CN103923911B - CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA - Google Patents
CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA Download PDFInfo
- Publication number
- CN103923911B CN103923911B CN201410149287.4A CN201410149287A CN103923911B CN 103923911 B CN103923911 B CN 103923911B CN 201410149287 A CN201410149287 A CN 201410149287A CN 103923911 B CN103923911 B CN 103923911B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sgrna
- gene
- sequence
- ccr5 gene
- ccr5
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA。本发明提供了CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA以及涉及到中间载体和应用。利用本发明制备的特异性靶向人CCR5基因的sgRNA能够精确靶向人CCR5基因并且实现基因敲除。该制备方法步骤简单、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系统的敲除效率高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA。
背景技术
人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属反转录病毒的一种。普遍认为，人类免疫缺陷病毒的感染导致艾滋病，艾滋病是后天性细胞免疫功能出现缺陷而导致严重随机感染及继发肿瘤并致命的一种疾病。艾滋病自1981年在美国被识别并发展为全球大流行至2003年底，已累计导致两千余万人死亡。人类免疫缺陷病毒通常也俗称为“艾滋病病毒”。 自1981年发现第一例由HIV引起的艾滋病的25年以来，尽管对艾滋病的临床治疗已有了很大进展，但是仍无有效治愈手段可以攻破此科学难题。研究表明，HIV可分为HIV-1和HIV-2两种亚型，HIV-1致病力强，是引起艾滋病的主要病原体。
病毒特异的CD4+T细胞是针对HIV免疫应答的重要组成部分，也是HIV-1感染过程的首要靶点。自1984年发现HIV-1通过与CD4结合感染宿主细胞，随后研究又发现仅有CD4分子并不能介导HIV-1的侵入，同时还需要一种或几种辅助受体。1996年证实，趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV-1感染的辅助受体（coreceptor）。其中，趋化因子CCR5，作为G蛋白偶联因子超家族（GPCR）成员的细胞膜蛋白，是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一。一个接触HIV但未检测到HIV感染的个人，带有CCR5编码基因32个核苷酸缺失，表明了CCR5影响HIV病毒入侵细胞。因而以CCR5为靶点的HIV-1受体拮抗剂越来越受关注，主要有趋化因子衍生物、非肽类小分子化合物、单克隆抗体、肽类化合物等。这些抗病毒活性强、亲和力高的CCR5拮抗剂，已有一部分进入了临床试验阶段。
尽管辅助受体拮抗剂可有效预防HIV-1感染，遏制艾滋病的流行，但是该类抑制剂的发展也面临着挑战。长期使用一种抑制剂，最终会使HIV-1产生耐药性，不幸的是，几乎所有的小分子拮抗剂都会产生耐药性，随着耐药性的不断出现，使得现有的抗HIV-1药物难以达到理想的治疗效果。因此，从基因组层面失活CCR5具有重要的治疗价值，这样，特异性靶向CCR5引起了人们的广泛关注。
2008年，Sangamo成功的利用Engineered zinc finger nucleases (ZFNs) 在CD4+T细胞上实现CCR5的敲除，如今这项名为SB-728-T的项目已被尝试应用于HIV感染人群的基因治疗，并已进入临床二期阶段。这一基因编辑产品通过敲除分离到的病人的CD4+T细胞的CCR5，然后自体回输到病人，可以用于HIV感染的治疗。越来越多的实验结果表明CCR5基因是一个可靠、高效和安全的治疗HIV的靶点，能够实现CCR5在基因组层面上的敲除也是可靠、高效和安全的治疗方法。
然而，即使在经过真核抗性筛选之后，ZFN靶向敲除CCR5的效率也只有大约为30%。很明显，这个效率还是差强人意，现有的技术还很难满足需要，人们期待找到更高效的CCR5的敲除策略。通过靶向敲除HIV感染人群的CD4+T细胞上的CCR5，达到HIV感染人群治疗的目的。
规律成簇间隔短回文重复系统（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat; CRISPR-associated，CRISPR-Cas9）是一种具有核酸内切酶活性的复合体，识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂（Double-strandbreaks, DSB），在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接（Non-homologous endjoining, NHEJ）,造成移码突变（frameshift mutation），导致基因敲除（图1）。
这一技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，从而引起了广泛的关注，在2012年开始像爆炸一般流行开来。由于其容易操作、可以同时靶向多个基因，可以高通量制备、造价低等优势，Cas9已经成为一种发展最快的技术（Pennisi, 2013）。正是由于其优越性，这一技术在Nature推荐的2013十大进展中位列第一（http://www.nature.com/news/365-days-nature-s-10-1.14367），在Science推荐的2013十大进展中位列第二位（http://news.sciencemag.org/breakthrough-of-the-year-2013）。
Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA——crRNA （CRISPR RNA）和tracrRNA(trans-activating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA（single guide RNA）。因此，sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR-Cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件，无论是脱靶还是错误靶向，都会影响CRISPR-Cas9对目标基因的特异性敲除。因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR-Cas9基因敲除的关键技术（图1）。
与ZFN相比，CRISPR-Cas9具有更快速、简便、高效、多位点、特异性靶向敲除基因的优势。为高效靶向敲除CCR5，实现艾滋病及其相关疾病的治疗提供了一种可能的选择。本发明的目的就是要验证利用CRISPR-Cas9高效靶向敲除CCR5提供相应的技术方案，以达到特异性敲除CCR5的目的。
参考文献：
Mali P, Esvelt KM, Church GM. Cas9 as a versatile tool forengineering biology. Nat Methods. 2013 Oct;10(10):957-63. doi: 10.1038/nmeth.264.
