CN102899343B - 一种基因载体系统及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统及其制备方法和在基因治疗领域的应用。该基因载体系统由具备靶向功能的还原敏感遮蔽体系、阳离子高分子材料和质粒DNA组成；阳离子高分子材料和质粒DNA复合形成复合物颗粒，具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系通过静电作用遮蔽到复合物表面，可以降低载体的毒性，并成功将负载的基因物质转移到细胞内，实现基因物质的表达，完成转染过程，并且可以提高基因转染的靶向性，同时提高基因转染效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，涉及一种具有靶向功能和还原敏感响应特性的基因载体。
背景技术
在治疗遗传性疾病以及肿瘤方面，基因治疗是一个很有前途的治疗手段，在过去的十年中得到极大地推进。然而，基因治疗的瓶颈之一是基因的传递。核酸是带负电的生物大分子，因此稳定和高效的合成载体通常是带正电的。人们开发了许多的阳离子脂质和聚合物载体系统，与DNA静电结合，并用在体外促进基因转染。
聚乙烯亚胺(PEI)是非病毒类载体中受到关注最多的一个阳离子聚合物，它已被广泛地作为黄金基准的聚合物载体，但是PEI固有的细胞毒性和很高的表面正电荷，限制其在体内的应用。随着对PEI基因载体转染过程的逐渐认识，对PEI/DNA进行遮蔽的策略得到了发展，开发出多种多样的遮蔽材料，如非离子型的亲水性的聚乙二醇（PEG）、带负电荷的脂质体和一些可降解的聚合物等。这些遮蔽材料或与PEI共价结合，或与PEI/DNA复合物静电作用结合，从而屏蔽正电荷，降低毒性，防止盐和血清白蛋白引起聚集，甚至达到肿瘤靶向性。但是由于这些遮蔽材料与基因载体结合牢固，在进入细胞后不易脱落，依然将运载的基因紧紧包裹，使其难以发挥作用，从而大大降低了基因转染的效率。
因此，开发出既具有较低的细胞毒性，有具有较高的转染效率的基因载体是行业亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是针对现有基因载体遮蔽体系存在的不足，提供一种具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系，并将它与阳离子聚合物和DNA复合，得到三元复合物基因载体，将其用于体外基因转染、肿瘤、哮喘和心血管疾病的基因治疗。
透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）由于具有无毒无免疫原性，且对细胞表面CD44（Cluster determinant 44），LYVE-1（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1）受体具有靶向作用而受到关注。本发明通过对透明质酸上的至少一个葡萄糖醛酸单元上的羧基进行修饰，得到的具有还原敏感的二硫键并且末端仍是羧基的透明质酸衍生物（HA-SS-COOH），提供了一种具有靶向配体的还原敏感型遮蔽体系。
作为一种优选，本发明中所述遮蔽体系中所用的透明质酸的分子量为 5000-2000000道尔顿。
本发明还提供了一种基因载体系统，由具有靶向功能和还原敏感特性的遮蔽体系、阳离子高分子材料和质粒DNA组成，所述阳离子高分子材料和质粒DNA复合形成复合物颗粒，所述遮蔽体系通过静电作用遮蔽到复合物表面。
作为一种优选，本发明所述基因载体系统中的阳离子高分子材料为聚乙烯亚胺，聚赖氨酸，聚酰胺-胺等聚阳离子或鱼精蛋白中的任意一种。
作为一种优选，本发明所述基因载体系统中的质粒DNA采用在真核细胞表达的质粒DNA。
作为一种优选，本发明所述基因载体系统中遮蔽体系与质粒DNA的质量比例为0. 1：1-50：1，阳离子高分子材料与质粒DNA的质量比例为0. 1：1-50：1。
本发明还提供了一种基因载体系统的制备方法，其具体步骤如下：
（1）具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的制备：
1）将透明质酸溶于pH 6.8的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入1- (3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和1-羟基苯并三唑（HOBT），搅拌，活化羧基。加入胱胺二盐酸盐（Cys），作为优选，透明质酸（HA）和胱胺二盐酸盐的质量比在1:30-30:1之间，搅拌，上述反应溶液在室温下反应过夜，反应结束后将反应产物透析，冷冻干燥，得到胱胺接枝的透明质酸（HA-Cys）；
