CN111892661B

CN111892661B - 一种嵌合抗原受体及其在制备治疗肿瘤的产品中的应用

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Publication number: CN111892661B
Application number: CN202010806260.3A
Authority: CN
Inventors: 朱建高; 杨文君
Original assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-12
Filing date: 2020-08-12
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2040-08-12
Also published as: CN111892661A

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体及其在制备治疗肿瘤的产品中的应用。所述嵌合抗原受体依次包括先导肽、抗LILRB4单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4‑1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽和人IFN全长。本发明首次运用LILRB4作为抗原靶点设计开发新一代CAR‑T细胞治疗产品，并在LILRB4‑CAR的C末端增加基因优化的人全长干扰素(IFN)片段。与仅表达LILRB4‑CAR的CAR‑T细胞相比，表达LILRB4‑CAR‑IFN的CAR‑T细胞具有更强的肿瘤杀伤能力，进一步提高了CAR‑T细胞治疗肿瘤的安全性和有效性。

Description

一种嵌合抗原受体及其在制备治疗肿瘤的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向LILRB4的嵌合抗原受体及其应用，尤其涉及一种包含LILRB4-CAR并且分泌细胞因子的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是成人中最常见的、死亡率最高的一类白血病，在治疗上仍面临着挑战。目前，急性髓细胞白血病的治疗仍以化疗为主，病人达到完全缓解后桥接异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)。该方法可以使部分AML患者获得完全缓解，对于接受allo-HSCT的AML患者，5年无病生存期(Disease-free survival，DFS)可达到40-50％。但是，大约有43％的患者接受首次化疗后复发，而复发患者仅有一半能获得完全缓解，复发情况下的存活率低于15％。再者，有18％的患者在经历多次化疗诱导后仍无法达到完全缓解。急性单核细胞白血病(FAB M5/M4)是AML患者常见的亚型，占儿童AML病例的20％和婴儿AML病例的一半以上，在成人中约占40％-50％。临床研究表明，与非单核细胞亚型相比，单核细胞AML在干细胞移植后骨髓和髓外复发的风险更大。因此，针对复发和化疗诱导失败的AML，急需找到新的治疗方法。

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗由于在血液肿瘤中取得了显著疗效，正在成为一种富有前景的免疫治疗策略。CAR-T细胞指的是一种经过人工基因改造的在细胞表面表达嵌合型抗原受体(CAR)的T细胞。CAR是CAR-T的核心部件，赋予T细胞以组织相容性抗原(HLA)非依赖的方式识别肿瘤表面肿瘤相关抗原(TAA)的能力。因此，CAR-T细胞在体内能特异性靶向表达有TAA表面标记的肿瘤细胞，并通过激活T细胞免疫反应杀伤肿瘤细胞。

然而，在现有的技术水平下，T疗法在临床应用过程中，其安全性和有效性仍有待提高。首先，CAR靶点的选择尤为关键。作为CAR的靶点，必须同时满足以下几个条件：在肿瘤细胞中高表达；在正常组织中不表达或低表达；在肿瘤细胞表面表达。如果靶点选择不当，可能造成CAR T淋巴细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤，造成脱靶毒性。目前在研的用于靶向AML肿瘤细胞的CAR-T靶点包括CD33、CD123、folate receptorβ、FLT3和CLL-1等。虽然包含以上靶点的CAR-T细胞能在体外和体内有效杀伤AML肿瘤细胞，但是这些靶点抗原在造血干细胞或造血前体细胞中也有低水平表达，造成靶向这些靶点的CAR-T细胞“误伤”患者的造血细胞，引起严重的髓系抑制症状和增加患者感染及死亡的风险。因此，为了有效治疗AML，急需寻找新的分子靶点和治疗途径。

除了靶点本身的适用性和脱靶风险以外，CAR本身的设计也需要有利于在病人体内长期存留并发挥抗肿瘤活性，以提高肿瘤治疗的有效性。尤其对有些T细胞活性较差的病人，CAR-T设计就应当考虑增加CAR-T的持续增殖能力。现有大多数CAR-T普遍表现出体内持续存活能力不足的缺陷。而盲目加大CAR-T细胞的使用剂量，容易造成较强的毒副作用，如炎症因子风暴和中枢神经系统毒性，反过来降低CAR-T疗法的安全性。另外，对于实体瘤的肿瘤免疫疗法来说，免疫抑制性微环境通常是限制免疫细胞对肿瘤有效杀伤的主要原因之一。因此，仍然迫切需要对CAR的设计进行改造，克服肿瘤的免疫抑制微环境，并且进一步提高CAR-T细胞的活性和增殖能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向LILRB4的嵌合抗原受体及其在制备治疗肿瘤的产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种嵌合抗原受体。

本发明提供的嵌合抗原受体依次包括抗LILRB4单链抗体(简称LILRB4 scFv)、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽和人IFN全长。

进一步的，所述嵌合抗原受体依次包括先导肽、LILRB4 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽和人IFN全长。

所述人IFN全长可为人IFNα2a全长或人IFNα2b全长或人IFNβ全长。在本发明的一个具体实施例中通过实验证明：较LILRB4-CAR相比，在LILRB4-CAR的C末端增加人IFNα2b全长片段后表达LILRB4-CAR-IFNα2b的CAR-T细胞在动物体内具有更强的肿瘤杀伤能力。由于本领域技术人员公知，人IFNα2a和人IFNα2b的氨基酸序列高度相似，仅在第23位氨基酸不同(人IFNα2a第23位氨基酸是K，人IFNα2b第23位氨基酸是R，属于保守性取代)。而人IFNβ同样属于I型干扰素，与上述二者相比生物学功能相近，均具有诱导肿瘤细胞凋亡和调节免疫细胞活性的作用。临床研究中常常将IFNα2和IFNβ互相替代使用。因此申请人认为上述三种基因(人IFNα2a全长、人IFNα2b全长和人IFNβ全长)的任一种均具有对CAR-T细胞增效的作用，均属于本发明的保护范围。

