間のあいだ留まる生物医学的デバイスを表す。「架橋ヘモグロビン」とは、架橋が四量体分子において、分子内架橋ヘモグロビンおよび／または個々の側鎖間に存在する四量体分子がお互いに架橋する場合、分子内架橋したヘモグロビンまたはポリヘモグロビンを含有するヘモグロビンをいう。「重合度」とは、架橋したヘモグロビンにおいて互いに連結したヘモグロビンの分子数をいう。例えば、命名Hb₂は、分子間架橋により結合した２つのヘモグロビン単位を示し、それらはまた、分子内架橋され得る。ＩＩ．ジェニピンの調製および特性以下の構造Ｉに示されるように、ジェニピンは果実(Gardenia jasmindides El lis)に存在するイリドイドグリコシドである。これは、親化合物ジェニポシド、 (構造II)、から得られ、例えば、Oka、OkadaまたはKometaniに記載される天然供給源から単離され得る。ジェニポシドのアグリコンであるジェニピンは、酸化反応続いて還元と加水分解（Tanaka）または酵素加水分解（Fujikawa）の酸化反応によってジェニポシドから調製され得る。あるいは、ラセミ体のジェニピンは、構造Ｉは、ジェニピンの天然の立体配置を示すが、ジェニピンの任意の立体異性体または立体異性体の混合物が、本発明に従って架橋試薬として使用され得る。ジェニピンは、マウスにおいてLD₅₀i.v．382mg/kの低い急性毒性を有する。それゆえに、それはグルタルアルデヒドおよび多くの他の通常使用される合成架橋試薬よりもはるかに低い毒性である。以下に記載されるように、ジェニピンは人工器官および他のインプラント、創傷用の包帯および代用血液のようなインビボ生物医学的適用が意図される生物学的材料の処理のために効果的な架橋試薬であることが示される。 III．ジェニピンと生物学的構造化合物との架橋架橋されている生物学的化合物は、好ましくはコラーゲンまたはエラスチン、あるいは例えばコラーゲン、またはコラーゲン性組織の加水分解によって生じるゼラチンのようなタンパク質から得られる材料のような結合性組織タンパク質を含有する。また、キトサンのような他のアミン含有構造の化合物は、生物適合性架橋材料を生じるジェニピンで処理され得る。生物人工器官、皮膚移植片および血管性移植片、ならびに創傷用包帯の包帯のような医療デバイスへの、架橋を有するかまたは有さない（特にコラーゲン）ような材料の製造は、当該分野で十分に確立されている。例えば、「Prosthetic an d Biomedical Devices」、Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Science & Te chnology、John Wiley & Sons，1995、ならびにHilbert，Khor，Li，Oliver，Sa belman、およびStenzelのようなさらなる参考文献を参照のこと。このような適用におけるキトサンの使用に対する参考文献については例えば、Chandy（1990,1 995）Jameela、およびOlsenのを参照のこと。ジェニピン架橋したコラーゲン性組織はまた、血流の遮断および血液凝固の支持のための生体適合性の表面を提供することにより、ホメオスタシス状態で使用し得る。生体適合性の接着物は、ゼラチンを架橋することにより処理され得る。このようなゼラチンは、所望の接着性ならびに一貫性を提供するために効果的なジェニピン量をもつ、コラーゲンの加水分解またはコラーゲンを含有する組織の加水分解的処理から誘導し得る。実施例１に記載されるように、架橋しているコラーゲン性組織に対して、効果的なジェニピン量は、組織の6×6cmシートに対して5%溶液の約200mlであることが見出された。おおよその試薬は、所望の架橋密度に依存して使用され得た。同様に、ゼラチンまたはキトサンの架橋について、日常的な実験が、最終生成物において所望される特徴に適する試薬量の決定に使用され得る。以下において実施されるように、ジェニピン固定したコラーゲン性組織は、コラゲナーゼまたはプロナーゼでの分解に対して非常に耐性であり、そして、それらの生体適合性は、皮下の移植実験において実証される。