CN101560522A - 在昆虫-杆状病毒系统中表达ibv-hn99膜蛋白基因的方法 - Google Patents

Abstract

一种在昆虫－杆状病毒系统中表达IBV－HN99膜蛋白基因的方法，属于生物工程领域。本发明还公开了一种膜蛋白基因重组表达载体，它同时含有麦芽糖标签和绿色荧光蛋白基因，命名为ACBacmid－egfp－MBP－M。在昆虫－杆状病毒系统中表达IBV－HN99膜蛋白基因的方法为：采用脂质体转染法用表达载体Bacmid－egfp－MBP－M转染Sf9细胞，经两代盲传。本发明的在昆虫－杆状病毒系统中表达IBV－HN99膜蛋白基因的方法的构建对开发IBV M基因的基因工程疫苗或M蛋白的ELISA诊断试剂盒具有重要的意义。

Description

在昆虫-杆状病毒系统中表达IBV-HN99膜蛋白基因的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种膜蛋白基因重组表达载体及在昆虫-杆状病毒系统中表达IBV-HN99膜蛋白基因的方法。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸、消化和泌尿生殖系统，造成蛋鸡产蛋数量减少，蛋的品质下降；雏鸡由于呼吸道或肾脏感染而大批死亡。IBV的膜蛋白基因编码M蛋白，M蛋白N端位于病毒粒子外部并被糖基化，其主要组成部分跨膜3次，M蛋白含有224～225个氨基酸残基，分子质量为23ku，M蛋白横跨囊膜，大部分在囊膜的内侧面，仅有一小部分糖基化的N端露在膜外，其C端无明显的亲水区或疏水区。M蛋白的作用与病毒颗粒的形成有关。DAVID F等在研究IBV糖蛋白结构与功能时发现糖基化的M蛋白与IBV的感染性有关，M蛋白由于糖基化程度不同，导致了M蛋白多态现象的产生(David F Stern，Bartholomew M Seffon.CoronavirusProteins：Structure and Function of the Oligosaccharides of the Avian InfectiousBronchitis Virus Glycoproteins[J].Virology，1982，p：804-812.)。IBV E蛋白和M蛋白的相互作用以及双分子层的膜在VLP的形成和病毒出芽发挥着重要作用(Emily Corse，Carolyn E，Machamer.The Cytoplasmic Tail of Infectious BronchitisVirus E Protein Directs Golgi Targeting[J].Virology，2002，76：1273-1284.)。Ignjatovic研究发现S1、S2和M蛋白均可诱导细胞介导的免疫反应。同年，Ignjatovic J，Galli L在研究IBV结构蛋白免疫保护性时发现，M蛋白能够诱导产生低滴度的限制性的交叉反应抗体，但M蛋白免疫的鸡不能抵抗强毒的攻击(Ignjatovic J，Galli L.Structural proteins of avian infectious bronchitis virus：role inimmunity and protection[J].Adv Exp Med Biol.)。在国内，陈萍等在2002年成功构建了重组质粒PC-M(IBVWHNJ)，分别采用裸露的质粒DNA疫苗和脂质体包被的M基因DNA疫苗免疫10日龄的雏鸡，他们所制成的M基因DNA疫苗能诱导鸡体产生体液免疫和细胞免疫，对强毒攻击有一定的抵抗力，M基因DNA疫苗对鸡的保护率可达70％。(陈萍.间接ELISA检测IBV DNA疫苗免疫抗体及IBV M基因表达研究[A].2005年第二届全国核酸疫苗与免疫研讨会论文集[C].北京，2005：14.)

尽管如此，对M蛋白进行疫苗开发的报道相当少，现在的IBV DNA疫苗的研究主要集中在免疫原性较高的N基因和S基因，对免疫原性较低的M基因的研究，国内外报道的都很少，因此，进一步研究M基因的免疫原性及其在IBV中的作用，对开发IBV M基因的基因工程疫苗或M蛋白的ELISA诊断试剂盒具有重要的意义。

杆状病毒表达系统自1983年建立以来，一直是应用最广泛的真核表达系统之一，它虽然具有很多突出的优势，但是也表现出一些不足。杆状病毒表达系统在具体应用当中还有一个缺陷就是病毒感染昆虫细胞后的病变及空斑难以识别，特别是对初学者。由于表达外源蛋白的需要，Bacmid缺失了多角体蛋白基因，使该系统就失去了天然的筛选标记，只能依靠病毒感染细胞后的病变来判断。绿色荧光蛋白基因egfp是一个广泛使用的报告基因，早期的研究表明，它能在昆虫细胞中正常表达，并具有产生绿色荧光的能力，因此它也被应用到杆状病毒表达系统中，但以前的研究多是预先将其构建到转移载体中，再通过转座与外源基因一起转座到穿梭载体，从而指示病毒的侵染及蛋白质的表达，不能成为一个普通使用的系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种膜蛋白基因重组表达载体及其构建方法；本发明的另一目的在于提供一种在昆虫-杆状病毒系统中表达IBV-HN99膜蛋白基因的方法。

