CN108503721A - 具有抗凝血功能活性多糖及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗凝血制剂及材料抗凝血修饰领域，具体涉及一种具有抗凝血功能活性多糖及其制备和应用。所述的复合多糖为多种硫酸化多糖的混合物。本发明选取多糖，采用浓硫酸法对其分别进行硫酸化修饰，硫酸多糖带有大量的负电荷基团，AT Ⅲ由于分子中存在懒氨酸和精氨酸残基，有高密度的正电荷，二者可以非特异性结合，诱导SPS改变立体构象，激活AT Ⅲ从而显示出较高的抗凝血功能，本发明创造性的将硫酸化多糖按照一定的方法制备成复合活性多糖，相对于单一的硫酸化多糖显示出更高的抗凝血功能，尤其相比于现在常用的低分子肝素的抗凝血效果提高1.1倍‑1.5倍；而实验也表明复合植物多糖与动物多糖后比单纯的动物多糖或单纯植物多糖的抗凝血效果提高1.2‑1.5倍。

Description

具有抗凝血功能活性多糖及其制备和应用

技术领域

本发明属于抗凝血制剂及材料抗凝血修饰领域，具体涉及一种具有抗凝血功能活性多糖及其制备和应用。

背景技术

多糖polysaccharide是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，它是生物体内重要的生物大分子，是维持生命活动正常运转的基本物质之一。多糖作为地球上第一大生物资源，广泛来自多个物种，包括微生物、藻类、植物及动，主要以淀粉、糖原、纤维素及壳多糖的形式存在，但大多数多糖并不具有生物活性。淀粉、纤维素等多糖的主要成分都不具有药理活性。为了能够使更多廉价易得的多糖造福人类，研究多糖的结构和功能甚至对多糖进行特定的结构修饰都成为多糖领域研究的重点。

多糖的活性与其分子结构有着直接或间接的关联，一般来说，化学基团的引入或改变会增强多糖的活性或使多糖产生新的活性。对多糖进行结构修饰的方法有很多种，主要包括化学法和生物法等，其中化学修饰的常见方法有硫酸化、醛基化、磷酸化、乙酰化、烷基化、磺酰化、羧甲基化等。此外，其它修饰方法如酶法、超声波等也有较好的运用。

硫酸多糖是一种单糖分子上的一个或多个羟基被硫酸根取代的多糖,硫酸多糖的化学结构是其生物活性的基础。国内外对硫酸多糖的探索集中在两方面，一是寻找到新的，更广泛，效用更高，副作用更小的来源，同时也在寻找修饰效果更好副作用更小的硫酸化方法；目前国内外学者持续探索研究硫酸多糖抗凝血活性机理，以及硫酸多糖结构和功能之间的构效关系。硫酸多糖的作用位点、活性中心、介导物质、作用凝血因子及其可能带来一些凝血方面的副作用正在进一步的研究中，需要重点和目的性地应用硫酸多糖带来技术支持。随着研究水平和技术的提高，更多深入、清楚的机理研究将为硫酸多糖的结构功能关系奠定更为深的基础，也为硫酸多糖的广泛应用提供更坚实的依据。

人与动物体内一旦发生凝血，就会危及生命。肝素是抗凝血的首选药物，广泛应用于临床，它是一种由葡萄糖胺，L－艾杜糖醛苷、N－乙酰葡萄糖胺和D－葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂。对低分子肝素(LMWH)的研究发现它口服易吸收，同时具有抗血栓作用，生物利用度高，是有效抗血栓类药物。但肝素还具有抗血小板活性，可导致不正常的流血现象，对人类和动物的伤害不容忽视。因此，利用好现有的抗凝血药物和开发新的抗凝血药物显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有抗凝血功能活性多糖制备及其应用。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种具有抗凝血功能活性的复合多糖，所述的复合多糖为多种硫酸化多糖的混合物。

