CN107236760A - 一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法 - Google Patents

一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107236760A
CN107236760A CN201610182762.7A CN201610182762A CN107236760A CN 107236760 A CN107236760 A CN 107236760A CN 201610182762 A CN201610182762 A CN 201610182762A CN 107236760 A CN107236760 A CN 107236760A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano
atoh1
pei
compound
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610182762.7A
Other languages
English (en)
Inventor
吴南
杨仕明
王方园
邓雄威
吴雁
陈志婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chinese PLA General Hospital
Original Assignee
Chinese PLA General Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chinese PLA General Hospital filed Critical Chinese PLA General Hospital
Priority to CN201610182762.7A priority Critical patent/CN107236760A/zh
Publication of CN107236760A publication Critical patent/CN107236760A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法。本发明的用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物包括由透明质酸修饰的PEI载体以及由所述载体运载的Atoh1基因。所述PEI载体为25kDa的bPEI纳米颗粒。所述Atoh1基因为小鼠来源。本发明合成的纳米基因载体复合物入胞后，其上包被的HA具有良好的生物相容性和可降解性，体内降解后不产生附加的毒性；在转染过程中保护纳米基因复合物不被体液中的蛋白结合导致转染效率低下；本发明制备的复合物能有效实现内耳毛细胞的定向转染。

