发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的价廉、疗效好的具有抗凝血作用的壳聚糖衍生物的制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种壳聚糖衍生物的制备方法,其具体制备步骤如下:
将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中,所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为4∶25,搅拌均匀,并将其升温至30~50℃,然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖,搅拌并反应12~18h后,再滴加质量分数为10~30%的氢氧化钠溶液,中和至pH值为6~8,过滤,取滤液待用;再将得到的滤液进行透析, 透析结束后进行冷冻干燥,得到所述的壳聚糖衍生物。
在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进。
进一步,所述丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的制备方法为:
(1)将质量分数为1~5%的醋酸溶液加入到精制壳聚糖中,搅拌,溶解1~3h,得到壳聚糖的醋酸溶液,备用,所述醋酸溶液与精制壳聚糖的质量比为80∶1~40∶1;
(2)将二氯甲烷加入到胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解,所述胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为10~30∶10~20∶1~3,溶解,加热至40~60℃并反应24~48小时,反应结束后过滤,得到滤液,将所述滤液洗涤后,除去尽可能的杂质,再进行减压蒸除溶剂,再加入丙酮溶液,重结晶,得到丁二酸单胆固醇酯(琥珀酸单胆固醇酯),所述丙酮溶液与所述二氯甲烷的体积比为1∶1;
(3)将步骤(2)中得到的丁二酸单胆固醇酯滴加到丙酮中,溶解,得到丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液;
(4)将步骤(1)中制得的壳聚糖的醋酸溶液加热至30~50℃并不断搅拌,然后将步骤(3)中制得的丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中,反应15~25小时,反应结束后,再加入丙酮,出现沉淀物,过滤后得到沉淀物;
(5)将步骤(4)中得到的沉淀物,用丙酮洗涤,再过滤除去丙酮,得到洗涤后的沉淀物,最后将洗涤后的沉淀物进行干燥,得到所述的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖。
进一步,在步骤(2)中,所述滤液洗涤是用去离子水洗涤两次后再用质量分数为5%HCl溶液洗涤两次。
进一步,在步骤(4)中所述再加入的丙酮与步骤(3)中丙酮的体积比为3∶1。
进一步,在步骤(5)中,所述用丙酮洗涤的次数为3~5次。
进一步,在步骤(5)中,所述将洗涤后的沉淀物进行干燥的温度为20~80℃。
进一步,在步骤(1)中,所述精制壳聚糖的制备方法为:
1)将质量分数为1~5%的醋酸加入到壳聚糖中,搅拌,溶解,溶解后再过滤,得到滤液;
2)向步骤1)得到的滤液中加入质量分数为2~8%的氢氧化钠溶液,调节pH值至7~8,出现沉淀物,过滤,洗涤,再过滤,得到沉淀物;
3)将步骤2)中得到的沉淀物进行干燥,即得所述的精制壳聚糖。
进一步,在步骤2)中,所述洗涤所述洗涤用的溶液为蒸馏水。
