JP2005518226A - 胎児組織由来のｅｂマトリックスの作製及び組織修復のためのその使用 - Google Patents

Abstract

動物組織、特に胎児又は新生児組織に化学的及び力学的処理を行うことで、生体リモデリング可能な、生体高分子スキャフォールド材料を形成及び保存する方法。本プロセスは、限定はしないが、組織を採集するステップと、選択的に、前記組織から成長因子及び分化因子を抽出するステップと、前記組織の感染性物質を不活化するステップと、前記組織から望ましくない成分を力学的に搾り出すステップと、前記組織を脱脂するステップと、前記組織を洗浄するステップと、選択的に、前記組織を乾燥するステップと、選択的に、前記組織を架橋させるステップと、を必ずしも解説した順序でなく、含む。その結果得られる製品であるＥＢＭは、その細菌、真菌、ウィルス及びプリオン不活化状態を特徴とする。ＥＢＭは強度があり、生体リモデリング可能であり、ドレープ適性があり、石灰化を起こさない。ＥＢＭは、組織工学におけるそのユニークな作製法及び幅広い応用性から、従来の発明にとって代わる。

Description

発明の詳細な説明

関連出願の参照
本出願は、引用をもってここに援用することとする２０００年１２月４日出願の米国出願第６０／２５１，１２５号に関連するものである。

発明の背景
発明の分野
本発明は、組織工学の分野、特に、具体的には胎児もしくは新生児組織を含む動物組織を処理してＥＢマトリックス（「ＥＢＭ」）と呼ばれる生体高分子スキャフォールド材料を作製する方法に関する。ＥＢＭは組織修復及び再生のための幅広い用途を有する。それは、ヒト組織及び臓器の修復又は置換のためのリモデリング可能なスキャフォールドとして役立てることができる。また移植前にそれをシグナリング分子及び細胞で強化することができ、シグナリング分子の有無に関係なく、移植後に定着させるため、ホストの実質細胞と免疫細胞だけでなく、ホストの血管と血管細胞を誘引することができる。さらに、シグナリング因子、細胞及び薬物の送達器具としても、役立てることができる。

関連技術の解説
ヒト人体の再構築は重要な産業である。ヒト組織バンク及び合成高分子は、身体部分の修復又は置換のための必要性を満たさない。この必要性を満たすために用いられる材料の代替的供給源のリストの上位にあるのが、免疫原性を減らしつつ実用性及び効果を最大にする新しい方法で作製された動物組織である。

組織工学の分野では、組織及び臓器を修復したり、新しい代用組織及び臓器を作製するために、以下の三種類の構成要素を単独又は組合せで用いている。１）天然高分子（例えばコラーゲン）、人造高分子（例えばPTFE、ダクロン、PET又はポリエチレン）又は自己分解性の人造高分子（例えばPLA又はPGA）から作製されたスキャフォールド；２）細胞に発生上の指示を与えるシグナリング分子；及び３）しばしば「幹細胞」と呼ばれる、特異的又は複数の組織構築能を有する細胞、である。ここでは我々は、胎児及び新生児組織を含む動物組織から得られ、新規な方法により作製される、組織工学スキャフォールドとして用いられる生体高分子マトリックスを解説する。

合成高分子、プラスチックス、及び表面被覆された金属などの人造移植材料は、様々な程度の免疫原性を有することがあり、それらの幅広い用途の妨げとなる大きな制約があることがある。主な制約の１つは、移植後に細胞がそれらをリモデルできないことである。またこれらは細菌感染への罹患性が高く、中には石灰化を起こすものもある。合成血管導管は、末梢血管のバイパス手術後に高率で閉塞を起こす。