Pennisi E. The CRISPR craze. Science. 2013 Aug 23;341(6148):833-6.doi: 10.1126/science.341.6148.833.
Perez EE, Wang J, Miller JC, Jouvenot Y, Kim KA, Liu O, Wang N, LeeG, Bartsevich VV, Lee YL, Guschin DY, Rupniewski I, Waite AJ, Carpenito C,Carroll RG, Orange JS, Urnov FD, Rebar EJ, Ando D, Gregory PD, Riley JL,Holmes MC, June CH. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells bygenome editing using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 2008 Jul;26(7):808-16. doi: 10.1038/nbt1410.
Badia R, Riveira-Muñoz E, Clotet B, Esté JA, Ballana E. Gene editingusing a zinc-finger nuclease mimicking the CCR5Δ32 mutation inducesresistance to CCR5-using HIV-1. J Antimicrob Chemother. 2014 Mar 20.
Tebas P, Stein D, Tang WW, Frank I, Wang SQ, Lee G, Spratt SK,Surosky RT, Giedlin MA, Nichol G, Holmes MC, Gregory PD, Ando DG, Kalos M,Collman RG, Binder-Scholl G, Plesa G, Hwang WT, Levine BL, June CH. Geneediting of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. NEngl J Med. 2014 Mar 6;370(10):901-10. doi: 10.1056/NEJMoa1300662.
Kay MA, Walker BD. Engineering cellular resistance to HIV. N Engl JMed. 2014 Mar 6;370(10):968-9. doi: 10.1056/NEJMe1400593。
发明内容
针对现有使用ZFN靶向CCR5进行艾滋病治疗所存在的问题：（1）效率较低，只能少量敲除CCR5；（2）单个靶位点可能只造成非移码突变从而无法有效敲除CCR5；（3）设计与合成一对特异性的ZFN费时、费力、费钱，使得其花费昂贵等。本发明设计、合成了一组在CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因中特异性靶向CCR5基因的sgRNA，并分别将该sgRNA与线性的pGL3-U6-sgRNA质粒连接成载体，将一对正向和反向sgRNA寡核苷酸载体与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒一起成功转染细胞即可实现CCR5基因的敲除。本申请提供了一种利用Cas9/sgRNA快速、简便、高效、特异性敲除CCR5的策略。有效地解决了利用ZFN治疗存在的问题：（1）效率高，CCR5敲除效率达到60%以上；（2）既可以针对CCR5的多个编码序列进行同时敲除，也可以针对多个靶基因进行同时敲除；（3）提供了高效的sgRNA；（4）sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产。
本申请的技术方案如下：
一、sgRNA寡核苷酸的设计和选择
1.靶向CCR5基因的sgRNA的设计：
因为没有使用体外转录，只是构建普通载体的方式制作。所以如无特殊说明，文中的sgRNA序列指的是sgRNA对应DNA序列。
（1）在CCR5基因上选择5’-GGN(19)GG 的序列，如果没有5’-GGN(19)GG 的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。
（2）sgRNA在CCR5基因上的靶向位点位于基因的外显子。
（3）sgRNA在CCR5基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。
（4）在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一。
2.靶向CCR5基因的sgRNA的选择：
（1）不能离ATG起始子太近，防止转录会后下游另一个ATG开始而出现一个被截短的基因形式，不能保证基因完全失活。
（2）sgRNA在CCR5基因上的靶向位点位于整个基因的前中段部分，尤其宜在自然界中存在的32bp缺失所造成的跨膜区域缺损型突变。
（3）选择相隔一定距离（10~30bp）成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。
二、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链
根据选择的sgRNA，在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸（Forward oligo）（如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G）；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸（Reverse oligo）。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverseoligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链，如下：
三、sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建
1.线性化pGL3-U6-sgRNA质粒（结构如图4所示）。
2.将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-hCCR5sg质粒。
3.转化并涂Amp+平板（50 µg/ml）。
4.用ID NO. 5的通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆。
5.37°C摇床摇菌过夜并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提pGL3-U6-hCCR5sg质粒。
四、转染细胞获得CCR5基因敲除细胞
1、按照Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将分别带有对应sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-hCCR5sg质粒（可以为1种或者多种）与序列为SEQ ID NO.7的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（结构如图5所示）混匀，共转染细胞。
2、用T7EN1 酶切检测和TA克隆测序确认CCR5基因已经被敲除。
更进一步的，同时利用一对相邻（在CCR5基因上的靶向起始位点相距15bp）的sgRNA可以显著提高敲除效率。在靶向CCR5的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之后，将靶向CCR5的sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得含靶向CCR5的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-hCCR5sg，在转染细胞获得CCR5基因敲除细胞过程中，如下操作：
1、按照Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将两个分别含1个靶向CCR5的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-hCCR5sg（这两个载体分别带有的靶向CCR5的sgRNA寡聚核苷酸在CCR5基因上的互补起始位点相距10-30bp）与序列为SEQ ID NO.7的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒混匀，共转染细胞。
