CN107541525B - 一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用CRISPER‑Cas9系统介导完成山羊Tβ4基因定点敲入，其是依据山羊的CCR5基因序列，构建基于CRISPER‑Cas9系统的gRNA表达载体及Tβ4同源重组载体。然后将优化后的CRISPER‑Cas9载体和构建的gRNA表达载体及Tβ4同源重组载体共同转入山羊骨骼肌卫星细胞中，获得Tβ4基因定点敲入的细胞。本发明所构建的基于CRISPER‑Cas9系统的打靶载体为山羊Tβ4基因的定点敲入提供了一种简单快捷安全的途径。该方法在细胞系筛选过程中没有涉及任何筛选标记基因，从而大大提高了转基因动物的安全性，对山羊的遗传育种以及基因功能的研究具有重要价值。

Description

一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学及动物遗传育种领域，具体地说，涉及CRISPER-Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法。

背景技术

CRISPR-Cas9作为一项基因定点修饰技术，近些年来发展迅速。该技术基于规律性短重复回文序列簇（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）和 Cas9核酸酶（CRISPR associated system9，Cas9），是存在于细菌和古生菌的获得性免疫系统，通过其转录产物crRNA(CRISPR RNA)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated, Cas)，尤其是Cas9蛋白，可以有效的帮助菌体抵抗外源DNA的侵染。基于该原理CRISPR-Cas9系统被改造成第三代基因编辑技术，该技术由一种短小RNA引导对 DNA 进行修饰，将DNA双链切开造成缺口，然后通过细胞的自我修复或是在外源基因存在下的同源重组修复，来实现基因的定点突变或定点敲入。该技术目前已经成功应用于多项研究，和其他同类技术相比，该技术表现出了明显的优势和广阔的应用前景。

作为毛纺产业的优质原材料，山羊所产的羊绒纤细柔软。但如今在山羊育种过程中存在为提高羊绒产量盲目杂交，造成羊绒质量降低等问题，亟待以现代生物技术实现品种改良。

胸腺素β4 (Thymosin beta 4,Tβ4) 可以诱导毛囊形成进而调节哺乳动物毛发生长，加速毛囊干细胞的分化、迁移，还可通过促进血管生成达到间接促进毛发生长的作用。本实验在安全位点CCR5基因上用KAP6-1作为目的基因Tβ4的毛囊特异表达的启动子,使得Tβ4基因只在毛囊细胞中表达,既可以加速山羊毛囊的形成进而提高羊绒产量,又可以防止外源基因在山羊的其他组织中表达，阻止其产生发育生长异常现象。

利用CRISPER-Cas9系统介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供CRISPER-Cas9系统介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的CRISPER-Cas9系统介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法，其是依据山羊CCR5基因序列（ NC-022314.1），在CCR5基因的第二外显子上设计靶序列，构建基于CRISPER-Cas9系统的gRNA表达载体,并构建Tβ4同源重组载体。然后将优化后的CRISPER-Cas9载体和gRNA表达载体及Tβ4同源重组载体共同转入山羊骨骼肌卫星细胞中，获得山羊Tβ4基因定点敲入的细胞系。

本发明中述及的山羊包括但不限于阿尔巴斯绒山羊

前述的方法，gRNA作用靶位点位于山羊CCR5基因的2号外显子上。sgRNA作用位点的DNA序列为5 ′- TCGTGGGGGAGAAGTTCCGA -3 ′。

前述的方法，所述的CRISPER-Cas9载体（即hCas9质粒）的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示（ hCas9质粒图谱见图1）；所述sgRNA表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示（sgRNA质粒图谱见图3）；所述Tβ4同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示（ Tβ4同源重组载体质粒图谱见图5）。

本发明还提供根据上述方法获得山羊Tβ4基因定点敲入的细胞系。

本发明进一步提供上述方法在制备Tβ4基因定点敲入的克隆山羊的应用。该应用是指将所述山羊Tβ4基因定点敲入的细胞为核移植供体细胞，离体的山羊卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得山羊克隆胚胎，然后将克隆胚胎通过胚胎移植技术移入受体山羊子宫内进行妊娠，获得Tβ4基因定点敲入的山羊。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

