CN115252647A - 一种促进毛发生长的复合外用制剂及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进毛发生长的复合外用制剂及其制备和应用。所述制备方法包括以下步骤：细胞的分离和培养；采用梯度超速离心法提取细胞对数生长期3～6代的外泌体；米诺地尔与外泌体的投药比为1:8～1:1，采用共挤出法将米诺地尔装载于外泌体内部。其优点在于：利用外泌体的天然递药功能和屏障穿透功能，显著改善米诺地尔的透皮渗透能力，使其易于到达毛囊部位产生药效。同时，外泌体本身具有治疗活性，能与所装载的米诺地尔之间协同增效，有效提升了毛乳头细胞的增殖活性，产生了良好的促毛发生长和促毛囊发育作用。且装载后增加了难溶性米诺地尔的溶解度和包封率，减少醇类有机溶剂的用量，降低头皮不良反应的发生率，有助于提升治疗安全性和患者依从性。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是关于一种促进毛发生长的复合外用制剂及其制备和应用。
背景技术
脱发类疾病包括雄激素性脱发、休止期脱发、瘢痕性脱发、斑秃等，目前正呈现出明显的年轻化和普遍化态势，并且给患者的社会交往和心理健康带来严重的负面影响。然而，脱发类疾病的治疗选择十分有限，临床药物治疗以米诺地尔(Minoxidil)和非那雄胺为主，其中非那雄胺仅被获批用于男性脱发患者，而米诺地尔则广泛适用于男性和女性脱发人群。米诺地尔是一种血管扩张剂，能够缩短毛囊休止期、诱导毛囊进入生长期并延长毛囊生长期的持续时间、抑制毛囊对雄激素的敏感性。目前，局部外用米诺地尔是雄激素性脱发的首选药物，在多种脱发类疾病的治疗中具有较高级别的疗效证据支持。
然而，米诺地尔的局部应用却存在着明显的缺陷，极大地降低了患者的用药依从性：①米诺地尔的起效较慢，平均见效时间为6～9个月；②米诺地尔需要长期连续用药才能维持药效，停药后毛发复脱的可能性较大；③米诺地尔是难溶性小分子药物，已获批的酊剂、泡沫剂和凝胶剂等剂型也不具备较高的靶向性和渗透性，因此天然皮肤屏障严格限制了其在皮肤部位的渗透吸收，使米诺地尔外用制剂具有较低的药物利用率；④现有的米诺地尔外用制剂大量使用丙二醇、丙三醇等有机溶剂，容易引发红肿、瘙痒、灼热、脱屑等过敏性皮炎和接触性皮炎症状，溶剂的缓慢挥发容易在皮肤表面析出结晶，进一步降低药物的透皮吸收。因此，临床亟需更加安全有效、使用方便、皮肤渗透性好的局部用药方案，用于克服米诺地尔的上述缺陷，为脱发类疾病提供一种疗效增强、副反应减轻的治疗选择。
外泌体(Exosomes，Exo)是一种纳米尺度的细胞外膜性囊泡，富含核酸、蛋白质、脂质等活性成分，在细胞间通讯和物质传递中承担着重要功能。研究表明，毛乳头细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪间充质干细胞外泌体、神经干细胞外泌体等多种外泌体所携带的miR-218-5p、miR-100等活性物质能够激活Wnt/β-连环蛋白通路，加速毛囊由休止期向生长期的过渡，从而促进毛发生长和毛囊发育。
专利CN112618572A使用微针促渗技术将间充质干细胞外泌体与米诺地尔一起应用于脂溢性脱发，有效促进了脱发患者的毛发生长。同样的，文献Yang G,Chen Q,Wen D,etal.A Therapeutic Microneedle Patch Made from Hair-Derived Keratin forPromoting Hair Regrowth.ACS Nano.20113(4):4354-4360.doi:10.1021/acsnano.8b09573、专利CN112153957A将间充质干细胞外泌体和包载一种新型小分子毛发生长剂的PLGA纳米粒一起装载于角蛋白微针贴剂中，在脱毛小鼠模型中产生了优于普通米诺地尔制剂的毛发再生效果。但上述制剂均采用微针这一有创递送方式，存在着需要微针特殊装置、皮肤刺激性大、微针材料体内降解性差等生物相容性问题，联用米诺地尔时可能产生更严重的药物刺激性症状。
与有创的微针递送不同，纳米经皮给药技术是一种有潜力的非侵入性给药策略。目前，脂质体、聚合物纳米粒等合成纳米载体已被报道用于米诺地尔的经皮递送，但是尚未出现外泌体递送米诺地尔的相关报道。外泌体是一种优良的天然纳米递送载体，直径范围为40～160nm(平均直径为100nm)，呈现典型的脂质双分子层结构。相比合成纳米载体，外泌体具有生物相容性好、免疫原性低的优点，并且能够以较高的递送效率穿越多种生物学屏障。
专利CN111617237A将胶原蛋白装载于毛乳头细胞外泌体中，经皮给药后能够增加毛母质细胞的增殖活性和迁移活性，改善脱发严重患者的头油感和脱发现象。但该组合配方中胶原蛋白组分的促毛发生长作用尚不明确，根据该专利所公布的实施例，外泌体装载胶原蛋白组处理24h后的毛母质细胞增殖活力仅为外泌体单用组的0.90倍～1.12倍，可见毛乳头细胞外泌体与所载胶原蛋白的协同作用十分有限。因外泌体本身有较为明确的促毛发生长和促毛囊发育机制，若选用对毛发生长具有明确促进作用的药物(如米诺地尔)，则有望使所载药物与外泌体产生明显的协同药效，更有利于对脱发类疾病的预防和治疗。
值得注意的一点是，在上述CN111617237A专利公布的毛乳头细胞外泌体装载胶原蛋白技术中，所载胶原蛋白为水溶性物质，易于被装载于外泌体内部，故在其所披露的技术文件中，仅将胶原蛋白直接与外泌体溶液混合后进行电穿孔转导即可完成制备。然而，米诺地尔作为难溶性药物，不易于被装载至外泌体内部，且不恰当的装载过程容易破坏外泌体的纳米结构。可见，将外泌体装载米诺地尔作为复合外用制剂用于脱发类疾病的治疗时，需要兼顾外泌体的纳米属性和米诺地尔的装载效果，故米诺地尔装载工艺的选择是该制剂开发时的技术难点。
综上，外泌体装载米诺地尔用于脱发类疾病时，既能发挥出外泌体的天然药物递送和屏障穿透功能，促进米诺地尔在真皮组织内的渗透吸收，又能降低处方中有机溶剂的用量，有效提升治疗安全性和患者依从性；同时有利于两种药物组分的机制协同，有望产生更显著的治疗脱发和/或促毛发生长效果。
目前尚未有一种外泌体装载米诺地尔的复合外用制剂(Exo(Mino))用于促进毛发生长的报道，有望为脱发类疾病的预防和治疗提供一种疗效增强、副反应降低、易于使用推广的经皮外用制剂。
发明内容
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种促进毛发生长的复合外用制剂。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种外泌体装载米诺地尔的复合外用制剂，其特征在于，所述复合制剂由米诺地尔装载于外泌体内部组成，外泌体取自细胞对数生长期的3～9代，所述的米诺地尔与外泌体的投药比为1:8～8:1。