进一步,在步骤3)中,所述干燥的时间为24~48小时。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种用上述制备方法制得的壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。
血红细胞膜具有由磷脂分子及胆固醇分子自组装形成的双层膜.因此设计了含有胆固醇基的细胞膜仿生生物材料,有效地改善了材料的血液相容性。壳聚糖(Chitosan,CS)是甲壳素部分脱乙酰化的产物。这种天然的聚合物具有无毒性、生物降解性和生物相容性的特性,在医学领域具有广泛的应用价值。壳聚糖本身具有很强的凝血作用,其很多衍生物却有较好的抗凝血作用。
本发明的有益效果为:本发明的壳聚糖衍生物,即O-磺酸基-N-胆甾醇-壳聚糖具有良好的抗凝血性,且价格低廉,极有希望作为肝素的替代物用于临床。为临床提供一种新的价廉、疗效好的抗凝血剂。而且合成过程易于操作,简便医德,易于工业化大生产,产业化程度高,投入及开发成本较小,为一种良好的具有潜在价值的海洋新药。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种壳聚糖衍生物的制备方法,其具体制备步骤如下:
1、壳聚糖的精制
配置质量分数为1%的醋酸溶液:用移液管移取2.5ml冰醋酸溶液于250ml容量瓶,用去离子水定容到刻线,摇匀即得。
配置2%的氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠颗粒2g,用去离子水溶于小烧杯中,转移至100ml量瓶,再用去离子水定容,摇匀即得。
称取5.0g壳聚糖置于500ml小烧杯中,加入250ml的1%醋酸,置于恒温磁力搅拌器上搅拌溶解。溶解后,将壳聚糖溶液用布氏漏斗抽滤。滤液转移至500ml的烧杯,用2%的氢氧化钠溶液调节pH至7,此时出现大量白色沉淀。再次抽滤,并用蒸馏水洗至中性,抽滤脱水,滤饼至于表面皿中。将表面皿置于真空干燥箱干燥24小时,即得精制壳聚糖。
2、丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的合成
丁二酸单胆固醇酯的合成:分别称取2.0g胆固醇(5mmol)、1.5g丁二酸酐(15mmol)、0.1g DMAP(0.8mmol),置于100ml圆底烧瓶中,加入40ml二氯甲烷溶解,将圆底烧瓶置于恒温水浴锅中,加热至回流,恒温反应40h。反应结束后,抽滤,滤液用去离子水,质量分数为5%HCl(2mol/L)溶液各 洗涤两次(20ml)后,减压蒸除溶剂。并置于烧杯中,加入丙酮溶液,重结晶,出现白色固体。
配置2%的醋酸溶液:用移液管移取1ml冰醋酸溶液于50ml容量瓶,用去离子水定容到刻线,摇匀即得。
胆固醇壳聚糖的合成:称取0.25g精制壳聚糖于100ml圆底烧瓶,加入15ml、1%的醋酸溶液,置于恒温磁力搅拌器上搅拌溶解1h。精密称取单胆固醇琥珀酸酯12.6mg,于小烧杯中溶于5ml丙酮。将圆底烧瓶转移到恒温水浴锅中,升温到40℃。恒温搅拌下,将单胆固醇琥珀酸酯的丙酮溶液滴加到圆底烧瓶中,并反应20h。反应结束后,在其中加入3倍丙酮(约45ml丙酮),出现大量白色沉淀。抽滤,滤饼用丙酮洗涤4次,抽滤除去丙酮。滤饼置于表面皿上,40℃下置于真空干燥箱干燥即得。
3、磺酸基壳聚糖的制备
量取25mlDMF置于100ml圆底烧瓶,冰水浴搅拌下滴加约4ml氯磺酸,搅拌混匀。将圆底烧瓶转移至恒温水浴锅,升温至40℃,加入精密称取的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖197.9mg,恒温搅拌反应15h。
