CN113943753A - 一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒及制备方法和应用，涉及基因转染技术领域。一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒，该纳米粒由聚乙烯亚胺和胆酸类药物组成。本发明还提供了该高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，包括以下步骤：S1：将聚乙烯亚胺和胆酸类药物溶解于溶剂中，制得预混合溶液；S2：将制备好的预混合溶液转移至透析袋中透析处理，制得自组装阳离子纳米粒。本发明还提供了该高效低毒的自组装阳离子纳米粒的应用。本发明可以制得具有较低细胞毒性，且有效提高转染效率的自组装阳离子纳米粒。
Description
技术领域
本发明涉及基因转染技术领域，具体而言，涉及一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒及制备方法和应用。
背景技术
基因转染是一种“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”的技术。基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究(基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究)和基因治疗研究。目前，基因转染主要依赖基因载体进行，可分为病毒载体与非病毒载体；非病毒载体具备无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，且易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中，有着病毒载体不可替代的作用。
聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)是一种水溶性阳离子高分子聚合物，化学结构中大量胺基正电氮原子使其携带高密度正电荷。早在1995年被用于体外核酸转染，带正电荷的PEI利用静电交互作用缩聚带负电的核酸并形成易被细胞摄取的正电小粒径复合体。此外，PEI所含的大量胺基具有质子海绵效应,能促使PEI核酸复合物逃离出内涵体和溶酶体继而在胞内释放核酸使目的基因得以表达，是一种商业化的阳离子转染试剂。
目前，PEI作为核酸传递载体具有操作简便、安全廉价等优点，具有作为基因治疗中核酸传递工具的应用潜力。然而，目前主要研究集中在PEI的转染效率，而由于PEI可与细胞膜结构上的蛋白或磷脂相互作用影响膜的完整性，从而会产生细胞毒性。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒，可以制备得到具有较低细胞毒性，且有效提高转染效率的自组装阳离子纳米粒。
本发明的第二个目的在于提供一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，通过制备方法制得的转染试剂细胞毒性低，且有效提高转染效率。
本发明的第三个目的在于提供一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒的应用，其应用于制备基因转染试剂中，细胞毒性低，且有效提高转染效率。
本发明的实施例通过以下技术方案实现：
一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒，该纳米粒由聚乙烯亚胺和胆酸类药物组成。
进一步地，所述聚乙烯亚胺和胆酸类药物的质量比为(1～4):1或1:(1～4)。
进一步地，所述胆酸类药物为熊去氧胆酸、胆酸或猪去氧胆酸。
进一步地，该转染试剂的纳米粒直径为50～300nm。
一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1：将上述质量比的聚乙烯亚胺和胆酸类药物溶解于溶剂中，制得预混合溶液，使聚乙烯亚胺和胆酸类药物在预混合溶液中自组装形成聚合物；
S2：将制备好的预混合溶液转移至透析袋中透析处理，制得自组装阳离子纳米粒。
进一步地，所述步骤S1中聚乙烯亚胺和胆酸类药物溶解于1～2ml的DMSO、甲醇或乙腈溶剂中。
进一步地，所述步骤S1制得的预混合溶液中聚乙烯亚胺浓度始终保持为4～6mg/ml。
进一步地，所述步骤S2中采用20～25℃去离子水透析，前4次每12～15min换一次水，后4次每30～35min换一次水，后续每1～1.5h换一次水，直到透析结束，至少6h以上。