作为本发明的一个优选例，所述米诺地尔的装载方法选自共挤出法、超声法、电穿孔法、反复冻融法、共孵育法的一种。
作为本发明的另一优选例，所述优选细胞对数生长期为3～6代，米诺地尔与外泌体的投药比为1:8～1:1，所述外泌体选自毛乳头细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪间充质干细胞外泌体、脐带间充质干细胞外泌体的一种或几种。
第二方面，本发明提供了一种促进毛发生长的外泌体装载米诺地尔的复合外用制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)从毛乳头细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞之间选择一种或几种细胞进行分离和培养，再选用对数生长期第3～6代的细胞；
b)采用梯度超速离心法提取细胞内的外泌体；
c)采用共挤出法将米诺地尔装载于外泌体内部，米诺地尔与外泌体的投药比为1:8～1:1。
作为本发明的一个优选例，所述米诺地尔的装载方法包括共挤出法、超声法、电穿孔法、反复冻融法、共孵育法。
作为本发明的另一优选例，所述米诺地尔的装载方法为共挤出法。
作为本发明的另一优选例，所述外泌体选自毛乳头细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪间充质干细胞外泌体、脐带间充质干细胞外泌体的一种或几种。
第二方面，本发明提供了如上任一所述的复合外用制剂在制备治疗脱发疾病的药物中的应用。
作为本发明的一个优选例，所述脱发疾病为雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃。
本发明优点在于：
经创造性工作，筛选得到一种全新的装载米诺地尔的复方药物组合，其中外泌体兼具治疗活性和高效透皮递送的特质：
1、本发明药物将米诺地尔装载于外泌体内部，利用外泌体的天然递药功能和屏障穿透功能，促进米诺地尔在真皮组织内的渗透和吸收，有助于米诺地尔药物到达毛囊部位发挥药效，并与外泌体产生更强的协同增效作用，提升治疗有效性。
2、本发明药物将米诺地尔装载于外泌体内部，增加了难溶性药物米诺地尔的溶解度和包封率，减少处方中醇类有机溶剂的用量，有助于降低红肿、瘙痒、灼热、脱屑等不良反应的发生率，提升治疗安全性和患者依从性。
附图说明
附图1为不同装载方法所制得复合外用制剂的包封率和粒径比较。
附图2为不同投药比所制得复合外用制剂的包封率和粒径比较。
附图3为不同代次外泌体所制得复合外用制剂的体外疗效比较。(P3～P9分别为P3～P9代次来源外泌体装载米诺地尔的复合制剂)
附图4为不同外用制剂的体外促增殖活性比较。(Mino为米诺地尔单用制剂、Exo为外泌体单用制剂、Exo(Col)为外泌体装载胶原蛋白制剂、Exo+Mino[Sol.]为米诺地尔与外泌体的混合制剂(普通溶液)、Exo(Mino)为外泌体装载米诺地尔的复合制剂)
附图5为不同外用制剂的体内促毛发生长药效比较。(Mino为米诺地尔单用制剂、Exo为外泌体单用制剂、Exo+Mino[Sol.]为米诺地尔与外泌体的混合制剂(普通溶液)、Exo+Mino[MN.]为米诺地尔与外泌体的混合制剂(微针递送)、Exo(Mino)为外泌体装载米诺地尔的复合制剂)
附图6为不同外用制剂的体内促毛囊发育药效比较。(Mino为米诺地尔单用制剂、Exo为外泌体单用制剂、Exo+Mino[Sol.]为米诺地尔与外泌体的混合制剂(普通溶液)、Exo+Mino[MN.]为米诺地尔与外泌体的混合制剂(微针递送)、Exo(Mino)为外泌体装载米诺地尔的复合制剂)
附图7为不同外用制剂的皮肤刺激性比较。(Mino为米诺地尔单用制剂、Exo为外泌体单用制剂、Exo+Mino[Sol.]为米诺地尔与外泌体的混合制剂(普通溶液)、Exo+Mino[MN.]为米诺地尔与外泌体的混合制剂(微针递送)、Exo(Mino)为外泌体装载米诺地尔的复合制剂)
附图8为不同纳米剂型的体外透皮行为比较。(Mino为米诺地尔酊剂、Anp(Mino)为白蛋白装载米诺地尔制剂、Lip(Mino)为脂质体装载米诺地尔制剂、Exo(Mino)为外泌体装载米诺地尔的复合制剂)
附图9为不同纳米剂型的体内促毛发生长药效比较。(Mino为米诺地尔酊剂、Anp(Mino)为白蛋白装载米诺地尔制剂、Lip(Mino)为脂质体装载米诺地尔制剂、Exo(Mino)为外泌体装载米诺地尔的复合制剂)
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1毛乳头细胞外泌体(DP-Exo)的制备
(1)毛乳头细胞(dermal papilla cells，DP)的分离和培养：将4～6周龄的雄性C57BL/6小鼠(购自上海市第一人民医院实验动物中心)脱臼处死，消毒后取下小鼠触须垫，分离皮下脂肪和结缔组织，暴露毛球部。剪下毛球部组织，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后，使用0.2％的Ⅰ型胶原酶溶液消化1h～2h，至毛乳头暴露后加入完全培养基终止消化。收集上述消化液，室温下1000r/min离心5min，弃去上清液，PBS洗涤后加入完全培养基重悬，将所得毛乳头细胞转移至培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3天换液。培养一周后，镜下观察到毛乳头细胞基本完全迁出，继续培养至细胞融合度约80％时传代。
(2)采用梯度超速离心法提取毛乳头细胞外泌体(DP-Exo)：取处于对数生长期的P3～P9代毛乳头细胞，饥饿培养12h后，收集细胞培养上清液；将上述细胞培养上清液在4℃下300g离心10min，弃去下层细胞沉淀后，4℃下2000g离心20min，再次弃去下层死细胞沉淀；随后，4℃下10000g离心30min以除去细胞碎片；最后，120000g超高速离心60min，收集沉淀，得到DP-Exo。用生理盐水重悬后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自赛默飞世尔科技有限公司)进行外泌体蛋白定量，在-80℃条件下保存备用。
实施例2脐带间充质干细胞外泌体(UCMSC-Exo)的制备