所述自切割肽可为本领域常见的任何一种自切割肽，包括E2A、F2A、P2A、T2A等。所述自切割肽是一种来源于病毒的“自裂解”小肽，其平均长度可为18-22个氨基酸。所述自切割肽作用机理如下：在翻译过程中会形成独特的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”。基因工程中利用2A元件可以实现不同蛋白的串联表达。在本发明的一个具体实施例中，所述自切割肽为P2A肽。

所述先导肽可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，如体内分泌的细胞因子蛋白、白细胞分化抗原(CD分子)的信号肽。在本发明的一个具体实施例中，所述先导肽为人CD8先导肽。

所述人CD8先导肽为如下A1)或A2)中的任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第1-21位所示的多肽或蛋白质；

A2)将SEQ ID No.4第1-21位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。

所述LILRB4 scFv为如下B1)或B2)中的任一种：

B1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第22-269位所示的蛋白质；

B2)将SEQ ID No.4第22-269位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人CD8铰链跨膜区为如下C1)或C2)中的任一种：

C1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第270-338位所示的蛋白质；

C2)将SEQ ID No.4第270-338位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人4-1BB胞内区为如下D1)或D2)中的任一种：

D1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第339-385位所示的蛋白质；

D2)将SEQ ID No.4第339-385位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人CD3ζ胞内区为如下E1)或E2)中的任一种：

E1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第386-497位所示的蛋白质；

E2)将SEQ ID No.4第386-497位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述P2A肽为如下F1)或F2)中的任一种：

F1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第498-523位所示的多肽或蛋白质；

F2)将SEQ ID No.4第498-523位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。

所述人IFNα2b全长为如下G1)或G2)中的任一种：

G1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第524-711位所示的多肽或蛋白质；

G2)将SEQ ID No.4第524-711位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。

所述人IFNα2a全长为如下H1)或H2)中的任一种：

H1)氨基酸序列是SEQ ID No.5第524-711位所示的蛋白质；

H2)将SEQ ID No.5第524-711位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人IFNβ全长为如下I1)或I2)中的任一种：

I1)氨基酸序列是SEQ ID No.6第524-710位所示的蛋白质；

I2)将SEQ ID No.6第524-710位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

更进一步的，所述嵌合抗原受体为如下(1)-(4)中的任一种：

(1)氨基酸序列是SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的蛋白质；

(2)在SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(3)将SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

(4)与(1)-(3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述任一所述蛋白质中，所述标签具体如表1所示。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述任一所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

为了实现上述目的，本发明又提供了与上述嵌合抗原受体相关的生物材料。

本发明提供的与上述嵌合抗原受体相关的生物材料为下述1)至8)中的任一种：

1)编码上述嵌合抗原受体的核酸分子；

2)含有1)所述核酸分子的表达盒；

3)含有1)所述核酸分子的重组载体；

4)含有2)所述表达盒的重组载体；

5)含有1)所述核酸分子的细胞系；

6)含有2)所述表达盒的细胞系；

7)含有3)所述重组载体的细胞系；

8)含有4)所述重组载体的细胞系。

上述1)中，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子依次包括LILRB4 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、自切割肽的编码基因序列、人IFN全长的编码基因序列。

进一步的，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、LILRB4 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、人IFN全长的编码基因序列。所述人IFN全长的编码基因序列可为人IFNα2a全长的编码基因序列或人IFNα2b全长的编码基因序列或人IFNβ全长的编码基因序列。

所述人CD8先导肽的编码基因序列为如下a1)-a3)任一所示的基因：

a1)SEQ ID No.1第1-63位所示的DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD8先导肽的DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD8先导肽的DNA分子。

所述LILRB4 scFv的编码基因序列为如下b1)-b3)任一所示的基因：

b1)SEQ ID No.1第64-807位所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述LILRB4scFv的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述LILRB4 scFv的DNA分子。

所述人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为如下c1)-c3)任一所示的基因：

c1)SEQ ID No.1第808-1014位所示的DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD8铰链跨膜区的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD8铰链跨膜区的DNA分子。

所述人4-1BB胞内区的编码基因序列为如下d1)-d3)任一所示的基因：

d1)SEQ ID No.1第1015-1155位所示的DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人4-1BB胞内区的DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人4-1BB胞内区的DNA分子。

所述人CD3ζ胞内区的编码基因序列为如下e1)-e3)任一所示的基因：

e1)SEQ ID No.1第1156-1491位所示的DNA分子；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD3ζ胞内区的DNA分子；

e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD3ζ胞内区的DNA分子。

所述P2A肽的编码基因序列为如下f1)-f3)任一所示的基因：

f1)SEQ ID No.1第1492-1569位所示的DNA分子；

f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述P2A肽的DNA分子；

f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述P2A肽的DNA分子。

所述人IFNα2b全长的编码基因序列为如下g1)-g3)任一所示的基因：

g1)SEQ ID No.1第1570-2133位所示的DNA分子；

g2)与g1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人IFNα2b全长的DNA分子；

g3)在严格条件下与g1)或g2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人IFNα2b全长的DNA分子。