2）将胱胺接枝的透明质酸（HA-Cys）溶于pH 8.5的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入过量的二硫苏糖醇（DTT），在室温下反应4小时后，用盐酸（HCl）调节pH值到3. 5，然后加入氯化钠（NaCl）至终浓度为5%（质量/体积百分数）。随后，用乙醇沉淀，再复溶于水，离心，冷冻干燥即可得到巯基化的透明质酸（HA-SH）；
3）巯基化的透明质酸（HA-SH）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，与过量的3-巯基丙酸在室温下反应过夜，反应结束后将反应产物透析，冷冻干燥，得到二硫键修饰且末端为羧基的透明质酸（HA-SS-COOH）。
（2） 具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统的制备：
将质粒DNA溶于灭菌水中，获得溶液A；将阳离子聚合物基因载体溶于HBG缓冲液（含4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 毫摩尔, 5% 葡萄糖，pH 7.4的水溶液）中，得到溶液B；将具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系（HA-SS-COOH）溶于HBG缓冲液中，得到溶液C；A和B复合得到基因载体和质粒DNA的复合物颗粒溶液，在室温下放置20分钟后，加入溶液C，得到一种具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统。
本发明的有益效果：
1. 本发明所述基因载体采用透明质酸衍生物作为遮蔽体，一方面不会影响阳离子聚合物对DNA的复合能力，另一方面利用透明质酸的靶向功能提高了基因载体与细胞表面受体的结合效率，并通过HA受体介导的细胞内吞作用维持内涵体脱离的能力，促进PEI/DNA/HA-SS-COOH三元复合物被细胞摄取。
2.本发明所述基因载体的遮蔽体系，一方面其末端的羧基可以与阳离子聚合物和质粒DNA形成的复合物颗粒表面带有的大量氨基通过静电作用相结合，达到遮蔽的作用，降低毒性及避免血清白蛋白引起的聚集，逃脱网状内皮系统的清除作用，从而减少阳离子聚合物的细胞毒性、增加血清稳定性；另一方面，在进入细胞后，在胞内还原性环境的作用下，还原敏感的二硫键会发生断裂，从而解除屏蔽作用，使装载的基因暴露出来，提高其从内涵体逃逸的能力，从而大大提高转染效率。
3.本发明所述基因载体，利用静电结合的方法将具有靶向功能的还原敏感响应遮蔽层引入基因载体体系，可以通过调节遮蔽比例（HA-SS-COOH/DNA），控制过分遮蔽对转染效率的降低，同时利用靶向配体提高基因载体对目标组织的特异性识别和传递，并将运载的DNA环境响应地释放在靶细胞内。
4. 所述基因载体的制备方法原料易于获取，反应也较为简单，反应条件温和，反应参数和易控制。
5. 本发明所述基因载体，能够很方便地用于体外基因转染、肿瘤、哮喘和心血管疾病的基因治疗
附图说明
图1本发明所述遮蔽体系的结构和合成过程示意图。
图2是PEI/DNA/HA-SS-COOH复合物的琼脂糖凝胶电泳图，其中：从左至右共八条泳道，第一道为裸DNA；第二道至第七道为PEI/DNA/HA-SS-COOH复合物，其中HA-SS-COOH/DNA的质量比分别为10、6、3、2、1和0.5时的电泳图；第八道为PEI/DNA复合物。
图3是不同浓度的PEI/DNA/HA-SS-COOH复合物对B16细胞转染24小时后的细胞存活率。
图4是PEI/DNA复合物和PEI/DNA/HA-SS-COOH (HA-SS-COOH/DNA质量比为1）复合物分别介导绿色荧光蛋白质粒对B16细胞转染效率图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所用原料均为市售。
实施例1：具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的制备
按照表1所述的投料比例，将透明质酸溶于pH 6.8的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入1- (3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和1-羟基苯并三唑（HOBT），搅拌，室温下反应2小时活化羧基。加入胱胺二盐酸盐（Cys），搅拌，上述反应溶液在室温下反应过夜，反应结束后将反应产物用截留量为3500的透析袋透析48小时，冻干，得到胱胺接枝的透明质酸（HA-Cys）。通过核磁图谱计算产物（HA-Cys）中胱胺的接枝率，结果见表1。