(1)脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC)的分离和培养：取剖宫产分娩的健康新生儿脐带(来自上海市第一人民医院)，分离并去除血管组织和外膜，剪成小的组织块，加入完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，每3天半量换液，培养约1周后，观察到类似成纤维细胞样细胞从组织块边缘爬出，更换培养基，继续培养至细胞融合度约80％时传代。
(2)采用梯度超速离心法提取外泌体：取处于对数生长期的P3～P9代脐带间充质干细胞，饥饿培养12h后，收集细胞培养上清液；将上述细胞培养上清液在4℃下300g离心10min，弃去下层细胞沉淀后，4℃下2000g离心20min，再次弃去下层死细胞沉淀；随后，4℃下10000g离心30min以除去细胞碎片；最后，120000g超高速离心60min，收集沉淀，得到UCMSC-Exo。用生理盐水重悬后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行外泌体蛋白定量，在-80℃条件下保存备用。
实施例3脂肪间充质干细胞外泌体(ADMSC-Exo)的制备
(1)脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSC)的分离和培养：将6周龄的雄性SD大鼠(购自上海市第一人民医院实验动物中心)脱臼处死，剪开皮肤完整切取腹股沟脂肪垫，剔除明显的血管、筋膜，剪碎后加入等体积的0.2％Ⅰ型胶原蛋白酶溶液，37℃震荡消化1h，加入等体积完全培养基终止消化，无菌滤网过滤后，室温下1000r/min离心10min，弃去上清液，加入完全培养基重悬，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。24h后首次半量换液，然后每3天全量换液，当黏附细胞融合度约80％时传代。
(2)采用梯度超速离心法提取外泌体：取处于对数生长期的P3～P9代脂肪间充质干细胞，饥饿培养12h后，收集细胞培养上清液；将上述细胞培养上清液在4℃下300g离心10min，弃去下层细胞沉淀后，4℃下2000g离心20min，再次弃去下层死细胞沉淀；随后，4℃下10000g离心30min以除去细胞碎片；最后，120000g超高速离心60min，收集沉淀，得到ADMSC-Exo。用生理盐水重悬后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行外泌体蛋白定量，在-80℃条件下保存备用。
实施例4骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-Exo)的制备
(1)骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)的分离和培养：将4周龄的雄性SD大鼠(购自上海市第一人民医院实验动物中心)脱臼处死，75％乙醇浸泡15min后分离胫骨和股骨，剪去胫骨和股骨的两端并冲洗骨髓腔，获得骨髓细胞悬液，室温下1000r/min离心5min，弃去上清液，加入完全培养基重悬，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。24h后首次半量换液，然后每3天全量换液，当黏附细胞融合度约80％时传代。
(2)采用梯度超速离心法提取外泌体：取处于对数生长期的P3～P9代骨髓间充质干细胞，饥饿培养12h后，收集细胞培养上清液；将上述细胞培养上清液在4℃下300g离心10min，弃去下层细胞沉淀后，4℃下2000g离心20min，再次弃去下层死细胞沉淀；随后，4℃下10000g离心30min以除去细胞碎片；最后，120000g超高速离心60min，收集沉淀，得到BMSC-Exo。用生理盐水重悬后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行外泌体蛋白定量，在-80℃条件下保存备用。
实施例5米诺地尔的装载方法筛选
在米诺地尔与外泌体的投药比为1:8的条件下，分别使用共挤出法、超声法、电穿孔法、反复冻融法、共孵育法制备DP-Exo来源的Exo(Mino)，使用高效液相色谱法测定不同制备方法下Exo(Mino)中装载米诺地尔的药物浓度，并计算药物包封率。同时，使用粒度电位分析仪测定不同制备方法下所得Exo(Mino)的平均粒径。最后，以包封率和粒径为指标，对米诺地尔的装载方法进行筛选。
共挤出法的制备方案：将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，将100mg DP-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的DP-Exo溶液，取1mL米诺地尔储备液加至16mL DP-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到DP-Exo来源的Exo(Mino)。
超声法的制备方案：将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，将100mg DP-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的DP-Exo溶液，取1mL米诺地尔储备液加至16mL DP-Exo溶液中，充分混合后使用超声波处理器在冰水浴条件下对混合液进行脉冲超声(on/off各15s，共5次循环)，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到DP-Exo来源的Exo(Mino)。
电穿孔法的制备方案：将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，将100mg DP-Exo溶解至10mL电转缓冲液中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的DP-Exo溶液，取1mL米诺地尔储备液加至16mL DP-Exo溶液中，充分混合后进行电穿孔转导，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到DP-Exo来源的Exo(Mino)。
反复冻融法的制备方案：将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，将100mg DP-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的DP-Exo溶液，取1mL米诺地尔储备液加至16mL DP-Exo溶液中，充分混合后进行液氮冷冻-室温解冻的10次反复冻融循环，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到DP-Exo来源的Exo(Mino)。
