CN102600515B

CN102600515B - 一种多糖分子片段复合涂层的制备方法

Info

Publication number: CN102600515B
Application number: CN 201210108111
Authority: CN
Inventors: 李彤; 高文卿; 周秦; 胡晓旻; 段大为; 于美丽; 李鑫; 宁萌
Original assignee: Tianjin Third Central Hospital
Current assignee: Tianjin Third Central Hospital
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2032-04-13
Also published as: CN102600515A

Abstract

本发明公开了一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，首先，将高分子材料浸泡在高锰酸钾的硫酸溶液中，进行酸化处理；将材料置于聚乙烯亚胺溶液中，以得到氨基化修饰的表面；将肝素钠溶于去离子水中，加入亚硝酸，低温重氮化处理肝素钠，得到多糖片段A；氧化处理海藻酸钠，使得海藻酸片段末端暴露醛基，得到多醛基海藻酸钠，即多糖片段B；配置多糖片段A和B的反应液，将氨基化修饰表面的材料置于反应液中，通过终点固定法得到复合涂层。本发明涂层中海藻酸钠和肝素集团固定在材料的表面，增大与血液接触的面积，有效发挥性质；终点固定法实施方便，结合牢固，空间构象好，能有效增加生物相容性和抗凝活性。

Description

一种多糖分子片段复合涂层的制备方法

技术领域

本发明涉及高分子材料表面涂层技术领域，更具体地说，涉及一种利用多糖分子片段对高分子材料表面涂层进行改性的制备方法。

背景技术

生物医学材料应用面临生物相容性及血液相容性两大问题。涂层技术通过对材料表面的预改性，从而改善了生物医学材料表面的生物相容性和抗凝活性。肝素属粘多糖，分子量5000-40000，是由带负电荷的线性多糖构成的混合体，肝素最重要的性质是其抗凝血特性，肝素的抗凝活性源于它可以和生物体内的多种凝血抑制因子相互作用，通过加速或提高这些抑制因子的抗凝活性来达到抗凝血的目的，但对于抑制蛋白粘附有缺陷。其中肝素对抗凝血酶III(AT-III)的作用最重要。目前生物医学材料表面肝素固定原理可归纳为物理法和化学法。物理法即通过机械包埋、分子链之间的缠绕和渗透、被有孔材料吸附等方式将肝素固定到生物材料表面，从而达到将肝素固定化的目的。化学法即通过肝素分子链上丰富的反应性官能基团，如磺酸基、氨基、羧基等与目标材料表面上相应的可反应基团进行反应，以离子键或以共价键的方式将之固定到生物材料表面。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，克服普通高分子材料生物相容性差、抗凝活性差等缺点，利用高碘酸氧化、重氮化处理和终点固定技术，提供了一种由多醛基海藻酸和重氮化处理后肝素组成的多糖分子片段复合涂层的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，按照下述步骤进行：

首先，即步骤(1)，将高分子材料浸泡在高锰酸钾的硫酸溶液中，进行酸化处理，其中：

所述高分子材料可以选择医用等级的聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚酯、硅橡胶、尼龙、聚碳酸酯或者聚四氟乙烯，这些材料可用于体外血液循环管路的构建，需要对其4表面进行改性以改进其与血液的相容性。

所述高锰酸钾的硫酸溶液采利用如下方式进行制备：先将高锰酸钾溶解在去离子水中混合均匀，然后缓慢向其中加入浓硫酸(质量百分数为95-98％的浓硫酸)，搅拌混合至硫酸的质量百分数达到为10％-70％即可。

将高分子材料浸泡在高锰酸钾的硫酸溶液中，进行酸化处理，主要是为了改性材料的表面性质，可以选择酸处理时间为1min-10min，常温处理，温度为20-25℃；在酸化处理过程中可采用机械或者超声搅拌的方式加强反应的强度，在酸化处理之后可使用去离子水对材料进行清洗。

