CN109456503B - 一种鱼精dna/壳聚糖共混薄膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜及其制备方法。该鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜是由天然安全的鱼精DNA和高聚壳聚糖混合成膜，薄膜的厚度为5‑10µm，微观结构为高密度的球状颗粒堆叠组成；鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备方法是先将灭菌的鱼精DNA水溶液、壳聚糖酸溶液按顺序和投料比例混合5‑10 min，依次经震荡混匀、真空脱泡、流延成膜、碱液浸泡、无菌水冲洗，干燥后得到鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜，制备方法简单易操控，可以大规模生产；由本发明方法制备的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜具有易浸润、DNA溶出率低、可酶解、优于单纯壳聚糖膜的金属离子吸附性等优点，可以用于水体中有害重金属的吸附、分离，也可以用于常量金属元素和金属微量元素的营养供给。

Description

一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种天然鱼精DNA为材料的新型膜材料和膜结构，同时涉及具有颗粒状微观结构的膜材料的制备技术及其在食品、医药、化妆品领域的应用。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)，是一种生物大分子，易从鱼白或贝类性腺等加工下脚料中大量提取。DNA由于其规则的双螺旋结构、分子表面的大小沟、严格的碱基互补配对以及骨架上有可电离的磷酸基团等特性，在纳米技术领域成为了比较重要的构筑材料。正是由于DNA的这些特性，使金属离子可嵌插/插入到DNA的大沟、小沟的碱基对之间空隙或可与DNA络合，从而实现对金属离子的吸附。但由于DNA极易溶于水，传统方法制备的以DNA为主要材料的膜材料稳定性差，表现为DNA易从膜上脱离溶解到水中，造成膜结构的破坏或瓦解；另外，含有DNA的膜材料易于被生物酶类降解，机械强度差；DNA分子结构的刚性特点，利用其组成膜材料后仍存着材料脆性大，在剪切力等机械力的作用下，易断裂成碎片，诸如上述问题均大大限制了天然DNA在膜材料领域的应用，导致国内外对DNA膜材料的研究较少。
目前以天然鱼精DNA构建的薄膜材料鲜有报道，2002年，Yamada等人通过紫外线照射的方法来制备DNA膜，其DNA的固定率最高为60％，且DNA膜的刚性强，易断裂。随后，Yamada等人制备了DNA-无机材料复合膜，制备出的膜具有一定机械强度，固定率能达到90％，但是生物酶的降解率较高，120min后膜中的DNA基本全部被生物酶降解，并且此方法形成的膜在水溶液中机械强度低，无法实现重金属的吸附。Yusuke等人利用热压发制备了可用于骨组织工程膜材料的DNA-壳聚糖复合膜，其制备工艺较为复杂，同时由于热压法需要80℃高温，无法实现与热敏性活性物质结合。由于以上研究存在DNA水溶性强，易降解，成膜性差等问题，使其功能化应用受到限制。如何改善膜的性能，使DNA稳定存在成为制备DNA膜的关键。
发明内容
本发明的目的是针对目前DNA成膜稳定性差、易降解、易溶出、机械强度差等问题，提供了一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备方法，利用本发明的制备方法获得的分子组成和微观结构独特的薄膜，并展现出了良好的安全性、酶解特性、生物相容性等特性，能够应用于医药、食品、水净化处理等多个领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜，包括以下主要组分：鱼精DNA和壳聚糖。所用的鱼精DNA为从鲑鱼、鲤鱼的鱼精中提取获得的天然DNA，且为具有双螺旋结构的长链、线性DNA，DNA的平均分子量为50-130kD，当分子量大于130kD时易产生絮状沉淀，不可用于透明薄膜的制备，当分子量小于50kD时，薄膜浸泡后易溶出DNA；所用的壳聚糖为甲壳素高度脱乙酰化的产物，壳聚糖的脱乙酰度大于90％且为平均分子量40-80kD的高聚壳聚糖，所用原料最佳的为食品级。
一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备，包括以下步骤:
1)室温条件下，将壳聚糖溶解于0.1％的盐酸或醋酸溶液中得到20mg/mL的壳聚糖稀酸溶液，然后加入0.05％碱液调节pH至5-6得到5-10mg/mL的壳聚糖溶液；
2)室温条件下，将固体DNA溶解于灭菌超纯水中，制得0.5-0.9mg/mL的DNA溶液；
3)设定转速为300-500rpm，搅拌条件下将步骤2)的DNA溶液以0.2-2cm3/s的流速加入到步骤1)的壳聚糖溶液中，控制壳聚糖溶液与DNA溶液体积比为1:10，同时控制反应体系中的壳聚糖与DNA的质量比控制在1:1-1:4范围内，经脱气处理后得到的溶液记为溶液I；
4)将溶液I置于表面光滑的玻璃平板或亚克力平板中，流延成膜，挥干除溶剂，得到干燥成型的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜半成品；
5)将鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜半成品浸泡于0.1％-0.3％的NaOH溶液中10-30min，然后用超纯水冲洗直到冲洗液中的pH为7，挥干除溶剂，最终得到鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜成品。