所述的多糖为植物多糖、动物多糖或者海洋多糖。

所述的多糖为黄芪多糖、白芨多糖、海藻酸钠或者黏多糖。

所述的植物多糖：动物多糖：海洋多糖的质量比为1-35:1-35:0-30；

本发明还包括一种制备所述的具有抗凝血功能活性的复合多糖的方法，其特征在于，采用下述步骤：

1)多糖的活化：将多糖用乙醇进行活化；

2)硫酸化多糖：称取步骤1)活化后的多糖快速加入到硫酸化试剂中，冰浴条件下搅拌反应，待反应结束后加入碱性溶液调节pH值至中性，透析后倒入乙醇，得到白色沉淀，过滤干燥即得硫酸化多糖；所述的硫酸化试剂与所述的多糖的质量比例为1:200-1:850；

3)活性多糖的制备：取步骤2)中得到的硫酸化多糖溶于水，加入氧化性试剂，常温反应，反应结束后加入氯化钠乙醇溶液析出，将析出物进行抽滤干燥后溶于水用透析袋进行透析，低温真空干燥后即得抗凝血功能活性多糖粉末。

4)将步骤3)得到的多糖进行混合。

步骤2)中所述的硫酸化试剂采用下述步骤制得：准确量取98％浓硫酸200mL，置于烧杯中；准确量取95％乙醇106mL；冰浴条件下，向浓硫酸中缓慢滴加乙醇，搅拌反应6-12小时，得到硫酸化试剂。

步骤3)中的氧化性试剂为高碘酸钠或者过碘酸钠溶液；所述的氧化剂与所述的硫酸化多糖的质量比例为5-24：100。

步骤3)中透析袋的孔径为3500Da。

本发明还包括一种所述的具有抗凝血功能活性多糖的应用，将所述的具有抗凝血功能活性多糖接枝到氨基化的聚合物表面或者应用于抗凝血药物领域。

所述的聚合物为聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯、聚氨酯、或者聚碳酸酯中的一种或者几种混合。

具有抗凝血功能活性多糖接枝到氨基化的聚合物表面采用下述步骤：

1)将聚合物浸入到酸溶液进行酸化处理后干燥；所述的酸溶液采用下述方法制备：准确量取30mL98％浓硫酸，加入到154mL水中，称取0.368gKMnO4，配制而成；

2)聚合物氨基化；将步骤1)得到的聚合物浸入质量分数为0.01-0.05％的PEI溶液中进行氨基化处理20分钟，将处理后的聚合物取出，用蒸馏水清洗干净，自然干燥；

3)聚合物表面多糖修饰；取0.1g/L的活性多糖溶液100mL，加入1.0g-5.50NaCl和10mg-35mgNaBH3CN充分混匀，调节溶液pH为1.5-6.5，将步骤2)得到的氨基化聚合物浸入其中，40℃恒温水浴震荡反应2小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明选取多糖，采用浓硫酸法对其分别进行硫酸化修饰，硫酸多糖带有大量的负电荷基团，ATⅢ由于分子中存在懒氨酸和精氨酸残基，有高密度的正电荷，二者可以非特异性结合，诱导SPS改变立体构象，激活ATⅢ从而显示出较高的抗凝血功能，本发明创造性的将硫酸化多糖按照一定的方法制备成复合活性多糖，相对于单一的硫酸化多糖显示出更高的抗凝血功能，尤其相比于现在常用的低分子肝素的抗凝血效果提高1.1倍-1.5倍；而实验也表明复合植物多糖与动物多糖后比单纯的动物多糖或单纯植物多糖的抗凝血效果提高1.2-1.5倍。

同时本发明还包括将复合活性多糖作为各种医用抗凝血表面修饰的功能材料作为抗凝血材料。本发明通过对多糖氧化剂的浓度选择控制其氧化度，使其不会因为过高而对细胞表现出较明显的抑制作用，或者细胞毒性。实验证明，本发明得到的多糖修饰的抗凝血材料对蛋白的吸附量少，不会影响血液本身的蛋白含量，同时，该材料制得的血管表面平整，能够使血液流通顺畅。