以下の節は、ジェニピンと架橋したコラーゲン性組織サンプルへの酵素耐性、他の一般に使用される試薬で架橋したサンプルと比較して、機械的特性の保持、および低毒性を含む特性を記載する。Ａ．分解酵素に対する安定性種々の架橋試薬で処理されたコラーゲン性繊維の安定性を決定するために、組織サンプルは、以下の実施例１に記載されるように、コラゲナーゼまたはプロナーゼでの分解に供され、そして試薬で処理された。図1A-Hは、それぞれ、新鮮な組織サンプル(1A-B)、グルタルアルデヒド固定した組織サンプル(1C-D)、エポキシ固定した組織サンプル(1E-F)、ジェニピン固定した(1G-H)組織サンプルのコラゲナーゼ分解の前および後の顕微鏡写真から得られたコンピュータ生成画像を表す。分解後、新鮮な組織は小片へ崩壊していた( 図１Ｂ)。対照的に、グルタルアルデヒド固定した組織およびジェニピン固定した組織のコラーゲン原線維構造は、コラゲナーゼ分解後もインタクトなままであった(図１Ｄおよび１Ｈ)。一方、エポキシ固定した組織のコラーゲン繊維のわずかな崩壊が観測された(図１Ｆ)。各試験サンプルの変性温度を、Perkin Elmerディファレンシャルスキャニング熱量測定器(モデルDSC7，Norwalk，Connecticut，USA)で測定した。図２および３は、それぞれ、コラゲナーゼまたはプロナーゼ分解の前および後の、上述で命名した試験サンプルの変性温度を提供する。これらのサンプルの広範囲にわたる分解に起因して、コラゲナーゼまたはプロナーゼ分解後には、新鮮な（架橋していない）組織の変性温度は決定し得なかった。図で示されるように、ジェニピン固定した組織の変性温度の減少(<2%)は、グルタルアルデヒドおよびエポキシで固定した組織の変性温度の減少(3〜10%)より小さかった。ジェニピン固定した組織はまた、引っ張り強度の優れた保持を示した。組織小片は、引っ張り強度測定に関するインビトロ分解の前および後において各試験サンプルから切り出された。組織小片の応力-歪み曲線は、Instron Universal Tes ting Machine(Model 4302)を用いて、50mm/分の一定速度で、一軸性の測定により決定された。図４は、コラゲナーゼ分解の前および後の新鮮な組織、グルタルアルデヒド固定した組織、エポキシ固定した組織、またはジェニピン固定した組織の引っ張り応力測定の結果を示す。新鮮な組織の引っ張り応力は、分解後また、このサンプルの広範囲の崩壊にまた起因して、０と記録された。図において示されるように、ジェニピン固定した組織の引っ張り応力の減少が最小(<l%)であり、そしてグルタルアルデヒド固定した組織およびエポキシ固定した組織(それぞれ、31%と25%)よりも有意に小さかった。上述の結果は、ジェニピン固定したコラーゲン性組織が、グルタルアルデヒド固定した組織と類似した熱安定性および引っ張り強度を有するということ、ならびにそれらがコラーゲン分解酵素での処理によって、グルタルアルデヒド固定した組織およびエポキシ固定した組織より有意に大きな程度に、それらの引っ張り強度と熱安定性を保持することを示す。Ｂ．皮下移植における安定性 1.短期間の研究（４週間）皮下移植の研究は、安定性（変性温度および引っ張り強度の変化）およびジェニピンで架橋した移植心膜組織におけるカルシウム沈着のレベルを評価するために、成長期ラットモデルを使用して、実施した。また新鮮な（架橋していない）組織、グルタルアルデヒド固定した組織、ならびにエポキシ固定した組織も試験した。組織サンプルは、実施例２で記載されるようにして調製した。皮下インプラントの研究は６週齢の雄性およびWistarラットにおいて実施し、そしてインプラントは、移植後１週間と４週間に取り出された。新鮮なサンプルは、一般的に、移植後１週間で、架橋したサンプルより薄くなり、そして、それは４週間で完全に分解した。４週間で、宿主組織の薄層は、ジェニピン固定したサンプルについて観察されたが、グルタルアルデヒドまたはエポキシ固定したサンプルについては観察されなかった。従って、ジェニピン固定したサンプルはこの基準により最も生体適合性であるようだった。上述の様に、サンプルの変性温度および引っ張り強度を、移植の前および後において決定した。