共孵育法的制备方案：将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，将100mg DP-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的DP-Exo溶液，取1mL米诺地尔储备液加至16mL DP-Exo溶液中，充分混合后在37℃下摇床孵育90min，随后置于37℃下孵育12h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到DP-Exo来源的Exo(Mino)。
结果：如图1所示，从装载效果的角度考虑，使用不同装载方法时DP-Exo来源的Exo(Mino)中米诺地尔的包封率从高到低依次为：共挤出法>超声法>电穿孔法>反复冻融法>共孵育法；从纳米属性的角度考虑，使用不同装载方法时DP-Exo来源的Exo(Mino)的粒径从低到高依次为：共挤出法<共孵育法<反复冻融法<超声法<电穿孔法。综合来说，使用共挤出法装载米诺地尔时，所制得Exo(Mino)具有较高的包封率和较低的粒径，与其余方法相比较时具有显著性优势(P<0.05)。因此，本发明所述复合外用制剂的载药步骤中，米诺地尔的较优装载方法为共挤出法。
实施例6装载工艺中投药比的筛选
在米诺地尔与外泌体的投药比为1:8～8:1的范围内，使用实施例5所述的共挤出法制备DP-Exo来源的Exo(Mino)，使用高效液相色谱法测定不同投药比下Exo(Mino)中装载米诺地尔的药物浓度，并计算药物包封率。同时，使用粒度电位分析仪测定不同投药比下所得Exo(Mino)的平均粒径。最后，以包封率和粒径为指标，对米诺地尔与外泌体的投药比进行筛选。
共挤出法的操作方案与实施例5一致，不同之处在于分别将1mL、2mL、4mL、8mL、16mL、32mL、64mL的米诺地尔储备液(20mg/mL)与16mL外泌体溶液(10mg/mL)混合，以分别制备投药比为1:8、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、8:1的Exo(Mino)制剂。
结果如图2所示，随着投药比的增加，Exo(Mino)的粒径逐渐升高，而其对米诺地尔的包封率则逐渐降低。其中，当投药比为1:8～1:1时，所得Exo(Mino)的粒径适宜，包封率也处于较高水平。因此，本发明所述复合外用制剂的载药步骤中，米诺地尔与外泌体的较优投药比为1:8～1:1。
实施例7细胞代次的筛选
本实施例评估了外泌体来源细胞的传代次数对本发明所述复合外用制剂的体外治疗效果的影响。
按照实施例4的方法，分离和培养P3～P9代次的骨髓间充质干细胞，制备相应代次的BMSC-Exo。随后按照实施例5所述的共挤出法，制备P3～P9代次BMSC-Exo来源的Exo(Mino)。将处于对数生长期的毛乳头细胞分别以每孔1×104个的密度接种到96孔细胞培养板中，培养24h后弃去旧培养基，分别加入P3～P9代次BMSC-Exo来源的Exo(Mino)(其中米诺地尔浓度为40μg/mL、外泌体蛋白浓度为400μg/mL)。继续培养24h后弃去含药培养基，PBS润洗后每孔加入100μL含10％CCK-8试剂的细胞培养基，于37℃培养箱中孵育45min后，使用全自动酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光度。以无细胞孔为空白对照，未加药物组为阳性对照，计算各组药物处理下毛乳头细胞的细胞活力，计算公式为：细胞活力(％)＝(A实验组–A空白对照组)/(A阳性对照组–A空白对照组)×100％。
结果如图3所示，P3～P6代次BMSC-Exo来源的Exo(Mino)对毛乳头细胞的促增殖作用优于P7～P9代次，数据有显著性差异(P<0.05)，提示低代次细胞来源的外泌体具有更强的体外促毛发生长疗效。说明在本发明所述复合外用制剂的制备过程中，所选外泌体的较优代次为P3～P6。
实施例8较优代次毛乳头细胞外泌体(DP-Exo)的制备
采用实施例1中的方法分离和培养毛乳头细胞，取处于对数生长期的P3～P6代毛乳头细胞，饥饿培养12h后，收集细胞培养上清液；将上述细胞培养上清液在4℃下300g离心10min，弃去下层细胞沉淀后，4℃下2000g离心20min，再次弃去下层死细胞沉淀；随后，4℃下10000g离心30min以除去细胞碎片；最后，120000g超高速离心60min，收集沉淀，得到DP-Exo。用生理盐水重悬后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行外泌体蛋白定量，在-80℃条件下保存备用。
实施例9较优代次脐带间充质干细胞外泌体(UCMSC-Exo)的制备
采用实施例2中的方法分离和培养脐带间充质干细胞，取处于对数生长期的P3～P6代脐带间充质干细胞，饥饿培养12h后，收集细胞培养上清液；将上述细胞培养上清液在4℃下300g离心10min，弃去下层细胞沉淀后，4℃下2000g离心20min，再次弃去下层死细胞沉淀；随后，4℃下10000g离心30min以除去细胞碎片；最后，120000g超高速离心60min，收集沉淀，得到UCMSC-Exo。用生理盐水重悬后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行外泌体蛋白定量，在-80℃条件下保存备用。
实施例10较优代次脂肪间充质干细胞外泌体(ADMSC-Exo)的制备
采用实施例3中的方法分离和培养脂肪间充质干细胞，取处于对数生长期的P3～P6代脂肪间充质干细胞，饥饿培养12h后，收集细胞培养上清液；将上述细胞培养上清液在4℃下300g离心10min，弃去下层细胞沉淀后，4℃下2000g离心20min，再次弃去下层死细胞沉淀；随后，4℃下10000g离心30min以除去细胞碎片；最后，120000g超高速离心60min，收集沉淀，得到ADMSC-Exo。用生理盐水重悬后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行外泌体蛋白定量，在-80℃条件下保存备用。
实施例11较优代次骨髓间充质干细胞外泌体(BMSC-Exo)的制备