附图说明

图1示出多糖硫酸化反应过程；

图2示出硫酸化多糖抗凝血效果指标tTT直方图；

图3示出硫酸化多糖抗凝血效果指标tAPTT直方图；

图4示出空白对照组电镜照片；

图5示出复合活性多糖修饰聚合物电镜照片；

图6示出硫酸化海藻酸钠多糖修饰聚合物电镜照片；

图7示出硫酸化黄芪多糖修饰聚合物电镜照片；

图8示出硫酸化白芨多糖修饰聚合物电镜照片；

图9示出空白对照组红外图谱；

图10示出复合活性多糖修饰聚合物红外图谱；

图11示出硫酸化海藻酸钠修饰聚合物红外图谱；

图12示出硫酸化黄芪多糖修饰聚合物红外图谱；

图13示出硫酸化白芨多糖修饰聚合物红外图谱。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

1.多糖的提取与纯化

1.1.白芨多糖的提取与纯化

准确称取340g白芨并打碎，向三颈烧瓶中加入5000mL水，缓慢加入白芨粉末，用电热搅拌器缓慢进行搅拌，控制温度在75-80℃，待加热搅拌4-5小时后，过滤弃去残渣，得到白芨多糖提取物。将提取物加热浓缩至3000mL，再倒入5倍体积的95％乙醇中，搅拌均匀，有白色絮状物析出，静置，将上层清液倒出，取出沉淀，干燥。再次溶于水中，用7000Da透析袋透析24小时，中间换去离子水3次后，取出倾倒在1500ml烧杯中，加入其体积5倍量95％乙醇沉淀、离心干燥得纯化白芨多糖。

1.2.黄芪多糖的提取与纯化

精密称取300g黄芪，用粉碎机打碎后，加水2800mL，95％乙醇150mL，用1mol/LNaOH调节PH为12，浸泡24小后，加热80至85℃，搅拌6小时后，过滤弃去滤渣，将上清液蒸发浓缩至1500mL,冷却至室温加入2倍体积的95％乙醇中，有白色絮状物析出，静置，将上层清液倒出，取出沉淀，干燥，再次溶于水中，用7000Da透析袋透析24小时，中间换去离子水3次后，取出倾倒在1500ml烧杯中，加入其体积5倍量95％乙醇沉淀、离心干燥得纯化黄芪多糖。

1.3.海藻酸钠纯化

准确称取100g海藻酸钠，加水2000mL，浸泡24小后，70至75℃磁力搅拌加热2小时后，过滤弃去残渣，倒入5倍体积的95％乙醇中，搅拌均匀，有白色絮状物析出，静置，将上层清液倒出，取出沉淀，干燥，再次溶于水中，用7000Da透析袋透析24小时，中间换去离子水3次后，取出倾倒在1500ml烧杯中，加入其体积5倍量95％乙醇沉淀、离心干燥得纯化海藻酸钠多糖。

2.多糖的硫酸化处理

多糖硫酸化反应过程如下图1示出。

2.1.硫酸化试剂的配制

准确量取98％浓硫酸200mL，置于烧杯中。准确量取95％乙醇106mL。冰浴条件下，向浓硫酸中缓慢滴加乙醇，搅拌反应8小时，得到硫酸化试剂。

2.2.硫酸化白芨多糖的制备

将提取纯化的的白芨多糖脱水干燥，密封保存。称取脱水白芨多糖10g，快速加入到22.8mL磺化剂中，冰浴条件下搅拌反应4小时。向反应物中加入1.25mol/L的NaOH溶液，调pH至7.0，得到淡黄色溶液。将所得溶液进行透析处理20小时，倒入2倍体积的95％乙醇中，有白色沉淀析出。静置24小时，将沉淀取出，干燥，得到硫酸化白芨多糖。

2.3.硫酸化黄芪多糖制备

将提取纯化的黄芪多糖脱水干燥，密封保存。称取脱水黄芪多糖10g，快速加入到22.8mL磺化剂中，冰浴条件下搅拌反应4小时。向反应物中加入1.25mol/L的NaOH溶液，调pH至7.0，得到淡黄色溶液。将所得溶液进行透析处理20小时，倒入2倍体积的95％乙醇中，有白色沉淀析出。静置24小时，将沉淀取出，干燥，得到硫酸化黄芪多糖。