本发明目的是通过以下技术方案实现的：

一种膜蛋白基因重组表达载体，它同时含有麦芽糖标签和绿色荧光蛋白基因，定名为Bacmid-egfp-MBP-M。

所述的膜蛋白基因重组表达载体，所述的膜蛋白基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。所述的膜蛋白基因具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

膜蛋白基因重组表达载体的构建方法是按下述步骤进行的：

(1)在pFBDM载体的BamH I与EcoR I酶切位点之间插入MBP标签，得到杆状病毒真核表达载体pFBDM-MBP。

(2)以含有HN99株膜蛋白基因的质粒pMD18-T-M为模板，进行PCR扩增和产物回收，反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃结束反应。

(3)将鸡传染性支气管炎病毒HN99株膜蛋白基因PCR产物经EcoR I和Hind III双酶切，克隆入杆状病毒真核表达载体pFBDM-MBP，得到重组表达质粒pFBDM-MBP-M；

(4)将所构建的重组表达质粒pFBDM-MBP-M转化到DH10BAC-eGFP菌中，得到重组表达载体Bacmid-egfp-MBP-M。

在昆虫-杆状病毒系统中表达鸡传染性支气管炎HN99株膜蛋白基因的方法：采用脂质体转染法用重组的将上述表达载体Bacmid-egfp-MBP-M转染Sf9细胞，经两代盲传。

在昆虫-杆状病毒系统中表达鸡传染性支气管炎HN99株膜蛋白基因的方法的具体操作步骤如下：

(1)取10μL重组质粒Bacmid-egfp-MBP/M加入到装有320μL的TNM-FH培养基的Eppendorf管中；

(2)另取Eppendorf管，每管加脂质体5μL，放置5min；

(3)将脂质体5μL加入到330μL含有重组质粒的培养基中，作用25min；

(4)用TNM-FH培养基冲洗6孔细胞培养板上已长成单层的Sf9细胞，重复3次，吸出培养液，弃去；

(5)将处理好的样品液接种Sf9细胞，然后用封口膜封闭培养板，28℃培养120h；

(6)分别收集Sf9细胞和培养上清，细胞培养液离心5000r/min，4℃离心5min，将上清移至一无菌管内70℃保存，该上清内可能含有重组病毒颗粒；

(7)将上清接种细胞单层，盲传2代。

本发明的有益效果：本发明将重组转移载体pF-MBP/M转化到DH10BAC-eGFP菌中，通过细菌内转座和进一步PCR、三抗平板蓝白斑筛选等三个步骤可保证所得到的绝大部分重组克隆均为阳性。本发明所用到的转座质粒pF-MBP含有两个多可隆位点。在两个反向启动子之间又可将原有的多克隆位点再重复插入一次，因此该质粒具有同时可表达四个外源基因的潜力。本发明中仅用到该质粒最右边一个多角体启动子和多克隆位点。将M基因插入pF-MBP之前，在多角体启动子下游插入了MBP标签，并将M蛋白与MBP标签融合表达。在MBP标签的尾部有一Factor Xa切割位点构成的软接头与M蛋白连接，因此在MBP/M融合表达后可通过Factor Xa或Genenase I酶切掉软接头而获得不带标签的M蛋白。

本发明将重组基团DH10BAC-eGFP直接通过同源重组策略整合到Bacmid的基因组中，再转染E.coli细胞成为一个完整的新型Bac to Bac系统，从而更加有效地指示病毒的侵染及蛋白质的表达，适于任何外源基因的插入和应用。以Bacmid-egfp DNA转染昆虫细胞后，绿色荧光蛋白基因的表达起到了指示作用，在表达外源蛋白时，可以根据绿色荧光指示细胞被感染的状况，同时也可根据细胞感染状况确定最佳的病毒感染复数(MOI)。将报告基因直接整合到Bacmid基因组非必须区域后，每次构建重组病毒时，只需将待表达的外源基因克隆到Bacmid-egfp即可，不必象从前那样将报告基因和外源基因同时克隆到转移载体中，不仅省去了克隆工作的烦琐，而且避免了在克隆双基因工作中因选择合适酶切位点所面临的困难。