所述人IFNα2a全长的编码基因序列为如下h1)-h3)任一所示的基因：

h1)SEQ ID No.2第1570-2133位所示的DNA分子；

h2)与h1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人IFNα2a全长的DNA分子；

h3)在严格条件下与h1)或h2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人IFNα2a全长的DNA分子。

所述人IFNβ全长的编码基因序列为如下i1)-i3)任一所示的基因：

i1)SEQ ID No.3第1570-2130位所示的DNA分子；

i2)与i1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人IFNβ全长的DNA分子；

i3)在严格条件下与i1)或i2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人IFNβ全长的DNA分子。

更进一步的，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子为如下Ⅰ)-Ⅲ)任一所示的基因：

Ⅰ)SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

Ⅱ)与Ⅰ)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子；

Ⅲ)在严格条件下与Ⅰ)或Ⅱ)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述人CD8先导肽、LILRB4 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、人IFNα2a全长、人IFNα2b全长、人IFNβ全长或嵌合抗原受体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述人CD8先导肽、LILRB4 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、人IFNα2a全长、人IFNα2b全长、人IFNβ全长或嵌合抗原受体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码上述人CD8先导肽、LILRB4 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、人IFNα2a全长、人IFNα2b全长、人IFNβ全长或嵌合抗原受体的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗。

上述2)中，所述表达盒依次由启动子、编码上述嵌合抗原受体的核酸分子和终止子组成。

上述3)或4)中，所述载体可为病毒载体。进一步的，所述病毒载体可为逆转录病毒载体或慢病毒载体。更进一步的，所述逆转录病毒载体为逆转录病毒载体(MP71)。所述重组载体是将上述嵌合抗原受体的核酸分子插入病毒载体中，得到表达上述嵌合抗原受体的重组病毒载体。

上述5)或6)或7)或8)中，所述细胞系可为用于病毒包装的细胞系或用于病毒传代培养的细胞系。所述用于病毒包装的细胞系具体为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞，所述用于病毒传代培养的细胞系具体为HY268细胞。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种CAR-T细胞的制备方法。

本发明提供的CAR-T细胞的制备方法包括如下步骤：将上述嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。

进一步的，所述嵌合抗原受体的编码基因可通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中。

更进一步的，所述将上述嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：

所述方法(一)包括如下步骤：用逆转录病毒感染T细胞；所述逆转录病毒是将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组逆转录病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体中得到的。

所述方法(二)包括如下步骤：用慢病毒感染T细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述慢病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。

上述方法(一)中，所述将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后还包括如下步骤：收集细胞培养上清中的病毒液，将所述病毒液转染传代细胞，并进行克隆筛选和培养，得到病毒滴度最高的产毒细胞株。该病毒滴度最高的产毒细胞株培养上清中的病毒即为上述方法(一)中的逆转录病毒。

在本发明的一个具体实施例中，所述嵌合抗原受体的编码基因通过逆转录病毒表达系统导入T细胞中。所述逆转录病毒载体具体为逆转录病毒载体(MP71)。所述重组逆转录病毒载体具体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变得到的载体。所述逆转录病毒包装细胞具体为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞。所述传代细胞具体为HY268细胞。

上述方法制备得到的CAR-T细胞或上述方法中的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体也属于本发明的保护范围。

上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述方法中的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在如下M1)-M6)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

M1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；

M2)治疗或辅助治疗肿瘤；

M3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；

M4)杀伤肿瘤细胞；

M5)制备生产CAR-T细胞的产品；

M6)生产CAR-T细胞。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品。

本发明提供的治疗或辅助治疗肿瘤的产品的活性成分为上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述CAR-T细胞或上述逆转录病毒或上述重组逆转录病毒载体或上述慢病毒或上述重组慢病毒载体。

上述任一所述应用或产品中，所述肿瘤包括但不限于急性髓系白血病(AML)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)等血液肿瘤，以及结直肠癌(Colon cancer)，胃癌(Gastric cancer)等实体肿瘤。进一步的，所述急性髓系白血病为急性单核细胞白血病。更进一步的，所述急性单核细胞白血病包括急性单核细胞白血病FAB-M4亚型和急性单核细胞白血病FAB-M5亚型。在本发明的一个具体实施例中，所述肿瘤为急性单核细胞白血病；所述肿瘤细胞为人髓系白血病单核细胞(如THP-1细胞、过表达LILRB4基因的K562细胞)。具体的，上述肿瘤为LILRB4阳性的肿瘤(LILRB4表达为阳性的肿瘤)。

与现有技术对比，本发明的创新之处及有益效果在于：

1、本发明首次将LILRB4作为CAR-T靶点。LILRB4是LILRB家族的一员，亦称为免疫球蛋白样转录因子3(Immunoglobulin-Like Transcript 3，ILT3)或CD85k，是一种免疫抑制受体。ILT3分子仅在少数几种类型的细胞上表达，其表达特点和功能如下：1)ILT3主要表达于单核细胞、单核细胞AML细胞(M4/M5 AML)，以及复发或难治性M4/M5 AML细胞表面，且单核细胞AML细胞表达水平更高，与预后呈负相关；2)ILT3在肿瘤环境中的MDSCs、TAM以及耐受性DC上高表达，ITL3自身也是一类免疫检查点蛋白，其通过抑制T细胞免疫反应来促进肿瘤生长，同时还参与调节单核AML细胞的浸润和转移过程。3)ILT3在其他类型恶性肿瘤中也有表达，如慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)的恶性B细胞和慢性粒单核细胞白血病(CMML)细胞等血液肿瘤，以及胃癌、结直肠癌等实体瘤；4)ILT3在正常造血干细胞上不表达，但在CD34⁺AML/B-CLL-SCs上表达，这群干细胞是肿瘤复发的根源。因此，靶向ILT3的CAR-T疗法有望解决AML复发和转移问题，同时降低造血系统抑制的风险。