図５に示されるように、ジェニピン固定したサンプルおよびグルタルアルデヒド固定したサンプルの変性温度は類似しており、そしてエポキシ固定したサンプルのものよりも有意により高かった。これは、ジェニピン固定した組織およびグルタルアルデヒド固定した組織におけるより高い架橋密度を示唆する。すべての場合に、変性温度の低下は、移植後４週間までほとんど観測なかった。図６に示されるように、ジェニピン固定したサンプルの引っ張り強度は、エポキシ固定したサンプルの引っ張り強度に対して、全ての段階で優れていた。移植前および移植後１週間で、ジェニピン固定したサンプルおよびグルタルアルデヒド固定したサンプルの引っ張り強度は類似していた。しかし、移植後４週間で、ジェニピン固定したサンプルは、グルタルアルデヒド固定したサンプルよりも実質的により大きな引っ張り強度を有した。図７は、実施例３に記載されるように、原子吸光分析により決定された移植の間に沈着したカルシウム量を示す。図が示すように、カルシウム沈着はジェニピン固定したサンプル、およびエポキシ固定したサンプルとかなり類似しており、そして、１週間で、架橋していないサンプルについて示されるよりも少なかった。グルタルアルデヒド固定したサンプルは、１週間で実質的により多いカルシウム沈着、および４週間で、他の２つの固定したサンプルと類似するレベルを示した。上述の結果は、グルタルアルデヒドならびに関連化合物に伴う毒性なく、ジェニピンで架橋したコラーゲン性組織が、グルタルアルデヒドで架橋したコラーゲン性組織と類似するか、または優れた安定性および生体適合性を示すことを示す。２．長期間の研究（12週間）新鮮な(架橋していない)、グルタルアルデヒド、エポキシ、およびジェニピンで固定したブタの心膜の滅菌済サンプルを、上記の短期間の研究について記載されたように、成長期ラットモデル（６週齢オス Wistar）に無菌条件下で皮下移植した。各々の研究した群からの１サンプルである４サンプルに、動物モデルの背の上部において移植した。再び各々研究した群からの１サンプルである、他の４サンプルを、逆の順序で、腰において移植した。各々の試験サンプルは、幅が約0.5cmそして高さが2cmであった。各列の試験サンプルの順序は、動物から動物へ、回された。次いで、移植サンプルの手術後１週間(n=4)、４週間(n=4)、および12週間(n=8)に取り出した。摘出において、取り出した各サンプルを試験して、そして写真撮影した。取り出した新鮮な組織は、グルタルアルデヒド、エポキシ、ならびにジェニピン固定した対照物よりも有意に薄いということが認められた。術後４週間で、８つの移植した新鮮な組織サンプルのうち６つは完全に分解されている一方で、他の２つの新鮮なサンプルは宿主組織により吸収されていたことが見出された。対照的に、グルタルアルデヒド、エポキシ、およびジェニピンで固定した組織は、研究の全行程を通してインタクトなままであった。走査型電子顕微鏡(SEM)を、各取り出したサンプルの表面形態学を試験するために用いた。SEM試験に用いたサンプルは、最初に、0.1Mのカコジル酸ナトリウム(pH7.4)中の2%のグルタルアルデヒドで固定して、次いで１％の四酸化オスミウム中に固定した。続いて、そのサンプルを段階的な一連のエタノール溶液中で脱水して、二酸化炭素により臨界点で乾燥させて、そして金フィルムでスパッター(spatter)させた。この試験は、日立製モデルS-800走査型電子顕微鏡で行った。図9Aならびに図9Eは、移植前ならびに術後１週間に取り出した新鮮な組織のSE M顕微鏡写真から得られたコンピュータ生成画像を示す。図9Eで示すように、術後１週間で取り出された新鮮な組織は、広範囲にわたりすでに分解していた。術後１２週間で取り出したグルタルアルデヒドおよびジェニピン固定した組織（それぞれ、図9Fならびに図9H）は、移植前の対照物（それぞれ、図9Bならびに図9D ）と比較してわずかに分解していた。エポキシ固定した組織（図9G対図9C）の分解の程度は、そのグルタルアルデヒドおよびジェニピン固定した対照物よりもさらに広範囲にわたった。光学顕微鏡に対して用いられたサンプルは少なくとも３日間、10%のリン酸緩衝化ホルマリン中で固定して、そして組織病理学的試験のために調製された。