步骤(2)，将经过酸化处理的材料置于聚乙烯亚胺(PEI)溶液中，反应以得到氨基化修饰的表面，其中：

所述聚乙烯亚胺(PEI)溶液的质量百分浓度为0.005％-0.5％，反应时间为10min-60min，常温处理，温度为20-25℃。

步骤(3)，将肝素钠溶于去离子水中混合均匀，加入亚硝酸钠，低温重氮化处理肝素钠，得到多糖片段A，其中：

所述低温重氮化处理肝素钠过程中，在0℃下重氮化处理至少1小时，优选1-2小时；所述亚硝酸钠的加入量根据肝素钠的用量进行调整，基本保证亚硝酸钠和肝素钠的等摩尔用量，或者其中之一稍有过量。

步骤(4)，使用高碘酸或者高碘酸钠氧化处理海藻酸钠，使得海藻酸片段末端暴露醛基，得到多醛基海藻酸钠，即多糖片段B，其中：

高碘酸或者高碘酸钠与海藻酸钠的重复单元的摩尔比为(1-3)∶10，氧化反应在避光条件下搅拌反应至少24小时，优选24-40小时；采用乙二醇终止反应，96wt％乙醇的水溶液进行沉淀，沉淀后抽滤、透析，-80℃冷冻干燥，得到多醛基海藻酸钠。

步骤(5)，配置多糖片段A和B的反应液(水溶液)，将氨基化修饰表面的材料置于反应液中，通过终点固定法得到多糖分子片段复合涂层，其中：

所述反应液为水溶液，其中多糖片段A 0.1-0.8mg/mL，多糖片段B 0.05-2mg/mL，NaCl 0.15-0.55mol/L，氰基硼氢化钠0.01-0.1mg/mL；反应温度为30℃-60℃，优选40-50℃；反应时间至少2小时，优选2-6小时。

分别配置多糖片段A和B的反应液(水溶液)，其中多糖片段A的反应液中多糖片段A 0.1-0.8mg/mL，NaCl0.15-0.55mol/L，氰基硼氢化钠0.01-0.1mg/mL；多糖片段B的反应液中多糖片段B0.05-2mg/mL，NaCl 0.15-0.55mol/L，氰基硼氢化钠0.01-0.1mg/mL；然后将氨基化修饰的高分子材料分别置于多糖片段A和B的反应液中，反应温度为30℃-60℃，优选40-50℃；反应时间至少2小时，优选2-6小时。

本发明采用的终点固定法，属特殊共价结合法，它首先通过预功能化在人工材料表面引入活性氨基层，其次通过部分降解海藻酸钠和肝素，产生末端带活性醛基的多糖分子片段，多糖片段的醛基并不参与半缩醛形成，而与人工材料表面的活性氨基结合为席夫碱，随后还原为稳定的共价体。因多糖分子片段活性醛基数量单一且处在末端，端点附着、成键量单一，所以多糖分子的功能活性部分可以从人工材料表面伸出与血液分子自由结合，发挥生物相容性好、抗凝活性的优点。

本发明使用的海藻酸钠是一种天然线性多糖，具有良好的生物相容性、生物粘着性、安全性、水溶性、缓释和聚电解质等特性，广泛应用于医药、食品、药物释放和组织工程领域。多醛基海藻酸是通过高碘酸将海藻酸钠的顺二醇结构氧化为二醛结构，从而在海藻酸钠分子中引入新的活性功能基团，能与具有游离氨基的大分子物质发生交联反应，同时改善了其降解性能。

本发明所提供的多糖分子片段复合涂层，由聚乙烯亚胺、海藻酸钠、肝素钠组成，均为多糖成分，天然毒性低、来源丰富成本低，在室温下可长期储存，且涂层中海藻酸钠和肝素集团固定在材料的表面，增大与血液接触的面积和或机会，有效发挥其性质；终点固定法实施方便，终点固定的多醛基海藻酸钠和肝素结合牢固，空间构象好，能有效增加高分子材料表面的生物相容性和抗凝活性。在生物医学材料领域，如体外循环管路、动脉滤器、动静脉插管等具有广阔的应用前景和较高的实用价值，能有效的降低医疗成本，减轻病人经济负担。

