CN103374632A - 重组杆状病毒实时荧光定量pcr检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种实时荧光定量PCR的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒的方法，所述引物对能够结合重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域。利用所述引物对的实时荧光定量PCR检测方法能够区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒，并且所述方法操作简便快捷、一致性高、重复性好，兼具特异性和通用性。

Description

重组杆状病毒实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及检测领域，更具体地说，本发明涉及重组杆状病毒的实时荧光定量PCR检测方法和试剂盒。

背景技术

杆状病毒表达系统(Baculovirus expression vector system，BEVS)是一个以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为受体的表达系统。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配，因此是表达有生物活性的蛋白质的理想载体。由于杆状病毒表达系统具有安全、高效、容量大、重组病毒易于筛选、表达产物能进行折叠和修饰具有生物活性等特点，可以获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白，使其被广泛地应用于药物开发、疫苗、促生长因子、癌基因、抑癌基因蛋白产物、某些致瘤病毒蛋白、免疫活性分子、基因表达调控等多个领域的研究中。而Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是目前最多使用的杆状病毒表达系统，已有几百种动植物、病毒、细菌、真菌基因在昆虫细胞内得到高效表达。

杆状病毒的滴度是指制备好的杆状病毒溶液里具有感染昆虫细胞能力的病毒颗粒数量。病毒滴度是衡量病毒感染能力的量化指标，既反映制备的病毒质量，也是重复制备重组蛋白的重要技术数据之一。杆状病毒溶液的成功制备和有效扩增，重组病毒感染宿主细胞制备目的蛋白都需要监控和优化杆状病毒的滴度。为了在BEVS中最大程度地表达重组蛋白质，确定杆状病毒与细胞的合适比例，即，感染复数(Multiplicity of infection，MOI)是非常重要的。为在合适的MOI时感染细胞，必需测定病毒滴度。这对于病毒的扩增和获得新的病毒液时进行重复性表达重组蛋白是必不可少的。

现有的杆状病毒滴度检测方法包括：

1.空斑测定法

该方法的主要原理是病毒感染宿主细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。该方法需时间长，病毒滴度鉴定需要10-14天时间；易受Sf9细胞的质量、单层细胞密度、琼脂糖的一致性、孵育时间和操作者的熟练程度等多种因素影响，试验结果重复性差异较大，检测准确性低，不同实验室之间结果不一样。此外，该方法不能区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒。

2.ELISA检测方法

该方法检测病毒滴度需要2天，需要昂贵的专门试剂盒，操作麻烦。不同实验人员之间会有操作差别，不同实验室之间的结果也不一样。此外，该方法仍然不能区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒。

3.实时定量PCR检测方法

实时定量PCR技术(real-time PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。实时定量PCR在常规PCR基础上把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，能提高灵敏度，且在整个实验中，所有反应物在同一溶液中进行，不需要任何后处理过程，被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关。此方法快速，样品的制备和Q-PCR分析只需不到4小时；直接测量病毒液，不需要接种细胞和病毒液稀释和感染等繁琐步骤；并且其敏感性、重复性和相关性好，不同实验人员之间操作差别小。原始数据可以有清晰完整的电子版信息记录，可以很好保存每次实验数据和进行数据的回归比较分析。但现有的QPCR检测方法或者局限于检测单条特异性基因(IL18，参见沈波等，荧光定量PCR用于重组杆状病毒鉴定及病毒滴度检测的研究，中国免疫学杂志，2005年，第21卷，第11期：853-855)，或者和ELISA检测方法类似，检测病毒表面蛋白Gp64基因，仍然不能区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒。

此外，本领域普通技术人员熟知，引物的设计十分复杂，涉及方方面面的因素。有些引物即便经BLAST比对后发现特异性很高，但在实际PCR实验时却还会扩增非目的序列。因此，实际应用中往往难以获得兼具优秀的特异性和通用性的引物。

