CN109529113B - 低免疫源性骨缺损部位填充材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种低免疫源性骨缺损部位填充材料，填充材料是由氨基化芦荟多糖‑甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞因子的肝素‑泊洛沙姆凝胶、骨去细胞基质组成，通过改变组分配比，控制骨缺损部位填充材料的力学强度和降解速度。该低免疫源性骨缺损部位填充材料克服现有技术免疫源性高的缺点和不足，提供一种免疫源性低且具备骨传导、骨诱导、骨生成和力学支持多项功能的新型骨缺损部位填充材料，为骨再生提供最佳的理化和生物学微环境，有效引导细胞定向排列，具有良好的力学性能，实现骨缺损部位的快速修复。

Description

低免疫源性骨缺损部位填充材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种骨缺损部位填充材料，特别涉及一种低免疫源性骨缺损部位填充材料的组成、制备及其用途。

背景技术

骨缺损在临床上发病率较高，其治疗仍是骨科目前较为棘手的问题。骨缺损治疗虽然可采用骨移植、组织工程技术、膜引导性组织再生技术、基因疗法等。但是，临床上仍以骨移植治疗骨缺损为常见。

自体骨移植由于具有免疫源性低、诱导性好的优势，但自体骨移植的材料来源有限，此外进行自体骨移植取骨时必将增加新的创伤，且术后供骨区有可能出现一系列并发症，因此自体骨移植很难在临床广泛应用。

目前临床应用的骨缺损部位填充材料主要有聚甲基丙烯酸甲酯、氧化铝陶瓷、生物玻璃、磷酸三钙、钛金属、骨水泥以及以羟基磷灰石/硫酸钙为基质的生物材料。这些填充材料尽管丰富了骨缺损修复方法，但其免疫源性较强，且不能完全替代原组织功能，因此相关研究依然停留在基础研究阶段，不能应用于临床治疗。

从临床应用角度出发，理想的骨缺损部位填充材料首先应满足免疫源性低、生物相容性好的要求。其次，从生物治疗学的角度来讲，理想的骨缺损部位填充材料应同时提供骨传导基质、骨诱导因子及骨生成细胞等三大因素，即：骨移植应能实现骨传导、骨诱导和骨生成三项功能。此外，从力学角度考虑，骨移植材料还应提供3个月的结构性支持以促进骨形成作用。

目前尚缺乏一种能够同时满足以上要求的理想骨缺损部位填充材料。现有的非自体骨的填充材料尽管在力学和生物治疗学方面取得较好成果，但均存在较强免疫源性，长期应用存在安全性隐患，因此限制了其在临床中的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术免疫源性高的缺点和不足，提供一种免疫源性低且具备骨传导、骨诱导、骨生成和力学支持多项功能的新型骨缺损部位填充材料，为骨再生提供最佳的理化和生物学微环境，有效引导细胞定向排列，具有良好的力学性能，实现骨缺损部位的快速修复。

申请人发现，现有的骨缺损部位填充材料均具有较强免疫源性，容易引起骨缺损部位的炎症、水肿和组织纤维化，即使炎症和水肿消退了，骨缺损周围也会出现严重的纤维包绕问题，从而阻塞微血管的生成和成骨细胞的黏附，导致骨缺损部位愈合慢。为了解决这个问题，申请人经过大量研究，芦荟中具有多种成分，但只有芦荟多糖具有最佳骨修复作用。申请人通过氨基化修饰，制备氨基化芦荟多糖，可以与甘油醛交联形成力学性质良好的凝胶，不仅没有已报道的醛基交联剂的毒性，还具有很好的生物相容性和3个月左右的降解速度，不会引起机体的免疫反应，充分发挥芦荟多糖的组织修复、血管再生、促进成骨细胞迁移、改善局部微环境等作用。此外，申请人发现肝素修饰的泊洛沙姆凝胶具有多重特点，包括：肝素的抗血栓、抗疤痕和抗纤维化的作用；保证肝素高亲和性细胞因子的缓慢释放和长效作用；保持泊洛沙姆的温敏型水凝胶性质，在体温时形成弹性好的固体凝胶，从而保证肝素高亲和性细胞因子不流失等。此外，骨去细胞基质免疫源性低，包含很多营养因子，可以为骨损伤修复提供良好的营养和空间微环境。