附图说明

图1是pFBDM载体物理图谱。

图2是Bac-To-Bac杆状病毒表达系统重组病毒构建和基因表达操作程序。

图3是pFastBacHTa载体物理图谱。

图4是pFastBacHTa多克隆位点图谱。

图5是Bacmid-egfp的构建流程。

图6是重组转座子的PCR鉴定原理。

图7是重组质粒酶切鉴定，M：DL8000标准分子量，1，2：pF-MBP-M双酶切产物。

图8重组转座子PCR鉴定，M：DL8000分子量标准，1：Bacmid-egfp-MBP/M，2：野生型杆状病毒DNA，3：对照。

图9是未转染Sf9细胞。

图10是转染72h后发生病变的Sf9细胞。

图11是转染72h后Sf9细胞中的绿色荧光。

图12是重组杆状病毒的PCR鉴定，1：M13特异性引物鉴定M重组杆状病毒，2：M通用引物鉴定M重组杆状病毒，M：DL8000标准分子量。

图13是重组杆状病毒感染的细胞与对照SDS-PAGE(左)和Western-blot(右)结果，1：野生型病毒对照，2：重组病毒表达样品，3：正常Sf9细胞对照，M：蛋白质分子量标准。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。

实施例1 重组表达载体的构建及其鉴定

1 材料

1.1 引物设计与合成

参照GenBank中发表的IBV M基因序列，采用引物设计软件Prime Premier5.0设计1对引物：

上游引物：5′-CGGAATTCAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAA-3′(EcoR I)

下游引物：5′-CCCAAGCTTCTCTCTACACGCACACATTTAT-3′(Hind III)

引物购自上海生物工程公司。

1.2 载体和菌株

载体pFBDM-MBP是在pFBDM载体的BamH I与EcoR I酶切位点之间插入了MBP标签，pFBDM的物理图谱见图1。

转座质粒pFBDM-MBP含有两个多可隆位点，在两个反向启动子之间又可将原有的多克隆位点再重复插入一次，因此该质粒具有同时可表达四个外源基因的潜力。本发明仅用到该质粒最右边一个多角体启动子和多克隆位点。将M基因插入pF-MBP之前，在pFBDM载体多角体启动子下游、BamH I与EcoR I酶切位点之间插入了MBP标签，并将M蛋白与MBP标签融合表达。在MBP标签的尾部有一Factor Xa切割位点构成的软接头与M蛋白连接，因此在MBP/M融合表达后可通过Factor Xa或Genenase I酶切掉软接头而获得不带标签的M蛋白。

菌株DH10BAC-eGFP(携带AcMNPV-eGFP病毒基因组及辅助质粒的DH10b菌)购自武汉大学医学分子病毒学国家重点实验室。

1.3 细胞系及其培养基

草地贪夜蛾昆虫细胞系Sf9(Spodopterafrugiperda)细胞和野生型病毒wtAcMNPV购自武汉大学医学分子病毒学国家重点实验室。Grace’s培养基、乳白蛋白水解物购于GIBCO公司；酵母粉购于OXOID公司。TNM-FH昆虫细胞培养基：1000ml Grace’s培养基中加酵母粉3.3g，乳白蛋白水解物3.3g，含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、10％胎牛血清。

1.4 酶和其他分子生物学试剂

各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、抗生素、IPTG、X-gal等为Sigma公司产品；碱性磷酸酶AP标记的羊抗兔IgG均购自北京中杉生物科技有限公司；DNA快速回收试剂盒购自上海申能博彩生物工程有限公司；质粒快速提取试剂盒购自上海中科开瑞生物芯片科技股份有限公司；DNA Marker、蛋白质Marker购自北京鼎国生物技术有限公司；小牛血清NCS和脂质体转染试剂(Lipofectin-2000)购于GIBCO/BRL公司；PVDF膜，购于Invitrogen公司；氨苄青霉素(Ap)，卡那霉素(Kan)，庆大霉素(Gm)和四环素(Tet)购于华美生物工程公司。其他的常规生化及分子生物学试剂均购自华美生物工程公司。

1.6 毒株

鸡传染性支气管炎HN99株，该毒株已申请中国专利(专利申请号位为200610018065.4)，并于2008年1月9号公开。

1.5 M13通用引物

用来检测重组Bacmid、重组杆状病毒的通用引物M13，购自大连TaKaRa生物公司。

上游引物为：5′-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3′

下游引物为：5′-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′

1.6 细菌培养基

三重抗性LB平板：

制作添加四环素(Tet)、庆大霉素(Gen)、卡那霉素(Kana)、IPTG、X-Gal的LB平板。各成分含量如下：

Tet(1mg/ml)            100μl

Gen(7mg/ml)            8.7μl

Kana(10mg/ml)          500μl

IPTG(100mmol/L)        167.85μl

X-Gal(20mg/ml)         200μl

涂LB平板时，首先涂X-Gal(20mg/ml)40μl。

1.7 主要仪器设备

二氧化碳培养箱；生化培养箱；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳仪；低温离心机；离子水生成仪；PCR仪；高速低温离心机；台式离心机；紫外可见光光度仪3000型；紫外分析仪97500型；超声波细胞破碎机；超净工作台；空气浴振荡器HZQ-C；微波炉；制冰机；电泳仪；微量移液器；电子天平；干烤箱；恒温培养箱；冰箱等，均由武汉大学医学分子病毒学国家重点实验室提供。

