CN107494539A - 一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料及其制备方法和抗菌应用 - Google Patents

一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料及其制备方法和抗菌应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料及其制备方法和抗菌应用。所述溶菌酶/水滑石复合抗菌材料是为以水滑石为载体，溶菌酶嵌入水滑石载体层间，所述溶菌酶通过静电引力与水滑石载体层板组装，形成花簇状的复合抗菌材料。所述材料的制备方法为将水滑石和溶菌酶溶于pH值为7.0‑7.4的磷酸缓冲液中，保持在18‑25℃的环境中搅拌反应后，离心得到沉淀物，低温干燥得到所述溶菌酶/水滑石复合抗菌材料。本发明所得的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料具有对细胞毒性低，稳定性好的特点，及其良好的抗耐药性和抗菌功能，可用于纺织、母婴、医疗用品等领域。

Description

一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料及其制备方法和抗菌应用
技术领域
本发明属于纳米抗菌材料技术领域，具体涉及一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料及其制备方法和抗菌应用。
背景技术
在人类的生活环境中存在有许多不同种类的微生物，日常生活中我们用到的医疗针管、针头，接触到餐具、厨具，以及穿着和使用的各种纺织品，如服装、棉被、鞋袜等，都易滋生繁衍各种微生物。遇到合适的环境，它们会迅速繁殖，使纤维制品发霉、变色甚至脆化降解，严重的还会对人体皮肤产生强烈刺激，诱发各种皮肤病，影响人们的健康。尤其是自然界中存在的各类病毒、真菌和有害细菌等微生物深深地影响着人类的健康和寿命，具有很大的危害。
纳米抗菌材料是一类具备抑菌性能的新型材料，由于材料中抗菌剂的高比表面积和高反应活性的特殊效应，大大提高了整体的抗菌效果，可以使微生物包括细菌、真菌、酵母菌、藻类以及病毒等的生长和繁殖保持较低的水平。用抗菌材料制成的各种制品，具有卫生自洁功能，可有效避免细菌的传播，并能使抗菌材料的力学性能得到强化。
发明内容
本发明的目的是提供一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料及其制备方法。
一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料，该材料是以水滑石为载体，溶菌酶嵌入水滑石载体层间，所述溶菌酶通过静电引力与水滑石载体层板组装，形成花簇状的复合抗菌材料。
优选的，所述水滑石载体是镍铝水滑石、锌铝水滑石、镍锌铝水滑石、镁铝水滑石、镁铝锌水滑石中的一种或几种。
优选的，所述镍铝水滑石载体中镍铝摩尔比为2:1，所述锌铝水滑石载体中锌与铝摩尔比为2:1，所述镍锌铝水滑石载体中镍锌铝摩尔比为1:2:1，所述镁铝水滑石载体中镁与铝摩尔比为2:1，所述镁铝锌水滑石载体中镁铝锌的摩尔比为4:2:1。
一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料的制备方法，将水滑石和溶菌酶以质量比1:1-3：1溶于pH值为7.0-7.4的磷酸缓冲液中，在保持在18-25℃的环境中，以760r/min至820r/min的转速搅拌6-8h后，离心得到沉淀物，低温干燥得到所述溶菌酶/水滑石复合抗菌材料。
优选的，所述水滑石载体是镍铝水滑石、锌铝水滑石、镍锌铝水滑石、镁铝水滑石、镁铝锌水滑石中的一种或几种。
一种抗菌薄膜材料，包括上述任意一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料。