综上所述，目前的杆状病毒滴度检测方法各自存在局限性和不足之处，它们均不能区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒。因此，本领域急需能够区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒，并且操作简便快捷、一致性高、重复性好，兼具特异性和通用性的实时荧光定量PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供能够区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒的引物以及利用该引物进行的实时荧光定量PCR检测方法。

在第一方面，本发明提供一种检测重组杆状病毒的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于重组BacMid中整合的pFastBac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3190-3240位；所述反向引物结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3290-3340位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-250bp。

在另一优选例中，扩增产物的长度为100-200bp，更佳地，扩增产物的长度为110-150bp，更佳地为120±5bp。

在另一优选例中，所述正向引物结合于重组BacMid中整合的pFastBac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3200-3230位；所述反向引物结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3300-3330位。

在一优选例中，所述正向引物和反向引物的长度为10-28bp。

在另一优选例中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为60-62℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。

在一优选的实施方式中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO：6所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：7所示。

在一优选例中，所述重组杆状病毒是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒。

在第二方面，本发明提供一种检测重组杆状病毒的引物对，所述引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域。

在一优选例中，所述引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFastBac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中2920-3410bp的片段。

在另一优选例中，所述引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFastBac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中3150-3380bp的片段。

在一优选的实施方式中，所述引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中3200-3330bp的片段。

在另一优选的实施方式中，所述引物对中正向引物的序列如SEQ ID NO：6所示，所述引物对中反向引物的序列如SEQ ID NO：7所示。

在一优选例中，所述重组杆状病毒是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒。

在第三方面，本发明提供一种检测重组杆状病毒的方法，包括以下步骤：利用以上所述任一引物对，对待测样品进行实时荧光定量PCR，并检测PCR扩增产物。

在一优选例中，所述方法利用以上所述任一引物对特异性检测Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒。

在第四方面，本发明提供一种检测杆状病毒样品是否为发生重组的杆状病毒的方法，包括步骤：

(a)提供来源于所述样品的模板，用以上所述任一引物对进行实时荧光定量PCR；

(b)检测扩增产物，如有扩增产物，则所述样品是发生重组的杆状病毒；如无扩增产物，则所述样品不是发生重组的杆状病毒。

在一优选例中，所述重组的杆状病毒是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒。

在第五方面，本发明提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的以上所述任一引物对。

在一优选例中，所述试剂盒用于特异性检测Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括使用说明书。

在第六方面，本发明提供一种实时荧光定量PCR方法，包括步骤：

(a)利用以上所述任一引物对实施实时荧光定量PCR。

在一优选例中，所述方法包括步骤：利用以上所述任一引物对特异性检测Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例1的QPCR扩增曲线。

图2显示了实施例1的标准曲线。

图3显示了实施例1的QPCR扩增产物融解曲线。

图4显示了实施例2的QPCR扩增曲线。

图5显示了实施例3的QPCR扩增曲线。

图6显示了重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域(2511-4674)的2164bp片段(SEQ ID NO：1)的图谱。其中，蓝色高亮区标出TRTL-1F(SEQ ID NO：2)和TRTL-1R(SEQ ID NO：3)相应的区段；黄色高亮区标出TRTL-2F(SEQ ID NO：4)和TRTL-2R(SEQ ID NO：5)相应的区段；绿色高亮区标出TRTL-3F(SEQ ID NO：6)和TRTL-3R(SEQ ID NO：7)相应的区段；灰色高亮区标出TRTL-4F(SEQ ID NO：8)和TRTL-4R(SEQ ID NO：9)相应的区段。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，针对重组BacMid片段设计特异性PCR引物，不仅能够保证PCR能检测到特异性扩增产物，区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒，还能减少非特异性引物二聚体信号干扰，从而获得操作简便快捷、一致性高、重复性好，兼具特异性和通用性的实时荧光定量PCR检测方法。在此基础上完成了本发明。