一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒的应用，其应用于制备基因转染试剂。
本发明实施例的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
本发明通过将聚乙烯亚胺和胆酸类药物自组装形成阳离子纳米粒，可以有效减小聚乙烯亚胺的细胞毒性；且利用胆酸类药物两性分子的优势，可以有助于提高药物对于细胞膜的渗透性，从而有效提高转染效率。
附图说明
图1为实施例1提供的自组装阳离子纳米粒的TEM图；
图2为实验例1提供的结果图；
图3、图4为实验例2提供的结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒及制备方法和应用进行具体说明。
实施例1
本实施例提供了一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒，该纳米粒由聚乙烯亚胺和熊去氧胆酸组成；聚乙烯亚胺与熊去氧胆酸的质量比为4:1。该转染试剂的纳米粒直径为50～300nm。
本实施例还提供了一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1：将上述质量比的聚乙烯亚胺和熊去氧胆酸溶解于1ml DMSO溶剂中，制得预混合溶液，使聚乙烯亚胺和熊去氧胆酸在预混合溶液中自组装形成聚合物，预混合溶液中聚乙烯亚胺浓度始终保持为5mg/ml；
S2：将制备好的预混合溶液转移至透析袋中透析处理，采用25℃去离子水透析，前4次每15min换一次水，后4次每30min换一次水，后续每1h换一次水，直到透析结束，至少6h以上；制得阳离子纳米转染试剂。
本实施例制得的自组装阳离子纳米粒进行TEM拍摄图片，如图1所示。
实施例2
本实施例提供了一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒，该纳米粒由聚乙烯亚胺和胆酸组成；聚乙烯亚胺与胆酸的质量比为1:4。该转染试剂的纳米粒直径为50～300nm。
本实施例还提供了一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1：将上述质量比的聚乙烯亚胺和胆酸溶解于2ml甲醇溶剂中，制得预混合溶液，使聚乙烯亚胺和胆酸在预混合溶液中自组装形成聚合物，预混合溶液中聚乙烯亚胺浓度始终保持为4mg/ml；
S2：将制备好的预混合溶液转移至透析袋中透析处理，采用20℃去离子水透析，前4次每12min换一次水，后4次每35min换一次水，后续每1h换一次水，直到透析结束，至少6h以上；制得阳离子纳米转染试剂。
实施例3
本实施例提供了一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒，该纳米粒由聚乙烯亚胺和猪去氧胆酸组成；聚乙烯亚胺与猪去氧胆酸的质量比为1:3。该转染试剂的纳米粒直径为50～300nm。
本实施例还提供了一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S1：将上述质量比的聚乙烯亚胺和猪去氧胆酸溶解于1ml乙腈溶剂中，制得预混合溶液，使聚乙烯亚胺和猪去氧胆酸在预混合溶液中自组装形成聚合物，预混合溶液中聚乙烯亚胺浓度始终保持为6mg/ml；
S2：将制备好的预混合溶液转移至透析袋中透析处理，采用22℃去离子水透析，前4次每13min换一次水，后4次每32min换一次水，后续每1.5h换一次水，直到透析结束，至少6h以上；制得阳离子纳米转染试剂。
对比例
本对比例提供了一种自组装纳米粒，该纳米粒由聚乙烯亚胺和舒林酸组成；聚乙烯亚胺与舒林酸的质量比为4:1。
本对比例的制备方法与实施例1的制备方法相同。
实验前准备
1.接种细胞：基因转染前一天取对数生长期的293T细胞胞悬液进行消化后，使用6孔板上每孔接种2ml，调节细胞密度为5×103个/孔，于37℃、5％CO2的无菌恒温培养箱中培育24h。
2.准备转染试剂：
A.用Opti-MEM ITM无蛋白培养基配制成1mg/mL的聚乙烯亚胺液(PEI)、2mg/mL的自组装阳离子纳米液(PUNPs)(采用实施例1制得的高效低毒的自组装阳离子纳米粒)和2mg/mL的自组装纳米液(PSNPs)(采用对比例制得的自组装纳米粒)。