一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备，其特征在于，所述的壳聚糖的浓度应控制在5-10mg/mL，DNA的浓度应控制在0.5-0.9mg/mL，加样顺序为将DNA缓慢加入到壳聚糖溶液中。
一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备，其特征在于，所述的挥干除溶剂，其方式可以为自然晾干，冷风干燥，烘干中的至少一种，且处理温度不得超过60℃。
一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备，其特征在于，在制备环节可向壳聚糖溶液中先加入肽类、维生素虾青素等热敏活性物质后再加入DNA，从而实现对活性物质的包载。
一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜及其制备的应用，包括但不限于水体净化及污水处理过程中重金属吸附、分离，常量金属元素和金属微量元素的日常营养供给，止血杀菌的医药敷料，食品保鲜保水膜材料的应用。
一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜及其制备，其特征在于，所述的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜可吸附的金属离子包括Ag+、Hg+等一价金属离子，Cd2+、Pd2+、Cu2+等二价金属离子和Fe3+、Al3+等三价金属离子。
本发明具有以下优点：
1)制备方法简单、易操控，原料来源广泛、成本低，制备的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜具有良好的亲水性、溶胀性、酶解特性、生物安全性和生物相容性；
2)本发明克服了DNA极易水溶而难以成膜的难题，通过加入壳聚糖并调节两组份的投料比，获得浸润能力、金属离子吸附能力、水蒸汽透过效率显著不同的系列薄膜，并且通过与活性物质的预混可丰富DNA/壳聚糖共混薄膜的应用范围，包括但不限于水质净化、医用敷料、保鲜保水。
附图说明
图1为干燥的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜(a)及其浸泡于水中(b)的照片。
图2为鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的扫描电镜图：a、b分别为样品1、2的表面图；c、d分别为样品1、2的截面图。
图3为鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜与单纯壳聚糖膜对Cu2+(左图)和Ca2+(右图)的吸附动态曲线。
图4为鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的理化性质表征。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明，并非限制本发明所涉及的范围。
实施例1：鱼精DNA/壳聚糖(1/4)共混薄膜的制备方法
500rpm搅拌的条件下，将0.8mg/mL的DNA溶液缓慢加入到10mg/mL的壳聚糖溶液中，使得最后DNA和壳聚糖的质量比为1:4，体积比为1:10，并在磁力搅拌作用下混合20min，经3h脱气处理后置于亚克力平板中，流延成膜，放置于烘箱中，45℃条件下烘干6h，制备得到鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜半成品，随后置于0.2％的NaOH溶液中浸泡10min，用超纯水冲洗3次后，45℃下烘干即得鱼精DNA/壳聚糖(1/4)共混薄膜，记为样品1。
实施例2：鱼精DNA/壳聚糖(1/1)共混薄膜的制备方法
300rpm搅拌的条件下，将0.8mg/mL的DNA溶液缓慢加入到10mg/mL的壳聚糖溶液中，使得最后DNA和壳聚糖的质量比为1:1，体积比为1:10，并并在磁力搅拌作用下混合20min，经3h脱气处理后置于亚克力平板中，流延成膜，放置于烘箱中，45℃条件下处理6h，制备成鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜。经0.2％的NaOH溶液，浸泡10min，用超纯水冲洗数次后即得鱼精DNA/壳聚糖(1/1)共混薄膜，记为样品2。观察其表观形貌为表面光滑、无色透明的薄膜，将其放置水溶液中，膜基本保持其形状，无溶解现象，见附图1，其中(a)为干燥的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜，(b)为浸泡于水中的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜状态。
实施例3：鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的理化性质表征
1)DNA溶出率的测定
将实施例1和实施例2制备得到的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜剪成30mg的样品分别放置于5mL的水溶液中，使水能完全浸润薄膜，放置48h后，利用Nanodrop 2000测量溶液中游离DNA的浓度。加入1mol/L的HCl调至pH 1，放置在100℃水浴锅中3h，然后用1mol/L的NaOH溶液调至pH7，利用Nanodrop 2000测定DNA总浓度，具体结果见图4，结果表明不同质量比的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜在水中浸泡48h后的DNA溶出率均低于2％，说明易溶于水的DNA可以被充分固定与薄膜上，因此利用本发明方法可以成功构建以天然DNA为主要组成的共混薄膜。DNA溶出率的计算公式如下：