2.4.硫酸化海藻酸钠制备

海藻酸钠脱水干燥，密封保存。称取脱水海藻酸钠10g，快速加入到22.8mL硫酸化试剂中，冰浴条件下搅拌反应4小时。向反应物中加入1.25mol/L的NaOH溶液，调pH至7.0，得到淡黄色溶液。将所得溶液进行透析处理20小时，倒入2倍体积的95％乙醇中，有白色沉淀析出。静置24小时，将沉淀取出，干燥，得到硫酸化海藻酸钠。

3.抗凝血功能复合活性多糖制备

分别取纯化干燥后硫酸化多糖共计42.26g充分混合溶解于2000g去离子水中，并加入高碘酸钠4.32g(或1mL的0.25mol/L过碘酸钠溶液)，避光反应24h，加入0.2mL乙二醇终止反应15min，得到抗凝血功能复合活性多糖溶液。向溶液加入3.0gNaCl充分混匀后倒入5倍体积的乙醇中，将析出物抽滤干燥后再次溶于去离子水中，用3500Da孔径的透析袋进行透析，低温真空干燥后获得抗凝血功能复合活性多糖粉末。

4.抗凝血活性测定

4.1.分五组：

A硫酸化海藻酸钠

B硫酸化黄芪多糖

C硫酸化白芨多糖

D复合活性多糖

E对照组

各组多糖材料分别取0.10g，溶于50ml蒸馏水，搅拌直至完全溶解，用微量加样器取出50微升，每样取三组，以0.9％NaCl做空白实验为对照组，进行加样。

4.2.贫血小板血浆(PPP)制备

选取健康志愿者新鲜全血20mL，3000r/min离心10min，获得贫血小板血浆(Platelet-poorplasma，PPP)，以备待用。

4.3.凝血功能检测

每个样品置于24孔培养板内，用微量加样器分别加入PPP700ul,37℃恒温水箱孵育2小时后，抽取孵育后血浆，加入离心管震摇混匀30s，测定凝血功能四项指标APTT、TT、PT和FT，空白管作以实验的空白对照组。

5.聚合物表面抗凝血修饰

5.1.聚合物预处理

聚合物(包括聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酯、聚氨酯、聚碳酸酯等)，本发明试验选择2cm2聚偏氟乙烯，准确量取30mL98％浓硫酸，加入到154mL水中，称取0.368gKMnO4，配制成质量分数为60％酸溶液。将2cm2聚偏氟乙烯浸入到酸溶液中，酸化处理5min，用蒸馏水冲洗干净，自然干燥。

5.2.聚合物氨基化

将预处理后的聚偏氟乙烯浸入质量分数为0.01-0.05％的PEI溶液中进行氨基化处理20分钟，将处理后的聚偏氟乙烯取出，用蒸馏水清洗干净，自然干燥。

5.3.聚合物表面多糖修饰

取0.1g/L的复合活性多糖溶液100mL，加入1.75gNaCl和20mgNaBH3CN充分混匀，调节溶液pH为3.5，将聚偏氟乙烯浸入反应液中，40℃恒温水浴震荡反应2小时。

6.多糖修饰聚合物表面形态及功能基团表征

6.1.多糖修饰聚合物表面形态观察

将多糖修饰聚合物样品表面喷金，用扫描电镜观察修饰前后聚合物材料表面形态变化。

6.2.多糖修饰聚合物表面功能基团特性分析

将多糖修饰聚合物用红外扫描探头直接检测，表征其功能基团。

7.多糖修饰聚合物表面凝血时间测定

取健康志愿者新鲜全血20mL，3000r/min离心10分钟，获得贫血小板血浆(Platelet-poorplasma，PPP)，测定凝血功能APTT、TT、PT和FIB；分别取10cm2不同多糖修饰聚合物材料，剪成约0.5cm*0.5cm的碎片，置于24孔培养板内；每个多糖修饰聚合物样品孔中分别加入PPP700μL，37℃恒温孵育2小时；抽取孵育后的血浆，加入离心管内振荡摇匀30s，再次测定四项凝血指标，每组做6次，计算每组样品凝血时间差值。