所述的抗菌薄膜材料的制备方法为：向聚乙二醇二丙烯酸酯原液中加入百分之一到千分之一质量的光引发剂；然后按300-500μg/mL的量加入溶菌酶/水滑石复合抗菌材料，超声溶解；取圆形磨具或直接在光滑玻璃板上滴加上述混合液，放入光固化箱中固化得到抗菌膜材料。
所述的光引发剂为光引发剂184(1-羟基环己基苯基甲酮)或光引发剂TPO(2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦)。
一种抗菌织品，包括上述任意一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料。
一种抗菌涂层，包括上述任意一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料。
本发明通过在水滑石分子上负载溶菌酶，利用该分子的高比表面积、强吸附能力以及高活性位点，来吸附细菌和病毒，溶菌酶可以溶解吸附在水滑石表面的细菌和病毒，结合DNA、RNA形成复盐使病毒失活，细菌死亡。提高抗菌、消炎、抗病毒的能力，得到更高效的抗菌材料。本发明所制备的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料的杀菌率比溶菌酶提高了40％，材料的细胞毒性很低，与细胞共同培养后，细胞成活率都在80％以上。本发明所制备的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料具有很好的稳定性，抗耐药性和抗菌性，对细胞毒性低、抑制细菌复长的优势，可以进一步制成薄膜、涂层，亦或静电纺丝等医疗卫生及纺织领域，还可以做成过滤垫用于水质净化除菌，综合表现出了在生物医药领域的应用价值。本发明提供的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料可用于纺织、母婴、医疗用品等领域。
附图说明
图1是本发明溶菌酶和水滑石组装的过程图；a是经过调控得到的水滑石材料；b是水滑石和溶菌酶相互吸附的过程；c是水滑石和溶菌酶负载后得到的花簇状的复合物材料。
图2、图3、图4分别为本发明实施例制备的溶菌酶/镁铝水滑石、溶菌酶/镁铝锌水滑石、溶菌酶/镍锌铝水滑石复合抗菌材料吸附细菌并致其死亡的SEM照片。
图5为本发明实施例制备的溶菌酶/锌镁铝水滑石复合抗菌材料涂板所得的a空白组、b单独加药组(仅加入溶菌酶)、c复合材料组的细菌生长情况对比图。
图6为本发明实施例制备的溶菌酶/镁铝锌水滑石复合抗菌材料的抗菌紫外对照实验结果图。
图7为本发明实施例制备的溶菌酶/镁铝水滑石复合抗菌材料与单独水滑石的红外对照图。
图8为本发明实施例制备的溶菌酶/镁铝水滑石复合抗菌材料与单独水滑石的XRD对照图。
图9为本发明实施例制备的溶菌酶/镁铝水滑石复合抗菌材料与单独水滑石的EDS对照图，图a是单独水滑石的元素特征峰，图b是负载溶菌酶之后溶菌酶和水滑石的元素特征峰。
图10为本发明实施例制备的溶菌酶/镁铝水滑石复合抗菌材料不同浓度的细胞毒性实验图。
图11为本发明实施例制备的溶菌酶/镍锌铝水滑石复合抗菌材料的抗大肠杆菌实验的共聚焦测试图，左图是空白对照，右图是加入复合材料，小白点都是死亡的细菌。
图12为本发明实施例制备的溶菌酶/镍锌铝水滑石复合抗菌材料的抗金葡萄球菌实验的共聚焦测试图，左图是空白对照，右图是加入复合材料，小白点都是死亡的细菌。
图13为本发明实例制备的溶菌酶/镍锌铝水滑石复合抗菌圆片膜材料的抗菌实验结果图，左图是膜空白，中间是抗菌圆片膜材料对大肠杆菌的抗菌实验，右图是抗菌圆片膜材料对金葡萄球的抗菌实验。
图14为本发明实例制备的溶菌酶/镍锌铝水滑石复合抗菌不规则薄膜材料的抗菌实验结果图，左边是膜空白，中间是材料对大肠杆菌的抗菌实验，右边是材料对金葡萄球的抗菌实验。
具体实施方式
本发明是用溶菌酶改性无机纳米颗粒，因其内部具有特殊的结构而带有不饱和负电荷，从而具有强烈的阳离子交换能力，经溶菌酶修饰后，对细菌有强的吸附固定及灭菌活性，从而起到抗菌作用。