2、本发明首次在CAR的C末端增加人IFN全长基因，获得同时表达CAR和释放分泌型人IFN蛋白的CAR-T细胞。要提高CAR-T的抗肿瘤效果，一种思路是在肿瘤部位增加细胞因子的表达。细胞因子可以调节肿瘤组织周围的免疫微环境，同时作为第三信号，进一步提高CAR-T细胞的应答水平。细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等，种类多达数百种。而选择I型干扰素作为第三信号，是基于已有的研究成果和申请人的大量前期研究工作。首先，I型干扰素是目前研究最早的干扰素类型，对其生理功能和潜在副作用已有较深入和全面的认识；其次，I型干扰素具有多重调节作用，一方面可以直接诱导肿瘤细胞凋亡，另一方面也能调控T细胞活性；最后，人工制备的I型干扰素重组蛋白，例如INFα2a、IFNα2b和IFNβ等，在临床上已应用于多种类型肿瘤治疗，但是由于直接注射的干扰素重组蛋白在体内半衰期短，且不易到达病灶部位，因此，I型干扰素与CAR-T细胞疗法联合使用有利于在正确的时间和地点最大限度发挥IFNα2b的生物学功能。

本发明申请人经过大量的前期研究发现，在CAR的C末端串联表达人IFN全长基因，可以显著提高CAR-T细胞的应答水平。人IFN基因序列可以是人IFNα2a、人IFNα2b和人IFNβ三者之中任一基因的全长序列。该设计的精妙之处在于，CAR基因和IFN基因之间用P2A肽分隔，因此可以同时表达CAR和分泌型的IFN蛋白。在CAR-T细胞到达肿瘤病灶并激活CAR基因的同时，P2A肽在细胞内的蛋白酶的作用下水解，释放游离的IFN，分泌到胞外发挥免疫激活功能。IFN的表达受到CAR基因的调控，因此可以在病灶部位释放IFN活性，起到精准增效的作用。

3)本发明用嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的转导方法是基于逆转录病毒转导方法，通过筛选稳定的产毒株，收集产毒株上清进行T细胞转导。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，批次稳定性高且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。

本发明首先通过全基因合成嵌合抗原受体LILRB4 scFv-CD8铰链跨膜区-4-1BB-CD3ζ-oIFN的基因片段，并将其插入到逆转录病毒载体中，构建得到重组逆转录病毒载体；重组逆转录病毒载体在ECO细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体，得到CAR-T细胞。通过流式细胞术检测与抗LILRB4单链抗体κ链结合的protein L的含量，计算逆转录病毒感染的T淋巴细胞的CAR阳性率在40％-70％之间。体外通过酶联免疫法(ELISA)检测发现，CAR-T细胞能分泌大量的IFN至培养基上清，说明逆转录病毒成功转导至T细胞并表达分泌型的IFN。通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测实验检测CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞的杀伤功能发现：本发明制备的CAR-T细胞对LILRB4阳性的肿瘤细胞具有强烈的杀伤功能，在效靶比是1比1的情况下，杀伤效率超过80％。动物体内的研究结果证明，LILRB4-CAR-IFN的设计可显著提高CAR-T细胞对LILRB4阳性的肿瘤细胞杀伤效率，并延长动物生命。本发明设计的LILRB4-CAR-IFN增强了CAR-T细胞在LILRB4阳性肿瘤中的应用效果，进一步提高了CAR-T细胞治疗肿瘤的安全性和有效性。

附图说明

图1为CAR基因结构示意图。A为LILRB4-CAR的结构示意图；B为LILRB4-CAR-IFN的结构示意图。ScFv：单链抗体可变区；Hinge：CD8铰链区；TM：CD8跨膜区；IFN：人干扰素全长序列，包括IFNα2a，IFNα2b和IFNβ三者中任一序列。

图2为流式细胞术分析显示逆转录病毒感染T细胞3天后CD4⁺亚群和CD8⁺亚群的T细胞表面Protein L的阳性率，即CAR的表达效率。其中，LILRB4 CAR-IFN T细胞为表达LILRB4-CAR-IFN的T细胞；LILRB4 CAR T细胞为表达LILRB4-CAR的T细胞；NO CAR T为未转导CAR的T细胞；CTR CAR T为转导了非靶向LILRB4的T细胞。

图3为LILRB4 CAR-IFN T、LILRB4 CAR T和CTR CAR T细胞分泌的IFNα2含量检测及对靶细胞的裂解率检测。A为酶联免疫反应(ELISA)检测逆转录病毒感染后，LILRB4CAR-IFN T、LILRB4 CAR T和CTR CAR T细胞培养基上清中IFNα2的含量。B为使用CAR-T细胞和靶细胞按照不同效靶比共培养后，用CFSE标记法检测靶细胞裂解率。其中，LILRB4 CAR-IFN T细胞为表达LILRB4-CAR-IFN的T细胞；LILRB4 CAR T细胞为表达LILRB4-CAR的T细胞；NOCAR T为未转导CAR的T细胞；CTR CAR T为转导了非靶向LILRB4的T细胞。

图4为pRV-Luc-GFP-LILRB4载体图谱。

图5为肿瘤移植模型中皮下注射CAR-T细胞后，测量小鼠体内肿瘤体积大小变化。A为主要实验流程；B为统计不同时间点各组别小鼠体内的肿瘤体积；C为各组别小鼠的生存曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的逆转录病毒载体(MP71)记载于文献“Engels,B.,et al.,Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes.HumGene Ther,2003.14(12):p.1155-68.”中，公众可从浙江康佰裕生物科技有限公司获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、CAR-T细胞的制备