2、用T7EN1 酶切检测和TA克隆测序确认CCR5基因已经被敲除。
本发明还提供了特异性靶向CCR5基因的sgRNA，其序列如SEQ ID NO. 15-114所示。
相比于现有利用ZFN进行CCR5靶向敲除治疗艾滋病技术，本发明的优点在于：
（1）ZFN的敲除效率较低，加上真核抗性药筛效率大约只有30%，只能少量敲除CCR5，本发明使用CRISPR敲除CCR5，效率可达60%，效率高，治疗效果好；
（2）一对ZFN针对单个靶位点敲除，可能只造成非移码突变，从而无法有效敲除CCR5，本发明使用多个sgRNA可以同时针对多个靶位点甚至多个基因有效敲除，提高了效率；
（3）有效的ZFN设计与合成很困难，本发明提供了针对人CCR5基因的一组高效的sgRNA；
（4）设计与合成一对特异性的ZFN是一项费时、费力、费钱的过程，使得其花费昂贵，利用sgRNA只需要小量合成多核苷酸片断，就能大批量生产。
由于大量的研究结果已经表明CCR5基因是一个可靠、高效和安全的治疗HIV的靶点，因此能够实现CCR5在基因组层面上的敲除也是可靠、高效和安全的治疗HIV的方法。因此本发明的用于CCR5基因敲除的用到的sgRNA以及中间载体能够在治疗HIV当中被应用。因此，本发明还保护在CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因中用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA在非诊疗目的的敲除人CCR5基因中的应用以及中间载体pGL3-U6-hCCR5sg质粒在非诊疗目的的特异性敲除人CCR5基因中的应用。本发明还保护中间载体pGL3-U6-hCCR5sg在制备抗艾滋病药物中的应用，以及保护中间载体pGL3-U6-hCCR5sg和pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒的组合物在制备抗艾滋病药物中的应用。
附图说明
图1 Cas9实现定点切割导致DNA双链断裂过程示意图。
CRISPR/Cas9系统定向识别和剪切从而导致基因敲除是通过sgRNA和Cas9实现的。sgRNA 决定了Cas9的靶向性。
图2 T7EN1酶切鉴定sgRNA/Cas9介导的基因人CCR5特异性切割
以提取的HEK293T细胞基因组为模板，使用序列如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9的hCCR5 test For和hCCR5 test Rev为引物进行PCR扩增，PCR产物为650 bp，纯化PCR产物。将上述PCR产物取200 ng退火，使用T7EN1酶切鉴定，电泳。如图2所示，加入针对人CCR5的sgRNA的样品都出现了切割条带，而且具有很高的效率。
图3 sgRNA/Cas9介导的基因位点特异性人CCR5切割结果测序
以提取的细胞基因组为模板，使用序列如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9的hCCR5test For和hCCR5 test Rev为引物进行PCR扩增。纯化PCR产物，连入TA克隆并送测序。下划线序列为PAM序列；(-)表示敲除。
图4 载体pGL3-U6-sgRNA的结构。
图5 载体pST1374-NLS-flag-cas9-ZF的结构。
图6 sgRNA/Cas9介导的基因位点特异性人CCR5切割结果测序。
以提取的细胞基因组为模板，使用序列如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9的hCCR5test For和hCCR5 test Rev为引物进行PCR扩增。纯化PCR产物，连入TA克隆并送测序。下划线序列为PAM序列；(-)表示敲除。
图7 sgRNA/Cas9介导的基因位点特异性人CCR5切割结果测序。
以提取的细胞基因组为模板，使用序列如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9的hCCR5test For和hCCR5 test Rev为引物进行PCR扩增。纯化PCR产物，连入TA克隆并送测序。下划线序列为PAM序列；(-)表示敲除。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。
实施例 1 CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因中用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA的设计和合成
1.靶向人CCR5基因的sgRNA的设计：
（1）在CCR5基因上选择5’-GGN(19)GG 的序列，如果没有5’-GGN(19)GG 的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。
（2）sgRNA在CCR5基因上的靶向位点位于基因的外显子，这样更容易引起片段的缺失或移框突变，从而达到基因完全失活的目的。
（3）sgRNA在CCR5基因上的靶向位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。
（4）在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA的靶序列是否唯一，减少潜在的脱靶位点。
根据以上方法，我们一共设计了100个靶向人CCR5基因的sgRNA，序列分别如序列表SEQ ID NO. 15-114所示。
2.靶向人CCR5基因的sgRNA的选择：
（1）靶向CCR5基因的sgRNA的靶序列在CCR5基因上不能离ATG起始子太近，防止转录会后下游另一个ATG开始而出现一个被截短的基因形式，不能保证基因完全失活。
（2）sgRNA在CCR5基因上的靶向位点位于整个基因的前中段部分，尤其宜在自然界中存在的32bp缺失所造成的跨膜区域缺损型突变。
（3）在CCR5基因上选择相隔一定距离（10~30bp）成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。
根据以上方法，在100个靶向人CCR5基因的包含PAM序列的sgRNA（序列分别如序列表SEQ ID NO. 15-114所示）中符合的序列有12个（分别如序列表SEQ ID NO. NO. 20、22、28、29、38、47、53、55、56、58、60或者63所示），由于序列较多，没有必要一一做实验验证，我们从中随机选了2个（分别如序列表SEQ ID NO. 53或者58所示）进行后续实验。
3.靶向人CCR5基因的sgRNA寡聚核苷酸的合成和构建
根据选择的2个sgRNA（分别如序列表SEQ ID NO. 53或者58所示），在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸（Forward oligo）（如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G）；根据选择的sgRNA，获得其互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸（Reverse oligo）。分别合成（合成方法参见文献：Significant improvement ofquality for long oligonucleotides by using controlled pore glass with largepores.Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2005;24(5-7):1037-41.）上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸，模式如下：
变性、退火体系为：
2.5 µl forward Oligo (100 µM)
2.5 µl reverse Oligo (100 µM)
1 µl NEB buffer 2
4 µl 灭菌水
在PCR仪中按照以下touch down程序运行：95°C，5 min；95–85°C at −2°C /s；85–25°C at −0.1°C /s；hold at 4°C。