将不同比例胱胺接枝的透明质酸（HA-Cys）溶于pH 8.5的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入5倍过量的二硫苏糖醇（DTT），在室温下反应4小时后，用盐酸（HCl）调节pH值到3. 5，然后加入氯化钠（NaCl）至终浓度为5%（质量/体积百分数）。随后，用乙醇沉淀，再复溶于水，离心，冻干即可得到巯基化的透明质酸（HA-SH）。用Ellman方法（见Anal Biochem. 1985;145:200-4.）计算产物（HA-SH）中SH所占的比例，结果见表1。
不同比例巯基化的透明质酸（HA-SH）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，与100倍过量的3-巯基丙酸在室温下反应过夜，反应结束后将反应产物用截留量为3500的透析袋透析48小时，冻干，得到二硫键修饰且末端为羧基的透明质酸（HA-SS-COOH）。用Ellman方法计算产物（HA-SS-COOH）中S-S所占的比例，结果见表1。
表1具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的制备表
| 产物编号 | HA：EDC??HCl：Cys投料比 | HA-Cys中胱胺的接枝率 | HA-SH中SH所占比例 | HA-SS-COOH中S-S所占比例 |
| HA-SS-COOH 30 | 10：3.5：10 | 32.9% | 32.5±0.1% | 30.0±0.6% |
| HA-SS-COOH 45 | 10：4.5：10 | 43.4% | 42.7±0.3% | 45.5±0.3% |
| HA-SS-COOH 65 | 10：6.5：10 | 64.7% | 63.0±0.7% | 64.7±0.4% |
| HA-SS-COOH 93 | 1：6.5：30 | 94.4% | 93.9±0.4% | 93.1±0.2% |
| HA-SS-COOH 2 | 30：6.5：1 | 2.2% | 2.2±0.5% | 1.9±0.3% |
实施例2：具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统的制备
将质粒DNA溶于灭菌水中，配制成浓度为0.1 mg/mL的DNA溶液A；将阳离子聚合物基因载体聚乙烯亚胺（PEI）溶于无菌HBG缓冲液（4-羟乙基哌嗪乙磺酸20 毫摩尔，pH 7.4, 5% 葡萄糖）中，配制成浓度为0.01-1 mg/mL的PEI溶液B；将具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系（HA-SS-COOH）溶于无菌HBG缓冲液中，配制成浓度为0.01-1 mg/mL的HA-SS-COOH溶液C。
将不同浓度的阳离子聚合物PEI溶液和质粒DNA水溶液以质量比为1.2：1混合，混合后的水溶液在室温下孵育20分钟后，得到PEI/DNA复合物。再加入不同浓度的HA-SS-COOH溶液，水溶液在室温下孵育10分钟后，得到具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统PEI/DNA/HA-SS-COOH三元复合物。此PEI/DNA/HA-SS-COOH三元复合物用于下一步的电泳、转染和毒性实验。按照上述方法制备的三元复合物颗粒的组成及性能如表2所示。
表2 PEI/DNA/HA-SS-COOH三元复合物的组成和性能
| 三元复合物编号 | HA-SS-COOH种类 | PEI：DNA：HA-SS-COOH的质量比 | 三元复合物粒径（nm） | 三元复合物表面电荷（mV） |
| PD | 不含遮蔽体系 | 1.2：1 | 116.25 | 27.50 |
| PDS30-0.5 | HA-SS-COOH 30 | 1.2：1：0.5 | 155.20 | 13.97 |
| PDS30-2 | HA-SS-COOH 30 | 1.2：1：2 | 169.30 | 6.72 |
| PDS30-5 | HA-SS-COOH 30 | 1.2：1：5 | 145.20 | -23.40 |
| PDS45-2 | HA-SS-COOH 45 | 1.2：1：2 | 175.54 | 6.71 |
| PDS65-2 | HA-SS-COOH 65 | 1.2：1：2 | 179.12 | 6.77 |
| PDS65-0.1 | HA-SS-COOH 65 | 0.1：1：0.1 | 498.00 | -41.80 |
| PDS65-50 | HA-SS-COOH 65 | 50：1：50 | 150.70 | 23.40 |
实施例3：利用凝胶电泳鉴定复合物颗粒的稳定性
取5 μL 0.1 mg/mL的DNA溶液与3 μL 0.2 mg/mL的PEI溶液混合，在室温下孵育20分钟，然后加入5μL不同浓度的HA-SS-COOH溶液，使HA-SS-COOH/DNA的质量比分别为10、6、3、2、1和0.5，并在室温下孵育10分钟后，利用凝胶电泳阻滞实验检测复合物颗粒在不同量的HA-SS-COOH遮蔽体系加入后的稳定性。