Description

一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法。
背景技术
感音神经性耳聋主要是由听觉感受器官—耳蜗的变性引起的。对人类颞骨解剖学研究发现，感音神经性耳聋可由耳蜗多种细胞类型的变性引起，其中，承担将声音信号转换为电信号的毛细胞病变，是目前针对感音神经性耳聋研究的核心问题之一。以往，研究者们认为在哺乳动物体内，耳蜗毛细胞损伤变性后是不可再生的。
近年来，有研究发现将包含毛细胞分化的关键基因---Atoh1基因的质粒导入体外培养的Corti器中，可以产生异位的毛细胞，本研究小组前期，利用腺病毒作为载体将Atoh1基因成功介导转染至噪声性聋的豚鼠耳蜗内，发现噪声损伤的豚鼠耳蜗过表达Atoh1基因，可使受损耳蜗内产生大量新的内外毛细胞纤毛簇，促进听功能的恢复。
既往关于将Atoh1基因及其同源基因转入内耳的研究采用的基因载体大多为病毒类基因载体---腺病毒等。目前，常见的基因载体有病毒载体和非病毒载体两大类。腺病毒载体属于病毒载体的一种，具有较高的转染效率，目前被广泛应用。但病毒载体存在明显的缺点，如可能诱导宿主免疫反应、存在潜在致癌性，制备条件复杂，细胞转染缺乏特异性，且病毒载体所能装载的外源DNA大小相对有限。此外，病毒载体导致的宿主基因重组是限制其临床应用的另一个安全隐患。
因此，针对病毒载体的上述缺点，我们转向非病毒载体的研究。非病毒制备简单，载基因容量大，且不会诱发宿主的免疫反应。而纳米颗粒又由于具备较高转染效率及特异性靶向作用，以及部分可生物降解性、低毒性、无免疫原性等特点，是理想的基因载体选择。其中，阳离子聚合物载体具有良好的结合和保护DNA的能力，易制备成纳米颗粒，能较易实现生物靶向性及生物适用性改造，是目前基因非病毒载体的一个重要研究对象。
既往关于内耳非病毒基因载体的研究发现了数个能实现有效内耳基因转染的阳离子聚合物纳米颗粒载体，如Wu N等研制了一种基于PAMAM的羧甲基β-环糊精分子修饰聚酰胺胺纳米载体携带Atoh1基因，通过圆窗膜途径将复合物导入内耳，术后7天发现内毛细胞的转染效率可达47.57±6.68％，外毛细胞的转染效率则可高达82.14±9.67％，实现了Atoh1基因向大鼠耳蜗的成功递送。但PAMAM衍生物合成过程复杂，制备过程可控性较差，合成产物稳定性不佳，因此无法进行进一步的推广，且既往的内耳转染研究均未报道能实现针对于毛细胞的定向转染。
因此，我们选择了聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)。PEI是目前最热门的非病毒基因载体材料之一，也是目前最为广泛研究的阳离子聚合物基因载体材料，在体外具有较高的转染效率。在结构上，PEI可分为直链型(linear Polyetherimide,lPEI)和分支型(branched Polyetherimide,bPEI)两种结构。以往大部分的实验研究均采用分支型PEI，其内含有大量的伯仲叔三种氨基，质子缓冲区间大，即具有独特的“质子海绵效应”，在PEI-DNA纳米复合物通过内吞作用进入细胞后，在溶酶体内逐渐累积，致使溶酶体的渗透性逐渐增强，在无需溶酶体溶解肽辅助作用下即可使溶酶体破裂，释放内吞的DNA至胞质。然而，PEI等合成型阳离子聚合物都有一定的毒性，其基因转染效率和毒性与其分子量有关。高分子量的PEI(如25kDa PEI)，带有较多的正电荷，因此具备较高的结合DNA的能力，而具有较高的转染效率，但因PEI在体内不可降解，因此过高的电荷密度也导致较大的细胞毒性，在体内应用受到限制。低分子量PEI(如<2kDa PEI)毒性较小，但所带的正电荷也少，不能有效结合及完全包裹DNA，载体稳定性差，转染效率也不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术中的问题，提供一种新的纳米基因载体复合物及其制备方法，该方法合成过程易操作、稳定性强、可实现内耳毛细胞的定向转染，达到治疗受损毛细胞的目的。
本发明为了解决上述技术问题，所采取的技术方案为：
本发明提供了一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物，其中，所述纳米基因载体复合物包括由透明质酸修饰的PEI载体以及由所述载体运载的Atol1基因。
作为优选地，本发明所述的PEI载体为25kDa的bPEI纳米颗粒。
本发明选择的目的基因为可以任意动物的来源的Atoh1基因，例如，小鼠、大鼠、兔和猪等动物的Atoh1基因以及人的Atoh1基因，具体来源根据实际需要选择。
作为标记，可以选择将所述Atol1基因携带EGFP，也可以携带其它基因标记物。
本发明的用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物的制备方法，包括以下步骤：
1)纳米基因复合物的制备：将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水中，获得PEI/Atoh1复合物；
2)纳米基因复合物的修饰：将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液中，反应后即获得纳米基因复合物。
根据本发明的纳米基因复合物制备方法，其中优选地，步骤1)按照N/P＝10:1将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水中。具体地，Atoh1质粒溶解于充分灭菌的无酶去离子水中(去离子水的用量可以参照常规操作，达到充分溶解即可)，保持溶液pH＝7.2-7.6。步骤1)将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水后，反复吹打20-30次，室温下反应20-30分钟。
根据本发明的纳米基因复合物制备方法，其中优选地，步骤2)按照COOH/N/P＝4:10:1将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液中。步骤2)将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液后，反复吹打20-30次，室温下反应20-30分钟。
根据本发明，加入质粒后所有的反应前的混匀都通过移液器轻柔反复吹打，为预防Atoh1质粒被破坏，不采用涡旋的方式，而优先选择吹打方式。
PEI纳米颗粒与Atoh1质粒混匀后，通过静电结合力，PEI上的阳离子结合Atoh1质粒上的阴离子，形成一个纳米球。但其表面还有许多能导致细胞毒性的阳离子，通过将这些带阳离子的纳米球置入带负电荷的HA溶液中，前者表面的阳离子可与HA相结合，被HA包被起来。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明合成的纳米基因载体复合物入胞后，其上包被的HA具有良好的生物相容性和可降解性，体内降解后不产生附加的毒性；
2)本发明利用HA修饰PEI/Atoh1复合物，中和了PEI/Atoh1复合物表面的阳离子，在转染过程中保护纳米基因复合物不被体液中的蛋白结合导致转染效率低下；
3)本发明利用HA修饰PEI/Atoh1复合物，中和了PEI/Atoh1复合物表面能导致细胞毒性的阳离子，在入胞过程中，大大减少了阳离子与细胞膜上蛋白结合导致的细胞毒性；
4)本发明制备的HA/PEI/Atoh1复合物能有效实现内耳毛细胞的定向转染，准确将目的基因转染至需要治疗的毛细胞，避免其他细胞的摄取导致的转染效率低下，更有效地实现毛细胞纤毛损伤后的修复。
5)本发明的制备工艺简单，制备过程易于控制、生产效率高、稳定性佳，成本低。
附图说明
图1为本发明的纳米基因载体合成过程示意图。
图2为实施例1中PEI/Atho1纳米复合物颗粒的电镜下形态。
图3为实施例1中PEI/Atho1纳米复合物颗粒的粒径分布情况
图4为实施例1中HA/PEI/Atoh1纳米复合物颗粒的电镜下形态。
图5实施例1中HA/PEI/Atoh1纳米复合物颗粒的粒径分布情况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中均采用25kDa的bPEI纳米颗粒结合Atoh1-EGFP质粒，并利用带负电荷的HA进行包被修饰。合成示意图见图1，表征结果见图2-5及表1。
实施例1
用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物制备方法包括如下步骤：
1)纳米基因复合物的制备：利用静电结合力原理，按照N/P＝10:1将Atoh1-EGFP质粒及PEI纳米颗粒混溶于充分灭菌的无酶去离子水中，因质粒涡旋条件下易被破坏，故用移液器轻柔反复吹打20-30次，室温下反应20-30分钟，即可获得粒径大小在90-200nm之间，表面带有明显的正电荷的纳米复合物颗粒。
2)纳米基因复合物的修饰：利用生物可降解和相容性极佳的透明质酸(Hyaluronic acid,HA)对纳米基因复合物进行修饰。按照COOH/N/P＝4:10:1将PEI/Atoh1-EGFP复合物加入HA溶液中，用移液器轻柔反复吹打20-30次，室温下反应20-30分钟，HA通过静电力与PEI/Atoh1-EGFP复合物结合，即获得HA/PEI/Atoh1-EGFP复合物，此时纳米复合物颗粒的粒径大小在100-600nm之间，仍维持在纳米级别，但表面电荷转变成负电荷。
本实施例的表征结果见图2-5及表1，对合成的纳米复合物颗粒进行表面电位及粒径测量发现未经HA修饰的PEI/Atho1纳米复合物颗粒的粒径大小在90-200nm之间，表面带有明显的正电荷，HA修饰的PEI/DNA纳米复合物颗粒的粒径大小在100-600nm之间，仍维持在纳米级别，且表面电荷转变成负电荷。
表1两种复合物的粒径及Zeta电位(表面电位)
实施例1制备的表面带负电荷的纳米基因复合物通过圆窗膜渗透途径进行正常豚鼠的耳蜗转染，成功实现了豚鼠的载体转染，并呈现出毛细胞特异性的定向转染。
实施例2
用于内耳毛细胞定向转染治疗内耳毛细胞损伤的纳米基因载体复合物制备方法步骤同实施例1。
实施例2将制备的的纳米基因复合物通过圆窗膜渗透途径进行噪声性聋豚鼠模型动物内耳转染，呈现了转染后对损伤毛细胞的修复作用。

