CN105331608A - 脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一种源自脑膜炎双球菌的CRISPR-Cas9系统识别的靶序列，序列如SEQ？ID？NO:1-15中任意一个的第n-24位所示且n＝1-9。本发明还公开了序列为5’-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3’的sgRNA及其编码DNA分子，识别序列对应的DNA序列与靶序列相同。本发明还公开了一种CRISPR-Cas9系统，包括Cas9蛋白和sgRNA和/或携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体。本发明还公开了CRISPR-Cas9系统在编辑CXCR4基因和制备用于HIV感染的药物中的应用。本发明可以实现CXCR4基因的编辑，使得细胞无法被HIV感染。

Description

脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及CRISPR-Cas9系统识别的靶序列和sgRNA及它们的相关应用。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)又称艾滋病，是一种危害性极大的传染病。自发现的三十多年来，AIDS已累计导致两千余万人死亡，一直是一个巨大的公众健康难题，影响着全球3,530万人的生活。AIDS是由人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)感染引起的，HIV是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属反转录病毒的一种，又称为艾滋病毒。HIV可分为HIV-1和HIV-2两种亚型，HIV-1的致病力强，是引起艾滋病的主要病原体。

CD4⁺T细胞是HIV-1病毒感染过程的首要靶点，随后研究又发现仅有CD4分子并不能介导HIV-1病毒的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体(coreceptor)。1996年证实，趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-1病毒感染的辅助受体。其中，趋化因子CCR5，作为G蛋白耦联受体(G-proteincoupledreceptor，GPCR)超家族的细胞膜蛋白，是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一。CCR5主要在静止期记忆性T淋巴细胞、单核细胞和未成熟的树突状细胞的膜上表达，是HIV-1入侵人体时重要的辅助受体，它作为HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一，在治疗艾滋病研究中是一个重要的药物靶点。

其中，趋化因子受体CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子-1(CXCL12)的特异受体。CXCL12对淋巴细胞有强烈的趋化作用。CXCR4主要表达于单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和PHA激活的T细胞，它是由352个氨基酸组成的GPCR，具有七次穿膜结构。CXCR4分胞内区、跨膜区和胞外区。胞外区包括N端和3个胞外环，其中有两个潜在的糖基化位点和四个半胱氨酸残基。其中的第二个胞外环对受体活性显示了重要的作用。CXCR4的糖基化位点的作用是可遮盖与病毒包膜蛋白结合位点，但点突变对辅助受体活性并无太大影响。跨膜区含一些脯氨酸残基，胞内区包括三个胞内环和富含丝氨酸和苏氨酸的高度保守序列，并有一个G蛋白结合保守区。受体与配体结合后可能被磷酸化，并与G蛋白偶联。CXCR4参与体内多种生理机制，包括参与造血功能，胚胎发育，及肿瘤迁移等，也是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一，在治疗艾滋病研究中是一个重要的药物靶点。

目前对艾滋病的治疗手段主要是控制HIV-1病毒的感染以及阻碍AIDS的发展，称为高效抗逆转录病毒治疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART)，包括一系列抑制病毒各个繁殖阶段的化合物。HAART是能很大程度上减少细胞内病毒的繁殖和血浆病毒血症的发生，但对于新的宿主细胞不被HIV-1感染没有作用。为了从源头上预防健康的细胞被HIV-1感染，新的治疗方案需要彻底地破坏病毒的入侵途径，因而以CCR5为靶点的HIV-1受体拮抗剂越来越受关注，主要有趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等。经典的CCR5拮抗剂抑制R5嗜性的HIV-1感染细胞的机制是：它们与CCR5结合后，使CCR5构象改变，导致CCR5的内源化作用(internalization)或者不利于HIV-1的识别，阻断HIV-1与细胞膜蛋白的结合，导致HIV-1与CCR5在细胞表面的结合减少，从而起到抗感染的作用。但不幸的是长期使用一种抑制剂，最终会使HIV-1产生耐药性，随着耐药性的不断出现，使得现有的抗HIV-1药物难以达到理想的治疗效果。同时，CCR5拮抗剂还存在如下缺点，例如，天然趋化因子的半衰期短和存在潜在的诱导炎症应答作用；非肽类小分子化合物不能下调受体表达；肽类化合物不稳定、易降解；单克隆抗体存在人体对药物的不适应性、潜在的过敏反应等缺点。

近年来，随着靶向基因编辑技术的一步步突破，从ZFN(zincfingernuclease)到后来的TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)以及最新的CRISPR-Cas9技术，为艾滋病的彻底治愈提供了新的希望。研究表明带有CCR5编码基因32个核苷酸缺失的实验者接触HIV但未检测到HIV感染，表明了CCR5影响HIV病毒入侵细胞，说明CCR5基因是一个可靠、高效和安全的治疗HIV的靶点，因此能够实现CCR5在基因组层面上的敲除也是可靠、高效和安全的治疗HIV的方法。2008年，Sangamo成功地利用ZFNs在CD4⁺T细胞上实现CCR5的敲除，然而ZFN靶向敲除CCR5的效率较低，人们期待找到更高效的CCR5的敲除策略。