2 方法

2.1杆状病毒Bac to Bac表达系统操作流程

杆状病毒表达系统Bac to Bac重组病毒构建和基因表达操作程序如图2。

2.2 Bacmid-egfp的构建流程

Bac-To-Bac杆状病毒表达系统重组病毒构建和基因表达操作程序见图2。pFastBacHTa载体物理图谱见图3；pFastBacHTa多克隆位点图谱见图4；Bacmid-egfp的构建流程图5。

2.3 IBV HN99株M基因的PCR扩增及产物回收

2.3.1 质粒pMD18-T-M的构建

(1)IBV增殖与RNA的提取

将HN99株病毒液分别经一定比例稀释，接种10日龄SPF鸡胚，37℃培养36h后(弃去24h内的死胚)，无菌收集尿囊液，4℃ 5000r/min离心30min，取上清，再以27000r/min离心2h，用吸管轻轻吸出上清弃去，管底留下大约1mL，吹打，混匀。取该超离病毒液500μL，加Trizol试剂500μL，剧烈震荡1min，室温静置5min；加200μL三氯甲烷，震荡混匀30s，静置10min；4℃ 12000r/min离心15min，取上清液(约500μL)加等量体积异丙醇混匀，静置10min；4℃ 12000r/min离心10min，弃上清；加入1mL 75％乙醇，温和振荡混匀，悬浮沉淀；4℃ 7,500r/min离心5min，弃上清，室温干燥10min；用20μLDEPC水悬浮沉淀。立即进行反转录或置-20℃保存备用。

(2)RT-PCR扩增IBV HN99株M基因片段

(a)逆转录(RT)

按照Reverse Transcription System试剂盒说明书，以特异性下游引物为引物合成cDNA第一链。反应体系如表1，依次将以下试剂加入经DEPC水处理并灭菌过的PCR反应管中：

RNase Free H₂O        6μL

5×RT Buffer          4μL

10mmol/L dNTP         2μL

RNase inhibitor       1μL

特异性下游引物        1μL

Rever TraAce          1μL

Total RNA             5μL

总体积                20μL

反应参数为：

42℃       60min

95℃       5min

4℃        5min

将反应后的产物瞬间离心，立即进行PCR或储存于-20℃。

(b)PCR扩增

以cDNA第一链为模板，按照以下反应体系和反应参数进行目的基因的扩增：

cDNA第一链            5μL

上游引物              0.8μL

下游引物              0.8μL

10×PCR Buffer        2μL

10mmol/L dNTP         0.4μL

Taq DNA               0.2μL

RNase Free H₂O        10.8μL

总体积                20μL

反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃结束反应。取15μL PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳，并观察结果。

(3)PCR产物的回收、纯化与克隆

(a)PCR产物的回收

将以上PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，用紫外灯观察电泳结果，当要回收的DNA带与引物带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下含有欲回收带的凝胶，用凝胶回收纯化试剂盒回收目的片段。

(b)PCR产物的纯化

参照DNA快速回收试剂盒说明书的操作步骤进行纯化。

(c)PCR产物的克隆

将纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接。连接体系为：

纯化后的PCR产物       1μL

pMD18-T载体           1μL

ddH₂O                 3μL

总反应体积            5μL

连接反应液16℃水浴放置过夜后，存于-20℃备用。

2.3.2 M基因的PCR扩增及产物回收

以含有HN99株M基因的质粒pMD18-T-M为模板，按照以下反应体系和反应参数进行目的基因的扩增：

pMD18-T-M质粒            0.1μL

M基因上游引物            0.5μL

M基因下游引物            0.5μL

10×PCR Buffer           2.0μL

10mmol/LdNTP             0.4μL

Taq DNA                  0.2μL

RNase Free H₂O           16.3μL

                                               

总体积                   20μL

反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃结束反应。取15μL PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳。在紫外灯下用刀片切下含有目的条带的凝胶，用DNA回收纯化试剂盒回收M基因片段。