选择的第1个sgRNA（如序列表SEQ ID NO. 53所示），其forward oligo和reverseoligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 1和2所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
选择的第2个sgRNA（如序列表SEQ ID NO. 58所示），其forward oligo和reverseoligo（Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 3和4所示）成对变性、退火之后获得可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸。
实施例 2 利用CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因（用于靶向CCR5基因的sgRNA如序列表53所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO.6所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2 µg pGL3-U6-sgRNA（400 ng/µl）；
1 µl CutSmart Buffer；
1 µl BsaI (NEB，R0535L)；
补水至50 µl，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20~40 µl 灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 1和2所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCCR5sg1质粒。
连接体系如下：
3 µl，50 µM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ IDNO. 1所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 2所示）
1 µl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25 ng/µl）
1 µl T4 ligation Buffer
0.5 µl T4 ligase (NEB，M0202S)
4.5 µl 灭菌水
16 °C孵育1小时。
4、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）并涂Amp+平板（50 µg/ml），并挑取克隆。
5、用如序列表SEQ ID NO. 5所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
6、37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-hCCR5sg1质粒（如序列表SEQ ID NO. 10所示）。
7、细胞培养与转染
（1）HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含10% FBS，penicillin（100 U/ml）和streptomycin（100 µg/ml）。
（2）在转染前分至12孔板中，待70%~80%密度时进行转染。
（3） 按照Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 µg pGL3-U6-hCCR5sg1（如序列表SEQ ID NO. 10所示）与1.5 µg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 7所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，并加入Blasticidin（Sigma, 15205）和Puromycin（Merck, 540411）药筛，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013,Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. CellResearch 23, 720-723. （doi:10.1038/cr.2013.46）
8、T7EN1 酶切检测
（1） 将收集的细胞在裂解液（10 µM Tris-HCl, 0.4 M NaCl, 2 µM EDTA, 1%SDS）中用100 µg/ml 蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50 µl 去离子水中。
（2）使用序列如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9的引物hCCR5 test For和hCCR5test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200 ng统一稀释到20 µl进行变性、退火，程序如：95°C，5 min；95–85°C at −2°C/s；85–25°C at −0.1°C /s；hold at 4°C。
（3）在20 µl体系中加入T7EN1 0.3 µl，37°C 酶切30分钟后，加入2 µl 10XLoading Buffer ,用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
如图2所示，通过琼脂糖胶电泳可以发现：发生断裂末端连接修复的基因组会因为与原基因组不完全匹配，而被T7EN1切割，显示出较小的条带。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1 酶切检测步骤（2）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700~800 ng PCR回收产物
5 µl 10 X Buffer (Mg2+ free)
3 µl Mg2+
4 µl dNTP
0.5 µl rTaq (TAKARA, R001 AM)
补水至50 µl 体系。
37°C 温育30分钟后，取1 µl 产物与pMD19-T vector ( TAKARA, 3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO. 5的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO. 12所示）发现：靶基因CCR5缺失了sgRNA靶向的一段序列（如图6所示），基因敲除成功。
实施例 3 利用CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因（用于靶向CCR5基因的sgRNA如序列表SEQ ID NO. 58所示）
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO.6所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2 µg pGL3-U6-sgRNA（400 ng/µl）；
1 µl CutSmart Buffer；
1 µl BsaI (NEB，R0535L)；
补水至50 µl，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20~40 µl 灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 3和4所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCCR5sg2质粒。
连接体系如下：
3 µl 50 µM退火产物双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ IDNO. 3所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 4所示）
1 µl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25 ng/µl）
1 µl T4 ligation Buffer
0.5 µl T4 ligase (NEB，M0202S)
4.5 µl 灭菌水
16 °C孵育1小时。
4、将上述步骤获得的连接产物转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）并涂Amp+平板（50 µg/ml），并挑取克隆。