图2的电泳结果表明，加入的HA-SS-COOH透明质酸遮蔽体系的量达到DNA量的10倍时也不会破坏阳离子聚合物与DNA形成的复合物。
实施例4：利用具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统介导绿色荧光蛋白质粒对B16细胞的体外转染效率的测定
B16细胞的培养：取小鼠黑色素瘤细胞B16细胞，在含有10%（质量/体积百分数）的胎牛血清的培养液中，在含5%（体积百分数）CO2，温度为37℃的培养箱中培养24小时；
转染前，取对数生长期B16细胞，胰酶消化后用DMEM培养基稀释，按每孔4X105细胞的密度接种于6孔培养板，置于含5%（体积百分数）的CO2，温度为37℃的培养箱中继续培养至80-90%融合，转染时，吸去前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入基因组转染的复合物颗粒以及含有10%（质量/体积百分数）的小牛血清的DMEM培养基至终体积2 mL，继续培养48个小时；
体外转染效率的测定：取出培养板，用倒置荧光显微镜照相；图4分别显示了无功能性HA-SS-COOH作为遮蔽体系的PEI/DNA和有遮蔽体系的PEI/DNA/HA-SS-COOH两种基因载体介导绿色荧光蛋白质粒对B16细胞转染后的荧光照片。从照片中绿色荧光蛋白表达的情况可见，HA-SS-COOH作为遮蔽体系，很大程度的提高了绿色荧光蛋白质粒在B16细胞中的表达。这是由于HA-SS-COOH具有透明质酸（HA）的特性，可以和B16细胞表面的CD44受体作用，帮助PEI/DNA/HA-SS-COOH三元复合物粒子内吞；同时粒子进入细胞后，还原响应的二硫键断裂，帮助遮蔽体系的剥离，使得暴露出PEI的正电荷，发挥其质子泵效应，从而促进转染效率的提高。
实施例5：利用具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统介导荧光素酶质粒对B16细胞的体外转染效率的测定
B16细胞的培养：同实施例4的方法。
在6孔板上以4X105细胞/孔接种B16细胞，在37℃，5%的CO2的细胞培养箱中培养24小时左右，转染时，吸去前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入表3中所列的含有荧光素酶DNA的复合物颗粒以及无血清或者含有10%，50%（质量/体积百分数）的小牛血清的DMEM培养基至终体积2 mL，继续培养24个小时；
体外转染效率的测定：取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤细胞2次，然后加入含1%的Triton X-100的裂解液，使细胞裂解后用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒检测。结果如表4所示。
本发明利用具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系基因载体系统PEI/DNA/HA-SS-COOH三元复合物，提高基因载体的性能，分别在无血清，10%血清及50%血清的条件下，其对B16细胞的转染效率相应提高了14倍，538倍及130倍。
表3具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统介导荧光素酶质粒对B16的体外转染效率表
| 三元复合物编号 | PEI：DNA：HA-SS-COOH的质量比 | 转染条件 | 转染效率 RLU/mg protein |
| PDS 30 | 1.2：1：1 | 无血清 | 2.70E+10 |
| PD | 1.2：1 | 无血清 | 1.87E+09 |
| PDS 30 | 1.2：1：1 | 10%血清 | 7.00E+09 |
| PD | 1.2：1 | 10%血清 | 1.30E+07 |
| PDS 30 | 1.2：1：1 | 50%血清 | 3.88E+08 |
| PD | 1.2：1 | 50%血清 | 2.98E+06 |
实施例6：利用具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统介导荧光素酶质粒对HepG2细胞的体外转染效率的测定
HepG2细胞的培养：取人肝肿瘤细胞HepG2细胞，在含有10%（质量/体积百分数）的胎牛血清的培养液中，在含5%（体积百分数）CO2，温度为37℃的培养箱中培养24小时；
在6孔板上以4X105细胞/孔接种HepG2细胞，在37℃，5%的CO2的细胞培养箱中培养24小时左右，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入表4中所列的含有荧光素酶DNA的复合物颗粒以及无血清或者含有10%，50%（质量/体积百分数）的小牛血清的DMEM培养基至终体积2 mL，继续培养24个小时；
