CN105687240B - 一种经血源干细胞制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种经血源干细胞制剂及其制备方法与应用。本发明提供的经血源干细胞制剂，包括：经血源干细胞、白蛋白和生理盐水。实验表明，本发明提供的经血源干细胞制剂能够将经血源干细胞的存活率维持在99％以上，细胞大小均匀、形态均为梭型。0℃～4℃保存1个月后，细胞仍保持着良好的形态，没有出现体积变大等异常现象，存活率仍保持在95％以上，且经表面抗原检测，经血源干细胞仍保持干细胞的特点，没有发生分化，具有良好的活性。以本申请提供的经血源干细胞制剂用于治疗卵巢早衰能够具有良好的治疗效果，使用本发明提供的经血源干细胞制剂一周后，小鼠卵泡数量明显增加。

Description

一种经血源干细胞制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种经血源干细胞制剂及其制备方法与应用。

背景技术

卵巢早衰是指女性在40周岁以前，除妊娠外，由某种原因导致的闭经，以血清雌激素水平下降、促性腺激素水平升高为特征的疾病。据流行病学统计提示，女性40岁以前的发病率为1％，原发性必经中卵巢早衰占10％～28％，继发性闭经中卵巢早衰占4％～18％，且发病率呈逐年上升的趋势。卵巢早衰已成为当今妇女不孕症的主要病因之一，严重影响患者生活质量、增加社会经济负担。对于卵巢早衰的病因及发病机制较为复杂，尚不十分清楚。卵巢早衰的治疗主要采用激素治疗，但是有临床研究发现，以激素治疗卵巢早衰会增加乳腺癌、子宫内膜癌以及心血管疾患、中风的发病率。

近年来间充质干细胞移植治疗成为临床研究的热点，为卵巢早衰的临床治疗提供新的希望，并取得初步的疗效。目前虽然已有用骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞治疗卵巢早衰的报道，并取得一定的疗效，但是需要经过骨穿刺才能获取骨髓，对机体造成较大的身体创伤，同时骨髓含有复杂的细胞成分，干细胞在其中的含量较低，需要较长时间的扩增，并不是比较好的种子细胞；脐带干细胞虽然免疫原性低，但是如果早期没有储存间充质干细胞，只能采用异体干细胞移植，存在一定的风险。

近年来，日本科学家在女性经血中发现了具有多向分化潜能的干细胞，该干细胞可用于修复受损的心肌组织。2008年，美国科学家Patel等发现，从健康女性经血中可分离出来间充质干细胞，这些细胞具有多向分化能力，并将该细胞命名为经血源子宫内膜干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)。MenSCs属于成体干细胞的一种，具有来源丰富、有效成分含量丰富、收集过程无创、增殖和分化潜能巨大、无伦理争论及废物回收利用等优点。同时，研究表明，宫内膜干细胞可以用于治疗卵巢早衰、子宫内膜疾病、预防衰老等功能，有望成为较为理想的种子细胞。但目前并未见关于经血源干细胞制剂的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种经血源干细胞制剂及其制备方法与应用，本发明提供的经血源干细胞制剂干细胞存活率高，性质稳定，对卵巢早衰的治疗效果良好。

本发明提供的经血源干细胞制剂包括：经血源干细胞、白蛋白和生理盐水。

生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。本发明采用的生理盐水是指质量分数为0.9％的氯化钠溶液，其与人体组织的渗透压一致，以其作为溶剂，不会对经血源干细胞产生损伤。

白蛋白(又称清蛋白，albumin，Alb)是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40％～60％。能够维持血浆胶体渗透压的恒定且承担一定的运输功能。以往的研究中表明，白蛋白可能会诱导干细胞的分化。但本发明通过实验证实，在经血源干细胞制剂中添加白蛋白可以为经血源干细胞提供营养，提高经血源干细胞在制剂中的存活率，且经血源干细胞制剂在低温保藏一个月后仍未见分化的迹象。