処理の施されたヒト及び動物組織から作製される生体高分子マトリックスの使用には長い歴史がある。動物組織由来のコラーゲンベースのマトリックスを保存するいくつかの方法が開発されている（米国特許第4,801,299号、米国特許第5,336,616号、米国特許第5,756,678号、米国特許第5,916,265号及び米国特許第5,997,895号）。このような方法はすべて、細胞を殺す又は消滅させる化学的ステップを含む。生後の動物又はヒト由来の組織が、処理の対象となる主な材料であるため、抗原決定基をマスキングしたり、付着微生物を消滅させたり、また強度を高めるために、グルタルアルデヒド又は同様の薬剤を用いた固定ステップを利用する場合がある。しかしながら、アルデヒド処理により、実質的には原組織に対する細胞結合部位などの生物活性が破壊され、それに対する細胞の接着能まで大きく低下したり、失われてしまう。また、細胞に付着する、又は、細胞に結合可能な中間物に付着する細胞合成生成物にとっての結合部位や、細胞外マトリックスを構成する細胞生成物にとっての結合部位までも無くしてしまう。

動物由来で、グルタルアルデヒド又は同様な薬剤で固定されたコラーゲン・ベースの器具は、メタロプロティナーゼ酵素に対する抵抗性が高いために、リモデリングが不可能である。グルタルアルデヒド処理を受けた器具は次第に石灰化を起こすことが知られている。固定動物組織から作製された心臓弁は、石灰化のために、５乃至７年又はそれより早い時期に取り替えねばならないことがある。米国特許第4,801,299号及び米国特許第5,916,265号に示された方法は、生後動物を由来とする組織の固定のためのグルタルアルデヒド又は同様の薬剤の使用を含む。こうして得られる製品には、正確なリモデリングは起きない。

生後動物の組織を処理するために、界面活性剤又は水酸化ナトリウムが用いられることはある（米国特許第4,801,299号、米国特許第5,336,616号、米国特許第5,756,678号、米国特許第5,916,265号、米国特許第5,997,895号）が、これらが胎児又は新生児動物組織の処理に用いられたことはなかった。例えば１９９８年４月３０日に出願された米国特許第5,997,895号は、（好ましくは水酸化ナトリウムの5%水溶液及び硫酸ナトリウムの20%水溶液で）水酸化ナトリウム及び硫酸ナトリウムを含むアルカリ／塩処理を行う、生後動物組織を由来とする保証された代用コラーゲン硬膜を紹介する。1.0Nの水酸化ナトリウムを用いる、コラーゲンを含有する材料を処理する方法が、Diringer H. and Braig H. R. (Diringer H. and Braig H. R., 1989, Infectivity of unconventional viruses in dura mater. The Lancet, 439-440）による１９８９年の機関誌に開示されている。この参考文献は、FDAのGuide for 510(k) Review of Process Dura Mater (1990, 2)に引用されている。

本発明の製品であるＥＢＭは、概して生体リモデリングの不可能な上で引用した他の製品とは異なる。ＥＢＭは、細胞のためのその結合部位や、当該スキャフォールドを占拠する細胞の周囲の細胞外マトリックスを構成する細胞分泌性生成物にとっての結合部位を保つような方法で処理される。さらにＥＢＭには、DNAなどの望ましくない組織成分が組織から力学的に搾り出されること、そして脱脂性有機溶媒を用いて細胞及び核膜の存在度を低下させてある、という特徴がある。ＥＢＭは石灰化しないため、軟組織の修復のために人体に用いるのに安全である。軟組織へのその用途に加え、ＥＢＭは、適した成長因子で処理したり、骨前駆細胞を接種したり、又は、移植する場合には骨形成細胞に占拠させることにより、骨修復のためのスキャフォールドとしても利用できる。

ＥＢＭは、細胞又はシグナリング複合体の有無に関係なく、人体置換体を作製するための組織構築成分として用いることができる。組織修復をさらに促進するようなシグナリング分子を添加後にそれを用いることもできる。さらに、幹細胞又は分化細胞をその内部又は上に接種した後にそれを移植することもできる。

発明の簡単な概要
本発明を用いた方法により、胎児又は新生児組織を含む動物組織を処理すると、組織の本来の生物学的性質を低下させたり、又は、組織をリモデリングする際の細胞の組織占拠能を損なったりせずに、組織強度が保たれる。化学的処理に加え、望ましくない組織成分を組織から力学的に搾り出すステップは大きな刷新である。加えて、本発明の特徴は、その齢に応じて成体組織よりも抗原性が遙かに低い胎児又は新生児組織の使用を含む点である。本発明は、グルタルアルデヒド処理に基づく動物組織使用法に内在する問題を克服するものである。