組織病理学的試験において、固定化されたサンプルをパラフィンで包含し、５μｍの厚さに切断して、そしてヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した。各試験サンプルの染色切片は、組織炎症性反応に対して光学顕微鏡(Nikon Microph oto-FXA)により試験を行い、そして100 ASA Kodachromeフィルムを使って写真撮影した。術後１２週間で取り出したグルタルアルデヒド固定した組織、エポキシ固定した組織およびジェニピン固定した組織の顕微鏡写真から得られたコンピュータ生成画像を図10(A-C)に示す。この時点で取り出した新鮮な組織の顕微鏡写真は、その完全な分解に起因して撮り得ないことに注意すべきである。ジェニピン固定した組織の炎症性反応は、グルタルアルデヒド固定した対照物およびエポキシ固定した対応物の反応よりも有意に少なかった。これは、有意に低いその毒性（以下の、セクションＣを参照）に起因して、ジェニピン固定した組織の優れた生体適合性を示す。実施例３で記載されるように、原子吸光分析を、各取り出したサンプルのカルシウム含量の決定のために用いた。移植前および術後１週間、４週間、12週間で取り出した、新鮮な、グルタルアルデヒド、エポキシおよびジェニピンで固定した組織についてのカルシウム含量のデータは、乾燥組織重量のmgあたりμｇのカルシウムとして表１に提示される。それらの完全な分解により、術後の４週間ならびに12週間で取り出した新鮮な（架橋していない）組織に対して得られたデータは観測され得ないということに注意すべきである。表で示されるように、本研究において、カルシウム含量の有意な差は、移植前のサンプルおよび種々の移植時間で取り出したサンプル間において観測されなかった。表１移植前、および異なる移植時間における、カルシウム含量（μｇカルシウム／mg 組織乾燥重量）データは平均±標準偏差で示した。^* N/A:組織が完全に分解したため、データが得られなかった。 C.細胞傷害性の研究本研究に用いた細胞は健常新生児包皮由来のヒト包皮線維芽細胞である。細胞は、直径3.5cmのペトリ皿で、10％ウシ胎児血清(Hyclone Laboratories,Logan,U t.,USA)で補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM,Gibco 430-2800EG,Grand Island,NY.USA)で培養した(一皿あたり、10⁵細胞)。細胞培養は、加湿培養器で3 7℃、10％CO₂を含む空気中で24時間維持した。次いで、培地を0(ブランク)、10、100、または1,000ppm(μｇ/ml)の濃度でジェニピン(Challenge Bioproducts Co.,Taichung,Taiwan)を含むDMEMに置換した。グルタルアルデヒド、およびエポキシ化合物（エチレングリコールジグリシジル５、または10ppmの濃度で試験した。培養24時間後、リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を２回洗浄し、そして培地を試験架橋剤を含まない新しいDMEM培地に置換した。最後に、細胞をさらに２週間インキュベートし、この期間の間、培地は１回交換された。図8Aは、上に記載するように、しかし試験架橋剤を加えずに培養したヒト線維芽細胞のコントロール培養の、顕微鏡写真から得たコンピューター作製画像(com puter-generated image)である。この図に示すように、ペトリ皿内で観察された細胞はコンフルエントである。図8B〜8Dは、以下の濃度で異なる架橋剤を補充した培地で培養した、ヒト線維芽細胞の顕微鏡写真から得たコンピューター作製画像を示す：1ppmグルタルアルデヒド(8B)、5ppmエポキシ(8C)、および1000ppmジェニピン(8D)。細胞密度は、グルタルアルデヒドを補充した培地で最も低く(図8B)、そしてエポキシで処理した培養においてわずかに高かった。双方とも、コントロール培地で観察されたものより非常に低かった。対照的に、ジェニピンを補充した培地（図8D）で観察された細胞密度は、より高濃度のジェニピンを用いたにもかかわらず、グルタルアルデヒド、またはエポキシ化合物で補われたものよりも、有意に多かった。