5、用如序列表SEQ ID NO. 5所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
6、37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-hCCR5sg2质粒（如序列表SEQ ID NO. 11所示）。
7、细胞培养与转染
（1）HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含10% FBS，penicillin（100 U/ml）和streptomycin（100 µg/ml）。
（2）在转染前分至12孔板中，待70%~80%密度时进行转染。
（3） 按照Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 µg pGL3-U6-hCCR5sg2质粒（如序列表SEQ ID NO. 11所示）与1.5µg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 7所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，并加入Blasticidin （Sigma, 15205）和Puromycin （Merck,540411）药筛，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013,Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. CellResearch 23, 720-723. （doi:10.1038/cr.2013.46）
8、T7EN1 酶切检测
（1）将收集的细胞在裂解液（10 µM Tris-HCl, 0.4 M NaCl, 2 µM EDTA, 1%SDS）中用100 µg/ml 蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50 µl 去离子水中。
（2）使用序列如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9的引物hCCR5 test For和hCCR5test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200 ng统一稀释到20 µl进行变性、退火，程序如：95°C，5 min；95–85°C at −2°C/s；85–25°C at −0.1°C /s；hold at 4°C。
（3）在20 µl体系中加入T7EN1 0.3 µl，37°C 酶切30分钟后，加入2 µl 10XLoading Buffer , 用2.5%的琼脂糖胶电泳检测，结果如图2所示。
如图2所示，通过琼脂糖胶电泳可以发现：发生断裂末端连接修复的基因组会因为与原基因组不完全匹配，而被T7EN1切割，显示出较小的条带。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1 酶切检测步骤（2）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700~800 ng PCR回收产物
5 µl 10 X Buffer (Mg2+ free)
3 µl Mg2+
4 µl dNTP
0.5 µl rTaq (TAKARA, R001 AM)
补水至50 µl 体系。
37°C 温育30分钟后，取1 µl 产物与pMD19-T vector ( TAKARA, 3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO. 5的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO. 13所示）发现：靶基因CCR5缺失了sgRNA靶向的一段序列，基因敲除成功（如图7所示）。
实施例 4 利用CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因
用于靶向CCR5基因的sgRNA为两个sgRNA共靶向，其序列如序列表SEQ ID NO. 53和58所示，这两个sgRNA在CCR5基因上的靶向起始位点相距15 bp，可以显著提高敲除效率。
1、线性化序列如序列表SEQ ID NO.6所示的pGL3-U6-sgRNA质粒。
酶切体系和条件如下：
2 µg pGL3-U6-sgRNA （400 ng/µl）；
1 µl CutSmart Buffer；
1 µl BsaI (NEB，R0535L)；
补水至50 µl，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。
酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至20~40 µl灭菌水中。
2、将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 1和2所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCCR5sg1质粒。
将变性、退火之后获得的可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸（其Forward oligo和Reverse oligo序列分别如序列表SEQ ID NO. 3和4所示）与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒相连获得pGL3-U6-hCCR5sg2质粒。
连接体系如下：
3 µl 50 µM退火产物（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ IDNO. 1所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 2所示）或者（双链sgRNA寡聚核苷酸，其forward oligo如序列表SEQ ID NO. 3所示，其reverse oligo如序列表SEQ ID NO. 4所示）
1 µl线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒（25 ng/µl）
1 µl T4 ligation Buffer
0.5 µl T4 ligase (NEB，M0202S)
4.5 µl 灭菌水
16 °C孵育1小时。
4、将上述步骤获得的连接产物分别转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）并涂Amp+平板（50 µg/ml），并挑取克隆。
5、用如序列表SEQ ID NO. 5所示的通用引物U6，用常规测序的方法鉴定获得阳性克隆。
6、37°C摇床摇菌过夜培养阳性克隆，并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提质粒，获得pGL3-U6-hCCR5sg1（如序列表SEQ ID NO. 10所示）和pGL3-U6-hCCR5sg2（如序列表SEQ ID NO. 11所示）。
7、细胞培养与转染
（1）HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含10% FBS，penicillin（100 U/ml）和streptomycin（100 µg/ml）。
（2）在转染前分至12孔板中，待70%~80%密度时进行转染。
（3） 按照Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent（Invitrogen，11668-019）的操作手册，将0.5 µg pGL3-U6-hCCR5sg1（如序列表SEQ ID NO. 10所示）和0.5 µgpGL3-U6-hCCR5sg2（如序列表SEQ ID NO. 11所示）与1.5 µg的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒（如序列表SEQ ID NO. 7所示）混匀，共转染至每孔细胞中，6~8 小时后换液，并加入Blasticidin （Sigma, 15205）和Puromycin （Merck, 540411）药筛，48小时后收取细胞。
质粒pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF的制备方法参见文献：Shen et al. 2013,Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting. CellResearch 23, 720-723. （doi:10.1038/cr.2013.46）