因此，本申请保护的低免疫源性骨缺损部位填充材料，该填充材料是由氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、骨去细胞基质组成，通过改变组分配比，控制骨缺损部位填充材料的力学强度和降解速度。

上述的填充材料中氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶的质量百分含量为40％-60％、包载肝素高亲和性细胞因子的肝素-泊洛沙姆凝胶的质量百分含量为10％-20％、骨去细胞基质的质量百分含量为20％-40％。

上述的肝素高亲和性细胞生长因子选自：转化生长因子、胰岛素样生长因子、角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子中的一种或几种组合。

上述的肝素高亲和性细胞因子在肝素-泊洛沙姆凝胶中的质量百分含量为0.001％～0.1％。

上述的骨去细胞基质优选两栖动物骨去细胞基质。

上述的肝素高亲和性细胞生长因子优选血管内皮生长因子和转化生长因子。

上述低免疫源性骨缺损部位填充材料的一种制备方法：将骨去细胞基质粉碎，与包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶，混匀形成均匀的半固体凝胶。

上述低免疫源性骨缺损部位填充材料的一种制备方法：将骨去细胞基质粉碎，与氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，混匀形成均匀的半固体凝胶。

上述低免疫源性骨缺损部位填充材料的另一种制备方法：将骨去细胞基质粉碎，与氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，混匀形成均匀的半固体凝胶。

上述低免疫源性骨缺损部位填充材料制备过程中进一步加入用于药学常用的pH缓冲液、抗氧剂、表面活性剂。

上述的低免疫源性骨缺损部位填充材料用于骨组织缺损部位的填充。

与现有技术相比，本发明的低免疫源性骨缺损部位填充材料发挥“氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、骨去细胞基质”各组分的优势，实现优势互补，在保证免疫源性低的前提下为骨再生提供最佳的力学和生物学微环境，具体包括：①氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶，提供良好的免疫微环境，降低骨缺损部位填充材料的免疫源性，同时保证填充材料的力学性能，提供骨缺损部位所需的力学强度。②包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，具有引导和促进骨缺损部位的快速修复的多重优点，包括：防止骨缺损部位的纤维形成、体温时形成弹性好的固体凝胶保证肝素高亲和性细胞因子不流失、保证肝素高亲和性细胞因子的缓慢释放和长效作用。③骨去细胞基质，提供成骨细胞生长所需的各种养分。④本发明的骨缺损部位填充材料降解速度慢，可以提供3个月的结构性支持，保证骨组织缺损部位的完全康复。⑤本申请保护的技术方案中各组分是协同互补和必要的关系，共同发挥作用。

具体实施方式

下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

实施例1低免疫源性骨缺损部位填充材料的制备

制备方法1：按照表1的低免疫源性骨缺损部位填充材料各实验组的组成，秤取各组分，按照无菌操作法将骨去细胞基质粉碎，与包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶，混匀，形成均匀的半固体凝胶。

制备方法2：按照表1的低免疫源性骨缺损部位填充材料各实验组的组成，秤取各组分，按照无菌操作法将骨去细胞基质粉碎，与氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，混匀，形成均匀的半固体凝胶。

各对照组的制备参照实验组的制备方法进行。

表1低免疫源性骨缺损部位填充材料各实验组的组成

注：“骨去细胞基质”项下括号内的动物是指骨去细胞基质的来源动物；TGF：转化生长因子；IGF：胰岛素样生长因子；KGF：角质细胞生长因子；bFGF：碱性成纤维细胞因子；VEGF：血管内皮生长因子；EGF：表皮生长因子；NGF：神经生长因子。

表2低免疫源性骨缺损部位填充材料各对照组的组成

注：VEGF代表血管内皮生长因子；各列括号内的材料是指该类材料的来源；英文缩写的生长因子全称见表1的注解。

实施例2在体评价各组骨缺损部位填充材料应用效果

(1)兔桡骨缺损动物模型

骨缺损模型的骨缺损程度是根据Schmitz等提出的临界骨缺损概念，即骨缺损部位达到长骨直径的1.5倍时，机体无法自行愈合，造成骨缺损，而小于该倍数的骨缺损，可以自行愈合。

兔桡骨缺损模型：取体重2.5-3kg的新西兰大白兔，麻醉后，分离桡骨处血管、肌腱，暴露桡骨，锯断桡骨直至断面直径的1.5倍长，通过Micro-CT影像确认桡骨骨缺损动物模型缺损部位是否正确，缺口是否整齐。