规律成簇间隔短回文重复系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR-associated，CRISPR-Cas9)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，是细菌和古细菌在进化过程中形成的一种免疫防御体系，用以对抗外来病毒和外源DNA入侵。CRISPR-cas9系统通过整合外源DNA片段到CRISPR中，利用CRISPRRNA(CRISPR-derivedRNA，crRNA)和反式作用RNA(trans-activatingRNA，tracrRNA)特异性地识别靶向序列，并对序列靶位点进行切割。在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologousendjoining，NHEJ)，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或缺失(indel)，造成移码突变，导致基因敲除。或者是在有同源模板的情况下，可通过另一条同源重组(homologousrecombination，HR)的修复途径进行修复，可实现对靶向基因的精确编辑，如引入特异突变或定点转基因。现在已经把两种小RNA(crRNA和tracrRNA)融合成一条RNA链，简称sgRNA(singleguideRNA)，因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种CRISPR-Cas9系统识别的靶序列以及精确特异地靶向人CXCR4基因的sgRNA和它们的有关应用。

因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种CRISPR-Cas9系统识别的靶序列，所述靶序列如SEQIDNO:1-15中任意一个的第n-24位所示且n＝1-9。

第二方面，本发明提供了一种sgRNA，该sgRNA的序列为：5’-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3’，其中，所述识别序列对应的DNA序列如SEQIDNO:1-15中任意一个的第n-24位所示且n＝1-9。

第三方面，本发明提供了编码第二方面所述的sgRNA的DNA分子。

第四方面，本发明提供了一种CRISPR-Cas9系统，该CRISPR-Cas9系统包括Cas9蛋白和sgRNA、和/或包括携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体，所述Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列位于相同或不同的载体上，其中，所述sgRNA为第二方面所述的sgRNA且所述Cas9蛋白源自脑膜炎双球菌(Neisseriameningitidis)。

第五方面，本发明提供了一种编辑CXCR4基因的方法，该方法包括：将第四方面所述的CRISPR-Cas9系统导入表达CXCR4的细胞中。

第六方面，本发明提供了第四方面所述的CRISPR-Cas9系统在制备用于预防和/或治疗HIV感染的药物中的应用。

第七方面，本发明提供了一种预防和/或治疗HIV感染的方法，该方法包括将第四方面所述的CRISPR-Cas9系统导入表达CXCR4的细胞中。

本发明可以实现人CXCR4基因的编辑，进而改变CXCR4的序列，尤其是和HIV表面蛋白结合的序列，导致细胞无法被HIV感染，从而实现预防和/或治疗艾滋病的目的。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为表达sgRNA的重组质粒的结构示意图；

图2为表达NmCas9的重组质粒的结构示意图；

图3为同时表达sgRNA和NmCas9的重组质粒的结构示意图；

图4为根据本发明的一种实施方式对HEK293T细胞的CXCR4基因进行敲除后的测序结果。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未做相反说明的情况下，使用的术语“基因敲除”或“基因编辑”是指对生物的基因组DNA进行删除、插入或者替换，从而达到对目的序列修改的目的；本发明涉及的sgRNA和CRISPR-Cas9系统均为人工改造而成的(engineering，non-naturallyoccurring)。

在第一方面中，本发明提供的CRISPR-Cas9系统识别的靶序列如SEQIDNO:1-15中任意一个的第n-24位所示且n＝1-9(整数，1、2、3、4、5、6、7、8或9)。

在第二方面中，本发明提供的sgRNA的序列为：5’-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3’，其特征在于，所述识别序列对应的DNA序列如SEQIDNO:1-15中任意一个的第n-24位所示且n＝1-9(整数，1、2、3、4、5、6、7、8或9)。其中，“-”表示多核苷酸元件(识别序列和招募Cas9蛋白的序列)以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能，被连接的多核苷酸序列是连续的。

所述招募Cas9蛋白的序列为能够招募Cas9蛋白的序列，即结合Cas9蛋白并使其活化而能够切割目标基因的序列，通常具有特定的二级结构(如茎环结构)。优选地，所述招募Cas9蛋白的序列如SEQIDNO:16所示。

所述Cas9蛋白可以来源于脑膜炎双球菌(N.meningitidis)，如参见NCBI的WP_014574210.1、WP_015815286.1、WP_002235162.1、WP_050185948.1、WP_002250828.1、CFA99522.1或CKL44177.1等。例如，Cas9蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:24所示。