この結果は、ジェニピンの細胞傷害性がグルタルアルデヒド、およびエポキシ化合物の細胞傷害性よりも有意に低いことを示唆する。 IV.ヘモグロビンの架橋この節に記載された結果から示されるように、ジェニピンで重合させたヘモグロビンは、長期の保存期間にわたり、安定な四量体構造を有し、および分子量分布は変化しないままである。代用血液として使用するヘモグロビンの架橋においては、過剰重合したヘモグロビン(＞９単位、および、＞500kDa)、ならびにメトヘモグロビンの形成を最小限にしつつ、２〜９単位から構成されるヘモグロビンオリゴマーの分布を得るのが望ましい。本発明を支持するために、ジェニピンで処理したヘモグロビンから得た生成物の分布に対する効果に関して、いくつかの因子の研究が行われた。これらの因子（以下で個々に議論される）は、(a)反応時間、(b)ヘモグロビン濃度、(c)ジェニピン／ヘモグロビンのモル比、(d)反応温度、(e)緩衝液のpH、および(f)失活剤としてのリジンの添加である。各反応では、反応中のメトヘモグロビンの形成を減少させるため、最初にヘモグロビンを、COガスでパージした。以下の実施例３に記載されるように、生成物の分布を、HPLCによって分析した。 A.反応時間生成物の分布を、２〜48時間にわたり観察した(ここで、ヘモグロビン濃度は、pH7.0、４℃において、14g/dl、およびジェニピン濃度は15mMであった)。12時間において、Hb₁（非重合ヘモグロビン）のレベルは60.15％に減少し、ならびにメトヘモグロビンは、表２に示されるように、わずかに14.98％から、18.81％へと増加した。15時間目以上では、過剰に重合したヘモグロビン（＞500kDa）が観察され、所望の架橋ヘモグロビンは最小限に増加し、およびメトヘモグロビンは急速に増加した。したがって、この条件での最適な反応時間は、約12〜15時間だった。表２異なる反応時間での分子量分布、およびメトヘモグロビン形成 ^*Hb_n：架橋したヘモグロビン単位の数^* Met Hb：メトヘモグロビン^* メトヘモグロビンの最初の割合は15.69％だった。 B.ヘモグロビン濃度ジェニピン濃度、pH、および反応温度は、上のセクションＡにおいて用いられたものと同一である。10〜14g/dlの範囲のヘモグロビン濃度が、重合反応に適切であることが見出された。濃度が10g/dl未満の場合、所望の架橋ヘモグロビン（＜500kDa）は、ヘモグロビン濃度の増加に伴い増加するが、反応速度は遅い。14 g/dlより濃度が高いときについては、表３に示すように、過剰重合したヘモグロビン、およびメトヘモグロビン両方が増加する。表３異なるヘモグロビン濃度における、分子量分布とメトヘモグロビン形成 ^*Hb_n：架橋したヘモグロビン単位の数^* Met Hb：メトヘモグロビン^* メトヘモグロビンの最初の割合は10.08に等しい C.ジェニピン／ヘモグロビンの比ヘモグロビン濃度(14g/dl)、温度、およびpHは変更しなかった。ジェニピン／ヘモグロビンの最適なモル比は、6/1〜9/1の範囲であることが見出された。モル比が6/1未満の場合、反応速度は非常に低く、および重合ヘモグロビンの収量も低かった。表４に示すように、9/1より大きいモル比では、所望の重合ヘモグロビンは増加しないが、より高いレベルのメトヘモグロビン、および過剰重合したヘモグロビンを生産した。表４異なるジェニピン／ヘモグロビンのモル比における、分子量分布およびメトヘモグロビンの形成 ^*Hb：ヘモグロビン^* Hb_n：架橋したヘモグロビン単位の数^* Met Hb：メトヘモグロビン^* メトヘモグロビンの最初の割合は22.18％ D.緩衝液のpH 本反応の系列では、温度は４℃、反応時間は15時間、ならびにヘモグロビン、およびジェニピンの濃度は10g/dl，および15mM（モル比7/1）である。それぞれ5 .5、7.5、および9.5のpH値を有する緩衝液を調製するため、リン酸水素カリウム溶液(0.05M、pH4.0)、リン酸ナトリウム溶液(0.001M、pH9.0)、ほう酸ナトリウム溶液(0.01M、pH9.0)、および炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム溶液（0.19M/ 0.18M）を用いた。