8、T7EN1 酶切检测
（1） 将收集的细胞在裂解液（10 µM Tris-HCl, 0.4 M NaCl, 2 µM EDTA, 1%SDS）中用100 µg/ml 蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50 µl 去离子水中。
（2）使用序列如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9的引物hCCR5 test For和hCCR5test Rev进行PCR扩增，用AxyPrep PCR cleanup纯化获得PCR回收产物，取200 ng统一稀释到20 µl进行变性、退火，程序如：95°C，5 min；95–85°C at −2°C/s；85–25°C at −0.1°C /s；hold at 4°C。
（3）在20 µl体系中加入T7EN1 0.3 µl，37°C 酶切30分钟后，加入2 µl 10XLoading Buffer ,用2.5%的琼脂糖胶电泳检测。
如图2所示，通过琼脂糖胶电泳可以发现：发生断裂末端连接修复的基因组会因为与原基因组不完全匹配，而被T7EN1切割，显示出较小的条带。
9、TA克隆测序
（1）将T7EN1 酶切检测步骤（2）获得的PCR回收产物用rTaq进行加A反应。加A反应体系为：
700~800 ng PCR回收产物
5 µl 10 X Buffer (Mg2+ free)
3 µl Mg2+
4 µl dNTP
0.5 µl rTaq (TAKARA, R001 AM)
补水至50 µl 体系。
37°C 温育30分钟后，取1 µl 产物与pMD19-T vector ( TAKARA, 3271)连接并转化DH5α感受态细胞（TransGen, CD201）。
（2）挑取单克隆以序列如序列表SEQ ID NO. 5的通用引物U6测序，根据测序结果（如序列表SEQ ID NO. 14所示）发现：靶基因CCR5缺失了两个sgRNA靶序列的中间一段，基因敲除成功（如图3所示）。
Claims (1)
1.CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，其特征为包括如下步骤：
(1)提供sgRNA，所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列符合5’-N(21)GG的序列排列规则，所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列位于基因的外显子，所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共有外显子上，所述sgRNA在CCR5基因上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA对应的DNA序列如序列表SEQ ID NO.53或者58任意一条序列所示，在所述sgRNA对应的DNA链5’加上CCGG合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo；获得所述sgRNA对应DNA的互补链，并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo；将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；
(2)线性化序列如序列表SEQ ID NO.6所示的pGL3-U6-sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-hCCR5sg质粒；pGL3-U6-hCCR5sg质粒转化感受态细菌并涂Amp+平板，挑选单克隆并用序列如序列表SEQ ID NO.5所示的通用引物U6通过测序鉴定出阳性克隆；37℃摇床摇阳性克隆菌过夜并用货号为AP-MN-P-250的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit抽提pGL3-U6-hCCR5sg质粒；
(3)用LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent装载两种或者两种以上不同的pGL3-U6-hCCR5sg质粒和序列为SEQ ID NO.7的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒，共转染细胞；
(4)用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认CCR5基因已经被敲除并获得基因敲除的细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410149287.4A CN103923911B (zh) | 2014-04-14 | 2014-04-14 | CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410149287.4A CN103923911B (zh) | 2014-04-14 | 2014-04-14 | CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103923911A CN103923911A (zh) | 2014-07-16 |
| CN103923911B true CN103923911B (zh) | 2016-06-08 |
Family
ID=51142309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410149287.4A Active CN103923911B (zh) | 2014-04-14 | 2014-04-14 | CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103923911B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107858373A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-03-30 | 山东省千佛山医院 | 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法 |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6261500B2 (ja) | 2011-07-22 | 2018-01-17 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善 |
| US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US9340799B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | MRNA-sensing switchable gRNAs |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| LT3066201T (lt) | 2013-11-07 | 2018-08-10 | Editas Medicine, Inc. | Su crispr susiję būdai ir kompozicijos su valdančiomis grnr |
| BR112016013547A2 (pt) * | 2013-12-12 | 2017-10-03 | Broad Inst Inc | Composições e métodos de uso de sistemas crispr-cas em distúrbios de repetições de nucleotídeos |
| US9840699B2 (en) | 2013-12-12 | 2017-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for nucleic acid editing |
| WO2016022363A2 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| CN104651399B (zh) * | 2014-12-31 | 2018-11-16 | 广西大学 | 一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法 |