8.统计方法

采用SPSS23.0软件进行数据分析。

实验结果

1.不同硫酸化多糖抗凝血活性比较

以硫酸化多糖为横轴，APTT、TT时间为纵轴，再以APTT、TT各自的原始数作差取平均值为条形图的面积大小表示抗凝血效果，空白管作以对照组。图2示出硫酸化多糖抗凝血效果指标tTT直方图。图3示出硫酸化多糖抗凝血效果指标tAPTT直方图。图2.图3显示.复合活性多糖tAPTT和tTT的时间明显高于硫酸化海藻酸钠、硫酸化黄芪多糖、硫酸化白芨多糖的时间，复合活性多糖协同作用，使其抗凝血效果明显增高。

2.多糖修饰聚合物表面形态及功能基团表征结果

2.1.多糖修饰聚合物电镜结果；

2.2.红外检测结果

通过红外光谱法检测到多糖修饰聚合物在3350nm均有一个宽且较浅的醛基吸收峰，而空白对照组没有这个吸收峰，表明实验中多糖硫酸酯已成功固定在聚合物表面。

3.多糖修饰聚合物表面凝血时间测定：

通过对反应前后凝血常规APTT指标的分析，可见经过多糖修饰聚合物APTT均显著高于空白对照组，聚合物表面的抗凝血性能有明显改善(P<0.05)。四种硫酸多糖修饰聚合物之间APTT未有明显差异(P>0.05)，但均显著长于空白对照组(P<0.05)。复合活性多糖修饰聚合物TT均显著高于其他组，说明均复合活性多糖有良好的抗凝血性能。表1示出多糖修饰聚合物表面凝血常规四项(x±s,n＝6)其中，复合活性多糖A＝硫酸化海藻酸钠+硫酸化黄芪多糖+黏多糖硫酸脂，质量比为1:3:3；复合活性多糖B＝硫酸化黄芪多糖+硫酸化白芨多糖，质量比为：1:5,复合活性多糖C＝硫酸化白芨多糖+黏多糖硫酸脂,质量比为：1：1；复合活性多糖D＝硫酸化海藻酸钠+硫酸化黄芪多糖+黏多糖硫酸脂，质量比为1:35:15；复合活性多糖E＝硫酸化海藻酸钠+硫酸化黄芪多糖+黏多糖硫酸脂，质量比为35:1:30。表1示出不同的多糖修饰聚合物表面得到的抗凝血材料的性能测试结果。

表1

4.不同修饰表面亲水性实验

微量进样器在干燥后样品表面滴加2μL纯水，用动态接触角测量仪记录接触角随时间的变化，每个样品每次测量5个点，每点计量10次取平均值。通过测定材料表面接触角的变化，来表征涂层的亲水特性。表2示出不同修饰表面接触角。通过表2可以看出本申请得到的多糖修饰的抗凝血材料亲水性好，能够使该材料制得的血管中的血流通畅。

表2

5不同修饰表面蛋白吸附实验

表面粘附蛋白的定量采用BCA法，依据BCA试剂盒方法建立蛋白浓度标准曲线。将待测样品剪成0.5cm×0.5cm碎片，加入24孔培养板；配置0.2mg/ml人血清白蛋白(humanplasma albumin，HAS)和人纤维蛋白原(human protein fibriogen，HPF)稀释液；配置BCA工作液；向放置待测样品的培养孔中，分别加入1.5mLHSA和HPF稀释液，将材料完全浸没，放入恒温水箱中，37℃孵浴1h；将孵育后蛋白液全部取出，加入离心管中震荡混匀后待测；取100μL待测蛋白液，加入洁净的离心小管中，同时加入BCA工作液1mL，再次震荡混匀后，60℃恒温孵浴30min；利用紫外分光光度计测定孵浴后混合液在562nm波长处Abs值，根据标准曲线，计算反应前后蛋白差值，即为材料表面蛋白粘附量。表3示出不同修饰表面蛋白吸附；从表3可以看出本申请制得的抗凝血材料对蛋白的吸附量小，不影响血液中蛋白的品质。