20%氢氧化钠溶液的配置:称取氢氧化钠颗粒20g,用去离子水溶于小烧杯中,转移至100ml量瓶,再用去离子水定容,摇匀即得。
反应结束后将圆底烧瓶置于冰水浴中,滴加20%氢氧化钠溶液中和至中性,出现白色沉淀。抽滤,取滤液储存于小烧杯待用。
透析袋的处理:选截留分子量为8000~12000的透析带,剪成长约5cm,宽约3cm的两段,并剪四段细线,一起放入1000ml的大烧杯,在烧杯中加满去离子水,并于多功能万用电炉上加热煮沸30min。30min后,用镊子夹出透析带,用煮过的细线绑住一端,搓开带子呈袋状,待其中加入待透析液,封住另一端即得。
透析:将小烧杯中的滤液封入两个透析袋中,分别放入盛满去离子水的 1000ml大烧杯中,置于恒温磁力搅拌器上搅拌2d,且每隔6h换一次水。
冷冻干燥:透析结束后,取透析液装入10ml西林瓶,每瓶装入约五分之一的透析液。封口后置于冷冻干燥箱中冷冻干燥。为证实所得产物的确是所要物质,用氢谱对产物进行表征,可证实。
一种用实施例1的制备方法制得的壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。
实施例2
一种壳聚糖衍生物的制备方法,其具体制备步骤如下:
1、壳聚糖的精制
1)将质量分数为1%的醋酸加入到壳聚糖中,搅拌,溶解,溶解后再过滤,得到滤液;
2)向步骤1)得到的滤液中加入质量分数为2%的氢氧化钠溶液,调节pH值至7,出现沉淀物,过滤,再用蒸馏水洗涤,再过滤,得到沉淀物;
3)将步骤2)中得到的沉淀物进行干燥,干燥时间为24小时,即得所述的精制壳聚糖。
2、丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的合成
(1)将质量分数为1%的醋酸溶液加入到精制壳聚糖中,搅拌,溶解1h,得到壳聚糖的醋酸溶液,备用,所述醋酸溶液与精制壳聚糖的质量比为40∶1;
(2)将二氯甲烷加入到胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解,所述胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为10∶10∶1,溶解,加热至40℃并反应24小时,反应结束后过滤,得到滤液,将所述滤液用去离子水洗涤两次后再用质量分数为5%HCl溶液洗涤两次后,除去尽可能的杂质,再进行减压蒸除溶剂,再加入丙酮溶液,重结晶,得到丁二酸单胆固醇酯(琥珀酸单胆固醇酯),所述丙酮溶液与所述二氯甲烷的体积比为1∶1;
(3)将步骤(2)中得到的丁二酸单胆固醇酯滴加到丙酮中,溶解,得 到丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液;
(4)将步骤(1)中制得的壳聚糖的醋酸溶液加热至30℃并不断搅拌,然后将步骤(3)中制得的丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中,反应15小时,反应结束后,再加入丙酮(再加入的丙酮与步骤(3)中丙酮的体积比为3∶1),出现沉淀物,过滤后得到沉淀物;
(5)将步骤(4)中得到的沉淀物,用丙酮洗涤3次,再过滤除去丙酮,得到洗涤后的沉淀物,最后将洗涤后的沉淀物在20℃下进行干燥,得到所述的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖。
3、磺酸基壳聚糖的制备