采用实施例4中的方法分离和培养骨髓间充质干细胞，取处于对数生长期的P3～P9代骨髓间充质干细胞，饥饿培养12h后，收集细胞培养上清液；将上述细胞培养上清液在4℃下300g离心10min，弃去下层细胞沉淀后，4℃下2000g离心20min，再次弃去下层死细胞沉淀；随后，4℃下10000g离心30min以除去细胞碎片；最后，120000g超高速离心60min，收集沉淀，得到BMSC-Exo。用生理盐水重悬后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行外泌体蛋白定量，在-80℃条件下保存备用。
实施例12较优DP-Exo来源的Exo(Mino)的制备(一)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例8中的DP-Exo，将100mg DP-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的DP-Exo溶液，取1mL米诺地尔储备液加至16mL DP-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到DP-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例13较优DP-Exo来源的Exo(Mino)的制备(二)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例8中的DP-Exo，将100mg DP-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的DP-Exo溶液，取2mL米诺地尔储备液加至16mL DP-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到DP-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例14较优DP-Exo来源的Exo(Mino)的制备(三)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例8中的DP-Exo，将100mg DP-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的DP-Exo溶液，取4mL米诺地尔储备液加至16mL DP-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到DP-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例15较优DP-Exo来源的Exo(Mino)的制备(四)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例8中的DP-Exo，将100mg DP-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的DP-Exo溶液，取8mL米诺地尔储备液加至16mL DP-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到DP-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例16较优UCMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(一)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例9中的UCMSC-Exo，将100mgUCMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的UCMSC-Exo溶液，取1mL米诺地尔储备液加至16mLUCMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到UCMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例17较优UCMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(二)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例9中的UCMSC-Exo，将100mgUCMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的UCMSC-Exo溶液，取2mL米诺地尔储备液加至16mLUCMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到UCMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例18较优UCMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(三)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例9中的UCMSC-Exo，将100mgUCMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的UCMSC-Exo溶液，取4mL米诺地尔储备液加至16mLUCMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到UCMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例19较优UCMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(四)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例9中的UCMSC-Exo，将100mgUCMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的UCMSC-Exo溶液，取8mL米诺地尔储备液加至16mLUCMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到UCMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例20较优ADMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