2.4重组质粒pFBDM-MBP/M(简称pF-MBP/M)的构建

2.4.1双酶切及产物纯化回收

取pF-MBP质粒和M基因PCR回收产物，分别进行EcoR I和Hind III双酶切。反应体系为：

pF-MBP质粒    5μL         M基因PCR产物    15μL

10×buffer    10μL        10×buffer      10μL

EcoR I        2μL         EcoR I          2μL

Hind III      2μL         Hind III        2μL

ddH₂O         31μL        ddH₂O           21μL

                                                    

总体积        50μL        总体积          50μL

37℃水浴作用3h，1％琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收pF-MBP载体和M基因片段。

2.4.2 连接、转化

将以上经纯化的目的基因和载体片段连接，其连接反应体系的组成为：

M基因片段     13μL

载体片段        4μL

连接Buffer      2μL

T4 DNA连接酶    1μL

                          

总体积          20μL

连接反应液16℃水浴放置过夜，然后转化DH10BAC DH5α(含Bacmid-egfp)感受态细胞。

2.4.3 阳性重组子的筛选、鉴定

在转化后过夜培养的LB琼脂平板上，任意挑取8个白色单菌落接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养10h左右。按小量碱裂解法提取质粒DNA。取3μL于0.8％琼脂糖凝胶中电泳鉴定，用空质粒作对照，鉴定有无重组质粒。选取鉴定阳性的重组质粒进一步进行酶切鉴定和PCR扩增鉴定。

2.5 转座

(1)取鉴定为阳性的重组质粒pF-MBP/M 10μL，加入到100μL含有DH10Bac-eGFP感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴45min。

(2)42℃水浴中热激200s，迅速移至冰中冰浴5min。

(3)加入800μL新鲜SOC液体培养基，37℃，150r/min轻摇1h。

(4)加入4μL Tet、1μL Kan、0.2μL Gen，37℃，150r/min，培养4h。

(5)取培养液100μL均匀涂在含Tet、Kan、Gen、IPTG、X-gal的LB平板上，正向放置1～2h，直至液体被充分吸收，倒置平板，于37℃培养箱中培养过夜，经过蓝白斑筛选，得到阳性克隆，再进行PCR鉴定。

2.6 重组转座子的鉴定

2.6.1 重组Bacmid DNA的提取与制备

(1)分别用无菌牙签挑取生长在含有三抗(Tet、Kan、Gen)的LB平板上的白色单个菌落，接种到5mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，250r/min培养过夜。

(2)次日将培养的菌液4℃，12000r/min离心30s，吸弃上清，收集菌体沉淀，加入300μL冰预冷的溶液I，重悬沉淀。

(3)加入300μL溶液II，温和颠倒数次混匀，冰浴静置5min，使细菌裂解。

(4)加入300μL冰预冷的溶液III，轻微振荡均匀，冰浴10min。

(5)12000r/min，4℃离心10min，转移上清至一个无菌Eppendorf管中。

(6)加入等体积的酚/氯仿抽提一次，颠倒混匀时一定要温和操作，以防质粒DNA断裂。

(7)12000r/min，4℃离心10min，小心吸取上清，丢弃沉淀。

(8)加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀过夜。

(9)12000r/min，4℃离心10min，保留沉淀，去除上清。

(10)加入室温放置的70％乙醇1mL，12000r/min，4℃离心10min，吸弃液体，重复操作一次，将Eppendorf管倒置于无菌滤纸上37℃温箱内干燥。

(11)将DNA沉淀溶于20μL含RNase A(20μg/mL)的TE溶液中，37℃放置30min以上，以消化RNA和重溶沉淀，然后-20℃保存。

2.6.2重组转座子的PCR鉴定

(1)重组转座子的PCR鉴定原理  见图6所示。

(2)PCR鉴定  取所制备的质粒DNA作1∶100稀释，分别使用M13通用引物、M基因特异引物进行PCR鉴定。M13通用引物反应体系如下：

10×PCR buffer      5μL

2.5mmol/L dNTPs     4μL

M13上下游引物各     2.5μL

质粒DNA             1μL

TaqDNA              0.5μL

ddH₂O               35.5μL

                                     

总体积              50μL

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min。同时设立水对照和蓝色菌落阴性对照。

3 结果

3.1 pF-MBP-M质粒的筛选与酶切鉴定

选择质粒凝胶电泳初步鉴定为阳性的质粒，进行双酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析表明，含M基因片段重组质粒经EcoR I+HindIII双酶切后，产生了约6.0kb的pF-MBP载体条带和0.7kb的M基因条带(图7)，与预期结果一致。阳性质粒测序结果表明，读码框正确，插入片段与原始序列相同，目的基因克隆到了载体的预期位置，可以用于表达。