本发明引入水滑石作为载体制备的抗菌材料，是一种具有层状结构、层间离子具有可交换性的一类化合物。利用层状化合物主体在强极性分子作用下所具有的可插层性和层间离子的可交换性，将一些功能性客体物质，如抗生素、溶菌酶等引入层间空隙并将层板距离撑开从而形成层柱化合物，得到性能良好的抗菌复合材料。层板上的金属离子可以被不同价态的金属离子同晶取代，从而使得层板上有多余电荷，当药物分子以离子形式插入层间时，分子两端可通过静电引力与层板相连接，负载更多的药物，提高抗菌效率。作为抗菌剂的载体，水滑石可以显著地提高比表面积，并具有高反应活性的特殊效应，大大增强了整体的抗菌效果。
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种很稳定的天然蛋白质，有较强的抗热性，能够水解致病菌中黏多糖。通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，致使细胞壁破裂，遗传物质逸出而使细菌溶解。溶菌酶还能与带负电荷的病毒蛋白直接结合，跟DNA、RNA以及脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。引入溶菌酶正是利用了其良好的抗菌性能、耐热性能和稳定性，结合水滑石的高比表面积、强吸附能力，两两协同达到更强的抗菌性能。
溶菌酶/水滑石复合抗菌材料的制备实施例
实施例1：NiAl-LDH@lyso的制备
(1)制备NiAl-LDH：
分别称取Ni(NO3)2·6H2O 5.816g(0.02mol)、Al(NO3)3·9H2O 3.751g(0.01mol)、urea 3.6038g(0.6mol)，溶于200ml去离子水中，将混合物置于反应釜中，150℃下反应12h；反应后取出，用乙醇水溶液洗涤三次，3000r/min离心5min；用60℃烘箱干燥得到镍铝水滑石NiAl-LDH。
(2)组装NiAl-LDH@lyso：
分别称取NiAl-LDH 0.6g、Lysozyme 0.3g，溶于200mL pH值为7.0的磷酸缓冲液中，置于单口烧瓶中，悬于搅拌器之下，调控760r/min的转速，保持在18～25℃的环境中8h。4000r/min离心6min，去除上清液，将沉淀用锡纸封好冷冻，置于冷冻干燥机冷冻干燥12h得到NiAl-LDH@lyso材料。
实施例2：ZnAl-LDH@lyso的制备：
(1)制备ZnAl-LDH：
分别称取Zn(NO3)2·6H2O 5.92g(0.02mol)和Al(NO3)3·9H2O 3.75g(0.01mol)配制成甲液，用NaOH 0.8g(0.02mol)制成乙液；将乙液缓慢滴加入甲液中；置于100℃烘箱中反应24h；用乙醇离心多次去除杂质后，去离子水洗涤沉淀；于60℃烘箱干燥得到锌铝水滑石ZnAl-LDH。
(2)组装ZnAl-LDH@lyso：
分别称取ZnAl-LDH 0.6g、Lysozyme 0.3g，溶于200ml pH值为7.0的磷酸缓冲液中，置于单口烧瓶中，悬于搅拌器之下，调控760r/min的转速，保持在18～25℃的环境中8h。4000r/min离心6min，去除上清液，将沉淀用锡纸封好冷冻，置于冷冻干燥机冷冻干燥12h得到ZnAl-LDH@lyso材料。
实施例3：NiZnAl-LDH@lyso的制备：
(1)制备NiAl-LDH：
分别称取Ni(NO3)2·6H2O 2.90g(0.1mol)；Zn(NO3)2·6H2O 5.95g(0.2mol)；Al(NO3)3·9H2O 3.75g(0.1mol)；urea15g(0.25mol)；将混合物搅拌冷凝回流48h后过滤；用乙醇离心多次去除杂质后，去离子水洗涤沉淀；于60℃烘箱干燥至得出镍铝水滑石NiAl-LDH。
(2)组装NiZnAl-LDH@lyso：
分别称取NiZnAl-LDH 0.6g、Lysozyme 0.3g，溶于200ml pH值为7.0的磷酸缓冲液中，置于单口烧瓶中，悬于搅拌器之下，调控760r/min的转速，保持在18～25℃的环境中8h。4000r/min离心6min，去除上清液，将沉淀用锡纸封好冷冻，置于冷冻干燥机冷冻干燥12h得到NiZnAl-LDH@lyso材料。