L＝C1V1×100％/C0V0
L为DNA的溶出率，％；
C1为不同浸泡时间水溶液中DNA的浓度，μg/mL；
C0为DNA总浓度，μg/mL；
V1为放入膜后加入的水溶液的体积(5mL)；
V0为调整pH后水溶液的体积(7mL)。
2)DNase I对鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的酶解效率的测定
将实施例1和实施例2制备得到的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜分别在水溶液中放置8h后取出，分别加入2mL DNaseI的缓冲液，加入4μL DNase I，置于37℃恒温箱中48h，利用Nanodrop 2000测量溶液中DNA浓度。加入1mol/L的盐酸溶液调至pH1，然后放置在100℃水浴锅中孵育3h，最后用1mol/L的碱溶液调至pH7，利用Nanodrop 2000测定DNA总浓度，具体结果见图4，说明DNA酶对本发明中以天然DNA为主要组成的共混薄膜具有一定的可降解性，但是降解效率在48h内并不显著。薄膜的DNA降解率计算公式如下：
Q＝C2V2×100％/C0V0
Q为DNA的降解率，％；
C2为不同放置时间水溶液中DNA的浓度，μg/mL；
C0为DNA总浓度，μg/mL；
V2为放入膜后加入的缓冲液的体积，mL；
V0为调整pH后溶液的体积，mL。
3)鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的溶胀度的测定
将实施例1和实施例2制备得到的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜分别放置于烘箱中至恒重，称其重量记为W1，将薄膜浸泡在水溶液中15min，吸干表面水分，称其重量记为W2，溶胀度的测定结果见图4，结果表明本发明制备的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜具有一定的溶胀性，主要得益于两种生物大分子的亲水性。计算公式如下：
R＝(W2-W1)×100％/W1
R为溶胀度，％；
W1为鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜干重，mg；
W2为浸泡于水中的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜湿重，mg。
4)鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的水蒸汽透过性测定
将实施例1和实施例2制备得到的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜剪成7cm的圆形，配置饱和硫酸钾溶液，向称量杯中倒入35mL饱和硫酸钾溶液，用薄膜封口。将称量瓶放置于真空干燥器内，测量放置0h、2h、4h、6h、8h、10h下称量瓶的质量，随着时间的变化对质量减少量做回归分析求出变化率。水蒸气透过性的具体结果见图4，结果表明本发明制备的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜具有良好的水蒸汽透过性，堆叠粒子间隙有助于小分子如水蒸汽、气体的透过。水蒸汽透过性的计算公式如下：
WVP＝WVTR×L/(P1-P2)
WVP为水蒸汽透过性，g/m2·pa·s；
WVTR为水蒸汽透过率，g/(m2s)；
L为测定膜的平均厚度，m；
P1为膜内侧的水蒸气压力，Pa；
P2为膜外侧的水蒸气压力，Pa。
5)鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的接触角检测
用德国Dataphysics OCA20视频光学接触角测量仪测定实施例1和实施例2制备得到的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的接触角，用进样器吸取0.02mL的蒸馏水滴到复合膜上，液滴在膜表面停留20s后，每个样品至少取5个测量点，取平均值，具体结果见图4，说明随着共混薄膜中DNA含量的增加，共混薄膜的亲水性逐渐增强，表现为其增大的水性溶液易浸润的特性。
6)鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的扫描电镜观察
将实施例1和实施例2制备得到的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜剪成适当大小并固定，经真空喷金后置于样品台上，利用扫描电子显微镜(SEM,JSM-330A,Japan)对薄膜的表面和截面的微观形貌进行分析，具体形貌特征见图2，其中(a)(b)分别为实施例1、2制备的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的表面图；(c)(d)分别为实施例1、2制备的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的横截面图，从表面图和横截面图可见不同质量比的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜均由球状颗粒堆积而成，薄膜厚度在5-10μm范围内。