3.2重组转座子PCR鉴定

含M基因片段重组阳性质粒转化大肠杆菌Bacmid-egfp感受态，发生转座。PCR鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳分析表明，1道的重组转座子产生了4.6kp左右带(携带Bacmid-egfp上的2.6kp左右序列和插入外源融合基因MBP/M的2.0kb左右序列)，见图8，与预期结果相符合，确定为阳性Bacmid穿梭载体，将其命名为Bacmid-egfp-MBP/M。

实施例2 IBV-HN99膜蛋白基因在昆虫-杆状病毒系统中的表达

1.重组表达载体Bacmid-egfp-MBP/M的构建

重复实施例1的方法构建重组表达载体Bacmid-egfp-MBP/M。

2.转染

Sf9细胞培养使用含100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，10％胎牛血清的TNM-FH培养基培养，一般每3d传代一次，每次一传三或一传四。当95％的Sf9细胞处于对数生长期时用于转染试验。采用脂质体转染法用重组载体Bacmid-egfp-MBP/M转染Sf9细胞，空白对照为正常的Sf9细胞，阴性对照采用野生型杆状病毒AcNPV感染Sf9细胞。具体操作步骤如下：

(1)取10μL重组质粒Bacmid-egfp-MBP/M加入到装有320μL的TNM-FH培养基的Eppendorf管中。

(2)另取Eppendorf管，每管加脂质体5μL，放置5min。

(3)将脂质体5μL加入到330μL含有重组质粒的培养基中，作用25min。

(4)用TNM-FH培养基冲洗6孔细胞培养板上已长成单层的Sf9细胞，重复3次，吸出培养液，弃去。

(5)将处理好的样品液接种Sf9细胞，然后用封口膜封闭培养板，28℃培养120h。

(6)分别收集Sf9细胞和培养上清，细胞培养液离心5000r/min，4℃离心5min，将上清移至一无菌管内70℃保存，该上清内可能含有重组病毒颗粒。

(7)将上清接种细胞单层，盲传2代。

3.重组病毒的鉴定

3.1镜检观察细胞病变及绿色荧光

用重组杆状病毒感染Sf9单层细胞72h后，置6孔细胞培养板分别在倒置显微镜和荧光显微镜下观察有无细胞病变及绿色荧光。

3.2重组病毒DNA的提取

(1)用100μL细胞培养瓶培养Sf9细胞，待细胞长成单层时，更换培养基，接种病毒收集液，置28℃培养72h。

(2)吹打后，取出培养液，5000r/min，离心5min。

(3)取上清20000r/min，离心1h，弃取上清，保留沉淀。

(4)用600μL ddH₂O悬浮沉淀，加入100μL SDS(10％)置37℃保温1h。

(5)酚/氯仿抽提2次，加入1/10体积的乙酸钠和等体积的异丙醇，-20℃放置1h以上。

(6)12000r/min，离心10min，沉淀DNA。

(7)加入800μL70％乙醇清洗2次，室温晾干。

(8)加入50μL TE，37℃放置30min以上以溶解DNA沉淀，然后放置于-20℃冰箱中保存备用。

3.3重组病毒PCR鉴定

取提取的重组病毒DNA 1μL作模板，以M基因特异性引物和M13通用引物进行PCR鉴定，参照重组转座子PCR鉴定的方法进行操作。

4.蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳

4.1感染后Sf9细胞的收集

用重组杆状病毒感染Sf9单层细胞72h后收获细胞，用弯头吸管将培养瓶中贴壁的Sf9细胞轻轻刮下，转移至Eppendorf管中，1000r/min离心5min，弃上清，用1mL PBS(0.01mmol//L)洗涤细胞，Tip头轻吹使细胞悬浮，1000r/min离心5min，倒净PBS，每个Eppendorf中加入1mL无菌水，移到5mL的离心管中，冰浴条件下超声波破碎细胞基因组DNA至溶液不粘为止，然后用SDS-PAGE上样缓冲液将细胞裂解，沸水煮样品5min，10000r/min离心5min。

4.2表达产物的SDS-PAGE检测

参考《分子克隆实验指南》第2版(金冬鹰等译，1999)制作SDS-PAGE凝胶(凝胶浓度根据蛋白质分子量而定)。

取15μL样品进行SDS-PAGE，采用不连续凝胶系统，浓缩胶4％、分离胶12％，电泳条件为积层胶80V，分离胶120V恒压。

5.重组蛋白活性的Western Blot检测

制备用于Western Blot分析的SDS-PAGE凝胶，以AcNPV病毒感染的Sf9细胞、野生型AcNPV感染单层Sf9细胞和正常培养的Sf9细胞作为阴性对照。用兔抗MBP多克隆抗体(12CA5克隆)进行Western杂交分析，检测重组病rAc-egfp-MBP/M感染Sf9细胞72h后MBP/M融合蛋白的表达。检测方法如下：