発明の詳細な説明
便宜上、本明細書、実施例、及び付属の請求の範囲で用いたいくつかの用語を、ここにアルファベット順に集める。

用語「生体リモデリング可能」又は「生体リモデリング可能性」とは、占拠した細胞によって分解される材料であって、また前記細胞の分泌する新たに合成された成分で主に構成される置換体を生じるための鋳型として前記細胞が用いるような材料を言う。

用語「脱脂」あるいは「脱脂化」とは、組織から脂質を取り除くことを言う。

用語「DHT」とは、組織を高温で架橋及び脱水する脱水的熱処理を言う。

用語「ドレープ性」とは、不均一な曲面又は他の幾何学表面に成形できる材料の可能性を言う。

用語「不活化する」又は不活化された」とは、感染性を確実に防ぐために必要な要件を満たすよう、４、６又は８の対数で感染性物質（例えば細菌、糸状菌、ウィルス及びプリオン）の濃度を減少させることを言う。

文言「力学的に搾り出す」とは、力学的に圧力を印加して組織から望ましくない成分を搾り出すことを言う。NaOHなどの試薬により放出された、生成物のうちで、例えばDNA、RNA又は他の分子などの潜在的に抗原性の生成物は、適した溶媒の助けを借りて不要なものとして取り除かれる。

用語「縫合可能な」には、縫合糸の引き抜きに必要な抵抗力を当該材料が持つような、当該材料の縫合可能性を包含する。

本発明は、動物組織、特に胎児又は新生児組織由来の、天然の生体高分子ベースのマトリックス（ＥＢＭ）の保存に関する。それは、以下のステップ：（１）組織をその供給源から取り出すステップ；（２）選択的に、前記組織から成長因子及び分化因子を抽出するステップ；（３）前記組織の感染性物質を不活化させるステップ；（４）望ましくない成分を前記組織から力学的に搾り出すステップ；（５）化学的残留物を取り除くために前記組織を洗浄するステップ；（６）選択的に乾燥させるステップ；及び（７）選択的に、化学的及び力学的処理後に前記組織を架橋させるステップ、を含むＥＢＭを作製する方法を提供するものである。

好適な実施態様では、胎児及び新生児組織を含む、ブタ又はウシ組織を用いる。好ましくは、例えば胎児ウシ組織源は、生後１０週から新生齢の間のものである。一例としては、胎児ウシ皮膚を急速凍結させ、保管する。他の源となる材料には、血管、他の管状構造、膀胱を含む内部臓器、腱、靱帯、軟骨、腎臓被膜又は隔膜などの膜、又は、軟骨又は骨などの硬組織、がある。解凍後、当該組織又は臓器を、−４℃乃至１０℃の間の温度の氷槽で低温で冷却した状態に保つ。ある好適な実施態様では、塩を加えた氷槽を用いて組織を０℃未満の温度に冷却する。例えば皮膚下側に付着した組織などは、力学的に取り除く。

ウィルス及びプリオンの不活化や不要な構造及び化学的成分の除去を、時には高温で行ったために、組織、具体的には胎児及び新生児組織、のうちの特定の望ましい天然成分が失われてしまうこともあるが、成長因子及び分化因子などの望ましい成分は、ウィルス及びプリオンの不活化や不要な構造及び化学的成分の除去を目的とした漂白又は水酸化ナトリウム処理を行う前に、皮膚又は他の組織から抽出しておいてもよい。代替的な実施態様では、成長因子及び分化因子を、ここに引用をもって援用することとする２０００年１２月４日提出の米国出願60/251,125号に開示された方法（例えば緩衝剤、酵素又は酸抽出）により、組織から抽出する。溶液中にある抽出された成長因子及び分化因子を、1Nの水酸化ナトリウムなどのウィルス及びプリオン不活化に用いられる薬剤で４時間、氷上のシェーカ上で、より遙かに穏和に処理する。処理後、抽出された成長因子及び分化因子を、処理しようとする皮膚又は他の組織に戻すと、これらの皮膚又は組織はそれらを容易に吸収する。