定义

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

本文所述的“Bac-to-Bac杆状病毒表达系统”指近年来开发的一种快速、高效产生重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的技术。该技术利用细菌转座子原理，在大肠杆菌内能完成重组病毒的构建，取名为Bac-to-Bac表达系统，即，从细菌(bacterium)到杆状病毒(baculovirus)，是一种有效的重组昆虫杆状病毒的构建方法。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的基本原理为：AcNPV是一种环状双链DNA病毒，分子量在90～130kd，其是目前应用最广泛的杆状病毒表达载体。其中的多角体蛋白对于感染过程不是必需的，因此可以用外源基因来代替多角体蛋白基因，用这样一个重组的杆状病毒来感染昆虫细胞，从而实现目的蛋白的高效表达。将一个改造后的AcNPV基因组转化入大肠杆菌，使它像普通质粒一样能在细菌中复制，其称为杆状病毒穿梭载体(baculovirus shuttle vector，又称病毒质粒baculovirus plasmid，其首尾合写而成为BacMid)，通过位点特异性转座，在大肠杆菌内完成病毒基因组的重组。杆状病毒穿梭载体BacMid含有细菌单拷贝数mini-F复制子、卡那霉素抗性选择标记基因及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段。

在lacZα基因的N氨基末端插入一小段含有细菌转座子Tn7整合所需的靶位点(mini-att Tn7)，但它的插入不影响lacZα基因的表达阅读框。将杆状病毒穿梭载体(130kb)转化入大肠杆菌DH10β，获得转化子DH10Bac。因此，杆状病毒穿梭载体像一个大质粒一样，可以在大肠杆菌中增殖并使细菌细胞获得卡那霉素抗性，且与存在于受体菌染色体上的lacZα缺失产生互补，在IPTG诱导和X-gal或Blue-gal生色底物存在下转化体产生蓝斑(lacZ+)。

重组BacMid通过pFASTBAC供体质粒(donor plasmid)上的mini-Tn7转座子，在另一个辅助质粒(helper plasmid，13.2kb)的功能作用下将外源目的基因插入到BacMid中来完成。辅助质粒表达转座酶并含有四环素(tetracycline)抗性基因。pFASTBAC系列供体质粒具有共同的特征：每个质粒都含有杆状病毒启动子(polh或p10启动子)，在mini-Tn7左右臂间由一个完整的表达框，包括庆大霉素(gentamincin)抗性基因、杆状病毒启动子、多克隆位点及SV40 poly(A)。外源基因插入到杆状病毒启动子下游的多克隆位点，将此重组的供体质粒转化入含有辅助质粒和BacMid的DH10Bac中，由mini-Tn7转座子将供体质粒上的表达框插入到BacMid的靶位点，破坏lacZα基因的表达。在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素和X-gal的培养板进行筛选，重组的BacMid(即重组病毒基因组)转化体菌落呈白色。而非重组BacMid转化菌落依然为蓝色。因此可以通过菌落的颜色进行重组病毒的筛选。通过单菌斑的培养，抽提得到重组BacMid基因，随后转染入昆虫培养细胞获得重组病毒，即可进行重组蛋白的表达生产。

利用位点特异性转座作用将外源基因插入到能在大肠杆菌增殖的穿梭载体BacMid，实现重组病毒的构建，从而大大地缩短了重组病毒构建所需要的时间。因此，该技术可以快速、同时分离多种重组病毒。这是一种目前最快速简捷地生产重组病毒的方法。目前，Invitrogen公司的Bac-to-Bac系列产品已经是市场是最主要的昆虫表达系统，在全球科研制药疫苗工作中被广泛应用。

然而，该方法重组病毒的分离是通过蓝白斑筛选，虽然理论上可以分开野生型和非重组型病毒污染，但实际工作中，蓝白斑之间的差异不够显而易见，不同操作人员之间判断分析可能有差异，且非重组型病毒污染经常存在，对下游的蛋白表达存在严重干扰和影响，从而严重影响重组蛋白的表达生产。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒

本文所用的术语“Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒”或“重组BacMid”指外源基因插入到能在大肠杆菌增殖的穿梭载体BacMid获得的重组病毒。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒

本文所用的术语“Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒”指未插入外源基因的能在大肠杆菌增殖的穿梭载体BacMid。

Ct值

本发明利用Ct值表征模板的拷贝数。其中C代表循环(Cycle)，t代表阈值(threshold)。所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。

在实验过程中，加入已知浓度的标准品进行梯度稀释(5-6个稀释梯度)，将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR实验中进行反应，将稀释标准品得到的Ct值构建标准曲线，通过标准曲线可以进行样品的绝对定量数据分析，推算出未知样品的量。标准曲线的制作不需要人工操作，由仪器自动完成。未知杆状病毒样本的量，例如病毒DNA拷贝数可通过梯度稀释的含量已知标准品的Ct值推算出。

重组BacMid片段特异性PCR引物

本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的重组BacMid片段特异性PCR引物的设计不是针对外源基因本身或病毒载体本身，而是针对重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域的2164bp片段(2511-4674bp)设计的。

在优选的实施方式中，本发明引物对中的正向引物结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3190-3240位(对应于SEQ IDNO：1的第680-730位)；其中的反向引物结合于重组BacMid中整合的pFastBac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3290-3340位(对应于SEQ ID NO：1的第780-830位)，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-250bp。

在另一优选实施方式中，扩增产物的长度为100-200bp，更佳地，扩增产物的长度为110-150bp，更佳地为120±5bp。

在另一优选实施方式中，所述正向引物结合于重组BacMid中整合的pFastBac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3200-3230位(对应于SEQ ID NO：1的第690-720位)；所述反向引物结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3300-3330位(对应于SEQ ID NO：1的第790-820位)。

在另一优选实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为10-28bp。

在另一优选实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为60-62℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。

在另一优选实施方式中，本发明的引物对中正向引物的序列如SEQ ID NO：6所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：7所示。

在进一步的优选实施方式中，所述重组杆状病毒是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒。

在另一优选实施方式中，本发明的引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域。

在另一优选实施方式中，所述引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中2920-3410bp的片段(对应于SEQ IDNO：1的第410-900位)。

在另一优选实施方式中，所述引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中3150-3380 bp的片段(对应于SEQ IDNO：1的第640-870位)。

在另一优选实施方式中，所述引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中3200-3330bp的片段(对应于SEQ IDNO：1的第690-820位)。

本发明获得的重组BacMid片段特异性PCR引物有：TRTL-1F和TRTL-1R、TRTL-2F和TRTL-2R、TRTL-3F和TRTL-3R、以及TRTL-4F和TRTL-4R。经过进一步的测试，TRTL-3F和TRTL-3R为最佳引物对。

本发明的重组杆状病毒实时荧光定量PCR检测方法

本发明的重组杆状病毒实时荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：

1).设计和测试Bac-to-Bac杆状病毒表达系统特异性PCR引物

在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，针对重组BacMid片段设计特异性PCR引物，从而保证PCR能检测到特异性扩增产物，尽量减少非特异性引物二聚体信号干扰。

设计的PCR引物进行qPCR测试其特异性和扩增效率。经过系统优化后，选取最佳引物为最终检测用PCR引物。

2).碱裂解法提取杆状病毒DNA

本发明应用碱裂解法提取杆状病毒DNA，强碱溶液可使样本中蛋白质类PCR抑制物变性失活，解除对Taq酶的抑制作用，从而保证病毒DNA荧光定量有较好的重复性。除了保证较好的实验重复性，碱裂解法处理样本还有以下许多优点：(1)步骤少，操作简单，省时，整个过程不超过15min；(2)操作在一个离心管中进行，无需多次转移，降低了外源性病毒DNA污染的可能性；(3)耗费极低，无需贵重试剂和特殊仪器。综上所述，碱裂解法提取血清病毒DNA，简单、快速、耗费低，用于病毒DNA荧光定量测定敏感性高、重复性好，适用于实验室推广和应用。

