CN111937903B - 一种酶蛋白-纳米银抗菌复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种酶蛋白‑纳米银抗菌复合物及其制备方法和应用，采用紫外光和酶蛋白辅助技术还原纳米银，显著降低纳米银的粒径，减少抗菌过程中纳米银的使用量。此外，溶菌酶等酶蛋白可以破坏细菌细胞壁，与纳米银协同抗菌、抗病毒，进一步降低纳米银使用量，并且提高了抗菌、抗病毒的效果和广谱性，可实现长效持续抗菌、抗病毒。制备的酶蛋白‑纳米银粒径均一、分散性和稳定性好，制备方法条件温和、操作简单、成本低廉，可在短时间内实现抗菌复合物的大量制备。

Description

一种酶蛋白-纳米银抗菌复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物纳米材料和杀菌/抗菌领域，具体涉及一种酶蛋白-纳米银抗菌复合物及其制备方法和应用。
背景技术
纳米银具有广谱抗菌作用，它通过其纳米尺寸、表面电荷作用和产生的活性氧(ROS)杀灭微生物，在抗菌应用方面取得了显著的成效。采用纳米银抗菌材料制成的产品，可以减少病原微生物的繁殖，延长产品的使用时间以及提高重复利用性。例如，在空气净化器的过滤器上添加纳米银，过滤器兼具阻挡颗粒物(PM)、生物气溶胶和挥发性有机化合物(VOC)和杀菌的功能，提高了过滤器的使用寿命；在医院，由于大量抗生素的使用，细菌等病原体耐药性不断增强，增大了医院受感染的威胁，使用纳米抗菌材料制备的口罩、手套或防护服等医疗用品，可以降低医院病原微生物的感染几率、延长医疗用品的使用时间。也有研究表示，纳米银存在抗病毒作用，纳米银能够粘附在HIV-1病毒颗粒上，对T细胞起保护作用(SunRWY,ChenR,ChungN PY,et al.Chemical communications,2005(40):5059-5061.)。香港大学LUT等在研究纳米银对乙肝病毒的复制中发现，纳米银能够有效地减少细胞外乙型肝炎毒DNA的形成，抑制率大于50％(Lu L,SunRW,ChenR,et al.Antiviral therapy,2008,13(2):253.)。
研究发现，纳米银粒径越小，越有利于增强其直接机械损伤作用，并且有利于更高效释放银离子提高其化学损伤和抑制作用；所以，纳米银粒径越小，杀菌效率越高，达到有效杀菌效果所需要的剂量越小。
然而，纳米银在应用过程中存在一定的缺陷，小尺寸的纳米银更易团聚，稳定性不高，释放银离子速度较快，无法实现稳定持续的抗菌。而且，纳米银可在环境中以离子或纳米粒子形式累积，对土壤微生物、动植物具有毒性。纳米银的不稳定性和潜在毒性限制了其进一步应用。采用有机或无机纳米复合材料也可以增加纳米银的稳定性，但是会存在生物相容性问题，如何绿色合成纳米银愈发受到关注。
溶菌酶作为一种天然蛋白，可以破坏细胞壁中的β-1,4-糖苷键，破坏肽聚糖支架，使细胞裂解死亡。然而，由于革兰氏阴性菌肽聚糖处于细胞壁内层，溶菌酶需经过脂多糖才能作用到肽聚糖，因而溶菌酶对革兰氏阴性菌的抗菌效果较弱。将溶菌酶和纳米银结合起来协同抗菌，克服单独使用一种抑菌剂时抗菌谱窄的缺点，溶菌酶的柔性结构给纳米银提供限域空间，防止纳米银的聚集，从而在抗菌上发挥1+1>2的效果。此外，由于本申请的还原条件是紫外光，无需再添加其他试剂，不用调节pH，保证了生物试剂与无机材料的相容性。
发明内容
本发明的第一个目的是提供酶蛋白-纳米银抗菌复合物，采用光还原和蛋白辅助还原技术还原纳米银，以酶蛋白作为稳定剂和辅助还原剂，硝酸银作为银源，紫外光照作为还原手段。