在一些实施例中，其中所述白蛋白的质量分数为1％～5％。

在一些实施例中，其中所述白蛋白的质量分数为3％。

在一些实施例中，其中所述白蛋白为人血清白蛋白。

在一定范围内，白蛋白的添加量与经血源干细胞的存活率成正相关。但过高的白蛋白浓度会导致细胞因渗透压失衡而失水变形，反而降低经血源干细胞的存活率。实验表明，制剂中添加白蛋白的质量分数为1％～5％最有利于提高细胞存活率。

在本发明的实施例中，其中所述经血源干细胞的密度为10⁴个/mL～10⁵个/mL。

在一些实施例中，其中所述经血源干细胞的密度为10⁴个/mL。

在一些实施例中，其中所述经血源干细胞的密度为10⁵个/mL。

制剂中，干细胞密度过大则存活率会因营养不足而大幅降低，而干细胞密度过小也不利于存活率的保持，且过小的干细胞密度会导致用所需制剂量的增大。本发明通过实验证实，干细胞密度为10⁴个/mL～10⁵个/mL时，干细胞存活率最高。

在一些实施例中，所述经血源干细胞的制备方法包括：

步骤1：以PBS稀释经血后，分离单个核细胞，以PBS清洗后，接种至无血清培养基；

步骤2：37℃，体积分数为5％的CO₂，培养48h后，半量换液，72h后全量换液，之后每3天全量换液1次，直至细胞生长至70％～80％汇合，传代。

在一些实施例中，无血清培养基为Lonza无血清培养基。

经血源干细胞分离自女性经血，来源丰富，且属于废物利用，很好的解决了脐带干细胞或其他干细胞存在的伦理问题。经血源干细胞的分离方法对其细胞活性的影响很大，本申请采用的制备方法能够最大限度的保护经血源干细胞的活性。

作为优选，PBS稀释经血时，PBS与经血的体积比为1：1。

作为优选，Ficoll分离液与经血的体积比为1：1。

作为优选，单个核细胞的分离方式为离心分离，具体为，700g离心15min后，转移上清液，以PBS清洗2次后，再次离心取细胞沉淀，接种至无血清培养基。

作为优选，接种的密度为7×10⁵cell/mL～8×10⁵cell/mL。

作为优选，传代具体为：以胰蛋白酶消化后，悬浮细胞接种于无血清培养基，继续培养。

在一些实施例中，经血源干细胞为为第3代～第5代的经血源干细胞。

第3代～第5代的经血源干细胞能够保持干细胞固有的分化潜能，不会出细胞凋亡或衰退的现象，其状态最佳，在适当的条件下，可以迅速增长并分化。

本发明提供的经血源干细胞制剂的制备方法，包括：将白蛋白与生理盐水混合后，重悬经血源干细胞，获得经血源干细胞制剂。

本发明提供的经血源干细胞制剂能够很好的维持经血源干细胞的活性和存活率，在保存期间不会发生分化，因此，本发明提供的经血源干细胞制剂可以用于制备治疗卵巢早衰的药物。

本发明提供的经血源干细胞制剂在制备治疗卵巢早衰的药物中的应用。

在一些实施例中，经血源干细胞制剂治疗卵巢早衰的剂量为0.2mL/次～0.4mL/次。

在一些实施例中，经血源干细胞制剂治疗卵巢早衰的方法为注射，具体为0.2mL/次～0.4mL/次，注射的次数为2次，每日一次。

本发明提供的经血源干细胞制剂，包括：经血源干细胞、白蛋白和生理盐水。本发明提供的经血源干细胞制剂中，经血源干细胞在白蛋白及生理盐水的保护下，能够维持良好的存活率和活性，且不会启动分化。实验表明，本发明提供的经血源干细胞制剂能够将经血源干细胞的存活率维持在99％以上，细胞大小均匀、形态均为梭型。0℃～4℃保存1个月后，细胞仍保持着良好的形态，没有出现体积变大等异常现象，存活率仍保持在95％以上，且经表面抗原检测，经血源干细胞仍保持干细胞的特点，没有发生分化，具有良好的活性。以本申请提供的经血源干细胞制剂用于治疗卵巢早衰能够具有良好的治疗效果，使用本发明提供的经血源干细胞制剂一周后，小鼠卵泡数量显著(p<0.05)增加。