3).定量PCR检测杆状病毒DNA

PCR反应的相关反应体系和反应条件可由本领域普通技术人员根据现有技术和实际情况自主确定。

4).QPCR荧光信号数据分析

荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段(基线期)，荧光信号指数扩增阶段(对数期)和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化；在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，必须选择在这个阶段进行定量分析。

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍(机器自动设置)，也可手动设置荧光阈值。手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值。

在确定好荧光阈值后，就能分析每个样品得到Ct值数据。再根据标准曲线推算出样品中模板的拷贝数。

本发明的重组杆状病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

本发明的重组杆状病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒装有：

a)本发明的Bacmid特异性引物；

b)其它相关试剂；和

c)使用说明书。

本发明的引物和方法的主要优点包括：

1.能够区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒；

2.能减少非特异性引物二聚体信号干扰；

3.操作简便快捷；

4.不同操作人员所得结果的一致性高、重复性好；和

5.兼具特异性和通用性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1.设计和测试Bac-to-Bac杆状病毒表达系统重组病毒的特异性PCR引物

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统重组病毒的特异性PCR引物的设计

在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，针对重组BacMid中整合的pFastBac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域的2164bp片段设计特异性PCR引物，从而保证PCR能检测到特异性扩增产物，并最大程度减少非特异性引物二聚体信号的干扰。

对设计的PCR引物进行qPCR以测试其特异性和扩增效率。经过系统测试后，选取最佳引物TRTL-3F和TRTL-3R为最终检测用PCR引物：

表1

测试步骤：

1.碱裂解法提取杆状病毒DNA：

根据Invitrogen公司Bac-to-Bac系统说明书，合成基因特异性引物L1-F：5’-CTGTATTTTCAGGGCGAATTCCAGGTGACTTTTATTTACATCC-3’(SEQ ID NO.：10)和L1-R：5’-CTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTACAGCTTACGT TTTTTGCG-3’(SEQ ID NO.：11)，通过PCR扩增L1基因，然后将L1基因克隆到市售的pFastBacHT载体(购自Invitrogen)中，按照说明书完整操作流程在Sf9细胞(Invitrogen)制备重组杆状病毒颗粒若干批次，-4℃贮存备用。

取50μl病毒样本中加入50μl碱裂解液(0.4M NaOH)，保温10min后以15000g离心5min，取上清，加入25μl 0.4M Tris HCl pH 7.5，-4℃贮存备用。

2.PCR反应：

2.1样品PCR板设计：确定检测样品后，首先在记录本上编排好上机的样品排放顺序，注意一个样品的加样尽可能安排在同一行，同一次重复的实验不能分开两板。

2.2实验设计中加入空白对照和标准品曲线，阳性病毒DNA。

2.3PCR反应体系配制

QPCR反应体系配制如下表所示：

表2

	25μl体系
		ddH2O	12.675
10X PCR缓冲液	2.5
		dNTP	2
20X EvaGreen	0.625
		正向引物TRTL-3F	1
反向引物TRTL-3R	1
		Hot start TapE	0.2
DNA	5
		总体积(μl)	25

计算好实验中需用多少份体系，按具体量配置PCR反应混合物。体系分装会有损失，一般多配10％份体系。总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀，然后20μl每管分装至PCR反应管中，再每管加入不同DNA模板和水对照模板，阳性病毒DNA和标准品曲线DNA模板。

2.4PCR反应扩增

QPCR扩增程序如下表所示：

表3

3.QPCR荧光信号数据分析

如“本发明的重组杆状病毒实时荧光定量PCR检测方法”中所述进行QPCR荧光信号数据分析。

实验结果：

QPCR扩增曲线如图1所示。

标准曲线如图2所示。

QPCR扩增产物的融解曲线如图3所示。

实施例2

碱裂解法提取Bac-to-Bac杆状病毒DNA和样品的QPCR扩增

如以上实施例1所述进行实验，利用引物TRTL-3F和TRTL-3R(SEQ ID NO.：6和7)，对多个病毒样品(病毒来源同前)进行碱裂解法提取Bac-to-Bac杆状病毒DNA和样品的QPCR扩增。