Claims (8)

1.一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物，其特征在于，所述纳米基因载体复合物包括由透明质酸修饰的PEI载体以及由所述载体运载的Atoh1基因。
2.根据权利要求1所述的纳米基因载体复合物，其特征在于，所述PEI载体为25kDa的bPEI纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的纳米基因载体复合物，其特征在于，所述Atoh1基因为小鼠来源。
4.一种权利要求1-3任一所述纳米基因载体复合物的制备方法，包括以下步骤：
1)纳米基因载体复合物的制备：将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水中，获得PEI/Atoh1复合物；
2)纳米基因复合物的修饰：将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液中，反应后即获得纳米基因复合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)按照N/P＝10:1将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水中，保持溶液pH＝7.2-7.6。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)按照COOH/N/P＝4:10:1将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液中。
7.根据权利要求4-6任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1)将Atoh1质粒及PEI纳米颗粒混溶于无酶去离子水后，反复吹打20-30次，室温下反应20-30分钟。
8.根据权利要求4-6任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)将PEI/Atoh1复合物加入透明质酸溶液后，反复吹打20-30次，室温下反应20-30分钟。
CN201610182762.7A 2016-03-28 2016-03-28 一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法 Pending CN107236760A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610182762.7A CN107236760A (zh) 2016-03-28 2016-03-28 一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610182762.7A CN107236760A (zh) 2016-03-28 2016-03-28 一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107236760A true CN107236760A (zh) 2017-10-10