表５に示すように、中性pH、および塩基性pHがヘモグロビンの重合化に最も好ましかった。表５異なるpH値における分子量分布、およびメトヘモグロビンの形成 ^*Hb_n：架橋したヘモグロビン単位の数^* Met Hb：メトヘモグロビン^* メトヘモグロビンの最初の割合は17.12％ E.反応温度この一連の反応では、ヘモグロビン濃度、およびジェニピン濃度は変化させず、そしてpHは、7.0に調整した。温度の範囲は４℃〜40℃を用い、表６に示す結果を得た。示されるように、温度が高いほど、より高い程度のヘモグロビンの重合化を誘導する。30℃〜40℃では非重合ヘモグロビンの60％〜65％が、２時間以内に反応する。しかし、意外ではないが、より高い温度はまた、過剰重合ヘモグロビン、およびメトヘモグロビンの形成、ならびに細菌の産生を増加させた。適切な温度は４℃と20℃との間だった。表６異なる反応温度における分子量分布、およびメトヘモグロビンの形成 ^*Hb_n：架橋したヘモグロビン単位の数^* Met Hb：メトヘモグロビン^* メトヘモグロビンの最初の割合は10.08％ F.ターミネーターとしてのリジンの添加一般的に、リジンはタンパク質架橋反応のためのターミーネーターとして用いられる。同時に２つの重合を行い、そして片方には14.5時間においてリジンを添加した。ヘモグロビン、およびジェニピンの濃度は、上に記載したように14g/dl 、および15mM、反応時間は15時間、ならびに反応温度は４℃を維持した。表７に示すように、リジンは重合の失活、および過剰重合ヘモグロビンのレベルの減少に有効だった。表７ヘモグロビン重合化における、分子量分布およびメトヘモグロビン形成に対するリジン失活剤の効果 ^*Hb_n：架橋したヘモグロビン単位の数^* Met Hb：メトヘモグロビン^* メトヘモグロビンの最初の割合は12.08％実施例以下の実施例は、本発明を例示するが、決して本発明を限定することを意図したものではない。実施例１：架橋したコラーゲン組織の、分解酵素に対する安定性屠殺場から得た、新鮮なブタ心膜を生材料として用いた。組織サンプルを、摘出した後、即座に冷生理食塩水に移し、固定化のため運んだ。リン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）で緩衝化した５％ジェニピン溶液を、生体組織の架橋に用いた。この処理は37℃で３日間行った。固定の後、生体組織を脱イオン水で60分間リンスした。続けて、固定した組織を70％エタノール溶液で37℃で７日間殺菌した。グルタルアルデヒド固定化対応物、およびエポキシ固定化対応物をコントロールとして用いた。0.625％グルタルアルデヒド溶液を固定化に用いた。エポキシ化 Nagase,Chemicals Ltd.,Osaka,Japanから入手した）。コラゲナーゼまたはプロナーゼ分解前、および後の各々の試験サンプルの、コラーゲン原繊維構造の変化を調べるため、光学顕微鏡を用いた。試験サンプルは 10％ホルマリン溶液で固定し、組織学試験用に調製した。組織学試験では、分解前、および後の、各試験サンプルの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色した。各試験サンプルの変性温度は、Perkin-Elmer示差走査熱量計(Model DSC 7,Nor walk,Connecticut,USA)で測定した。結果は上記のようであり、図２、および図３に示した。組織片は、抗張力測定用にインビトロで分解前後の各試験サンプルから切り出した。組織片の応力ひずみ曲線は、定速50mm/minのInstron Universa l Testing Machine(Model4302)を用いて、単軸測定（uniaxial measurement）によって決定した。結果を上記し、図４に示す。実施例２：皮下移植研究上に記載したように、新鮮なブタ心膜を生材料として用いた。ジェニピン Osaka,Japan))、またはグルタルアルデヒド（0.625％溶液）で３日間、37℃で固定する前に、血液、および脂肪を取り除くため、サンプルをリンスし、そして切り取った。