将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中,所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为1∶10,搅拌均匀,并将其升温至30℃,然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖,搅拌并反应12h后,再滴加质量分数为10%的氢氧化钠溶液,中和至pH值为6,过滤,取滤液待用;再将得到的滤液进行透析,透析结束后进行冷冻干燥,得到所述的壳聚糖衍生物。为证实所得产物的确是所要物质,用氢谱对产物进行表征,可证实。
一种用实施例2的制备方法制得的壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。
实施例3
一种壳聚糖衍生物的制备方法,其具体制备步骤如下:
1、壳聚糖的精制
1)将质量分数为3%的醋酸加入到壳聚糖中,搅拌,溶解,溶解后再过滤,得到滤液;
2)向步骤1)得到的滤液中加入质量分数为5%的氢氧化钠溶液,调节pH值至7.5,出现沉淀物,过滤,再用蒸馏水洗涤,再过滤,得到沉淀物;
3)将步骤2)中得到的沉淀物进行干燥,干燥时间为36小时,即得所 述的精制壳聚糖。
2、丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的合成
(1)将质量分数为3%的醋酸溶液加入到精制壳聚糖中,搅拌,溶解2h,得到壳聚糖的醋酸溶液,备用,所述醋酸溶液与精制壳聚糖的质量比为60∶1;
(2)将二氯甲烷加入到胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解,所述胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为20∶15∶2,溶解,加热至50℃并反应36小时,反应结束后过滤,得到滤液,将所述滤液用去离子水洗涤两次后再用质量分数为5%HCl溶液洗涤两次后,除去尽可能的杂质,再进行减压蒸除溶剂,再加入丙酮溶液,重结晶,得到丁二酸单胆固醇酯(琥珀酸单胆固醇酯),所述丙酮溶液与所述二氯甲烷的体积比为1∶1;
(3)将步骤(2)中得到的丁二酸单胆固醇酯滴加到丙酮中,溶解,得到丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液;
(4)将步骤(1)中制得的壳聚糖的醋酸溶液加热至40℃并不断搅拌,然后将步骤(3)中制得的丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液滴加到壳聚糖的醋酸溶液中,反应20小时,反应结束后,再加入丙酮(再加入的丙酮与步骤(3)中丙酮的体积比为3∶1),出现沉淀物,过滤后得到沉淀物;
(5)将步骤(4)中得到的沉淀物,用丙酮洗涤4次,再过滤除去丙酮,得到洗涤后的沉淀物,最后将洗涤后的沉淀物在50℃下进行干燥,得到所述的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖。
3、磺酸基壳聚糖的制备
将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中,所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为4∶25,搅拌均匀,并将其升温至40℃,然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖,搅拌并反应15h后,再滴加质量分数为20%的氢氧化钠溶液,中和至pH值为7,过滤,取滤液待用;再将得到的滤液进行透析,透析结束后进行冷冻干燥,得到所述的壳聚糖衍生物。为证实所得产物的确是所要物质,用氢 谱对产物进行表征,可证实。
一种用实施例3的制备方法制得的壳聚糖衍生物在抗凝血药物上的应用。
实施例4
一种壳聚糖衍生物的制备方法,其具体制备步骤如下:
1、壳聚糖的精制