好適な実施態様では、当該皮膚に対する細菌、真菌、ウィルス及びプリオンの不活化として、漂白剤による処理を始めに行う。漂白剤は0.05%乃至5%の間の濃度であり、処理時間は１分乃至５時間の範囲で様々にしてよい。さらにこのステップを以下に解説する水酸化ナトリウムステップ後に行うこともできる。溶液はすべて、氷又は塩を加えた氷で−４℃乃至１０℃の間の温度に冷却する。

好適な実施態様では、組織を水又は生理的緩衝剤（例えばTris、HEPES、PBS緩衝液）でよく洗浄して、残留漂白剤を取り除く。この組織をさらに0.1N乃至10 Nの濃度の水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムで１０分間乃至２時間、処理する。この処理でも、組織の感染性物質（例えば細菌、糸状菌、ウィルス及びプリオン）が不活化される。容器及び全溶液は、氷又は塩を加えた氷で−４℃乃至１０℃の温度に冷却する。その後容器をシェーカ上に置く。

好適な実施態様では、組織から出る不要な成分（例えばNaOHなどの試薬により放出されたDNA、RNA又は他の分子）を、平らな刃物（パテナイフのようなもの）及び／又はローラを用いて圧力を繰り返し印加することにより、力学的に搾り出す。組織から化学的に解離する物質を力学的に搾り出すこのステップは、手動で用いられるのと同様な作業を通じて、機械で行うこともできる。

脂質を溶解させるのに適した有機溶媒やそれらの混合物を、脂質物質の除去に用いてもよい（例えばクロロホルム、アセトン、エーテル、アルコール及びそれらの混合物）。好適な実施態様では、組織をクロロホルム及びエタノールの混合物（1:1の濃度比）で５分間乃至５時間かけて脱脂した後、70%エタノール及び水中で洗浄するか、又は、前述の溶媒を、クロロホルムステップ後の同様な時間、エタノール濃度を70%にして続けて用いることができる。

好適な実施態様では、化学的残留物が取り除かれるまで、組織を蒸留水又は緩衝液でよく洗浄する。ＥＢＭと命名される、最終的なこの生成物を蒸留水又は緩衝液中で保存するか、又は乾燥させる。

代替的な実施態様では、ＥＢＭをゲニピン又はDHTで架橋させることができる。DHTを用いる場合、組織を高温で脱水する。

代替的な実施態様では、組織を急速凍結させた後、それを高真空下で脱水することで、ＥＢＭを凍結乾燥させることができる。凍結乾燥により、組織の多孔性及び柔軟性が増す。

実施例１
ＥＢＭの調製
好適な態様のＥＢＭを調製するには、以下のプロトコルに従う。以下のステップはすべて、層流フード内で無菌的技術及び無菌溶液を用いて行う。

ウシ胎児皮膚切片を切り出し、面を識別するために印を付ける。この皮膚切片は大きさでほぼ25×20cmであり、色素又は孔はない。この皮膚を2.0リットルのMili-Q^TM水を容れたビーカ内に浸して余分な血液をすすぎ落とす。この皮膚を平らなプラスチック製プレート上に表皮側を下にして置く。皮膚をこのプレート上で平らに延ばす。

前記皮膚の下側（真皮側）から、手で行うのであれば解剖具を用いて肉を取り除く。 先端が鋸歯状になった鉗子を用いて肉を持ち上げ、膝状鋏を用いて約5-10mmの幅の連続した肉片を、皮膚の一方の側から他方の側へ向かって切り離す。肉の除去後、皮膚の外側からの表皮の除去を、肉剥ぎ器で行うこともできる。手で行う場合、このプロセスは以下の通りに続行すべきである。

皮膚を３０±３分間、氷上の20%の漂白剤中に置く。500±50mlの漂白剤を容れたねじキャップの付いた、1.0リットル入り方形広口びんから、1cm²の皮膚当たりほぼ1.0mlの溶媒を供給する。漂白剤の温度は４±２℃である。このびんを振盪プラットフォーム上に置く。次にこの皮膚を2.0リットルのMili-Q^TM水で２０分間洗浄して、漂白剤を減殺する。