(一)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例10中的ADMSC-Exo，将100mgADMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的ADMSC-Exo溶液，取1mL米诺地尔储备液加至16mLADMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到ADMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例21较优ADMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(二)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例10中的ADMSC-Exo，将100mgADMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的ADMSC-Exo溶液，取2mL米诺地尔储备液加至16mLADMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到ADMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例22较优ADMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(三)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例10中的ADMSC-Exo，将100mgADMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的ADMSC-Exo溶液，取4mL米诺地尔储备液加至16mLADMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到ADMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例23较优ADMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(四)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例10中的ADMSC-Exo，将100mgADMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的ADMSC-Exo溶液，取8mL米诺地尔储备液加至16mLADMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到ADMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例24较优BMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(一)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例11中的BMSC-Exo，将100mgBMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的BMSC-Exo溶液，取1mL米诺地尔储备液加至16mL BMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到BMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例25较优BMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(二)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例11中的BMSC-Exo，将100mgBMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的BMSC-Exo溶液，取2mL米诺地尔储备液加至16mL BMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到BMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例26较优BMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(三)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例11中的BMSC-Exo，将100mgBMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的BMSC-Exo溶液，取4mL米诺地尔储备液加至16mL BMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到BMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例27较优BMSC-Exo来源的Exo(Mino)的制备(四)
将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，采用实施例11中的BMSC-Exo，将100mgBMSC-Exo溶解至10mL去离子水中，得到20mg/mL的米诺地尔储备液和10mg/mL的BMSC-Exo溶液，取8mL米诺地尔储备液加至16mL BMSC-Exo溶液中，充分混合后使用微型挤出器将混合液依次在400nm和200nm的聚碳酸酯多孔膜下来回挤出20次，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载药物，加入适量生理盐水重悬，得到BMSC-Exo来源的Exo(Mino)。
实施例28药效考察
本实施例对比了不同外用制剂的体内外疗效和安全性，所涉及的具体制剂有：米诺地尔单用制剂、外泌体单用制剂、米诺地尔与外泌体的混合制剂(普通溶液、微针递送)、外泌体装载胶原蛋白的复合制剂、外泌体装载米诺地尔的复合制剂。各制剂的制备方案如下：
①米诺地尔单用制剂(Mino)为酊剂，制备方案为：先将100mg米诺地尔溶解至5mL无水乙醇中，随后逐渐滴加去离子水稀释，使最终溶剂比例为乙醇:水＝1:1。