附图说明

图1多醛基海藻酸钠的制备原理示意图。

图2多糖片段A制备原理示意图。

图3本发明的制备方法的示意图。

图4聚氯乙烯(PVC)和带PEI涂层的PVC的红外光谱图，其中a为未经处理的PVC，b为带PEI涂层的PVC。

图5聚氯乙烯(PVC)和带有多醛基海藻酸钠涂层的PVC的红外光谱图，其中a为未经处理的PVC，b为带有多醛基海藻酸钠涂层的PVC。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。使用的高分子材料为东莞科威医疗器械有限公司提供的体外循环管路，材料为聚氯乙烯。

实施例1

第一步，将0.344克高锰酸钾溶于162毫升去离子水中，缓慢加入95wt％浓硫酸10ml，使浓硫酸与高锰酸钾很混合均匀。

第二步，在步骤一所得溶液中中加入高分子材料PVC，搅拌充分反应10min。

第三步，2g肝素钠溶于200ml去离子水中，加入20mg亚硝酸钠，在0℃条件下重氮化处理1.5小时。后调定反应液pH为7.0终止反应，经7000Da透析袋透析、-80摄氏度冷冻干燥制得多糖片段A。

第四步，按高碘酸钠与海藻酸钠单元摩尔比1∶10，氧化处理海藻酸，使海藻酸片段末端暴露醛基，乙二醇终止反应，96wt％乙醇水溶液沉淀，沉淀后抽滤、透析，-80℃冷冻干燥，得到多醛基海藻酸钠，即多糖片段B。氧化反应在避光条件下搅拌反应24小时。

第五步，经步骤二预处理的高分子材料浸入0.01wt％聚乙烯亚胺水溶液中，常温20℃反应60min，得到氨基化修饰的表面。

第六步，上述所得多糖片段A和B配制反应液(水溶液)，其中多糖片段A0.8mg/mL，多醛基海藻酸浓度0.1mg/ml，NaCl 0.15mol/L，氰基硼氢化钠0.1mg/ml，氨基化修饰的高分子材料置于反应液中，反应温度40℃，反应时间2小时。

将未经处理的PVC、带PEI涂层的PVC、带有多醛基海藻酸钠涂层的PVC进行红外光谱测试(红外光谱厂商及型号Thermo NICOLET 6700、检测器为DTGs KBr、分束器为KBr、波长范围为650-4000nm)，从附图4和5所示可知，1550cm^-1处为NH₂的特征吸收峰，3400cm^-1左右可见海藻酸钠的特征吸收峰，说明多醛基海藻酸钠通过NH₂固定在材料的表面。

实施例2

第一步，将0.328克高锰酸钾溶于144毫升去离子水中，缓慢加入95％浓硫酸20ml，使浓硫酸与高锰酸钾很混合均匀。

第二步，在步骤一所得溶液中加入高分子材料，搅拌充分反应1min。

第三步，2g肝素钠溶于200ml去离子水中，加入20mg亚硝酸钠，在0℃条件下重氮化处理2小时。后调定反应液pH为7.0终止反应，经7000Da透析袋透析、-80摄氏度冷冻干燥制得多糖片段A。

第四步，按高碘酸钠和海藻酸钠单元摩尔比3∶10，氧化处理海藻酸，使海藻酸片段末端暴露醛基，乙二醇终止反应，96％乙醇沉淀，沉淀后抽滤、透析，-80℃冷冻干燥，得到多醛基海藻酸钠，即多糖片段B。氧化反应在避光条件下搅拌反应40小时。

第五步，经步骤二预处理的高分子材料浸入0.5％聚乙烯亚胺水溶液中，常温25℃反应10min，得到氨基化修饰的表面。

第六步，上述所得多糖片段A和B配制反应液(水溶液)，其中多糖片段A0.1mg/mL，多醛基海藻酸浓度2mg/ml，NaCl 0.15mol/L，氰基硼氢化钠0.1mg/ml，氨基化修饰的高分子材料置于反应液中，反应温度50℃，反应时间6小时。

实施例3

第二步，在步骤一所得溶液中加入高分子材料，搅拌充分反应8min。

第四步，按高碘酸钠和海藻酸钠单元摩尔比1∶10，氧化处理海藻酸，使海藻酸片段末端暴露醛基，乙二醇终止反应，96％乙醇沉淀，沉淀后抽滤、透析，-80℃冷冻干燥，得到多醛基海藻酸钠，即多糖片段B。氧化反应在避光条件下搅拌反应30小时。