B.按PEI、PUNPs、PSNPs分别与质粒(带绿色荧光蛋白报告基因)的N/P比1/1、2/1、4/1、8/1、16/1、32/1、64/1混合配制(质粒用量固定在1μg，溶液整体体积为50μL，按氮磷比推算出PEI、PUNPs、PSNPs的用量)；一边涡旋装有质粒的试管，一边将材料试剂滴加至试管中，混合后室温静置20min，制得转染试剂。
实验例1
将制得的不同浓度梯度的PEI和PUNPs转染试剂加入到每孔293T细胞中各2ml，每个浓度梯度设置三个复孔；空白组设置为于每孔293T细胞中加入1640培养基2ml；均于37℃、5％CO2的无菌恒温培养箱中孵育，孵育24h后使用CCK8检测细胞存活率，结果如图2所示。
由图2可以看出，在每个浓度下，本发明制得的自组装阳离子纳米粒应用制备的转染试剂的细胞存活率均比PEI应用制备的转染试剂的细胞存活率高，则说明发明制得的自组装阳离子纳米粒应用制备的转染试剂比PEI应用制备的转染试剂的细胞毒性低。
实验例2
将制得的不同浓度梯度的PEI和PUNPs、PSNPs质粒-转染液复合物加入到每孔293T细胞中各2ml，每个浓度梯度设置三个复孔；空白组设置为于每孔293T细胞中加入1640培养基2ml；均于37℃、5％CO2的无菌恒温培养箱中孵育5h后取出，去除加入到每孔的不同浓度梯度的PEI和PUNPs质粒-转染液复合物，再在每孔加入1640培养基2ml，于37℃、5％CO2的无菌恒温培养箱中孵育48h，使用流式细胞仪测定细胞的绿色荧光蛋白表达量，计算细胞转染率；结果如图3、图4所示。
由图3可以看出，在每个浓度下，本发明制得的自组装阳离子纳米粒应用制备的转染试剂均比PEI应用制备的转染试剂的转染效率高。
由图4可以看出，在每个浓度下，本发明制得的自组装阳离子纳米粒应用制备的转染试剂均比对比例制得的自组装纳米粒应用制备的转染试剂的转染效率高；本发明采用胆酸类药物与聚乙烯亚胺形成自组装阳离子纳米粒，其应用制备的转染试剂可以有效提高转染效率。
实验例3
选取细胞存活率为60％的样品，查看其PEI转染试剂的N/P比分别为8/1，PUNPs转染试剂的N/P比分别为64/1；检测其PEI转染试剂的转染率为3.82±0.09％，PUNPs转染试剂的转染率为98.73±0.50％。由此可知，在相同细胞毒性下，本发明制得的制得的自组装阳离子纳米粒应用制备的转染试剂比PEI应用制备的转染试剂的转染率有极大的提高。
综上，本申请制得的自组装阳离子纳米粒，具应用制备的转染试剂具有较低的细胞毒性，且可以有效提高转染效率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种高效低毒的自组装阳离子纳米粒，其特征在于，该纳米粒由聚乙烯亚胺和胆酸类药物组成。
2.根据权利要求1所述的高效低毒的自组装阳离子纳米粒，其特征在于，所述聚乙烯亚胺和胆酸类药物的质量比为(1～4):1或1:(1～4)。
3.根据权利要求1所述的高效低毒的自组装阳离子纳米粒，其特征在于，所述胆酸类药物为熊去氧胆酸、胆酸或猪去氧胆酸。
4.根据权利要求1所述的高效低毒的自组装阳离子纳米粒，其特征在于，该转染试剂的纳米粒直径为50～300nm。
5.一种由权利要求1～4任一项提供的高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将上述质量比的聚乙烯亚胺和胆酸类药物溶解于溶剂中，制得预混合溶液，使聚乙烯亚胺和胆酸类药物在预混合溶液中自组装形成聚合物；
S2：将制备好的预混合溶液转移至透析袋中透析处理，制得自组装阳离子纳米粒。
6.根据权利要求5所述的高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中聚乙烯亚胺和胆酸类药物溶解于1～2ml的DMSO、甲醇或乙腈溶剂中。
7.根据权利要求5所述的高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S1制得的预混合溶液中聚乙烯亚胺浓度始终保持为4～6mg/ml。
8.根据权利要求5所述的高效低毒的自组装阳离子纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中采用20～25℃去离子水透析，前4次每12～15min换一次水，后4次每30～35min换一次水，后续每1～1.5h换一次水，直到透析结束，至少6h以上。
9.一种由权利要求1～4任一项提供的高效低毒的自组装阳离子纳米粒或由权利要求5～8任一项制备方法制得的高效低毒的自组装阳离子纳米粒的应用，其特征在于，其应用于制备基因转染试剂。
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