一、逆转录病毒载体的构建

1、野生型人IFNα2b基因cDNA全长序列的优化

将野生型人IFNα2b基因cDNA全长序列称为nIFNα2b。为了使nIFNα2b更适合在人类细胞中表达，在保证nIFNα2b编码的氨基酸序列不变的情况下，将nIFNα2b序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行了密码子优化，得到oIFNα2b，oIFNα2b的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1570-2133位所示。

2、LILRB4-CAR-IFN基因序列的设计及合成

LILRB4-CAR-IFN基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、LILRB4 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列和oIFNα2b基因序列。LILRB4-CAR-IFN基因序列如SEQ ID NO.1所示，其中，人CD8先导肽的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1-63位，LILRB4 scFv的编码基因序列为SEQ ID NO.1第64-807位、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第808-1014位、人4-1BB胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1015-1155位、人CD3ζ胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1156-1491位、P2A肽的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1492-1569位、oIFNα2b基因序列为SEQ ID NO.1第1570-2133位。LILRB4-CAR-IFN基因序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

LILRB4-CAR基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、LILRB4 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列。LILRB4-CAR基因序列为SEQ ID NO.1第1-1491位。

LILRB4-CAR-IFN基因序列和LILRB4-CAR基因序列中的主要元件结构示意图如图1所示。

委托擎科生物科技有限公司合成LILRB4-CAR-IFN基因序列和LILRB4-CAR基因序列。将合成的基因序列克隆在pUC57载体上进行测序鉴定。

3、逆转录病毒载体的构建

将LILRB4-CAR-IFN基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体LILRB4-CAR-IFN。

将LILRB4-CAR基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体LILRB4-CAR。

将SEQ ID NO.7所示的非靶向LILRB4的CAR基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到对照逆转录病毒载体。

二、逆转录病毒包装和产毒株的建立

将步骤一中制备得到的重组逆转录病毒载体LILRB4-CAR-IFN和LILRB4-CAR及对照逆转录病毒载体，按照以下方法分别包装得到两种逆转录病毒及对照逆转录病毒：

1、包装细胞的培养

每10cm细胞培养皿中添加4～5×10⁶个Phoenix Ecotropic(ECO)细胞(ATCC，CRL-3214)(小于20代，不过分长满)和10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜。

2、包装细胞的转染

待ECO细胞融合度达到60-70％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；在一个管中添加目的质粒12.5μg，1.25M CaCl₂ 250μl，H₂O 1ml，总体积为1.25ml；在另一个管里添加与质粒复合物等体积的2×HBS溶液，将质粒复合物加入2×HBS溶液中，边加质粒复合物边涡旋震荡20s，得到混合物。轻柔地将混合物沿着边加入到ECO细胞培养皿中，37℃培养4h，去除培养基，重新加入预热的新鲜培养基。

3、病毒液的获得

转染48h后收集上清并用0.45μm滤器过滤后，得到病毒液，分装保存于-80℃。将由重组逆转录病毒载体LILRB4-CAR-IFN获得的逆转录病毒液记作LILRB4-CAR-IFN病毒液。将由重组逆转录病毒载体LILRB4-CAR获得的逆转录病毒液记作LILRB4-CAR病毒液。将由对照逆转录病毒载体获得的逆转录病毒液记作对照逆转录病毒液。

4、产毒细胞株的建立

将步骤3获得的逆转录病毒液感染HY268细胞，感染两天后，用生物素标记的Protein L蛋白(金斯瑞)和PE标记的链亲和素(SAv-PE)(Biolegend)染色，洗涤后，应用流式分选仪分选CAR强阳性细胞至96孔板，每孔一个细胞，将在96孔板培养后单克隆孔的上清作为逆转录病毒液，进一步通过感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度。筛选出96孔板中病毒滴度最高的三至五个CAR⁺细胞克隆，接种至24孔板中继续培养，进行二次筛选。培养上清感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度，选择病毒滴度最高的细胞克隆作为稳产株，在液氮中长期保存。利用此细胞株可以大规模制备病毒上清用于基因转导制备CAR-T细胞。

三、CAR-T细胞的制备

1、复苏冻存的健康人外周血单个核细胞(PBMC)，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为(1-2)×10⁶个/ml。

2、用Ficoll分离液(达科为公司，DKW-KLSH-0100)收集PBMC，采用磁珠法从PBMC中分离获得较纯的CD3⁺T细胞，按磁珠:CD3⁺细胞体积比为3:1的比例加入临床级DynabeadsHuman T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。

3、T细胞活化后第二天，用浓度为15μg/ml的Retronectin溶液(Takara)包被含有CD3⁺T细胞的6孔板，6孔板每孔加入1.2ml Retronectin溶液，避光，4℃过夜备用。

4、T细胞活化培养两天后，取出包被Retronectin的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。

5、将步骤二制备的逆转录病毒液(病毒滴度最高的产毒细胞株培养上清)加入孔内，每孔加5-6ml，32℃、2000×g离心2h，弃未结合的病毒上清液，每孔加入3ml含hIL-2(上海华新生物高技术有限公司)(500U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，初始细胞密度大约为2×10⁶个/ml，继续培养1天。

6、细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含hIL-2(100U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，细胞密度控制在5×10⁵个/ml，便于细胞扩增。

收集感染病毒液72小时后的T细胞，得到感染逆转录病毒的CAR-T细胞。将感染LILRB4-CAR-IFN病毒液的T细胞记作LILRB4 CAR-IFN T细胞。将感染LILRB4-CAR病毒液的T细胞记作LILRB4 CAR T细胞。