实施例4：MgAl-LDH@lyso的制备：
(1)制备MgAl-LDH：
分别称取Mg(NO3)2·6H2O 20.512g(0.08mol)、Al(NO3)3·9H2O 15.0052g(0.04mol)、urea 24.024g(0.4mol)，溶于400ml去离子水中；将混合物置于反应釜中，150℃下反应12h；反应后取出，用乙醇水溶液洗涤三次，3000r/min离心5min；用60℃烘箱干燥至得出MgAl-LDH。
(2)组装MgAl-LDH@lyso：
分别称取MgAl-LDH 0.6g、Lysozyme 0.3g，溶于200mlPB缓冲液中，置于单口烧瓶中，悬于搅拌器之下，调控760r/min的转速，保持在18～25℃的环境中6h。4000r/min离心7min，去除上清液，将沉淀用锡纸封好冷冻，置于冷冻干燥机冷冻干燥12h得到MgAl-LDH@lyso材料。
实施例5：ZnMgAl-LDH@lyso的制备:
(1)制备ZnMgAl-LDH：
分别称取Mg(NO3)2·6H2O 12.3g(0.048mol)、Zn(NO3)2·6H2O 1.735g(0.006mol)、Al(NO3)3·9H2O 4.38g(0.012mol)、urea 8.41g(0.14mol)；溶于200ml去离子水中；将混合物置于反应釜中，100℃下反应25h；反应后取出，用乙醇水溶液洗涤三次，3000r/min离心5min；用60℃烘箱干燥至得出成品。
(2)组装ZnMgAl-LDH@lyso：
分别称取ZnMgAl-LDH 0.6g、Lysozyme 0.3g，溶于200mlPB缓冲液中，置于单口烧瓶中，悬于搅拌器之下，调控760r/min的转速，保持在18～25℃的环境中6h。4000r/min离心7min，去除上清液，将沉淀用锡纸封好冷冻，置于冷冻干燥机冷冻干燥12h得到样品。
抗菌实验
具体步骤如下：
(1)取1mlOD值在0.8～1.0的E.Coli(或Sa)，于2ml离心管，8000r/min离心3min，去除上清液；
(2)加入1mlPBS缓冲液，离心去除上清液；
(3)加入1ml溶菌酶/水滑石溶液(320ug/ml)，摇床37℃、200r/min作用30min；
(4)取上述菌液梯度稀释到10-5倍，涂板，37℃培养箱培养16h；
(5)观察数菌落，做统计分析。
细胞毒性实验
具体步骤如下：
(1)在96孔板中加入100μL/孔(约1×104)，置37℃5％CO2细胞培养箱中培养24h。
(2)加入1～500μg/L的溶菌酶/水滑石溶液。
(3)将96孔板在37℃5％CO2细胞培养箱培养24h。
(4)每孔加50μL 1×MTT，在37℃孵育4h，使MTT还原为甲臢。
(5)吸出上清液，每孔加150μL DMSO使甲臢，用平板摇床摇匀。
(6)酶标仪在490nm波长处检测每孔的光密度。
细菌活死染成像实验
具体步骤如下：
(1)取1mlOD值在0.8～1.0的E.Coli(或Sa)，于2ml离心管，8000r/min离心3min，去除上清液；
(2)加入1mlPBS缓冲液，离心去除上清液；
(3)加入1ml溶菌酶/水滑石溶液(320ug/ml)，不加药作对照，摇床37℃、200r/min作用4h；
(4)加入1mlPI染料(3uM于PBS缓冲液中)，轻柔混匀，室温下避光孵育30min，之后离心并用PBS洗两次。
(5)取20ul滴于载玻片上并用载玻片压紧，置于共聚焦显微镜(FV1000-Ix81)，在552nm激发波长下观察。
扫描电镜成像实验
具体步骤如下：
(1)取1mlOD值在0.8～1.0的E.Coli(或Sa)，于2ml离心管，8000r/min离心3min，去除上清液；
(2)加入1mlPBS缓冲液，离心去除上清液；
(3)加入1ml溶菌酶/水滑石溶液(320ug/ml)，不加药作对照，摇床37℃、200r/min作用30min；