1）CRISPER-Cas9载体的优化；2）根据山羊的CCR5基因序列，构建基于CRISPER-Cas9系统的gRNA表达载体；3）构建Tβ4同源重组载体；4）将上述优化的CRISPER-Cas9载体、gRNA表达载体及Tβ4同源重组载体共同转染到山羊骨骼肌卫星细胞中，通过口吸管法、流式细胞仪法和稀释法筛选单克隆细胞系；5）通过PCR技术鉴定筛选单克隆细胞系，获得Tβ4基因定点敲入的单克隆细胞系。

其中，步骤4）中利用口吸管法挑取单克隆细胞系是指将转染48h后的细胞，用胰蛋白酶消化并用含20%胎牛血清及10%马血清的DMEM/F12培养液重悬，将细胞悬液做成20µL的小液滴，把玻璃管在酒精灯下拉出适合单细胞通过的直径，在显微镜下，用制好的口吸管吸取单个细胞，并接种于预先处理过的96孔板的一个孔中，96孔板提前用0.2%明胶处理，2h小时后，将明胶吸走，待明胶晾干后加培养液放于培养箱中预热。

步骤4）中利用流式细胞仪挑取单克隆细胞系是指转染48h后的细胞，用胰蛋白酶消化，用含20%胎牛血清及10%马血清的DMEM/F12培养液重悬终止消化，离心，弃上清，用PBS清洗细胞，此过程重复三次，最后用1mL PBS重悬细胞，利用流式细胞仪将单个细胞接种于预先处理好的96孔板中。

步骤4）中利用稀释法挑取单克隆细胞系是指将转染48h后的细胞用胰酶消化，终止消化，离心，去上清，用含20%胎牛血清及10%马血清的DMEM/F12培养液重悬制成细胞悬液，将细胞悬液稀释，直至每100µL细胞悬液中含有1-2个细胞，用100µL的移液枪将细胞接种于预先处理好的96孔板中。

步骤5）中鉴定Tβ4基因定点敲入单克隆细胞系主要采用设计扩增包含上游同源臂及启动子区域的上游检测引物及设计扩增包含Tβ4基因及下游同源臂区域的下游检测引物，通过PCR技术扩增并对扩增片段进行测序分析，目的是确定Tβ4基因定点敲入的情况。

本发明利用流式细胞仪法筛选得到124株单克隆细胞系，通过检测引物进行扩增并进行测序分析发现有1株实现定点敲入。利用口吸管法及稀释法筛选得到76株单克隆细胞系，通过检测引物进行扩增并进行测序分析发现有4株实现定点敲入，定点整合效率为5.3%。上游检测结果见图7，下游检测结果见图8。上游检测测序结果如SEQ ID NO:18，下游检测测序结果如SEQ ID NO:19。

本发明具有以下优点。

（一）CRISPR-Cas9基因编辑技术与常规的同源重组技术、TALEN技术和ZFNs技术相比，基因编辑效率显著提高。

(二)在安全位点CCR5基因上设计sgRNA，使得Tβ4基因可以稳定高效的表达且对整合位点周围内源性基因的表达没有影响。

(三) 用KAP6-1作为目的基因Tβ4的毛囊特异表达的启动子,使得Tβ4基因只在毛囊细胞中表达,既可以加速山羊毛囊的形成进而提高羊绒产量,又可以防止外源基因在山羊的其他组织中表达。

(四) 通过CRISPR-Cas9系统的介导，实现了不加任何筛选标记即可筛选出Tβ4基因定点敲入的细胞系，这是传统同源重组技术、TALEN技术和ZFNs技术无法实现的，很大程度提高了转基因动物的安全性。

(五) 通过体细胞核移植技术制备Tβ4基因定点敲入山羊，为构建成熟基因修饰动物的研究和生产奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中hCas9质粒图谱。

图2为本发明实施例2中CRISPR-Cas9系统介导山羊Tβ4基因定点敲入模式图。

图3为本发明实施例2中CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体质粒图谱。

图4为本发明实施例4中利用Surveyor突变检测试剂盒检测靶位点的电泳结果；其中，M:100bp Ladder marker;5:gRNA突变情况。图5为本发明实施例5中Tβ4同源重组载体质粒图谱。图6为本发明实施例6中单克隆细胞图。

图7为本发明实施例7中单克隆细胞的上游检测结果图。

图8为本发明实施例7中单克隆细胞的下游检测结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（ Sambrook J & Russell DW ,Molecular cloning: a laboratory manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中测序工作由华大基因完成。

实施例1 CRISPER-Cas9载体的优化

对购自北京中原公司的CRISPR-Cas9表达载体进行优化，优化的CRISPER-Cas9载体（即hCas9质粒）的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hCas9质粒图谱见图1。