本发明第二个目的是提供一种小粒径酶蛋白-纳米银抗菌复合物制备方法，制备的酶蛋白-纳米银粒径小且均一、分散性和稳定性好，制备方法条件温和、操作简单、成本低廉，可在短时间内实现抗菌复合物的大量制备。
本发明的第三个目的是克服现有纳米银抗菌和溶菌酶抗菌的不足，一方面通过合成更小粒径的纳米银增强抗菌效果来降低纳米银的用量，另一方面，溶菌酶对革兰氏阳性菌抗菌效果明显，对革兰氏阴性菌抗菌较弱，与纳米银协同抗菌，可以增强抗菌效果和抗菌的广谱性。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种酶蛋白-纳米银抗菌复合物，通过酶蛋白、硝酸银溶液在光照下反应得到，抗菌复合物的粒径为5～10nm，酶活保持在原酶酶活的60％以上。
优选的，所述酶蛋白选自葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、辣根过氧化物酶、脂肪酶、细胞色素c、乙醇脱氢酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶、蛋白酶、碳酸酐酶、蔗糖酶、漆酶中的一种或多种。
更优选的，所述酶蛋白为溶菌酶。
同时提供一种酶蛋白-纳米银抗菌复合物的制备方法，将酶蛋白分散于水中，缓慢加入硝酸银溶液，得到最终的反应体系，然后在光照下反应，透析冻干，得到酶蛋白-纳米银抗菌复合物干粉。
优选的，最终的反应体系中，酶蛋白、硝酸银的比例为5～20g/L：0.1～4mmol/L。
优选的，在25℃、200～500rpm、光照下反应0.5～4h。
优选的，光照的光源为紫外光。更优选的，紫外光光强为1000-2000mW/cm2。
本发明还提供上述酶蛋白-纳米银抗菌复合物在化妆品、食品包装、家电日化、医药器械、建筑材料、公共设施中的应用。
优选的，在家电上，应用于电冰箱、洗碗机、洗衣机、净水器、空气净化器、排风扇、干燥器、验钞机等；在日化上，可添加进衣物、手套、口罩、枕头、棉絮、床单、袜子、鞋、浴帘、拖把、围裙、洗面奶、沐浴露、面霜、化妆盒、粉扑等；在医药卫生领域，可添加进手术刀、静脉导管、针头、口腔手机、牙科材料、护士服、医用口罩、手套等；作为建筑住宅，纳米银可添加进油漆、墙面涂料、地板、壁纸、把手等；在皮革制品上，添加进皮鞋、皮包、皮带、皮衣、手表带等；在公共设施上，如公交车座椅、把手、公共厕所墙壁、公共便池、扶梯、电梯等。
本发明的有益效果为：
(1)采用酶蛋白辅助还原技术还原纳米银，显著降低纳米银复合物的粒径，合成粒径5～10nm，增强抗菌效果，从而降低纳米银的用量。
(2)溶菌酶既作为稳定剂，使金属纳米颗粒能够稳定存在，还可作为催化剂起作用，溶菌酶相比于原酶酶活保持60％以上。
(3)溶菌酶可以破坏细菌细胞壁、与病毒蛋白结合，与纳米银协同抗菌、抗病毒，进一步降低纳米银使用量，并且提高了抗菌、抗病毒的效果和广谱性，抗菌效果达到90％以上，可实现长效持续抗菌、抗病毒。
(4)本发明的酶蛋白-纳米银抗菌复合物的制备方法以“绿色化学”为宗旨，不添加额外试剂，只需在常温水溶液中获得，减少了实验合成的成本。
(5)本发明的酶蛋白-纳米银抗菌复合物可批量快速制备，可广泛应用于化妆品、食品包装、家电日化和医药卫生等领域。
附图说明
图1为使用光还原纳米银控制不同反应时间(0.5h、1h、1.5h、2h、4h)的全波长扫描紫外可见吸收光谱。
图2为实例2所制备的溶菌酶-纳米银复合物TEM图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1溶菌酶-纳米银复合物及其制备