附图说明

图1示原代培养7天的经血源干细胞，40×；

图2示原代培养7天的经血源干细胞，100×。

具体实施方式

本发明提供了一种经血源干细胞制剂及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的材料、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

取经检验合格的经血，用相同体积的PBS溶液稀释经血形成经血稀释液；取隔层离心管，加入经血稀释液一半体积的Ficoll分离液，缓慢加入经血稀释液，之后700g离心15min；将上层溶液移至另一个新的离心管中，PBS清洗2遍，用无血清培养基重悬离心后沉淀，调整接种密度为7～8×10⁵/ml，接种至培养皿中，十字混匀后放于二氧化碳培养箱中培养。48h后半量换液，72h后全量换液，之后每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化传代继续培养。

图1～2示经血源干细胞的细胞形态，在显微镜下观察到，细胞折光性强，呈梭形，无杂细胞，形态、大小均一，符合间充质干细胞的形态。

实施例2～4

表1实施例2～4经血源干细胞制剂配方

将白蛋白与生理盐水混合后，重悬经血源干细胞，获得经血源干细胞制剂。

对比例1～4

表2对比例1～4干细胞制剂配方

将白蛋白与生理盐水混合后，重悬干细胞，获得干细胞制剂。

实施例5制剂质量评价

对实施例2～4和对比例1～4制得的干细胞制剂进行质量鉴定。各样品检查3次。方法为：

制剂制成后，3h内对新鲜制得的制剂进行检测，检测内容包括：干细胞形态、存活率、制剂中细菌等的含量。其中，细胞形态检测、细胞活力检测采用台盼蓝染色法。检测结果如表3所示。

表3制剂制成后3h内检测结果

注：A表示细胞折光性强，大小均匀、呈梭型

B表示细胞体积增大、出现椭圆或不规则等异常形态

--示未检到

结果表明：在制备3h内，本发明提供的经血源干细胞制剂内，干细胞大小均匀，存活率高，在台盼蓝检测下，细胞均拒染(死细胞被染成蓝色，活细胞拒染)；说明了经血源干细胞没有出现死亡，活力好。而对比例1～4制备的干细胞制剂中，干细胞的存活率较低，有的甚至出现了异常形态。与对比例1～4相比，实施例2～4制备的制剂中干细胞的存活率显著提高(p<0.05)。

制剂制成后，装入注射器中，0℃～4℃保存1个月后再次检测干细胞形态、存活率、表面抗原，制剂中细菌等的含量。其中，细胞形态检测、细胞活力检测采用台盼蓝染色法，表面抗原检测采用流式细胞仪分析。检测结果如表4所示。

表4制剂制成后1个月后检测结果

注：A表示细胞大小均匀、呈梭型

B表示细胞体积增大、出现椭圆或不规则等异常形态

--示未检到

表4结果表明，在制备1个月后，实施例2～4制备的经血源干细胞制剂中干细胞形态小且均一，存活率显著(p<0.01)高于对比例1～4，折光性强而从流式分析的结果来看，实施例2～4制剂保存一个月后细胞表面标记的CD90和CD73的阳性表达量高于85％，阴性表达率低于2％，符合干细胞的表面抗原特征，说明了经血源干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。对比例1～4中也未见干细胞出现分化现象。

另外，经检测实施例2～4和对比例1～4提供的干细胞制剂在细菌、真菌、内毒素及五大病毒的检测中，均呈阴性。说明了经血源干细胞制剂的质量合格，可用于机体内的回注，进行卵巢早衰疾病的治疗。

实施例6：经血源干细胞制剂治疗卵巢早衰

从动物中心购买卵巢早衰的小鼠动物模型70只，分为7组，每组10只，各组给予试剂如下：

对照组1不做任何处理，正常饮食；

对照组2注射对比例1中的经血源干细胞制剂；

对照组3注射对比例2中的经血源干细胞制剂；

对照组4注射对比例3中骨髓干细胞制剂；

对照组5注射对比例4中脐带干细胞制剂；

实验组1注射实施例2中经血源干细胞制剂；

实验组2注射实施例3中经血源干细胞制剂；

实验组3注射实施例4中经血源干细胞制剂。

注射方法采用尾静脉注射，注射时将小鼠固定，将尾巴拉紧绷直，用酒精棉球擦拭尾巴，使尾部血管扩张，在距离尾尖三分之一至二分之一处用1ml注射器注射0.2-0.4ml细胞悬液，第二天重复注射，共注射2次，注射完成等待小鼠恢复3-5天后再进行卵泡数目、排卵数量计数。