(4)对上述菌液用PBS缓冲液洗涤两次，加戊二醛固定液，再用乙醇梯度脱水，最后用无水乙醇溶解滴于硅片，置于SEM/4700显微镜下观察。
抗菌膜制备及抗菌实验
具体步骤如下：
(1)向聚乙二醇二丙烯酸酯原液中加入百分之一质量的光引发剂184；
(2)称取320μg溶菌酶/水滑石复合材料分别加入到1ml原液中，超声溶解；
(3)取圆形磨具或直接在光滑玻璃板上滴加上述混合液，放入光固化箱中30秒，得到抗菌膜材料。
(4)取1mlOD值在0.8～1.0的E.Coli(或Sa)，于2ml离心管，8000r/min离心3min，去除上清液；
(5)加入1mlPBS缓冲液，离心去除上清液；
(6)加入1ml缓冲溶液，将该菌液梯度稀释到10-3倍，涂板；
(7)在上述琼脂板中间放上抗菌膜，37℃培养箱培养16h，观察数菌落，做统计分析。
可以理解的是，以上是为了阐述本发明的原理和可实施性的示例，本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料，其特征在于，该材料是以水滑石为载体，溶菌酶嵌入水滑石载体层间，所述溶菌酶通过静电引力与水滑石载体层板组装，形成花簇状的复合抗菌材料。
2.根据权利要求1所述的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料，其特征在于，所述水滑石载体是镍铝水滑石、锌铝水滑石、镍锌铝水滑石、镁铝水滑石、锌镁铝水滑石中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料，其特征在于，所述镍铝水滑石载体中镍铝摩尔比为2:1，所述锌铝水滑石载体中锌与铝摩尔比为2:1，所述镍锌铝水滑石载体中镍锌铝摩尔比为1:2:1，所述镁铝水滑石载体中镁与铝摩尔比为2:1，所述镁铝锌水滑石载体中镁铝锌的摩尔比为4:2:1。
4.一种溶菌酶/水滑石复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，将水滑石和溶菌酶以质量比1:1-3：1溶于pH值为7.0-7.4的磷酸缓冲液中，在保持在18-25℃的环境中，以760r/min至820r/min的转速搅拌6-8h后，离心得到沉淀物，低温干燥得到所述溶菌酶/水滑石复合抗菌材料。
5.根据权利要求1所述的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料的制备方法，其特征在于，所述水滑石载体是镍铝水滑石、锌铝水滑石、镍锌铝水滑石、镁铝水滑石、镁铝锌水滑石中的一种或几种。
6.一种抗菌薄膜材料，其特征在于，包括权利要求1-5中任意一条所述的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料。
7.根据权利要求6所述的一种抗菌薄膜材料的制备方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：向聚乙二醇二丙烯酸酯原液中加入百分之一到千分之一质量的光引发剂；然后按300-500μg/mL的量加入溶菌酶/水滑石复合抗菌材料，超声溶解；取圆形磨具或直接在光滑玻璃板上滴加上述混合液，放入光固化箱中固化得到抗菌膜材料。
8.根据权利要求7所述的一种抗菌薄膜材料的制备方法，其特征在于，所述的光引发剂为1-羟基环己基苯基甲酮或2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦。
9.一种抗菌织品，其特征在于，包括权利要求1-5中任意一条所述的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料。
10.一种抗菌涂层，其特征在于，包括权利要求1-5中任意一条所述的溶菌酶/水滑石复合抗菌材料。
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