②外泌体单用制剂(Exo)的制备方案与实施例10中较优ADMSC-Exo相同。
③外泌体装载胶原蛋白制剂(Exo(Col))的制备方案为：将100mg胶原蛋白(collagen，Col)溶解至5mL去离子水中，将100mgADMSC-Exo溶解至10mL电转缓冲液中，分别得到20mg/mL的胶原蛋白储备液和10mg/mL的ADMSC-Exo溶液，取1mL胶原蛋白储备液加至16mLADMSC-Exo溶液中，充分混合后进行电穿孔转导，随后置于37℃下孵育1h，最后采用上述梯度超速离心法去除有机溶剂和未装载胶原蛋白，加入适量生理盐水重悬，得到Exo(Col)。
④米诺地尔与外泌体的混合制剂(普通溶液)(Exo+Mino[Sol.])的制备方案为：将Mino溶液与Exo溶液直接混合。
⑤米诺地尔与外泌体的混合制剂(微针递送)(Exo+Mino[MN.])的制备方案为：将Mino溶液与Exo溶液直接混合，随后使用市售印章微针进行按压式给药。
⑥外泌体装载米诺地尔的复合制剂(Exo(Mino))的制备方案与实施例20中米诺地尔与外泌体投药比为1:8的较优ADMSC-Exo来源的Exo(Mino)一致。
1.对毛乳头细胞增殖的影响
使用CCK-8法考察各制剂对毛乳头细胞增殖活性的影响。将处于对数生长期的毛乳头细胞分别以每孔1×104个的密度接种到96孔细胞培养板中，培养24h后弃去旧培养基，分别加入药物浓度为50μg/mL和/或外泌体蛋白浓度为400μg/mL的Mino制剂、Exo制剂、Exo(Col)制剂、Exo+Mino[Sol.]制剂、Exo(Mino)制剂。继续培养24h后弃去含药培养基，PBS润洗后每孔加入100μL含10％CCK-8试剂的细胞培养基，于37℃培养箱中孵育45min后，使用全自动酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光度。以无细胞孔为空白对照，未加药物组为阳性对照，计算各组药物处理下毛乳头细胞的细胞活力，计算公式为：细胞增殖活力(％)＝(A实验组–A空白对照组)/(A阳性对照组–A空白对照组)×100％。
结果如图4所示，Exo(Mino)处理组的毛乳头细胞活力分别是Mino组、Exo组和Exo+Mino[Sol.]组的2.44倍(P<0.0001)、1.65倍(P<0.0001)和1.32倍(P<0.0001)，说明与米诺地尔单用、外泌体单用和/或二者的混合应用相比，外泌体装载米诺地尔后能显著促进毛乳头细胞的增殖；同时，Exo(Col)组的毛乳头细胞活力仅为Exo组的1.07倍(P>0.05)，数据没有显著性差异，说明胶原蛋白未能与外泌体产生明显的协同作用，提示本发明中外泌体与米诺地尔的组合应用对毛乳头细胞的促增殖作用更强，并且米诺地尔在外泌体内部的装载更有助于二者在毛乳头细胞内产生协同药效。
2.对小鼠毛发生长的影响
使用4～6周龄的雄性C57BL/6小鼠(购自上海市第一人民医院实验动物中心)考察各外用制剂对小鼠新生毛发生长的影响。用剃毛器剔除小鼠侧腹部皮肤表面毛发，并使用脱毛膏处理以完全去除残留毛发，将脱毛小鼠随机分为以下5组：Mino组、Exo组、Exo+Mino[Sol.]组、Exo+Mino[MN.]组、Exo(Mino)组。随后，分别制备米诺地尔浓度为10mg/mL、外泌体浓度为100mg/mL的上述制剂，以每日1次、每次1mL的频率在各组小鼠的脱毛区域进行涂抹式或微针(购自苏州美沃思医疗科技有限公司)按压式给药。连续给药14天后，随机选取3个脱毛区域，测量小鼠新生毛发覆盖面积，并进行统计分析。
各组小鼠新生毛发覆盖率的统计结果见图5。结果显示，经Exo(Mino)局部涂抹给药后，小鼠脱毛区域的毛发覆盖率显著升高，其促毛发生长作用分别是Mino组、Exo组和Exo+Mino[Sol.]组的4.50倍(P<0.0001)、2.97倍(P<0.0001)和1.98倍(P<0.0001)。同时，Exo(Mino)的促毛发效果达到了Exo+Mino[MN.]组的94％，数据不具有显著性差异(P>0.0001)。说明将米诺地尔装载于外泌体内部后，能够使两种组分产生更明显的协同作用，从而有效提升小鼠新生毛发的生长速率，并且达到了与微针递送相当的效果。
3.对小鼠毛囊发育的影响
使用4～6周龄的雄性C57BL/6小鼠考察各外用制剂对小鼠毛囊发育的影响。用剃毛器剔除小鼠侧腹部皮肤表面毛发，并使用脱毛膏处理以完全去除残留毛发，将脱毛小鼠随机分为以下5组：Mino组、Exo组、Exo+Mino[Sol.]组、Exo+Mino[MN.]组、Exo(Mino)组。随后，分别制备米诺地尔浓度为10mg/mL、外泌体浓度为100mg/mL的上述制剂，以每日1次、每次1mL的频率在各组小鼠的脱毛区域进行涂抹式或微针按压式给药。连续给药14天后，制备小鼠背部皮肤组织切片，显微镜下随机观察3个视野，并使用Image J软件计算各组小鼠的平均毛囊长度。
各组小鼠毛囊长度的统计结果见图6。结果显示，经Exo(Mino)局部涂抹给药后，小鼠脱毛部位的毛囊长度分别为Mino组、Exo组、Exo+Mino[Sol.]组和Exo+Mino[MN.]组的5.17倍(P<0.0001)、3.38倍(P<0.0001)、2.35倍(P<0.0001)和0.90倍(P<0.05)。上述结果与毛发生长结果一致说明，本发明所述复合外用制剂的体内抗脱发效果优于其余涂抹式外用制剂，对脱发小鼠的毛发生长和毛囊发育均具有明显的促进作用，并且达到了与微针递送几乎相当的治疗效果。
4.经皮给药的安全性
通过破损皮肤刺激性实验考察各外用制剂的体内生物相容性，实验开始前24h使用脱毛膏将小鼠脊柱两侧脱毛，脱毛范围为3cm×3cm，酒精消毒后在脱毛部位使用大头针划“井”字形擦伤，在脱毛皮肤表面分别涂抹式或微针按压式给予Mino制剂、Exo制剂、Exo+Mino[Sol.]制剂、Exo+Mino[MN.]制剂、Exo(Mino)制剂各1mL(其中米诺地尔浓度为10mg/mL、外泌体浓度为100mg/mL)，表面覆盖二层纱布和一层牛皮纸，再用无刺激性胶布和绷带固定。每次贴敷时长为4h，连续给药7d，并于每次去除药物1h及给药结束后24h、48h和72h进行皮肤刺激反应评分，评价标准参照(国家食品药品监督管理总局.药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则[EB/OL].2014-05-13.)。