(1)在10mL去离子水中加入170mg溶菌酶，搅拌10min，制得溶菌酶溶液；
(2)向步骤(1)中缓慢注入硝酸银溶液，得到最终的反应体系；
(3)在最终的反应体系中，溶菌酶浓度为17mg/mL，硝酸银浓度为3.5mmol/L，在25℃、300rpm、光强为1500mW/cm2的紫外光照射下反应0.5h，经透析、冻干后得到溶菌酶-纳米银复合物干粉。
实施例2溶菌酶-纳米银复合物及其制备
(1)在10mL去离子水中加入170mg溶菌酶，搅拌10min，制得溶菌酶溶液；
(2)向步骤(1)中缓慢注入硝酸银溶液，得到最终的反应体系；
(3)在最终的反应体系中，溶菌酶浓度为17mg/mL，硝酸银浓度为3.5mmol/L，在25℃、300rpm、光强为1500mW/cm2的紫外光照射下反应2h，经透析、冻干后得到溶菌酶-纳米银复合物干粉。
实施例3溶菌酶-纳米银复合物及其制备
(1)在10mL去离子水中加入170mg溶菌酶，搅拌10min，制得溶菌酶溶液；
(2)向步骤(1)中缓慢注入硝酸银溶液，得到最终的反应体系；
(3)在最终的反应体系中，溶菌酶浓度为17mg/mL，硝酸银浓度为3.5mmol/L，在25℃、300rpm、光强为1500mW/cm2的紫外光照射下反应4h，经透析、冻干后得到溶菌酶-纳米银复合物干粉。
实施例4脂肪酶-纳米银复合物及其制备
(1)在10mL去离子水中加入170mg脂肪酶，搅拌10min，制得脂肪酶溶液；
(2)向步骤(1)中缓慢注入硝酸银溶液，得到最终的反应体系；
(3)在最终的反应体系中，溶菌酶浓度为17mg/mL，硝酸银浓度为3.5mmol/L，在25℃、300rpm、光强为1500mW/cm2的紫外光照射下反应2h，经透析、冻干后得到脂肪酶-纳米银复合物干粉。
实施例5紫外可见吸收光谱
(1)在紫外分光光度计下设置200nm-600nm范围，对不同反应时间的溶菌酶-纳米银复合溶液进行全波长扫描。
(2)记录溶菌酶-纳米银复合溶液的紫外可见吸收光谱，纳米银在410nm附近会有特征峰。
由图1可以清楚看到在410nm附近有一个吸收峰，这是由纳米银表面等离子体共振造成的。这说明硝酸银在紫外光照射下形成纳米银，SPR峰的强度间接反映纳米银粒径，两者呈正相关关系。由于纳米银粒径越小，抗菌效果越好，但是，考虑到酶活越高，溶菌酶抗菌效果越好，综合考虑粒径和酶活，后续试验选用光照时间为2h。
对比例1溶菌酶-纳米银复合物及其制备
(1)在10mL去离子水中加入170mg溶菌酶，搅拌10min，制得溶菌酶溶液；
(2)向步骤(1)中缓慢注入硝酸银溶液，得到最终的反应体系；
(3)在最终的反应体系中，溶菌酶浓度为17mg/mL，硝酸银浓度为3.5mmol/L，在25℃、300rpm、光强为2500mW/cm2的紫外光照射下反应2h，经透析、冻干后得到溶菌酶-纳米银复合物干粉。
对比例2溶菌酶-纳米银复合物及其制备
(1)在10mL去离子水中加入170mg溶菌酶，搅拌10min，制得溶菌酶溶液；
(2)向步骤(1)中缓慢注入硝酸银溶液，得到最终的反应体系；
(3)在最终的反应体系中，溶菌酶浓度为17mg/mL，硝酸银浓度为3.5mmol/L，在25℃、300rpm、光强为500mW/cm2的紫外光照射下反应2h，经透析、冻干后得到溶菌酶-纳米银复合物干粉。
实施例6溶菌酶-纳米银复合物大批量制备
(1)在50mL去离子水中加入850mg溶菌酶，搅拌10min，制得溶菌酶溶液；
(2)向步骤(1)中缓慢注入硝酸银溶液，得到最终的反应体系；
(4)在最终的反应体系中，硝酸银浓度为3.5mmol/L，在25℃、300rpm、光强为1500mW/cm2的紫外光照射下反应2h，经透析、冻干后得到溶菌酶-纳米银复合物干粉。