1)将质量分数为5%的醋酸加入到壳聚糖中,搅拌,溶解,溶解后再过滤,得到滤液;
2)向步骤1)得到的滤液中加入质量分数为8%的氢氧化钠溶液,调节pH值至8,出现沉淀物,过滤,再用蒸馏水洗涤,再过滤,得到沉淀物;
3)将步骤2)中得到的沉淀物进行干燥,干燥时间为48小时,即得所述的精制壳聚糖。
2、丁二酸单胆固醇酯壳聚糖的合成
(1)将质量分数为5%的醋酸溶液加入到精制壳聚糖中,搅拌,溶解3h,得到壳聚糖的醋酸溶液,备用,所述醋酸溶液与精制壳聚糖的质量比为80∶1;
(2)将二氯甲烷加入到胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶中使之溶解,所述胆固醇、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的质量比为30∶20∶3,溶解,加热至60℃并反应48小时,反应结束后过滤,得到滤液,将所述滤液用去离子水洗涤两次后再用质量分数为5%HC l溶液洗涤两次后,除去尽可能的杂质,再进行减压蒸除溶剂,再加入丙酮溶液,重结晶,得到丁二酸单胆固醇酯(琥珀酸单胆固醇酯),所述丙酮溶液与所述二氯甲烷的体积比为1∶1;
(3)将步骤(2)中得到的丁二酸单胆固醇酯滴加到丙酮中,溶解,得到丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液;
(4)将步骤(1)中制得的壳聚糖的醋酸溶液加热至50℃并不断搅拌,然后将步骤(3)中制得的丁二酸单胆固醇酯的丙酮溶液滴加到壳聚糖的醋 酸溶液中,反应25小时,反应结束后,再加入丙酮(再加入的丙酮与步骤(3)中丙酮的体积比为3∶1),出现沉淀物,过滤后得到沉淀物;
(5)将步骤(4)中得到的沉淀物,用丙酮洗涤5次,再过滤除去丙酮,得到洗涤后的沉淀物,最后将洗涤后的沉淀物在80℃下进行干燥,得到所述的丁二酸单胆固醇酯壳聚糖。
3、磺酸基壳聚糖的制备
将氯磺酸滴加到二甲基甲酰胺中,所述氯磺酸与二甲基甲酰胺的体积比为6∶40,搅拌均匀,并将其升温至50℃,然后加入丁二酸单胆固醇酯壳聚糖,搅拌并反应18h后,再滴加质量分数为30%的氢氧化钠溶液,中和至pH值为8,过滤,取滤液待用;再将得到的滤液进行透析,透析结束后进行冷冻干燥,得到所述的壳聚糖衍生物。为证实所得产物的确是所要物质,用氢谱对产物进行表征,可证实。
对比实施例5
丁二酰化壳聚糖衍生物的制备
配置2%的盐酸溶液:精密移取2.7ml的38%盐酸溶液,置于50ml小烧杯中,用去离子水稀释,后转移至50ml量瓶中,去离子水定容,摇匀即得。
丁二酸酐丙酮溶液的配置:精密称取丁二酸酐23mg于10ml小量瓶,加入丙酮溶液溶解并定容,摇匀即得。
精密称取精制壳聚糖0.51g于100ml烧杯中,加入2%盐酸溶液50ml,置于恒温磁力搅拌器上搅拌溶解,储存过夜。将烧杯中壳聚糖盐酸溶液转移至100ml圆底烧瓶,并将圆底烧瓶置于恒温水浴锅中,调节温度至40℃,同时搅拌。移取1ml丁二酸酐丙酮溶液,搅拌下,缓慢滴加到壳聚糖溶液中,恒温反应4小时。反应结束后,用3倍丙酮溶液(约150ml左右)沉淀。然后用布氏漏斗抽滤,沉淀物再用丙酮溶液洗涤5次,抽滤脱去丙酮。将白色滤饼置于表面皿中,并于40℃真空干燥箱干燥至恒重。
具体实验验证
试验实施例1
壳聚糖衍生物体外抗凝血的验证
磺酸基壳聚糖的体外抗凝血实验:取两只直径1cm,长10cm的玻璃试管,编号为1和2。1号加入0.2ml磺酸基壳聚糖透析液,2号不加。然后分别加入新鲜小鼠血液0.3ml,立刻混匀,并于37℃水浴,每隔30s倾斜玻璃管,记录血液凝固时间。每组测量三个样本。