根据本发明的一种优选实施方式，所述识别序列对应的DNA序列如SEQIDNO:2所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQIDNO:16所示。该优选的sgRNA能够更有效地编辑(敲除)CXCR4基因。

在第三方面中，本发明提供了编码第二方面所述的sgRNA的DNA分子。

在第四方面中，本发明提供的CRISPR-Cas9系统包括Cas9蛋白和sgRNA、和/或包括携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体，所述Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列位于相同或不同的载体上，所述sgRNA为第二方面所述的sgRNA且所述Cas9蛋白源自脑膜炎双球菌。

所述载体为能够传递所携带的核酸(编码序列)的核酸分子。所述载体可以为质粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等。在特定的实施方式中，所述载体为真核表达载体，如pcDNA3。

携带有sgRNA的编码序列的载体的结构可以如图1所示。携带有Cas9蛋白的编码序列的载体的结构可以如图2所示。同时携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体的结构可以如图3所示。

如上所述，所述Cas9蛋白的编码序列来源于脑膜炎双球菌，且可以为经密码子优化后适于在真核细胞中表达的序列(如SEQIDNO:20第3815-7120位所示的序列)。

根据本发明的优选实施方式，所述sgRNA为“识别序列对应的DNA序列如SEQIDNO:2所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQIDNO:16所示”的sgRNA。

在第五方面中，本发明提供的编辑CXCR4基因的方法包括：将第四方面所述的CRISPR-Cas9系统导入表达CXCR4的细胞中。编辑CXCR4基因能够实现CXCR4基因表达的上调、下调、或者丧失，优选下调和丧失。所述细胞可以来源于灵长类动物，优选来源于人。该方法可以在体内或体外实施。

在第六方面中，本发明提供了第四方面所述的CRISPR-Cas9系统在制备用于预防和/或治疗HIV感染的药物中的应用。

需要说明的是，本发明提供的各个sgRNA可以联合使用，可以是任意两种或多种sgRNA的联合使用，通过联合使用，CRISPR-Cas9系统可以靶向多个位点，从而能够更有效地敲除CXCR4基因。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

在以下实施例中，涉及的寡核苷酸序列委托金斯瑞生物科技有限公司合成得到。

实施例1

本实施例用来说明本发明的sgRNA的设计。

根据5’-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3’和下表1所示的碱基序列构建15个sgRNA。

表1

实施例2

本实施例用来说明本发明的CRISPR-Cas9系统的构建。

(1)在sgRNA对应的DNA序列(如实施例1所示)的5’末端加上CACC得到正向寡核苷酸(Forwardoligo)，根据此sgRNA，获得其互补链，并且在其5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverseoligo)。分别合成。如果sgRNA识别序列对应的DNA序列5’末端第一个碱基不为G，则需要在CACC之后加入一个G，相应的在反向寡核苷酸的3’末端加入一个匹配的C。将上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸成对变性、退火，退火后形成可以连入U6真核表达载体中的双链sgRNA寡聚核苷酸，变性、退火的体系为：

PCR的条件为：37℃30min；95℃5min；然后以5℃/min的速率缓慢降温至25℃；置于4℃下保存待用。

(2)对质粒进行BsmBI酶切和去磷酸化，反应体系如下：

37℃孵育1小时，产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒(TIANGEN，DP080822)切胶回收酶切产物。

(3)退火后的双链sgRNA寡聚核苷酸具有BsmBI的粘性末端，将其与被BsmBI酶切过的质粒进行连接反应，连接反应的体系为：

16℃孵育1小时。

(4)将上述连接产物转化到Stbl3感受态细胞(购自博迈德生物技术有限公司)中，涂Amp+(100μg/ml)，挑取单克隆。

(5)通过PCR鉴定获得阳性克隆，使用的引物如下：

F1：TCATATGCTTACCGTAACTTGAAAG(SEQIDNO:17)

R1：CCAATTCCCACTCCTTTCAAG(SEQIDNO:18)

反应体系为：缓冲液，2.5ul；dNTP，2.5ul；ExTaq(TaKaRa)，0.15ul；稀释菌液，1ul；引物F1/R1，0.3ul；ddH₂O，18.25ul。