按照上述步骤，将逆转录病毒液替换为等体积PBS溶液或对照逆转录病毒液，分别得到NO CAR T细胞或CTR CAR T细胞。

四、流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的CAR表达效率

由于CAR基因中带有的抗LILRB4单链抗体的轻链是κ链能结合Protein L，所以采用FACS方法通过检测与CAR-T细胞结合的生物素标记的Protein L来反映CAR表达效率。以步骤三获得的LILRB4 CAR-IFN T细胞、LILRB4 CAR T细胞、CTR CAR T细胞及No CAR T细胞为供试细胞，按照如下步骤进行操作：分别离心收集感染后72小时的供试细胞，1％BSA-PBS洗涤1次后弃上清，加入生物素(biotin)标记的protein L抗体避光30min后1％BSA-PBS洗涤3次，重悬；再加入PE标记的亲和素(Streptavidin)，避光10min后1％BSA-PBS洗涤，重悬；最后流式细胞仪检测PE的荧光强度。

结果如图2所示。结果显示：使用步骤二制备得到的逆转录病毒感染T细胞3天后，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞中Protein L(CAR)的阳性率在40％-70％之间。

五、ELISA检测感染后T淋巴细胞培养基上清中IFNα2的含量

IFNα2b是LILRB4 CAR-IFN T的主要增效因子。IFNα2b和IFNα2a同属于IFNα2亚家族，具有高度的序列同源性，通过ELISA检测上清中IFNα2的含量，可以验证LILRB4 CAR-IFNT中CAR的表达水平。以步骤三获得的LILRB4 CAR-IFN T细胞、LILRB4 CAR T细胞、CTR CART细胞及No CAR T细胞为供试细胞，按照如下步骤进行操作：分别离心收集感染后72小时的供试细胞，收集培养后的上清液，ELISA(Biolegend)检测上清液中IFNα2的含量。

结果如图3A所示。结果显示：LILRB4 CAR-IFN T细胞上清中的IFNα2含量显著高于CTR CAR T和LILRB4 CAR T细胞。该结果确证LILRB4 CAR-IFN T细胞可以表达分泌型的IFN。

实施例2、CFSE标记法检测CAR-T细胞对肿瘤细胞特异性杀伤作用

CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。可以利用CFSE标记活细胞的原理对肿瘤细胞进行标记和定量，从而检测CAR-T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效率。具体方法为：靶细胞等量分成两个组，调整至相同的细胞密度。分别用低浓度和高浓度CFSE染色，其中高浓度染色的靶细胞与不染色的免疫细胞按照一定比例共培养。孵育一段时间后，将高浓度染色的靶细胞管(连同免疫细胞)与低浓度染色的靶细胞管等量混合。最后，通过比较CFSE低浓度标记组和CFSE高浓度标记组的靶细胞百分比，计算CAR T细胞对靶细胞的杀伤率。具体步骤如下：

1、将对数期的THP-1细胞300-500g离心1-5min，去上清。用PBS重悬细胞，调整细胞密度至(1-2)×10⁷个/ml。

2、将细胞密度为(1-2)×10⁷个/ml的THP-1细胞悬液等量分成两份，一份记作CFSE高标记细胞，另一份记作CFSE低标记细胞。CFSE低标记细胞用低浓度CFSE(0.5μM)染色，CFSE高标记细胞用高浓度CFSE(5μM)标记。染色方法具体如下：在管内按照既定浓度加入CFSE染料(Invitrogen)，避光37℃孵育10min。

3、加入至少2倍体积冷的完全培养基终止标记，300-500g离心5min。

4、去上清，收集细胞沉淀，用完全培养基洗2遍。

5、将染色的THP-1细胞接种至96孔板中，CFSE高标记组(CFSE高标记细胞+T细胞)：每个孔接种THP-1细胞(5×10⁴个/100μl)，加入不同数量的CAR-T细胞(LILRB4 CAR-IFN T细胞、LILRB4 CAR T细胞或CTR CAR T细胞)，使CAR-T细胞与THP-1细胞的个数比分别为1:1、1:3、1:9、1:27；CFSE低标记组(只有CFSE低标记细胞)：每个孔接种THP-1细胞(5×10⁴个/100μl)单独培养，并用完全培养基补足至相同体积。同时设置未与T细胞共培养的CFSE高标记细胞孔作为对照组。

6、37℃孵育6小时后，CFSE高标记组与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作实验组混合细胞。同时收集对照组(只有CFSE高标记细胞)与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作对照组混合细胞。

7、流式上机，检测各个组FITC单通道的荧光值。

8、靶细胞裂解率分析：流式上机后，应检测出两个FITC阳性峰，分别是CFSE高标记和低标记细胞峰，测得CFSE高标记组和低标记组靶细胞比例。然后按照以下公式计算T细胞对靶细胞杀伤率(％)：

T细胞对靶细胞的杀伤率(％)＝100％-[(实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/实验组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)/(对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/对照组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)]×100％。

例如，测得实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比42.5％，CFSE低标记细胞占比57.5％；测得对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比49.5％，CFSE低标记细胞占比51.5％，那么特异性裂解率(％)＝100％-(42.5％/57.5％)/(49.5％/51.5％)×100％。

实验结果如图3B和表2所示。结果显示：使用LILRB4 CAR-IFN T细胞和靶细胞THP-1按照不同效靶比共培养后，在效靶比为1:1时，细胞裂解率达到80％以上；效靶比为1:27时，细胞裂解率仍有30％左右。

表2、CAR T细胞的细胞裂解率(％)