7)鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的金属离子吸附效率的测定
取30mg实施例2制备得到的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜和纯壳聚糖膜分别置于250mg/mL的Cu2+及Ca2+标准溶液中，放置30min、1h、2h、4h、6h后，利用原子吸收分光度计测量溶液中Cu2+及Ca2+残留量，具体吸附效果见图3，结果表明鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的金属离子吸附效率显著高于纯壳聚糖膜。

Claims (6)

1.一种鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备方法，其特征在于，鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备过程包括以下步骤：
1）室温条件下，将壳聚糖溶解于0.1%的盐酸或醋酸溶液中得到20 mg/mL的壳聚糖稀酸溶液，然后加入0.05% 碱液调节pH至5-6得到5-10 mg/mL的壳聚糖溶液；
2）室温条件下，将固体鱼精DNA溶解于灭菌超纯水中，制得0.5-0.9 mg/mL的鱼精DNA溶液，所述的鱼精DNA原料为从鲑鱼、鲤鱼的鱼精中提取获得的基因组DNA，且为具有双螺旋结构的长链、线性DNA，鱼精DNA的平均分子量为50-130 kD；
3）设定转速为300-500 rpm，搅拌条件下将步骤2）的鱼精DNA溶液以0.2-2 cm3/s的流速加入到步骤1）的壳聚糖溶液中，控制壳聚糖溶液与鱼精DNA溶液体积比为1:10，同时控制反应体系中的壳聚糖与鱼精DNA的质量比控制在1:1-1:4范围内，经脱气处理后得到的溶液记为溶液I；
4）将溶液I置于表面光滑的玻璃平板或亚克力平板中，流延成膜，挥干除溶剂，得到干燥成型的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜半成品；
5） 将鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜半成品浸泡于0.1%-0.3%的NaOH溶液中10-30 min，然后用超纯水冲洗直到冲洗液中的pH为7，挥干除溶剂，最终得到鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜成品。
2.根据权利要求1所述的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备方法，其特征在于，步骤4）和步骤5）所述的挥干除溶剂，其方式为自然晾干，冷风干燥，烘干中的至少一种，处理温度控制范围不能超过60℃。
3.根据权利要求1所述的天然鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的制备方法得到的天然鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜，其特征在于，所述的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜由天然鱼精DNA和高聚壳聚糖组成，其中鱼精DNA和壳聚糖组份的质量比控制在1:1-1:4范围内；鱼精DNA/壳聚糖薄膜高度透明且表面光滑，平均厚度为5-10 μm，微观结构观察该薄膜是由高密度的球状颗粒无规则排列、堆叠而成，每一个球状颗粒是由天然鱼精DNA和壳聚糖长链分子相互缠绕形成的规则球状结构，平均粒径为300-600 nm，球状颗粒外表面所带的电荷大小通过调整鱼精DNA和壳聚糖的投料比控制，从而实现对二价、三价金属离子的高效吸附；干燥鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜具有50 MPa以上的拉伸强度，与单纯壳聚糖膜相比，水性液体对鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜具有更好的润湿性，接触角在28.5°-67.7°之间，且鱼精DNA含量越高，接触角越小，鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的溶胀度可达90-110%，且浸泡于水中48 h内的DNA溶出率低于2%，溶胀后的薄膜在72 h内无法被生物酶降解，所述生物酶为DNA酶、胃酶、胰酶、脂肪酶，超过20天后溶胀薄膜中的鱼精DNA可被生物酶降解完全，最终薄膜结构瓦解。
4.根据权利要求3所述的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜，其特征在于，所述的DNA酶为DNaseI、核酸外切酶，能够实现对单链和双链DNA任意位点的切割。
5.根据权利要求3所述的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜，其特征在于，所述的壳聚糖原料为甲壳素高度脱乙酰化的产物，所用壳聚糖的脱乙酰度大于90%且为平均分子量40-80 kD的高聚壳聚糖。
6.一种根据权利要求3所述的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜的应用，其特征在于，将制得的鱼精DNA/壳聚糖共混薄膜用于包括水体净化过程中重金属分离，常量金属元素和金属微量元素的日常营养供给，医用敷料的止血杀菌，食品材料的保鲜保水。
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