(1)rAc-egfp-MBP/M感染Sf9细胞72h后，用弯头吸管将培养瓶中贴壁的Sf9细胞轻轻刮下，不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电泳条件为恒流12mA。待溴酚蓝条带距离胶下沿约1cm时停止电泳。

(2)用电转印仪将凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上，转印条件为恒流100mA，1～2h。

(3)取下滤膜，装入杂交袋，在封闭缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，5％脱脂奶粉，0.05％ Tween-20)中室温下封闭3h，期间轻轻振摇。

(4)加入抗兔MBP多克隆抗体(1∶500稀释)，4℃杂交过夜，期间轻轻振摇。

(5)杂交终止，以洗涤缓冲液TBST(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，0.05％ Tween-20)洗涤两次，每次10min。

(6)在5mL封闭缓冲液中加入碱性磷酸酶(AP)偶联的羊抗兔IgG(1∶5000稀释)，室温孵育1h，期间轻轻振摇。

(7)以洗涤缓冲液TBST洗膜三次，每次10min；TBS(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl)洗膜两次，每次10min。

(8)取出纤维素膜，置50mL NBT/BCIP生色底物溶液中，轻轻振摇，至出现蓝紫色的反应信号，立即取出纤维素膜，细股流水冲洗掉杂交膜上残余的生色液。待杂交膜空气中自然干燥后，记录结果，拍照。

6.转染后细胞病变及绿色荧光观察

Bacmid-egfp-MBP/M转染Sf9细胞，经两代盲传后，在倒置显微镜下可见转染Sf9细胞核膨大，细胞折光性增加，细胞增大最后破碎，与正常Sf9细胞差别明显(图9，10)，在荧光显微镜下可以看到细胞浆内有大量绿色的荧光(图11)，表明已有大量重组病毒包装成功。此时收集含有大量的重组杆状病毒的细胞上清。细胞沉淀用于SDS-PAGE和Western-blot检测蛋白表达。

7.重组杆状病毒的PCR鉴定

用出现病变的Sf9细胞提取DNA，分别用M13引物、M基因特异性引物进行PCR鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳结果见图10。由图可见，成功地从病变细胞中扩增出特异性片段，长度分别为4600bp、700bp，表明已经产生重组病毒。

8.表达产物的SDS-PAGE和Western Blot分析

以正常Sf9细胞和野生型病毒感染的Sf9细胞作为对照，对重组病毒感染的Sf9细胞作SDS-PAGE，经染色、脱色后结果如图13(左)。从电泳所形成的蛋白条带上看，重组病毒组样品比对照在约68ku处多出一条蛋白带。

通过杂交后显色反应，在硝酸纤维素膜上MW为68ku附近出现明显的杂交条带，说明表达的蛋白质与已知抗体发生了抗原-抗体反应，证明所表达的蛋白就是目的蛋白，与预期结果一致，结果如图4-13(右)。

<110>河南农业大学

<120>在昆虫-杆状病毒系统中表达IBV-HN99膜蛋白基因的方法

<160>2

<170>DNAstar.

<210>1

<211>669

<212>DNA

<213>鸡(Chicken)

<220>

<221>met_peptide

<222>(3)...(14)(20，21，22)

<400>1

Atggaaaatt gcactcttaa cactcagcag gcagctgagc ttttcaagga atacaactta 60

tttataaccg cattcctgtt gtttctcact atactacttc agtatggtta tgcaactagg 120

agtcggctca tctatatagt gaaaatgata gtgttgtggt gcttttggcc cctcaacatt 180

gcaataggtg taatttcatg tatataccca ccaaatacag gaggtcttgt cgcagcgata 240

atacttactg tatttgcgtg tctttctttt gttggttatt ggatccagag tttcagactc 300

tttaagcggt gtaggtcttg gtgggccttt aaccctgaga gcaatgccgt gggttcaata 360

ctccttacaa atggtcagca atgtaacttt gctatagaga gtgtgccaat ggtactatct 420

cctattatta agaatgccat tctttattgc gaaggccagt ggcttgctaa atgtgaacca 480

gatcacttgc ctaaagatat atttgtttgc acacctgata ggcgtaatat ctatcgtatg 540

gtgcagaaat acactggtga ccaaagcgga aacaagaaga gatttgctac gtttgtctat 600

gctaaacagt cagtagatac tggcgagcta gaaagtgtag caacaggagg aaataacctt 660

tacacataa                                                         669

<210>2

<211>222

<212>PRT

<213>鸡(Chicken)