0.01mol/L PBS溶液的配置:称取十二水合磷酸氢二钠2.9g,二水合磷酸二氢钠0.3g于100ml容量瓶中,加去离子水溶解并定容到刻线,摇匀即得0.1mo l/LpH为7.4的PBS溶液。移取该溶液1ml于10ml容量瓶,加去离子水定容到刻线,摇匀即得。
丁二酰化壳聚糖溶液的配置:精密称取10.2mg丁二酰化壳聚糖于小烧杯,加入0.01mol/L PBS溶液搅拌溶解,即得。
丁二酰化壳聚糖的体外抗凝血实验:取两只直径1cm,长10cm的玻璃试管,编号为3和4。3号加入0.2ml丁二酰化壳聚糖溶液,4号不加。然后分别加入新鲜小鼠血液0.3ml,立刻混匀,并于37℃水浴,每隔30s倾斜玻璃管,记录血液凝固时间。每组测量三个样本。
试验实施例2
壳聚糖衍生物的抗凝血指数和溶血度
小鼠眼睑取血:先取EP管,滴入肝素钠注射液1滴,旋转使整个EP管均匀铺满肝素钠注射液。取玻璃吸管插入小鼠眼角部位,旋转取血,用肝素钠注射液的EP管接血,轻轻混匀。
生理盐水的配置:称取0.9g氯化钠于100ml容量瓶,加去离子水使其溶解,并定容的刻线,即得。
0.5mol/L醋酸溶液的配置:查资料可知冰醋酸浓度为17.485mol/L。用 移液管移取0.29ml冰醋酸溶液于10ml小量瓶,加去离子水定容到刻度线,摇匀即得。
1%壳聚糖和1%丁二酰化壳聚糖溶液的配制:分别精密称取壳聚糖和丁二酰化壳聚糖各50mg于小烧杯,加入0.5mol/L醋酸溶液溶解,待完全溶解后转移至5ml小量瓶,并定容至刻度线,摇匀即得。
抗凝血实验:取三只100ml小烧杯,编号分别为1,2,3号。1号加入0.1ml磺酸基壳聚糖透析液,2号加入1ml 1%丁二酰化壳聚糖溶液,3号什么都不加。再分别加入0.2ml新鲜抗凝小鼠血,轻轻混匀并使之平铺于烧杯底部。5分钟后,将50ml生理盐水缓慢流注于血液表面,轻轻摇匀后用紫外-可见分光光度计在540nm处测吸光度值。按照相同方法每个样品平行测定5次,其平均吸光度值记为As,材料的抗凝血指数(BCI)定义为:
BCI=As/Aw×100% (1)
Aw为0.2mL新鲜抗凝小鼠血与50ml生理盐水混合后的吸光度。
溶血实验:取新鲜抗凝小鼠血0.4ml加生理盐水0.5ml得稀释血。取5只离心试管并编号为A,B,C,D,E号。A加入4.5ml生理盐水和0.5ml 1%的壳聚糖醋酸溶液,B加入4.5ml生理盐水和0.5ml 1%的丁二酰化壳聚糖醋酸溶液,C加入4.5ml生理盐水和0.1ml磺酸基壳聚糖透析液。37℃恒温30min后加入稀释血0.2mL,继续恒温60min,再以900r/min离心8min,取上清液用紫外-可见分光光度计在540nm处测吸光度值,5次平行测定吸光度平均值记为AS。按同样方法,D为阳性对照,用5mL蒸馏水加稀释血0.2mL;E为阴性对照,用5mL生理盐水加稀释血0.2mL,分别测定吸光度值。按下式计算材料的溶血度:
HR=(AS-AN)/(AP-AN)×100% (2)
式中AP阳性对照吸光度,AN为阴性对照吸光度。
试验实施例3
磺酸基壳聚糖的表征
制备的磺酸基壳聚糖透析液澄清透明,冻干后呈白色絮状。冻干的磺酸基壳聚糖溶解于D20中,记录磺酸基壳聚糖的1H-NMR如图2所示。
如图2所示,壳聚糖已经成功接枝了磺酸基和丁二酸酐胆固醇(4~5部位为壳聚糖本体,2~3为磺酸基部位,8~9为胆固醇部位),说明磺酸基壳聚糖合成。
试验实施例4
壳聚糖衍生物抗凝血作用的验证
磺酸基壳聚糖体外抗凝血实验:加入磺酸基壳聚糖与未加的小鼠血液凝血时间如表1所示。
表1磺酸基壳聚糖体外抗凝血时间
从上表可以看出,相同条件下,加入磺酸基壳聚糖的小鼠血液凝固时间要远远长于未加该壳聚糖的血液,说明磺酸基壳聚糖具有很好的抗凝血作用。
空白血液完全凝固,而磺酸基壳聚糖后的血液一直未凝固。取加入磺酸基壳聚糖的小鼠血液,做成血涂片,并置于显微镜下观察,可观察到有完整的红细胞。说明加入磺酸基壳聚糖溶液的小鼠血液并没有全部溶血,磺酸基壳聚糖的确具有很好的抗凝血效果。