实施例3、肿瘤移植模型检测CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用

一、过表达LILRB4基因的K562肿瘤细胞的构建

以不表达LILRB4的K562细胞作为起始细胞，在K562细胞中过表达LILRB4基因，以实现其作为LILRB4阳性靶细胞的功能。具体构建方法如下：将合成的LILRB4序列(见SEQ IDNO.8)插入pRV-Luc-GFP载体的AgeI和EcoRI酶切位点中，经测序验证后，得到pRV-Luc-GFP-LILRB4重组表达载体(图4)。将测序验证正确的pRV-Luc-GFP-LILRB4重组表达载体转染K562细胞，得到过表达LILRB4基因的K562细胞(记作K562-LILRB4)。使用LILRB4抗体流式检测LILRB4是否正确表达在K562细胞表面。

二、肿瘤移植模型检测CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用

实验材料：5-6周龄、体重为18-22g的B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠(百奥赛图基因生物技术有限公司)。

实验分组：将实验材料随机分为3个实验组，每组各5只小鼠。每组处理方法具体如下：

LILRB4 CAR-IFN T组：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种K562-LILRB4肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含1×10⁷个K562-LILRB4细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的LILRB4 CAR-IFN T细胞溶液(溶剂为PBS)，注射量为0.2ml(含5×10⁶个LILRB4-CAR-IFN T细胞)。

LILRB4 CAR T组：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种K562-LILRB4肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含1×10⁷个K562-LILRB4细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的LILRB4 CAR T细胞溶液(溶剂为PBS)，注射量为0.2ml(含5×10⁶个LILRB4 CAR T细胞)。

CTR CAR T组：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种K562-LILRB4肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含1×10⁷个K562-LILRB4细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的CTR CAR T细胞溶液(溶剂为PBS溶液)，CTR CAR T细胞注射量为0.2ml(含5×10⁶个CTR CAR T细胞)。

实验方法：在注射CAR-T细胞之后的42天之内，每三天测量一次小鼠肿瘤直径。统计各个时间点的肿瘤直径并作图。在注射CAR-T细胞之后的60天之内，统计小鼠的存活数量，绘制存活曲线。

结果如图5所示。结果显示：与LILRB4 CAR T组相比，LILRB4 CAR-IFN T组小鼠的肿瘤体积明显减小，生存时间明显延长。说明LILRB4 CAR-IFN T组小鼠体内的K562-LILRB4细胞残留明显减少，LILRB4 CAR-IFN T细胞杀伤肿瘤的效果更好更持久。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江康佰裕生物科技有限公司

<120>一种嵌合抗原受体及其在制备治疗肿瘤的产品中的应用

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2136

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacattg tgatgagcca gagcccctcc tccctggcag tgagcgtggg agaaaaagtg 120

accatgagct gcaagagcag ccagaacctg ttttacagca ccaaccagaa aaactacctg 180

gcctggtacc agcagaagcc cggccagtct cccaagctgc tgatttattg ggccagcaca 240

agagagagcg gcgtgcccga cagattcacc ggaagcggca gcggaacagc cttcaccctg 300

actatcagca gcgtgaaagc tgaggacctg gccgtgtact actgtcagca gtactacaac 360

tacccactga ccttcggcgc aggcaccaag ctggagctga agggcggcgg gggttctggt 420

ggcggcggca gcggcggtgg aggatcagag gtgaacctgg aggagagcgg gggggggctg 480

gtgcagcctg gaggaagtat gaagctgagc tgtattgcca gcggattcac atttagcaac 540

tattggatga actgggtgag gcagagtccc gagaagggac tggagtgggt ggcagaaatt 600

agactgaagt acaacaacta cgccacacac tacgcagaaa gcgtgaaggg gagattcacc 660

atcagcagag acgatagcaa gagcaccgtg tacctgcaga tgaacaatct gagagccgag 720

gacaccggga tctactactg taccggcaca agatacggaa gcagcctgga ctactggggc 780

caggggacaa gcgtgacagt gagctccact acaactccag cacccagacc ccctacacct 840

gctccaacta tcgcaagtca gcccctgtca ctgcgccctg aagcctgtcg ccctgctgcc 900

gggggagctg tgcatactcg gggactggac tttgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggttc 1020

agtgtcgtga agagaggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgagg 1080

cccgtgcaga ctacccagga ggaagatgga tgcagctgta gattccctga agaggaggaa 1140

ggaggctgtg agctgagagt gaagttctcc cgaagcgcag atgccccagc ctatcagcag 1200

ggacagaatc agctgtacaa cgagctgaac ctgggaagac gggaggaata cgatgtgctg 1260

gacaaaaggc ggggcagaga tcctgagatg ggcggcaaac caagacggaa gaacccccag 1320

gaaggtctgt ataatgagct gcagaaagac aagatggctg aggcctactc agaaatcggg 1380

atgaagggcg aaagaaggag aggaaaaggc cacgacggac tgtaccaggg gctgagtaca 1440

gcaacaaaag acacctatga cgctctgcac atgcaggctc tgccaccaag acgagctaaa 1500

cgaggctcag gcgcgacgaa ctttagtttg ctgaagcaag ctggggatgt agaggaaaat 1560

ccgggtccca tggccctgac cttcgccctg ctggtggccc tgctggtcct gagctgcaag 1620

agctcctgca gcgtggggtg cgacctgccc cagacccaca gcctgggctc cagaagaacc 1680

ctgatgctgc tggcccagat gagaagaatc agtctgttca gctgcctgaa agacagacac 1740

gactttggct tccctcagga ggaatttgga aaccagttcc agaaggccga aaccatcccc 1800

gtgctgcacg agatgatcca gcagatcttc aacctgttct ccaccaaaga tagcagcgca 1860

gcctgggacg aaaccctgct ggacaagttc tacaccgagc tgtaccagca gctgaacgac 1920

ctggaggcct gcgtgatcca gggcgtggga gtgaccgaga caccactgat gaaagaggat 1980

agcattctgg ccgtgaggaa atacttccag agaatcaccc tgtacctgaa agagaaaaag 2040

tacagtccct gcgcctggga ggtggtgaga gccgagatca tgagaagctt cagcctgagc 2100

accaatctgc aggaaagcct gagaagcaag gagtga 2136

<210>2

<211>2136

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacattg tgatgagcca gagcccctcc tccctggcag tgagcgtggg agaaaaagtg 120