第五步，经步骤二预处理的高分子材料浸入0.05％聚乙烯亚胺水溶液中，常温25℃反应30min，得到氨基化修饰的表面。

第六步，上述所得多糖片段A和B配制反应液(水溶液)，其中多糖片段A0.5mg/mL，多醛基海藻酸浓度0.05mg/ml，NaCl 0.35mol/L，氰基硼氢化钠0.01mg/ml，步骤四所得氨基化修饰的高分子材料置于反应液中，反应温度60℃，反应时间4小时。

实施例4

第二步，在步骤一所得溶液中加入高分子材料，搅拌充分反应5min。

第四步，按高碘酸钠和海藻酸钠单元摩尔比2∶10，氧化处理海藻酸，使海藻酸片段末端暴露醛基，乙二醇终止反应，96％乙醇沉淀，沉淀后抽滤、透析，-80℃冷冻干燥，得到多醛基海藻酸钠，即多糖片段B。氧化反应在避光条件下搅拌反应35小时。

第五步，经步骤二预处理的高分子材料浸入0.005％聚乙烯亚胺水溶液中，常温25℃反应50min，得到氨基化修饰的表面。

第六步，上述所得多糖片段A和B配制反应液(水溶液)，其中多糖片段A0.3mg/mL，多醛基海藻酸浓度0.5mg/ml，NaCl0.25mol/L，氰基硼氢化钠0.05mg/ml，氨基化修饰的高分子材料置于反应液中，反应温度30℃，反应时间4小时。

实施例5

第六步，上述所得多糖片段A和B配制反应液(水溶液)，其中多糖片段A0.6mg/mL，多醛基海藻酸浓度1mg/ml，NaCl 0.25mol/L，氰基硼氢化钠0.05mg/ml，氨基化修饰的高分子材料置于反应液中，反应温度30℃，反应时间4小时。

在实施过程中，可按照上述实施例1-5的配比分别配置多糖片段A和B的反应液，然后将氨基化修饰的高分子材料先后分别置于多糖片段A和B的反应液中，按照相同条件进行反应，也可以得到多糖分子片段复合涂层6-10。

利用苯酚-硫酸法，通过计算反应前后海藻酸钠(OSA)反应液吸光度值变化，间接得到OSA的固定量，同时证明OSA固定确实(Dubois M，Gilles K A，Hamilton JK，et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].AnalyticalChemistry，1956，28(3)：350-356)，可见实施例1-5中海藻酸钠已经成功固定，这一点在分步制备样品6-10中也有相同的结果。

	反应前Abs	反应后Abs	固定量ug/cm²
				实施例1	0.394	0.338	0.79
实施例2b	0.235	0.224	7.78
				实施例3	0.153	0.127	0.49
实施例4a	0.292	0.266	3.62
				实施例5b	0.126	0.109	5.03

a：OSA测试液稀释10倍b：OSA测试液稀释50倍

利用TBO法，测定TB液与PVC材料作用后的吸光度值，通过标准曲线法得到固定的肝素量(Smith PK，Mallia AK，Hermanson GT.Colorimetric Method for the Assay ofHeparin content in immobilized heparin preparations[J].Analytical Biochemistry，1980，109(2)：466-473)，可见实施例1-5中肝素已经成功固定，这一点在分步制备样品6-10中也有相同的结果。

	吸光度值Abs	肝素密度ug/cm²
			实施例1	1.761	4.35
实施例2	1.883	2.74
			实施例3	1.810	3.71
实施例4	1.851	3.16
			实施例5	1.793	3.92

对涂层的高分子材料PVC进行实验，分别将实施例1-5的样品和相同条件分步进行制备的样品6-10进行凝血功能四项和抑制蛋白吸附的测试后，取平均数；采用10组相同的PVC作为对照进行相同的测试后，取平均数；其中凝血功能四项的测试采用Diagnostica Stago的STA-R自动凝血分析仪；蛋白吸附采用BCA法定量(Ishihara K，Fukumoto K，Iwasaki Y，Nakabayashi N.Modification of polysulfone withphospholipid polymer for improvement of the blood compatibility.Part 1.Surfacecharacterization.Biomaterials 1999，20(17)：1545-1551)

抑制蛋白吸附(改善了生物相容性)