1、卵泡计数方法：卵泡是卵巢最基础的功能单位，由卵母细胞及包围的颗粒细胞和膜细胞构成。正常生长的卵泡，卵母细胞的生长、成熟、颗粒细胞和膜细胞的增生和发育是和谐的，形成各自的卵泡单位。将卵泡分为原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡，窦状卵泡，和成熟卵泡。

原始卵泡：卵母细胞周围仅包绕着一层扁平状的颗粒细胞

初级卵泡：卵母细胞周围仅包绕着一层立方状的颗粒细胞

次级卵泡：卵母细胞周围有2-3层立方状的颗粒细胞，没有窦腔

早期窦状卵泡：出现窦腔

排卵前卵泡：是最大的卵泡并有清晰堆积的颗粒细胞层。

2、排卵的改变：移植一个月后，对各组小鼠进行超排，并取卵。在取卵前腹腔注射PMSC，48h后注射HCG，12-16h后杀鼠取卵。

卵泡和排卵计数结果如表5：

表5：卵泡和排卵计数

	实验组1	||实验组2	||实验组3	||对照组1	||对照组2	||对照组3	对照组4	对照组5
									卵泡数量(个)	456.7	547.8	523.6	102.2	100.2	289.4	352.6	318.9
排卵数目(个)	36.2	40.1	38.9	10.31	9.28	23.5	26.8	25.7

表5显示，注射实施例2～4和对比例1～4的制剂一周后，对照组1、对照组2的卵泡数量未有明显变化，对照组3～5和实验组1～3的各级卵泡均有所增加，但是实验组1、2和实验组3的卵泡数量比对照组3、对照组4、对照组5有显著的增加(p<0.05)，说明实施例1～3的经血源干细胞对卵巢早衰具有更好的治疗效果。

计算排卵的数目，发现注射实施例2～4和对比例1～4的制剂一个月后，对照组1、对照组2的排卵数目仍处于较低水平，部分卵子出现不规则的形态，细胞质中有碎片或凋亡；与对照组1～2相比，对照组3～5、实验组1～3在移植一个月后排卵数量显著(p<0.05)增多，但是实验组1～3排卵数量更多，与对照组3～5相比有显著差异(p<0.05)，说明实施例1～3的经血源干细胞对卵巢早衰具有更好的治疗效果。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种经血源干细胞制剂，其特征在于，由经血源干细胞、白蛋白和生理盐水组成；

所述白蛋白的质量分数为1%~5%；

所述经血源干细胞的密度为10⁴个/mL ~10⁵个/mL。

2.根据权利要求1所述的经血源干细胞制剂，其特征在于，其中所述白蛋白的质量分数为3%。

3.根据权利要求1所述的经血源干细胞制剂，其特征在于，其中所述白蛋白为人血清白蛋白。

4.根据权利要求1所述的经血源干细胞制剂，其特征在于，所述经血源干细胞的制备方法包括：

步骤1：以PBS稀释经血后，分离单个核细胞，以PBS清洗后，接种至无血清培养基；

步骤2：37℃，体积分数为5%的CO₂，培养48h后，半量换液，72h后全量换液，之后每3天全量换液1次，直至细胞生长至70%~80%汇合，传代。

5.根据权利要求4所述的经血源干细胞制剂，其特征在于，所述无血清培养基为Lonza无血清培养基。

6.根据权利要求1所述的经血源干细胞制剂，其特征在于，所述经血源干细胞为为第3代~第 5代的经血源干细胞。

7.权利要求1~6任一项所述的经血源干细胞制剂在制备治疗卵巢早衰的药物中的应用。