结果如图7所示，Exo和Exo(Mino)处理后在给药和恢复观察期间未出现红斑、水肿等刺激性症状，而Mino组、Exo+Mino[Sol.]组、Exo+Mino[MN.]组在给药后则出现了不同程度的皮肤刺激症状，其中Exo+Mino[MN.]处理所引发的皮肤刺激症状最强而持久。
综合分析体内外疗效和安全性实验结果，可以得出本发明所述复合外用制剂，既能协同促进新生毛发生长和毛囊发育，达到了与微针递送几乎相当的治疗效果；又兼具较高的体内生物相容性，有效降低了现有制剂的皮肤刺激性。
实施例29与纳米剂型比较
本实施例对比了不同纳米剂型的米诺地尔制剂的体外透皮行为和体内促毛发生长药效，所涉及的具体剂型有：米诺地尔酊剂、白蛋白装载米诺地尔制剂、脂质体装载米诺地尔制剂和外泌体装载米诺地尔的复合制剂。各制剂的制备方案如下：
①米诺地尔酊剂(Mino)的制备方案与实施例28一致。
②白蛋白装载米诺地尔制剂(Anp(Mino))的制备方案为：称取50mg米诺地尔溶解于10mL无水乙醇中，同时称取400mg白蛋白溶于20mL去离子水中，强烈搅拌下将所得米诺地尔溶液缓慢滴加至白蛋白溶液中，滴加完毕后在热水浴中搅拌固化40min，冷却后于4℃下14000g离心25min，去离子水洗涤2次，用适量生理盐水重悬得到Anp(Mino)。
③脂质体装载米诺地尔制剂(Lip(Mino))的制备方案为：称取50mg米诺地尔、50mg蛋黄卵磷脂、50mg胆固醇、100mg二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、200mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺溶解于装有10mL氯仿中，通过旋转蒸发仪在35℃条件下进行减压蒸发除去有机溶剂，加入适量生理盐水快速振荡，水合后在冰上进行水浴超声使脂质薄膜从瓶壁上完全脱落，避光搅拌1h，过0.45μm、0.22μm微孔滤膜，得到Lip(Mino)。
④外泌体装载米诺地尔的复合制剂(Exo(Mino))的制备方案与实施例16中米诺地尔与外泌体投药比为1:8的较优UCMSC-Exo来源的Exo(Mino)一致。
1.不同纳米剂型的体外透皮行为
将离体鼠皮肤固定于直立式Franz扩散装置的供给池和扩散池之间，分别在离体皮肤表面均匀涂抹1mL米诺地尔浓度为10mg/mL的Mino制剂、Anp(Mino)制剂、Lip(Mino)制剂、Exo(Mino)制剂。在37℃恒温水浴、100rpm/min磁力恒速搅拌的条件下，分别于2h、4h、8h、12h、24h各取1mL接收液(接收液为PBS溶液)，同时补加等体积的新鲜接收液。取样完成后，使用高效液相色谱法测定各个时间点的米诺地尔浓度，并计算0～24h内各组制剂中米诺地尔的累积渗透量。
结果如图8所示，相同时间点下，外泌体制剂的米诺地尔累积透皮渗透量与脂质体相当(P>0.05)，并且显著高于酊剂(P<0.0001)和白蛋白纳米制剂(P<0.0001)，说明本发明所述外泌体装载米诺地尔的复合制剂具有较强的透皮药物递送能力，有助于将所装载的米诺地尔药物递送至皮肤组织深处。
2.不同纳米剂型的体内药效
使用4～6周龄的雄性C57BL/6小鼠考察不同米诺地尔纳米制剂的体内药效。用剃毛器剔除小鼠侧腹部皮肤表面毛发，并使用脱毛膏处理以完全去除残留毛发，将脱毛小鼠随机分为以下4组，分别以每日1次、每次1mL的给药频率给予Mino制剂、Anp(Mino)制剂、Lip(Mino)制剂、Exo(Mino)制剂。
结果如图9所示，Exo(Mino)处理组的新生毛发覆盖率分别是Mino组、Anp(Mino)组和Lipo(Mino)组的4.42倍(P<0.0001)、2.75倍(P<0.0001)和1.47倍(P<0.001)，表明外泌体装载米诺地尔的复合制剂具有明显优于酊剂和普通纳米制剂的体内促毛发生长作用。
综合分析上述结果可以得出，外泌体作为米诺地尔的纳米经皮载体时，不但经皮递送效率高，并且凭借外泌体本身的活性而进一步增效，因此，本发明筛选得到的外泌体装载米诺地尔的复方药物组合对于治疗脱发和/或促进毛发生长具有十分明显的优势。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种外泌体装载米诺地尔的复合外用制剂，其特征在于，所述复合制剂由米诺地尔装载于外泌体内部组成，外泌体取自细胞对数生长期的3～9代，所述的米诺地尔与外泌体的投药比为1:8～8:1。
2.根据权利要求1所述的复合外用制剂，其特征在于，所述米诺地尔的装载方法选自共挤出法、超声法、电穿孔法、反复冻融法、共孵育法的一种。
3.根据权利要求1所述的复合外用制剂，其特征在于，所述优选细胞对数生长期为3～6代，米诺地尔与外泌体的投药比为1:8～1:1，所述外泌体选自毛乳头细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪间充质干细胞外泌体、脐带间充质干细胞外泌体的一种或几种。
4.一种促进毛发生长的外泌体装载米诺地尔的复合外用制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)从毛乳头细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞之间选择一种或几种细胞进行分离和培养，再选用对数生长期第3～6代的细胞；
b)采用梯度超速离心法提取细胞内的外泌体；
c)采用共挤出法将米诺地尔装载于外泌体内部，米诺地尔与外泌体的投药比为1:8～1:1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述米诺地尔的装载方法包括共挤出法、超声法、电穿孔法、反复冻融法、共孵育法。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述米诺地尔的装载方法为共挤出法。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述外泌体选自毛乳头细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪间充质干细胞外泌体、脐带间充质干细胞外泌体的一种或几种。
8.根据权利要求1-3任一所述的复合外用制剂在制备治疗脱发疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脱发疾病为雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃。
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