涂层类型	HAS吸附(ug/cm²)	HPF吸附(ug/cm²)
			对照组	270.7	544.3
涂层组	108.5	157.9

*吸附蛋白采用BCA法定量

*HAS：人血清白蛋白HPF：人纤维蛋白原

从上述实验中可以看出，经过海藻酸钠OSA和肝素涂层的高分子材料在测试凝血功能四项、蛋白吸附性能中，与对照组相比，明显抑制凝血和蛋白吸附，有效改善生物相容性和凝血功能。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行：

步骤（1），将高分子材料浸泡在高锰酸钾的硫酸溶液中，进行酸化处理;

步骤（2），将经过酸化处理的材料置于聚乙烯亚胺溶液中，反应以得到氨基化修饰的表面;

步骤（3），将肝素钠溶于去离子水中混合均匀，加入亚硝酸钠，低温重氮化处理肝素钠，得到多糖片段A;

步骤（4），使用高碘酸或者高碘酸钠氧化处理海藻酸钠，使得海藻酸片段末端暴露醛基，得到多醛基海藻酸钠，即多糖片段B;

步骤（5），配置多糖片段A和B的反应液，将氨基化修饰表面的材料置于反应液中，通过终点固定法得到多糖分子片段复合涂层;

所述步骤（5）中，所述反应液为水溶液，其中多糖片段A0.1-0.8mg/mL，多糖片段B0.05-2mg/mL，NaCl0.15-0.55mol/L，氰基硼氢化钠0.01-0.1mg/mL；反应温度为30℃—60℃，反应时间至少2小时；或者分别配置多糖片段A和B的反应液，其中多糖片段A的反应液中多糖片段A0.1-0.8mg/mL，NaCl0.15-0.55mol/L，氰基硼氢化钠0.01-0.1mg/mL，多糖片段B的反应液中多糖片段B0.05-2mg/mL，NaCl0.15-0.55mol/L，氰基硼氢化钠0.01-0.1mg/mL，然后将氨基化修饰的高分子材料分别置于多糖片段A和B的反应液中，反应温度为30℃—60℃，反应时间至少2小时。

2.根据权利要求1所述的一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述高分子材料选择医用等级的聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚酯、硅橡胶、尼龙、聚碳酸酯或者聚四氟乙烯；所述高锰酸钾的硫酸溶液采利用如下方式进行制备：先将高锰酸钾溶解在去离子水中混合均匀，然后缓慢向其中加入质量百分数为95—98%的浓硫酸，搅拌混合至硫酸的质量百分数达到为10%—70%即可；进行酸化处理的时间为1min—10min，温度为20—25℃，在酸化处理过程中采用机械或者超声搅拌的方式加强反应的强度。

3.根据权利要求1所述的一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述聚乙烯亚胺溶液的质量百分浓度为0.005%-0.5%，反应时间为10min-60min，温度为20—25℃。

4.根据权利要求1所述的一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中进行低温重氮化处理肝素钠过程中，在0℃下重氮化处理至少1小时；所述亚硝酸钠的加入量根据肝素钠的用量进行调整，保证亚硝酸钠和肝素钠的等摩尔用量，或者其中之一过量。

5.根据权利要求4所述的一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，其特征在于,所述步骤（3）中进行低温重氮化处理肝素钠过程中，在0℃下重氮化处理1—2小时。

6.根据权利要求1所述的一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，高碘酸或者高碘酸钠与海藻酸钠的重复单元的摩尔比为（1—3）：10，氧化反应在避光条件下搅拌反应至少24小时；采用乙二醇终止反应，96wt%乙醇的水溶液进行沉淀，沉淀后抽滤、透析，-80℃冷冻干燥，得到多醛基海藻酸钠。

7.根据权利要求6所述的一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，氧化反应在避光条件下搅拌反应24—40小时。

8.根据权利要求1所述的一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，将氨基化修饰的高分子材料置于多糖片段A和B的反应液中，反应温度为40—50℃；反应时间2—6小时。

9.根据权利要求1所述的一种多糖分子片段复合涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，将氨基化修饰的高分子材料分别置于多糖片段A和B的反应液中，反应温度为40℃—50℃；反应时间2—6小时。