实施例7溶菌酶-纳米银复合物的酶活测定
采用比浊法测定溶菌酶的活力。
1)溶菌酶液的配制：准确称取溶菌酶-纳米银复合物干粉5mg，用磷酸缓冲液(磷酸氢二钠7.86g，磷酸二氢钠11.7g，乙二胺四醋酸二钠0.372g，加水溶解至1L，pH为6.2)溶解为1mg/mL的酶液，再用缓冲液稀释4倍。
2)底物配制：取溶壁微球菌干粉5mg，加缓冲液少许，在乳钵中研磨2min，倾出，用缓冲液稀释至25mL，在450nm处测定吸光度为0.65-0.75时，进行活力测定。
3)酶活力测定：将酶液和底物悬液分别置于25℃水浴中保温10-15min，吸取3mL底物放入比色皿中测定底物悬液OD450，然后加入200ul酶液，迅速摇匀，从加酶时计时，每30s记一次吸光度，共测三次。
计算不同实例溶菌酶-纳米银抗菌复合物的酶活。
酶活力单位1U定义为在环境温度为25℃，pH＝6.2时，每分钟内酶分子使底物吸光度下降0.001为1个活力单位。
酶的活力单位数＝△A450/t×0.001
比活力为每毫克酶具有的酶活，单位为U/mg。
比活力＝酶活力/mg蛋白
表1不同溶菌酶-纳米银复合物的酶活测定
组别 比酶活(U/mg) 相对酶活(％)
实施例1 1.51 65.09
实施例2 1.68 72.41
实施例3 1.47 63.36
实施例4 1.46 62.93
实施例6 1.43 61.64
对比例1 1.3 56.03
对比例2 0.59 25.43
实施例8溶菌酶-纳米银复合物的抗菌实验
将大肠杆菌接种于LB培养基中，在摇床37℃下培养18h，活化大肠杆菌。然后用无菌生理盐水梯度稀释菌液至103CFU/mL，取出20μL稀释后的菌液于配置好的20mL LB液体培养基中，向菌液中加入一定量的溶菌酶-纳米银复合物混合液，在摇床37℃下培养18h，测定菌液在600nm处的吸光值。根据经验，在600nm处，吸光度为1对应于菌液浓度为1×109CFU/mL。
杀菌效果(％)＝(1-C/C0)×100％
C为加入纳米银或酶-纳米银复合物后在37℃下培养18h后的菌浓度，C0为空白组在37℃下培养18h后的菌浓度。
表2不同溶菌酶-纳米银复合物的抗菌效果
样品 杀菌效果(％)
实施例1 94.5
实施例2 98.4
实施例3 93.1
实施例4 92.7
实施例6 91.3
对比例1 57.5
对比例2 31.9
溶菌酶 32.2
对比只加入溶菌酶作为抑菌剂和加入溶菌酶-纳米银复合物作为抑菌剂，可以发现复合物作为抑菌剂的抗菌效果远大于于只加入溶菌酶作为抑菌剂的结果。
显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (2)

1.一种酶蛋白-纳米银抗菌复合物，其特征在于，通过酶蛋白、硝酸银溶液在光照下反应得到，抗菌复合物的粒径为5～10nm，酶活保持在原酶酶活的60％以上；所述酶蛋白为脂肪酶或溶菌酶；
所述的抗菌复合物的制备方法：将酶蛋白分散于水中，缓慢加入硝酸银溶液，得到最终的反应体系，最终的反应体系中，酶蛋白浓度为17mg/mL，硝酸银浓度为3.5mmol/L；然后在25℃、300rpm、光照下反应0.5-4h，光照的光源为紫外光，紫外光光强为1500mW/cm2；透析冻干，得到酶蛋白-纳米银抗菌复合物干粉。
2.如权利要求1所述的酶蛋白-纳米银抗菌复合物在化妆品、食品包装、家电日化、医药器械、建筑材料、公共设施中的应用。
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