(2)各组填充材料的体内应用效果

应用以上建立好的兔桡骨缺损模型，在桡骨缺损部位填充各组的填充材料，然后缝合，包扎，每周通过Micro-CT影像观察对比骨缺损部位的变化情况，并进行以下评价。

①对骨缺损部位组织的断面切片

分离取出骨缺损部位的组织，固定于4％多聚甲醛24小时，继而进行脱钙、脱水和石蜡包埋，包埋的兔子桡骨组织以5μm厚度连续切片。

②骨组织的免疫原性指标检测

检测骨缺损填充部位的新生骨组织的MHC-1和MHC-2的含量，从而观察各组填充材料的组织相容性，同时在填充材料应用后的第1天、第3天、第7天、第10天检测周围组织中炎症因子IL-6、TNF-α等的表达，观察不同组填充材料的免疫原性。

③对骨缺损部位修复的治疗效果

将骨组织的病理切片通过HE染色、TUNEL细胞凋亡、免疫组化方法，测定骨组织修复效果；应用透射电镜(TEM)观察切取各实验组骨组织电镜标本，比较经不同组填充材料应用后骨缺损部位的组织形态变化。

基于以上结果，采用双盲法评价各组填充材料的应用效果，给出综合评分(满分10分)，分数越高代表综合效果越好。

实验结果：骨缺损部位填充材料的实验结果见表3。从表3数据可见，各个实验组在体内免疫原性良好，兔桡骨缺损部位的免疫原性、材料力学强度、材料持久性、骨缺损部位的修复效果等指标良好，验证了实验组对于兔桡骨缺损部位具有良好修复效果。各对照组中，免疫原性、材料力学强度、材料持久性、骨缺损部位的修复效果等指标很差，综合评分明显低于实验组结果，大部分对照组应用后桡骨缺损部位出现变形。由上可知，各实验组对于兔桡骨缺损具有良好的修复效果，可以作为骨缺损部位的填充材料。

表3各组骨缺损部位填充材料的应用效果

上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.低免疫源性骨缺损部位填充材料，其特征在于，所述的填充材料是由氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶、包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶、骨去细胞基质组成，通过改变组分配比，控制骨缺损部位填充材料的力学强度和降解速度。

2.根据权利要求1所述的低免疫源性骨缺损部位填充材料，其特征在于：所述的填充材料中氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶的质量百分含量为40％-60％、包载肝素高亲和性细胞因子的肝素-泊洛沙姆凝胶的质量百分含量为10％-20％、骨去细胞基质的质量百分含量为20％-40％。

3.根据权利要求1所述的低免疫源性骨缺损部位填充材料，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞生长因子选自：转化生长因子、胰岛素样生长因子、角质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子中的一种或几种组合。

4.根据权利要求1所述的低免疫源性骨缺损部位填充材料，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞因子在肝素-泊洛沙姆凝胶中的质量百分含量为0.001％～0.1％。

5.根据权利要求1所述的低免疫源性骨缺损部位填充材料，其特征是：所述的骨去细胞基质为两栖动物骨去细胞基质。

6.根据权利要求3所述的低免疫源性骨缺损部位填充材料，其特征是：所述的肝素高亲和性细胞生长因子为血管内皮生长因子和转化生长因子的一种或两种组合。

7.根据权利要求1～6任一项所述低免疫源性骨缺损部位填充材料的制备方法，其特征是：将骨去细胞基质粉碎，与包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶混匀，加入氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶，混匀形成均匀的半固体凝胶。

8.一种根据权利要求1～6任一项所述低免疫源性骨缺损部位填充材料的制备方法，其特征是：将骨去细胞基质粉碎，与氨基化芦荟多糖-甘油醛凝胶混匀，加入包载肝素高亲和性细胞生长因子的肝素-泊洛沙姆凝胶，混匀形成均匀的半固体凝胶。

9.根据权利要求7所述的低免疫源性骨缺损部位填充材料的制备方法，其特征是：所述的低免疫源性骨缺损部位填充材料的制备过程中进一步加入用于药学常用的pH缓冲液、抗氧剂、表面活性剂。

10.根据权利要求1～6任一项所述的低免疫源性骨缺损部位填充材料，其特征是：所述的低免疫源性骨缺损部位填充材料用于骨组织缺损部位的填充。