| CN104805118A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-07-29 | 扬州大学 | 一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除方法 |
| CA2985615A1 (en) * | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids |
| CN105518135B (zh) * | 2015-05-22 | 2020-11-24 | 深圳市第二人民医院 | CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA |
| KR102553518B1 (ko) * | 2015-06-01 | 2023-07-07 | 템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 | Hiv 감염의 rna-가이드된 치료를 위한 방법 및 조성물 |
| CN105400779A (zh) * | 2015-10-15 | 2016-03-16 | 芜湖医诺生物技术有限公司 | 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用 |
| CN105331607A (zh) * | 2015-10-19 | 2016-02-17 | 芜湖医诺生物技术有限公司 | 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用 |
| CN105316337A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-02-10 | 芜湖医诺生物技术有限公司 | 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用 |
| CN105316324A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-02-10 | 芜湖医诺生物技术有限公司 | 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用 |
| CN105331609A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-02-17 | 芜湖医诺生物技术有限公司 | 脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用 |
| CN105331608A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-02-17 | 芜湖医诺生物技术有限公司 | 脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用 |
| US20190225955A1 (en) | 2015-10-23 | 2019-07-25 | President And Fellows Of Harvard College | Evolved cas9 proteins for gene editing |
| CN105567738A (zh) * | 2016-01-18 | 2016-05-11 | 南开大学 | 使用基因组编辑技术CRISPR-Cas9诱导CCR5Δ32缺失的方法 |
| CN106995821B (zh) * | 2016-01-26 | 2021-05-14 | 深圳市儿童医院 | Jurkat-KI-R5细胞系及其构建方法和应用 |
| CN105567688A (zh) * | 2016-01-27 | 2016-05-11 | 武汉大学 | 一种可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/SaCas9系统 |
| KR102547316B1 (ko) | 2016-08-03 | 2023-06-23 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도 |
| AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
| CN108277222A (zh) * | 2016-12-13 | 2018-07-13 | 广东赤萌医疗科技有限公司 | 一种用于敲除CCR5基因的gRNA、表达载体、敲除系统、试剂盒 |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| EP3592777A1 (en) | 2017-03-10 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| US11268082B2 (en) | 2017-03-23 | 2022-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| CN107142282A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-09-08 | 中山大学 | 一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法 |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| WO2019023680A1 (en) | 2017-07-28 | 2019-01-31 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE) |
| CN107541525B (zh) * | 2017-08-26 | 2021-12-10 | 内蒙古大学 | 一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法 |
| WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| US11795443B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| CN107893075A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-04-10 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | CRISPR‑Cas9靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA |
| CN107893076A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-04-10 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | CRISPR‑Cas9靶向敲除人乳腺癌细胞RASSF2基因及其特异性的sgRNA |
| CN108570479B (zh) * | 2017-12-06 | 2020-04-03 | 内蒙古大学 | 一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法 |
| CN108148835A (zh) * | 2017-12-07 | 2018-06-12 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | CRISPR-Cas9靶向敲除SLC30A1基因及其特异性的sgRNA |
| CA3130488A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | David R. Liu | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| CN110117622B (zh) * | 2019-05-24 | 2021-05-11 | 青岛农业大学 | 一种CRISPR/Cas基因编辑系统及其制备方法和应用 |