accatgagct gcaagagcag ccagaacctg ttttacagca ccaaccagaa aaactacctg 180

gcctggtacc agcagaagcc cggccagtct cccaagctgc tgatttattg ggccagcaca 240

agagagagcg gcgtgcccga cagattcacc ggaagcggca gcggaacagc cttcaccctg 300

actatcagca gcgtgaaagc tgaggacctg gccgtgtact actgtcagca gtactacaac 360

tacccactga ccttcggcgc aggcaccaag ctggagctga agggcggcgg gggttctggt 420

ggcggcggca gcggcggtgg aggatcagag gtgaacctgg aggagagcgg gggggggctg 480

gtgcagcctg gaggaagtat gaagctgagc tgtattgcca gcggattcac atttagcaac 540

tattggatga actgggtgag gcagagtccc gagaagggac tggagtgggt ggcagaaatt 600

agactgaagt acaacaacta cgccacacac tacgcagaaa gcgtgaaggg gagattcacc 660

atcagcagag acgatagcaa gagcaccgtg tacctgcaga tgaacaatct gagagccgag 720

gacaccggga tctactactg taccggcaca agatacggaa gcagcctgga ctactggggc 780

caggggacaa gcgtgacagt gagctccact acaactccag cacccagacc ccctacacct 840

gctccaacta tcgcaagtca gcccctgtca ctgcgccctg aagcctgtcg ccctgctgcc 900

gggggagctg tgcatactcg gggactggac tttgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaggttc 1020

agtgtcgtga agagaggccg gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc tttcatgagg 1080

cccgtgcaga ctacccagga ggaagatgga tgcagctgta gattccctga agaggaggaa 1140

ggaggctgtg agctgagagt gaagttctcc cgaagcgcag atgccccagc ctatcagcag 1200

ggacagaatc agctgtacaa cgagctgaac ctgggaagac gggaggaata cgatgtgctg 1260

gacaaaaggc ggggcagaga tcctgagatg ggcggcaaac caagacggaa gaacccccag 1320

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atgaagggcg aaagaaggag aggaaaaggc cacgacggac tgtaccaggg gctgagtaca 1440

gcaacaaaag acacctatga cgctctgcac atgcaggctc tgccaccaag acgagctaaa 1500

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ccgggtccca tggccctgac cttcgccctg ctggtggccc tgctggtcct gagctgcaag 1620

agctcctgca gcgtggggtg cgacctgccc cagacccaca gcctgggctc cagaagaacc 1680

ctgatgctgc tggcccagat gagaaaaatc agtctgttca gctgcctgaa agacagacac 1740

gactttggct tccctcagga ggaatttgga aaccagttcc agaaggccga aaccatcccc 1800

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cagcactgga gacaggggaa gcatagaacc ctggctcaga gacaggccga ttttcagaga 900

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ggcgtggaaa tggacaccag acagagccca catgacgaag acccccaggc cgtgacctac 1080

gccaaggtga agcacagcag acccagaaga gagatggcca gcccccccag cccactgtct 1140

ggcgaatttc tggacaccaa ggacagacag gctgaagaag acagacagat ggacaccgaa 1200

gccgccgcct ccgaggcccc tcaggatgtg acctacgcta gactgcactc cttcaccctg 1260

aggcagaagg ccacagaacc cccaccctcc caggaaggcg ccagccctgc tgaaccctcc 1320

gtgtacgcca ccctggccat ccactga 1347

Claims

1.一种嵌合抗原受体，为氨基酸序列是SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白质。

2.与权利要求1所述的嵌合抗原受体相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系；

B6)含有B2)所述表达盒的细胞系；

B7)含有B3)所述重组载体的细胞系；

B8)含有B4)所述重组载体的细胞系。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的DNA分子。

4.一种CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述嵌合抗原受体的编码基因通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中；

或，将权利要求1所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：

所述方法(一)包括如下步骤：用逆转录病毒感染T细胞；所述逆转录病毒是将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组逆转录病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体中得到的；

6.按照权利要求4或5所述的方法制备得到的CAR-T细胞；

或，权利要求5中所述的逆转录病毒；

或，权利要求5中所述的重组逆转录病毒载体；

或，权利要求5中所述的慢病毒；

或，权利要求5中所述的重组慢病毒载体。

7.权利要求1所述的嵌合抗原受体或权利要求2或3所述的生物材料或权利要求6所述的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在如下M1)-M4)中任一种中的应用：

M1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；

M2)制备杀伤肿瘤细胞的产品；

M3)制备生产CAR-T细胞的产品；

M4)生产CAR-T细胞。

8.一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品，其活性成分为权利要求6所述的CAR-T细胞或逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体。

9.根据权利要求7所述的应用或权利要求8所述的产品，其特征在于：所述肿瘤为急性单核细胞白血病。