PCR的条件为：37℃30min；94℃5min；(94℃30s；68℃30s；72℃45s)22个循环；72℃8min；置于4℃下保存待用。

测序验证质粒序列的正确性。

(6)37℃摇床过夜培养阳性克隆，并用质粒小提试剂盒(TIANGE，DP106-02)抽提质粒，获得表达sgRNA的重组质粒U6-CXCR4sgRNA-EF1a-Neo-WPRE(见图1，其中一种的序列如SEQIDNO:19所示，将SEQIDNO:19的第2857-3001位替换不同的sgRNA编码序列可以获得表达实施例1中各个sgRNA的重组质粒)、表达NmCas9的重组质粒U6-EF1a-NLS-NmCas9-2A-Puro-WPRE(见图2，其中一种的序列如SEQIDNO:20所示，将SEQIDNO:20的第3815-7120位替换不同的Cas9编码序列可以获得表达不同Cas9的重组质粒)以及共同表达NmCas9和sgRNA的重组质粒U6-hCXCR4sgRNA-EF1a-NLS-NmCas9-NLS-2A-Puro-WPRE(见图3，其中一种的序列如SEQIDNO:21所示，将SEQIDNO:21的第2857-3001位替换不同的sgRNA编码序列且第4200-7505位替换不同的Cas9编码序列可以获得表达实施例1中的各个sgRNA和不同Cas9的重组质粒)。

实施例3

本实施例用来说明使用本发明的CRISPR-Cas9系统编辑CXCR4基因的方法。

(一)细胞培养和转染

(1)将HEK293T细胞(CBR-130005，购自上海赛齐生物工程有限公司)在DMEM高糖培养基(含有10％的FBS、青霉素(penicillin，100U/ml)和链霉素(streptomycin，100μg/ml))中进行培养；

(2)转染前分至六孔板中，细胞密度达70％时进行转染；

(3)按照Lipofectamine3000(Invitrogen，11668-019)用量比例，使用3μg的U6-hCXCR4sgRNA-EF1a-NLS-NmCas9-NLS-2A-Puro-WPRE、或者1.5μg的U6-hCXCR4sgRNA-EF1a-Neo-WPRE和1.5μg的U6-EF1a-NLS-NmCas9-NLS-2A-Puro-WPRE组合转染每孔细胞，8h后换液，相应的，加入嘌呤霉素(Puromycin)和G418(Geneticin)进行药筛，48h后收取细胞。

(二)TA克隆测序检测：

(1)将收集的细胞在裂解液(10μMTris-HCl，0.4MNaCl，2μMEDTA，1％SDS)中，用100μg/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到100μl去离子水中；

(2)使用引物F2/R2进行PCR扩增，使用试剂盒(TIANGEN，DP080822)纯化PCR回收产物，其中，F2：CCCTTAGCCCACTACTTCAG(SEQIDNO:22)，R2：ACATCTGTGTTAGCTGGAGTG(SEQIDNO:23)；

(3)将获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应，体系为：

37℃温浴30min，取1μl产物与pMD19-T载体(TAKARA，3271)连接(连接方式参见pMD19-T载体的说明书)并转化Top10感受态细胞(购自博迈德生物技术有限公司)。

(4)挑取单克隆进行测序，根据测序结果发现：靶基因CXCR4在sgRNA靶向的序列处出现了缺失和插入(indel)，导致CXCR4发生移码突变，基因敲除成功。其中，针对识别序列对应的DNA序列为SEQIDNO:2且招募Cas9蛋白的序列为SEQIDNO:16的sgRNA处理后的单克隆的测序结果如图4所示(其中，箭头表示Csa9切割位点，浅色部分为sgRNA的打靶序列；随机挑选53个克隆，一共检测到7个克隆携带引起移码或者提前终止的突变，突变率为7/53＝13.2％)。

从以上实施例可以看出，本发明的CRISPR-Cas9系统能够实现人CXCR4基因的敲除，且敲除效率也较高。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种CRISPR-Cas9系统识别的靶序列，其特征在于，所述靶序列如SEQIDNO:1-15中任意一个的第n-24位所示且n＝1-9。

2.一种sgRNA，该sgRNA的序列为：5’-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3’，其特征在于，所述识别序列对应的DNA序列如SEQIDNO:1-15中任意一个的第n-24位所示且n＝1-9。

3.根据权利要求2所述的sgRNA，其中，招募Cas9蛋白的序列如SEQIDNO:16所示。

4.根据权利要求2或3所述的sgRNA，其中，所述识别序列对应的DNA序列如SEQIDNO:2所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQIDNO:16所示。

5.编码权利要求2、3或4所述的sgRNA的DNA分子。

6.一种CRISPR-Cas9系统，其特征在于，该CRISPR-Cas9系统包括：Cas9蛋白和sgRNA，和/或携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体，所述Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列位于相同或不同的载体上，其中，所述sgRNA为权利要求2、3或4所述的sgRNA且所述Cas9蛋白源自脑膜炎双球菌(Neisseriameningitidis)。

7.根据权利要求6所述的CRISPR-Cas9系统，其中，所述sgRNA为权利要求4所述的sgRNA。

8.一种编辑CXCR4基因的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求6或7所述的CRISPR-Cas9系统导入表达CXCR4的细胞中。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述细胞来源于灵长类动物，优选来源于人。

10.权利要求6或7所述的CRISPR-Cas9系统在制备用于预防和/或治疗HIV感染的药物中的应用。