表3

注：*HAS：人血清白蛋白，HPF：人血浆纤维蛋白原

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有抗凝血功能活性的复合多糖，其特征在于，所述的复合多糖为多种硫酸化多糖的混合物。

2.根据权利要求1所述的具有抗凝血功能活性的复合多糖，其特征在于，所述的多糖为植物多糖、动物多糖或者海洋多糖。

3.根据权利要求1所述的具有抗凝血功能活性的复合多糖，其特征在于，所述的多糖为黄芪多糖、白芨多糖、海藻酸钠或者黏多糖。

4.根据权利要求2所述的具有抗凝血功能活性的复合多糖，其特征在于，所述的植物多糖：动物多糖：海洋多糖的质量比为1-35:1-35:0-30。

5.一种制备根据权利要求1-4任一项所述的具有抗凝血功能活性的复合多糖的方法，其特征在于，采用下述步骤：

1)多糖的活化：将多糖用乙醇进行活化；

2)硫酸化多糖：称取步骤1)活化后的多糖快速加入到硫酸化试剂中，冰浴条件下搅拌反应，待反应结束后加入碱性溶液调节pH值至中性，透析后倒入乙醇，得到白色沉淀，过滤干燥即得硫酸化多糖；所述的硫酸化试剂与所述的多糖的质量比例为1:200-1:850；

3)活性多糖的制备：取步骤2)中得到的硫酸化多糖溶于水，加入氧化性试剂，常温反应，反应结束后加入氯化钠乙醇溶液析出，将析出物进行抽滤干燥后溶于水用透析袋进行透析，低温真空干燥后即得抗凝血功能活性多糖粉末。

4)将步骤3)得到的多糖进行混合。

6.根据权利要求5所述的具有抗凝血功能活性多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的硫酸化试剂采用下述步骤制得：准确量取98％浓硫酸200mL，置于烧杯中；准确量取95％乙醇106mL；冰浴条件下，向浓硫酸中缓慢滴加乙醇，搅拌反应6-12小时，得到硫酸化试剂。

7.根据权利要求5所述的具有抗凝血功能活性多糖的制备方法，其特征在于，步骤3)中的氧化性试剂为高碘酸钠或者过碘酸钠溶液；所述的氧化剂与所述的硫酸化多糖的质量比例为5-24：100。

8.根据权利要求5所述的具有抗凝血功能活性多糖的制备方法，其特征在于，步骤3)中透析袋的孔径为3500Da。

9.一种根据权利要求1-4任一项所述的具有抗凝血功能活性多糖的应用，其特征在于，将所述的具有抗凝血功能活性多糖接枝到氨基化的聚合物表面或者应用于抗凝血药物领域。

10.根据权利要求9所述的具有抗凝血功能活性多糖的应用，其特征在于，具有抗凝血功能活性多糖接枝到氨基化的聚合物表面采用下述步骤：

1)将聚合物浸入到酸溶液进行酸化处理后干燥；所述的酸溶液采用下述方法制备：准确量取30mL98％浓硫酸，加入到154mL水中，称取0.368gKMnO4，配制而成；

2)聚合物氨基化；将步骤1)得到的聚合物浸入质量分数为0.01-0.05％的PEI溶液中进行氨基化处理20分钟，将处理后的聚合物取出，用蒸馏水清洗干净，自然干燥；

3)聚合物表面多糖修饰；取0.1g/L的活性多糖溶液100mL，加入1.0g-5.50NaCl和10mg-35mgNaBH3CN充分混匀，调节溶液pH为1.5-6.5，将步骤2)得到的氨基化聚合物浸入其中，40℃恒温水浴震荡反应2小时。