皮膚を平らなプラスチック製プレート上に表皮側を下にして置く。この下側部分に真皮下の肉が残っていれば、パテナイフなどの平らな刃物により、組織表面全体にこの刃物を引くような圧力をかけることにより、そぎ落とす。このステップにより、望ましくない、化学的に分離された成分が、この組織から力学的にしぼり出される。この皮膚をすべり抵抗性の表面上に固定する。この皮膚を表皮側が上になるように裏返し、表皮を約5.0mmの片になるように平らな刃物でそぐ。手で用いられるのと同様な作業を通じ、機械でこの力学的な搾り出しステップを行うこともできる。

皮膚を、氷上に置いたシェーカ上の5.2NのNaOH溶液内に１５±３分間、配置する。500±50mlのNaOHを容れたねじキャップの付いた、1.0リットル入り方形広口びんにより、1cm²の皮膚当たりほぼ1.0mlの溶媒を提供する。NaOHの温度は４±２℃である。

NaOHステップを２回、繰り返し、１回目と２回目の間と、２回目の後に力学的搾り出しステップを行う。NaOHの濃度及びNaOHへの暴露時間は、皮膚の厚さに応じて増減することができる。次に、1.0リットルのMili-Q^TM水で３回、各ステップ毎に最長２０分間、洗浄し、その後必要に応じて付加的な力学的搾り出しステップを行う。

上述したように、あらゆる有機溶媒やそれらの混合物を、脂質物質の除去に用いることができる。好適な実施態様では、1:1クロロホルム／エタノール溶液処理の後に70%エタノールによる洗浄を行う。次に、1.0リットルのMili-Q^TM水で２回、各ステップ毎に最長１０分間、洗浄し、その後必要に応じて付加的な力学的搾り出しステップを行う。

ＥＢＭを、４±２℃の振盪プラットフォームに載せた1.0リットルの無菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に２０±４時間、浸漬し、ＥＢＭに皮膚1cm²当たり約2.0mlのPBSを提供する。

ＥＢＭを、二枚の多孔室プレートの間に挟んで圧力を印加した状態又は印加しない状態で、２４時間、空気乾燥させてもよい。多孔性を高くしたい場合、ＥＢＭを凍結乾燥することができる。

実施例２
ＥＢＭの使用
皮膚組織から作製されたＥＢＭは皮膚の創傷の包帯材又は皮膚置換組織として使用することができる。シグナリング分子及び細胞の添加にかかわらず、ＥＢＭは創傷治癒を促進する。ＥＢＭは火傷、潰瘍、及び剥離創などの慢性の局所的創傷の治療に適している。ラットなどのホスト動物に対する、全層性皮膚創傷を置換するための移植に際しては、無細胞ＥＢＭが、瘢痕を残さずに置換皮膚をリモデルすることが示されている。しかし二次的な派生物はない。皮膚線維芽細胞及び表皮細胞と一緒に接種すれば、ＥＭＢは生きた置換皮膚の役目を果たすことができる。

ＥＢＭは人体全般で修復又は置換具として用いることができる。例えばＥＢＭを、その高い物理的強度、延伸への抵抗、縫合可能性、細胞和合性及び生体リモデリング性を活かした尿道吊り帯として用いることができる。

胎児又は新生児動物皮膚（例えばブタ皮膚、ウシ皮膚）から作製されたＥＢＭは、心膜、骨膜、回旋腱板、又は硬膜の修復もしくは置換、あるいはヘルニアの修復にも用いることができる。それはドレープ適性があり、２０ニュートンを越える単一縫合糸引き抜き強度（原語：single suture-pullout strength）を有する。

ＥＢＭは、止血剤、硬膜置換、又は他の同様の治療域で注射用剤形又はフォームとして用いるよう、均質化することができる。上の実施例で解説したのと同じ又は同様な処理を身体の非皮膚組織に応用することで、細胞、シグナリング複合体又は薬物を添加した又は添加しない状態のスキャフォールドを置換部分に提供することができ、こうしてそれらが無細胞性又は細胞性のいずれであっても、血管新生させたり、ホスト細胞を集合させたりすることができる。