<220>

<221>CARBOHYD

<222>(2，4，5，10，11，12)

<400>2

Met Glu Asn Cys Thr Leu Asn Thr Gln Gln Ala Ala Glu Leu Phe

                5                   10                  15

Lys Glu Try Asn Leu Phe Ile Thr Ala Phe Leu Leu Phe Leu Thr

                20                  25                  30

Ile Leu Leu Gln Try Gly Try Ala Thr Arg Ser Arg Leu Ile Try

                35                  40                  45

Ile Val Lys Met Ile Val Leu Trp Cys Phe Trp Pro Leu Asn Ile

                50                  55                  60

Ala Ile Gly Val Ile Ser Cys Ile Try Pro Pro Asn Thr Gly Gly

                65                  70                  75

Leu Val Ala Ala Ile Ile Leu Thr Val Phe Ala Cys Leu Ser Phe

                80                  85                  90

Val Gly Try Trp Ile Gln Ser Phe Arg Leu Phe Lys Arg Cys Arg

                95                  100                 105

Ser Trp Trp Ala Phe Asn Pro Glu Ser Asn Ala Val Gly Ser Ile

                110                 115                 120

Leu Leu Thr Asn Gly Gln Gln Cys Asn Phe Ala Ile Glu Ser Val

                125                 130                 135

Pro Met Val Leu Ser Pro Ile Ile Lys Asn Ala Ile Leu Try Cys

                140                 145                 150

Glu Gly Gln Trp Leu Ala Lys Cys Glu Pro Asp His Leu Pro Lys

                155                 160                 165

Asp Ile Phe Val Cys Thr Pro Asp Arg Arg Asn Ile Try Arg Met

                170                 175                 180

Val Gln Lys Try Thr Gly Asp Gln Ser Gly Asn Lys Lys Arg Phe

                185                 190                 195

Ala Thr Phe Val Try Ala Lys Gln Ser Val Asp Thr Gly Glu Leu

                200                 205                 210

Glu Ser Val Ala Thr Gly Gly Asn Asn Leu Try Thr.

                215                 220

Claims (6)

1.一种膜蛋白基因重组表达载体，其特征在于：它同时含有麦芽糖标签和绿色荧光蛋白基因，命名为ACBacmid-egfp-MBP-M。

2.根据权利要求1所述的膜蛋白基因重组表达载体，其特征在于：所述的膜蛋白基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的膜蛋白基因重组表达载体，其特征在于：所述的膜蛋白基因具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的膜蛋白基因重组表达载体的构建方法，其特征在于该方法是按下述步骤进行的：

(1)在pFBDM载体的BamH I与EcoR I酶切位点之间插入MBP标签，得到杆状病毒真核表达载体pFBDM-MBP；

(2)以含有HN99株膜蛋白基因的质粒pMD18-T-M为模板，进行PCR扩增和产物回收，反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，4℃结束反应；

(3)将鸡传染性支气管炎病毒HN99株膜蛋白基因PCR产物经EcoR I、HindIII双酶切，克隆入杆状病毒真核表达载体pFBDM-MBP，得到重组表达质粒pFBDM-MBP-M；

(4)将所构建的重组表达质粒pFBDM-MBP-M转化到DH10Bac-eGF菌中，得到重组表达载体Bacmid-egfp-MBP-M。

5.一种在昆虫-杆状病毒系统中表达鸡传染性支气管炎HN99株膜蛋白基因的方法，其特征在于：采用脂质体转染法用权利要求1所述的表达载体Bacmid-egfp-MBP-M转染Sf9细胞，经两代盲传。

6.根据权利要求4所述的在昆虫-杆状病毒系统中表达鸡传染性支气管炎HN99株膜蛋白基因的方法，其特征在于，该方法的具体操作步骤如下：

(1)取10μL重组质粒Bacmid-egfp-MBP/M加入到装有320μL的TNM-FH培养基的Eppendorf管中；

(2)另取Eppendorf管，每管加脂质体5μL，放置5min；

(3)将脂质体5μL加入到330μL含有重组质粒的培养基中，作用25min；

(4)用TNM-FH培养基冲洗6孔细胞培养板上已长成单层的Sf9细胞，重复3次，吸出培养液，弃去；

(5)将处理好的样品液接种Sf9细胞，然后用封口膜封闭培养板，28℃培养120h；

(6)分别收集Sf9细胞和培养上清，细胞培养液离心5000r/min，4℃离心5min，将上清移至一无菌管内70℃保存，该上清内可能含有重组病毒颗粒；

(7)将上清接种细胞单层，盲传2代。

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