| GB2614813A (en) | 2020-05-08 | 2023-07-19 | Harvard College | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
-
2014
- 2014-04-14 CN CN201410149287.4A patent/CN103923911B/zh active Active
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107858373A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-03-30 | 山东省千佛山医院 | 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法 |
| CN107858373B (zh) * | 2017-11-16 | 2020-03-17 | 山东省千佛山医院 | 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103923911A (zh) | 2014-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103923911B (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA | |
| CN103820454B (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA | |
| CN103911376B (zh) | CRISPR‑Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA | |
| CN103820441B (zh) | CRISPR‑Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA | |
| AU2015299850B2 (en) | Genome editing using Campylobacter jejuni CRISPR/CAS system-derived RGEN | |
| WO2016197355A1 (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性靶向SALL1基因的sgRNA | |
| CN105518135B (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA | |
| WO2016197354A1 (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪PDX1基因的方法及用于特异性靶向PDX1基因的sgRNA | |
| CN105518139B (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪FGL2基因的方法及用于特异性靶向FGL2基因的sgRNA | |
| WO2016197356A1 (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-2基因的方法及用于特异性靶向SLA-2基因的sgRNA | |
| WO2016197357A1 (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-3基因的方法及用于特异性靶向SLA-3基因的sgRNA | |
| WO2016197360A1 (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪GFRA1基因的方法及用于特异性靶向GFRA1基因的sgRNA | |
| JP2020188757A (ja) | Ｈｉｖ感染のｒｎａガイド処置のための方法および組成物 | |
| WO2016187904A1 (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA | |
| JP2022001047A (ja) | Ｈｉｖ−１感染と複製に必須な遺伝子を切断するｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓの構築物のレンチウイルスによる送達 | |
| CN105886498A (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA | |
| WO2016197359A1 (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-1基因的方法及用于特异性靶向SLA-1基因的sgRNA | |
| EP2966170A1 (en) | HBV inactivation | |
| WO2016197361A1 (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA | |
| WO2016197362A1 (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因的方法及用于特异性靶向vWF基因的sgRNA | |
| AU2017211062A1 (en) | Methods and compositions for RNA-guided treatment of HIV infection | |
| CN105316324A (zh) | 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用 | |
| CN105331607A (zh) | 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用 | |
| WO2016161004A1 (en) | Compositions comprising talens and methods of treating hiv | |
| CN113227367B (zh) | 用cas12a蛋白进行基因组工程的组合物和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160219 Address after: 201203 Shanghai city Chinese (Shanghai) free trade zone 351 GuoShouJing Road No. 2 building A679-05 room Applicant after: HUANG XINGXU Address before: 210061, No. twelve, Xuefu Road, Pukou hi tech Development Zone, Jiangsu, Nanjing Applicant before: Huang Xingxu |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20161017 Address after: 210061, No. twelve, Xuefu Road, Pukou hi tech Development Zone, Jiangsu, Nanjing Patentee after: Huang Xingxu Address before: Shanghai city Chinese (Shanghai) free trade zone 351 GuoShouJing Road No. 2 building A679-05 room Patentee before: HUANG XINGXU |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180620 Address after: 510660 room 227, A 227, Shi Huan Road, Tianhe District, Guangzhou, Guangdong. Patentee after: Esoteric Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd. Address before: 210061 twelve Xuefu Road, Pukou hi tech Development Zone, Nanjing, Jiangsu. Patentee before: Huang Xingxu |
|
| TR01 | Transfer of patent right |