实验结果：

QPCR扩增曲线如图4所示。

实验结果分析：

样品检测结果和plaque数据基本吻合(1-3号样品数据)，并可被稳定放大(12个样品检测结果)(样品和对应Ct值数据如下表所示)

表4

孔号	检测类型	循环阈值
			B4	样品对照1	14.56
B5	样品对照2	26.39
			B6	样品1	20
B7	样品2	17.22
			B8	样品3	17.05
B9	样品4	18.83
			B10	样品5	18.59
C4	样品6	26.53
			C5	样品7	20.36
C6	样品8	16.88
			C7	样品9	18.39
C8	样品10	18.55
			C9	样品11	20.39
C10	样品12	20

实施例3

QPCR方法证实Bac-to-Bac杆状病毒样品滴度得到有效扩增

如以上实施例1所述进行实验，通过QPCR方法证实Bac-to-Bac杆状病毒样品(L1 P1病毒、L1 P2病毒和L1 P3病毒，(病毒来源同前，为L1病毒在病毒制备流程中的第一代，第二代和第三代病毒)滴度是否得到有效扩增。

QPCR扩增曲线如图5所示。

实验结果分析：

病毒滴度优化后最终得到的L1P1-P3病毒QPCR鉴定，确认重组病毒存在和有效扩增，是后续蛋白表达实验顺利进行的前提。

对比例1

本发明人利用基于杆状病毒GP64蛋白为基础的免疫学检测试剂盒BacPAK^TM Baculovirus Rapid Titer Kit(Contech)进行杆状病毒检测，结果发现空病毒亦得到阳性检测信号。

因此，本实施例证明利用现有技术不能特异性检测Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒。

实施例4

重复实施例1，利用针对Tn7R-Tn7L(2511-4674，2164bp)其它区段设计的3对引物(TRTL-1F和TRTL-1R、TRTL-2F和TRTL-2R以及TRTL-4F和TRTL-4R)(见表1)进行了QPCR实验。

结果发现，上述其它三对引物也能特异性扩增Bac-to-Bac杆状病毒表达系统有重组病毒颗粒。但在扩增效率、荧光信号以及引物二聚体干扰等方面的技术效果不如TRTL-3F和TRTL-3R那么优秀。

综上所述，本实施例证明，针对Tn7R-Tn7L的其它区段设计的引物均能区分Bac-to-Bac杆状病毒表达系统空病毒颗粒和有重组病毒颗粒，其中以TRTL-3F和TRTL-3R引物对为最佳引物对。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种检测重组杆状病毒的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3190-3240位；所述反向引物结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中第3290-3340位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-250bp。

2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物的序列如SEQ IDNO：6所示，反向引物的序列如SEQ ID NO：7所示。

3.一种检测重组杆状病毒的引物对，其特征在于，所述引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域。

4.如权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述引物对特异性结合于重组BacMid中整合的pFast Bac-to-Bac载体上Tn7R-Tn7L区域中3200-3330bp的片段。

5.如权利要求3或4所述的引物对，其特征在于，所述引物对中正向引物的序列如SEQ ID NO：6所示，所述引物对中反向引物的序列如SEQ ID NO：7所示。

6.一种检测重组杆状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求1-5中任一项所述的引物对，对待测样品进行实时荧光定量PCR，并检测PCR扩增产物。

7.一种检测杆状病毒样品是否为发生重组的杆状病毒的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供来源于所述样品的模板，用权利要求1-5中任一项所述的引物对进行实时荧光定量PCR；

(b)检测扩增产物，如有扩增产物，则所述样品是发生重组的杆状病毒；如无扩增产物，则所述样品不是发生重组的杆状病毒。

8.一种PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求1-5中任一项所述的引物对。

9.一种实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括步骤：

(a)利用权利要求1-5中任一项所述的引物对实施实时荧光定量PCR。

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