体外转染效率的测定：取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤细胞2次，然后加入含1%的Triton X-100的裂解液，使细胞裂解后用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒检测。结果如表4所示。
表4具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统介导荧光素酶质粒对HepG2的体外转染效率表
| 三元复合物编号 | PEI：DNA：HA-SS-COOH的质量比 | 转染条件 | 转染效率 RLU/mg protein |
| PDS 30 | 1.2：1：1 | 无血清 | 3.53E+09 |
| PD | 1.2：1 | 无血清 | 2.74E+08 |
| PDS 30 | 1.2：1：1 | 10%血清 | 5.89E+08 |
| PD | 1.2：1 | 10%血清 | 2.10E+07 |
| PDS 30 | 1.2：1：1 | 50%血清 | 7.93E+07 |
| PD | 1.2：1 | 50%血清 | 2.45E+06 |
本发明利用具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系基因载体系统PEI/DNA/HA-SS-COOH三元复合物，提高基因载体的性能，分别在无血清，10%血清及50%血清的条件下，其对HepG2细胞的转染效率相应提高了13倍，28倍及33倍。
实施例7：细胞存活率检测
转染前24小时内，取对数生长期B16细胞，胰酶消化后用DMEM培养基稀释，按每孔1X104细胞的密度接种于96孔培养板，置于含5%（体积百分数）的CO2，温度为37℃的孵箱中继续培养至80-90%融合，转染时，吸去前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，加入基因组转染的复合物颗粒和含有10%（质量/体积百分数）的小牛血清的DMEM培养基至终体积0.1 mL，继续培养24小时；
加入10 μL浓度为5 mg/mL 的MTT溶液（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）在37℃孵育4小时，加入150 μL DMSO（二甲基亚砜）。 然后用酶标仪（Bio-Rad）测试每孔的吸光度值A，测试波长选用492 nm。细胞存活率按下公式计算：
细胞存活率（%）=（Asample/Acontrol）X 100
Asample是转染后的细胞样品孔的吸光度值，Acontrol是不与转染复合物作用的细胞对照孔的吸光度值，每组实验重复六次。
图3是不同浓度的PEI/DNA/HA-SS-COOH复合物对B16细胞转染24小时后的细胞存活率。由图3可见，PEI/DNA/HA-SS-COOH三元复合物对B16细胞毒性远远低于PEI/DNA复合物，细胞存活率在80%以上，可见本发明的基因载体系统具有较低的细胞毒性。
Claims (7)
1.一种基因载体系统，由遮蔽体系、阳离子高分子材料和质粒DNA组成，所述阳离子高分子材料和质粒DNA复合形成复合物颗粒，所述遮蔽体系通过静电作用遮蔽到复合物表面，其特征在于所述遮蔽体系是通过对透明质酸上的至少一个葡萄糖醛酸单元上的羧基进行修饰，得到的具有还原敏感的二硫键并且末端仍是羧基的透明质酸衍生物，具有靶向功能和还原敏感特性。
2.如权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于：所述的阳离子高分子材料为聚乙烯亚胺，聚赖氨酸，聚酰胺-胺或鱼精蛋白中的任意一种。
3.如权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于：所述的质粒DNA采用在真核细胞表达的质粒DNA。
4.如权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于：所述遮蔽体系与质粒DNA的质量比例为0. 1：1-50：1，阳离子高分子材料与质粒DNA的质量比例为0. 1：1-50：1。
5.如权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于：制备遮蔽体系所使用的透明质酸的分子量为 5000-2000000道尔顿。
6.一种如权利要求1中所述的基因载体系统的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的制备：