Family

ID=59982582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610182762.7A Pending CN107236760A (zh) 2016-03-28 2016-03-28 一种用于内耳毛细胞定向转染的纳米基因载体复合物及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107236760A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302532A (zh) * 2008-06-23 2008-11-12 中国科学院长春应用化学研究所 一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统及制法和应用
CN102899343A (zh) * 2012-10-10 2013-01-30 四川大学 一种基因载体系统及其制备和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302532A (zh) * 2008-06-23 2008-11-12 中国科学院长春应用化学研究所 一种含靶向遮蔽体系的基因载体系统及制法和应用
CN102899343A (zh) * 2012-10-10 2013-01-30 四川大学 一种基因载体系统及其制备和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIAN JIN等: "Current Progress in Gene Delivery Technology Based on Chemical Methods and Nano-carriers", 《THERANOSTICS》 *
王方园: "HA-PEI纳米颗粒介导Atoh1基因转导豚鼠耳蜗细胞的研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Non-viral delivery systems for CRISPR/Cas9-based genome editing: Challenges and opportunities
Regier et al. Fabrication and characterization of DNA-loaded zein nanospheres
O’Rorke et al. Non-viral polyplexes: Scaffold mediated delivery for gene therapy
Yuan et al. Recent advances of siRNA delivery by nanoparticles
Kommareddy et al. Poly (ethylene glycol)–modified thiolated gelatin nanoparticles for glutathione-responsive intracellular DNA delivery
Sharma et al. Mechanistic studies on aggregation of polyethylenimine‐DNA complexes and its prevention
Choi et al. Glutamine-chitosan modified calcium phosphate nanoparticles for efficient siRNA delivery and osteogenic differentiation
US20230233693A1 (en) Poly(amine-co-ester) polymers with modified end groups and enhanced pulmonary delivery
Brevet et al. Improved gene transfer with histidine-functionalized mesoporous silica nanoparticles
Kovtun et al. Calcium phosphate nanoparticles for the transfection of cells
Yang et al. Multifunctional non-viral gene vectors with enhanced stability, improved cellular and nuclear uptake capability, and increased transfection efficiency
US12076416B2 (en) Gene editing nanocapsule and preparation method and use thereof
JP2021035377A (ja) ｍＲＮＡの機能化方法
Huang et al. Genetic recombination of poly (l-lysine) functionalized apoferritin nanocages that resemble viral capsid nanometer-sized platforms for gene therapy
ES2927532T3 (es) Composiciones para transfectar ARNm en una célula y sus aplicaciones
Ren et al. Math1 Gene Transfer Based on the Delivery System of Quaternized Chitosan/Na-Carboxymethyl--Cyclodextrin Nanoparticles
He et al. Trimethyl chitosan-cysteine nanoparticles for systemic delivery of TNF-α siRNA via oral and intraperitoneal routes
Krishnan Biomaterials in the treatment of Parkinson's disease
Liu et al. Current status of nonviral vectors for gene therapy in China
Wang et al. Production of transgenic mice through sperm-mediated gene transfer using magnetic nano-carriers
Jin et al. Transfection of difficult-to-transfect rat primary cortical neurons with magnetic nanoparticles
Yu et al. Latest progress in the study of nanoparticle-based delivery of the CRISPR/Cas9 system
Xi et al. Research progress on gene editing based on nano-drug delivery vectors for tumor therapy
Sun et al. Novel biomimetic vectors with endosomal-escape agent enhancing gene transfection efficiency
US20140004196A1 (en) Polyamide-amine dendrimer or derivative thereof-math1 gene nano particle and use thereof in treatment of hearing loss

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171010