丁二酰化壳聚糖的体外抗凝血实验:加入丁二酰化壳聚糖与未加的小鼠血液凝血时间如表2所示。
表2丁二酰化壳聚糖体外抗凝血时间
从上表可以看出,相同条件下,加入丁二酰化壳聚糖的小鼠血液凝固时间长于未加该壳聚糖的血液,说明丁二酰化壳聚糖也有抗凝血作用。
空白血液完全凝固,而加入丁二酰化壳聚糖后的血液后来也凝固了,由于丁二酰化壳聚糖溶于PBS中,故出现了一定的溶血血现象。
说明丁二酰化壳聚糖虽然也具有抗凝血作用,但抗凝血效果不理想。
试验实施例5
壳聚糖衍生物的抗凝血指数和溶血度
壳聚糖衍生物的抗凝血指数:加入壳聚糖衍生物和空白血液经处理后吸光度值如下表所示。
表3抗凝血试验
表3抗凝血试验
材料的抗凝血指数BCI=As/Aw×100%(1),所以磺酸基壳聚糖的抗凝血指数为99.2%,丁二酰化壳聚糖的抗凝血指数为15.2%。由以上计算可知,磺酸基壳聚糖的抗凝血指数远远大于丁二酰化壳聚糖,由此可看出,磺酸基壳聚糖和丁二酰化壳聚糖都具有凝血作用,且前者的抗凝血效果要强于后者。
分析:壳聚糖之所以具有凝血作用,是因为壳聚糖为碱性多糖,当与血 液接触时,由于材料表面的氨基(NH2)质子化作用而使材料表面产生正电基团(-NH3 +),从而吸附血液中带负电的红细胞、白细胞、血小板等形成血栓。磺酸基壳聚糖的等电点约为pH=4.9,当与血液(pH=7.35~7.45)接触时,会电离出大量的-SO3 -离子,使材料表面带有大量的负电荷,从而阻止红细胞、血小板等凝聚,抑制凝血活酶形成,解除抗凝血活酶抑制,表现出抗凝血活性。而丁二酰化壳聚糖溶于水,从而避免了氨基的质子化作用,但它只能电离出极少带负电的离子,故丁二酰化壳聚糖抗虽有凝血作用,效果却不及磺酸基壳聚糖好。
壳聚糖衍生物的溶血度:加入壳聚糖衍生物的血液和空白血液经处理后吸光度值如下表所示。
表4溶血试验
材料的溶血度HR=(AS-AN)/(AP-AN)×100%(2),所以壳聚糖的溶血度为87.6%,丁二酰化壳聚糖的溶血度为86%,磺酸基壳聚糖的溶血度为0.14%。由以上计算可知,壳聚糖的溶血度很高,丁二酰化壳聚糖的溶血度也很高,磺酸基壳聚糖几乎不容血。另外,磺酸基壳聚糖的溶血度小于5%,也从另一方面说明制备的磺酸基壳聚糖合格。
溶血实验是通过测定材料与血红细胞在体外接触过程中导致红细胞溶解和血红蛋白游离程度来评价材料的体外溶血性能。壳聚糖的水溶性不好,将其溶于0.2mol/L的HAc溶液中形成了聚阳离子电解质溶液,其分子链上 带有大量的正电基团(-NH3 +)。当这样的高分子与膜上带负电荷的血细胞接触时,高分子链与细胞膜间的静电作用会使双方扭曲变形直至细胞膜破裂而溶血。而磺酸基壳聚糖壳聚糖较壳聚糖具有更好的水溶性,新制得的磺酸基壳聚糖溶于水,这一方面避免了氨基的质子化作用,使得磺酸基壳聚糖分子上正电荷数量急剧减少,另一方面,分子上的磺酸基可电离出带负电荷的-SO3 -离子,随着氧化度的增高,使分子链带上大量的负电荷,降低或避免了高分子链与细胞膜之间的静电作用,避免了溶血现象。至于丁二酰化壳聚糖,它溶于水避免了氨基的质子化作用,使得丁二酰化壳聚糖分子上正电荷数量减少,但分子上几乎没有带负电荷的离子可以电离出来,所以仍有一定的溶血现象。
通过测定被稀释血液的吸光度来计算材料的抗凝血指数。抗凝血指数的测定,从数据上再一次证实磺酸基壳聚糖和丁二酰化壳聚糖的抗凝血作用。磺酸基壳聚糖的抗凝血指数为99.2%,丁二酰化壳聚糖的抗凝血指数为15.2%,再次证实磺酸基壳聚糖具有极好的抗凝血作用,而丁二酰化壳聚糖抗凝血作用很弱。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。