本開示はここで解説した組織又は臓器を由来とするＥＢＭの保存に限定されるものではない。ＥＢＭは多種の組織及び臓器由来でよい。

同等物
当業者であれば、日常的な実験によって、ここに解説した具体的な手法の同等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような同等物は本発明の範囲内にあると考えられ、以下の請求の範囲の包含するところである。本出願全体を通じて引用された全参考文献、発行済み特許、及び公開済み特許出願の内容を、引用をもってここに援用することとする。それらの特許、出願及び他の文献の適切な構成要素、処理、及び方法を、本発明及びその実施態様に向けて選択してよい。

Claims (8)

1. ａ．動物源から動物組織を採集するステップと、
   ｂ．選択的に、前記組織から成長因子及び分化因子を抽出するステップと、
   ｃ．前記組織の感染性物質を不活化するステップと、
   ｄ．前記組織から望ましくない成分を力学的に搾り出すステップと、
   ｅ．前記組織を脱脂するステップと、
   ｆ．化学的残留物を除去するために前記組織を洗浄するステップと、
   ｇ．選択的に、前記組織を乾燥するステップと、
   ｈ．選択的に、前記組織を架橋させるステップと
   を含む、生体高分子スキャフォールド材料を作製及び保存する方法。
2. 前記組織が胎児組織、新生児組織及び生後１０週齢乃至新生齢の間の組織からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記組織が血管である、請求項１に記載の組織。
4. ａ．前記抽出するステップが、緩衝剤、酵素又は酸抽出により前記成長因子及び分化因子を除去するステップを含み、
   ｂ．前記不活化するステップが、
   前記組織を漂白剤に１分間乃至５時間の間、浸漬するステップであって、但し、前記漂白剤が0.05%乃至5%の濃度である、ステップと、前記組織を−４℃乃至１０℃の間の温度で氷槽で冷却するステップであって、但し前記氷槽に塩を加えて温度を０℃乃至−４℃に達させる、ステップと、前記組織を水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの溶液に１０分間乃至２時間の間、浸漬するステップであって、但し前記溶液が0.1N乃至10Nの間の濃度である、ステップと、前記組織を−４℃乃至１０℃間の温度で氷槽で冷却するステップであって、但し前記氷槽に塩を加えて温度を０℃乃至−４℃に達させる、ステップとを含み、
   ｃ．前記力学的に搾り出すステップが、手又は機械により前記組織に力学的圧力を印加するステップを含み、
   ｄ．前記脱脂するステップが、前記組織をクロロホルム及びエタノール溶液（1:1濃度）に５分間乃至５時間の間、浸漬するステップと、前記組織を70%エタノール及び水中で洗浄するステップとを含み、
   ｅ．前記乾燥するステップが、前記組織を凍結乾燥又は空気乾燥するステップを含み、
   ｆ．前記架橋させるステップが、前記組織をゲニピン又はDHTで架橋させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記生体高分子スキャフォールド材料を病変又は損傷組織に適用して、組織の再生を促進することによる、請求項１で作製された生体高分子スキャフォールド材料を用いる方法。
6. ａ．前記生体高分子スキャフォールド材料を、天然、人造又は自己分解性の高分子から作製されたスキャフォールドと、又は、シグナリング分子もしくは幹細胞と、又は、薬物と、組み合わせるステップであって、前記シグナリング分子が、前記組織から抽出されると共に生物活性の保持に合致する濃度の水酸化ナトリウムで処理された前記成長因子及び分化因子を含んで成る、ステップと、
   ｂ．前記スキャフォールド材料及び前記スキャフォールド、シグナリング複合体、幹細胞又は薬物を病変又は損傷組織に適用して組織の再生を促進するステップと
   により、請求項１で作製された生体高分子スキャフォールド材料を細胞送達、シグナリング複合体又は薬物送達具として用いる方法。
7. 請求項１に記載の方法により作成された生体高分子スキャフォールド材料。
8. 請求項１４に記載の方法により作成された細胞送達、シグナリング複合体又は薬物送達具。