各々の場合に用いた溶液量は、６×６cmブタ心膜につき、約200mlだった。エポキシ溶液は0.21M炭酸ナトリウム／0.02M炭酸水素ナトリウム(pH10.5) で緩衝化した。一方、グルタルアルデヒド、およびジェニピン溶液は0.01Mリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)で緩衝化した。固定した心膜を、増加濃度(20％〜75％)を有する一連のエタノール溶液で、約５時間滅菌し、そして最後に滅菌リン酸緩衝化生理食塩水で数回リンスした。皮下移植研究は、６週齢雄性Wistarラットで、無菌条件で行った。インプラントは移植後１週間および４週間で摘出した。変性温度、および抗張力は実施例１と同様に決定し、そしてカルシウムレベルは、原子吸光分光法で決定した。結果を上記し、図５〜７に示す。実施例３：移植した組織サンプルのカルシウム含有量の測定摘出した組織サンプルを、24時間凍結乾燥し、重量を測定した。次いで凍結乾燥したサンプルを、6N HCl溶液に浸し（約3mg凍結乾燥組織/3mL 6N HCl)、そして、続けてマイクロ波加水分解システム（MDS-2000,CEM Co.,Matthews,NC,USA）で45分間加水分解した。最後に加水分解したサンプルを、3M HCl溶液中の５％塩化ランタニウム溶液で希釈した。各試験サンプルのカルシウム含量を、原子吸光分析計（Model AA-100,Perkin Elmer Inc.,Norwalk,Conn.,USA）で測定した。実施例４：ヘモグロビンの重合化ヘモグロビン溶液は一酸化炭素で１時間４℃でパージし、次いでジェニピンを溶液に添加した。反応時間、濃度、温度、およびpHは上に記載されるように変更した。分子量分布は（架橋の程度）、およびメトヘモグロビンの割合は、TSK300 0SWゲル濾過カラムをのせた（移動相溶媒は0.1Mリン酸緩衝液、0.3M NaCl,pH=7; 流速＝0.8ml/min;410nmおよび280nmで検出）高速クロマトグラフィーを用いて分析した。代表的なプロフィールを図11に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スン，シン―ウェン台湾タオユアン，ショウ―シャンロードナンバー 208，６エフ―１

Claims

【特許請求の範囲】１．キトサン、または結合組織タンパク質から選択される架橋アミン含有生体分子の使用であって、該生体分子が生体適合性インプラント、創傷用包帯、または接着剤中でジェニピンで架橋されている、使用。２．前記材料が、結合組織タンパク質を含む、請求項１に記載の使用。３．前記結合組織タンパク質がコラーゲンである、請求項２に記載の使用。４．前記材料がキトサンを含む、請求項１に記載の使用。５．生体適合性インプラントを提供する方法であって、キトサン、または結合組織タンパク質から選択されるアミン含有生体分子を含む材料を、該インプラントに適切な構造に作製する工程、および該材料を架橋構造を生産するためにジェニピンで架橋する工程を包含する、方法。６．前記材料が結合組織タンパク質を含む、請求項５に記載の方法。７．前記結合組織タンパク質がコラーゲンである、請求項６に記載の方法。８．前記材料がキトサンを含む、請求項５に記載の方法。９．前記架橋構造を被験体に移植する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。１０．ジェニピンで架橋したヘモグロビンを含む、代用血液における使用に適切な組成物。１１．前記架橋ヘモグロビンが、１より大きく、かつ約９未満の平均重合度を有する、請求項１０に記載の組成物。１２．ヘモグロビンを架橋するのに有効なジェニピンの量で、ヘモグロビンを処理する工程を包含する、架橋ヘモグロビンの調製方法。１３．前記ヘモグロビンが、１より大きく、かつ約９未満の平均重合度を与えるのに有効な量のジェニピンで処理される、請求項１２に記載の方法。１４．前記ヘモグロビンが、前記ジェニピンと、中性、または塩基性のpHを有する水性培地中で、約６：１から９：１のモル比で、約12〜15時間の間、約４℃〜 20℃の温度で接触される、請求項１２に記載の方法。１５．請求項１４に記載の方法に従って調製した架橋ヘモグロビン。