1）将透明质酸溶于pH 6.8的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入1- (3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和1-羟基苯并三唑（HOBT），搅拌，活化羧基；加入胱胺二盐酸盐，搅拌，室温下反应12小时，反应结束后将反应产物进行透析，冷冻干燥，得到胱胺接枝的透明质酸（HA-Cys）；
2）将胱胺接枝的透明质酸（HA-Cys）溶于pH 8.5的磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入过量的二硫苏糖醇（DTT），在室温下反应4小时后，用盐酸（HCl）调节pH值到3. 5，然后加入氯化钠（NaCl）至其最终质量/体积百分数为5%，随后，用乙醇沉淀，再复溶于水，离心，冷冻干燥即可得到巯基化的透明质酸（HA-SH）；
3）巯基化的透明质酸（HA-SH）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，与过量的3-巯基丙酸在室温下反应过夜，反应结束后将反应产物进行透析，冷冻干燥，得到二硫键修饰且末端为羧基的透明质酸（HA-SS-COOH）；
（2）具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统的制备：
将质粒DNA溶于灭菌水中，获得溶液A；将阳离子聚合物基因载体溶于HBG缓冲液中，得到溶液B；将具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系（HA-SS-COOH）溶于HBG缓冲液中，得到溶液C；A和B复合得到基因载体和质粒DNA的复合物颗粒溶液，在室温下放置20分钟后，加入溶液C，得到一种具有靶向功能的还原敏感遮蔽体系的基因载体系统。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中加入的透明质酸和胱胺二盐酸盐的质量比在1:30-30:1之间。
8. 如权利要求1所述的基因载体系统的应用，其特征在于，将其用于体外基因转染或将其用于制备对肿瘤、哮喘和心血管疾病进行基因治疗的药物。
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| Lee H et al.Target-specific intracellular delivery of siRNA using degradable hyaluronic acid nanogels.《Journal of controlled release》.2007,第119卷(第2期),245-252. |
| Poly(amidoamine) dendrimer-drug conjugates with disulfide linkages for intracellular drug delivery;Yunus E Kurtoglu et al;《Biomaterials》;20100401;第30卷(第11期);2112-2121 * |
| Target-specific intracellular delivery of siRNA using degradable hyaluronic acid nanogels;Lee H et al;《Journal of controlled release》;20070227;第119卷(第2期);245-252 * |
| Yunus E Kurtoglu et al.Poly(amidoamine) dendrimer-drug conjugates with disulfide linkages for intracellular drug delivery.《Biomaterials》.2010,第30卷(第11期),2112-2121. |
| 巯基化透明质酸包封的仿生交联基因微载体的构建;徐志学 等;《高等学校化学学报》;20120229;第33卷(第2期);404-408 * |
| 徐志学 等.巯基化透明质酸包封的仿生交联基因微载体的构建.《高等学校化学学报》.2012,第33卷(第2期),404-408. |
| 徐志学.透明质酸包封的非病毒基因微载体的研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》.2011,1-72. |
| 透明质酸包封的非病毒基因微载体的研究;徐志学;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》;20110715;1-72 * |
| 顾忠伟 等.新型生物医用材料: 肽类树枝状大分子及其生物医学应用.《中国科学:化学》.2010,第40卷(第3期),210-236. * |
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