实施例2 gRNA表达载体的构建。

根据山羊的CCR5基因序列（ NC-022314.1），基因序列如SEQ ID NO:2所示。在CCR5基因的第2号外显子序列上设计gRNA序列，并构建基于CRISPER-Cas9系统的gRNA表达载体。gRNA表达载体包括4部分：U6启动子、靶序列、gRNA骨架和终止信号。基于CRISPR-Cas9系统介导山羊Tβ4基因定点敲入模式图见图2 。其中，sgRNA作用位点的DNA序列如下：sgRNA1：5′- TCGTGGGGGAGAAGTTCCGA -3′。利用生物学软件根据sgRNA作用位点设计sgRNA序列，以gRNA-T2为模板用PrimeSTAR^®保真酶进行PCR扩增U6启动子部分和gRNA骨架载体部分，最后，使用整体PCR方法扩增gRNA，对其进行加A尾处理，处理后与PMD-19T载体连接、转化大肠杆菌Trans-110，涂板，12h后，挑取单菌落，摇菌，对菌液进行PCR鉴定，确定阳性后，保菌，送华大基因公司测序，将测序正确的单菌落接种于含Amp的LB培养基中，37℃、220rpm过夜揺菌，提取质粒备用。sgRNA1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体质粒图谱见图3。

实施例3 电穿孔法转染山羊胎儿成纤维细胞。

将胎儿成纤维细胞解冻于100mm的培养皿中，为了使细胞恢复良好的状态和活力，电穿孔法转染前对细胞进行传代。当细胞生长到90%时，用PBS清洗， 0.25%胰蛋白酶消化3min，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液对细胞进行终止消化，用枪反复吹打，避免有细胞团块，将细胞悬液加入到一个10mL离心管中，以1500rpm离心5min，弃上清。用5mLOpti-MEM重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清，此过程重复3遍。最后用Opti-MEM重悬细胞，使每90µL细胞悬液中含有1×10⁶个胎儿成纤维细胞，取90 µL重悬液并加入10µL质粒（CRISPR/Cas9环状质粒5µg、455bp的gRNA 5µg），将100µL混合液加入电击杯中，加入过程中防止气泡产生，然后将电击杯放入电转杯腔中，利用最佳转染条件225V/2.5ms进行细胞转染。转染完成后，加入600ul预热的含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液，用枪头吹打以重悬细胞，在100mm培养皿中加入预热的10mL培养液，将细胞悬液加入培养皿中，37℃、5%C0₂、饱和湿度条件下培养。

实施例4 CRISPER-Cas9系统中sgRNA的活性检测。

将gRNA和 Cas9质粒通过电穿孔法转染山羊胎儿成纤维细胞，提取细胞的基因组DNA，以提取的基因组为模板跨靶序列设计的上、下游引物进行PCR扩增，扩增引物如下CCR5F: GTGGTGGCTATGTTTGCCTCTC, CCR5 R: AGAGCTGATGCCAAATTGATGGATG。扩增体系（50µL）为：预混 Ex Taq 25µL，基因组模板 3µL（小于500ng），上游引物2µL，下游引物2µL，灭菌蒸馏水18µL。反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃10min，16℃30min。扩增得到大小为714bp的DNA片段，配制1％的琼脂糖凝胶，进行电泳检测，胶回收目的条带，胶回收产物逐步退火使其进行DNA杂交，杂交体系为：胶回收产物30µL，10×La PCR Buffer 3µL。杂交程序见表1。

表1 DNA杂交程序

反应温度	反应时间
		95℃	10min
95℃to85℃	-0.2℃/s
		85℃	1min
95℃to85℃	-0.3℃/s
		95℃	1min
85℃to75℃	-0.3℃/s
		75℃	1min
75℃to65℃	-0.3℃/s
		65℃	1min
65℃to55℃	-0.3℃/s
		55℃	1min
55℃to45℃	-0.3℃/s
		45℃	1min
45℃to35℃	-0.3℃/s
		35℃	1min
35℃to25℃	-0.3℃/s
		25℃	1min
4℃	Hold

得到了杂交DNA后，通过用Surveyor突变检测试剂盒来检测突变活性。根据Surveyor突变检测试剂盒的使用说明书来完成实验，具体的反应体系见表2。

表2 Surveyor突变检测体系

样品名称	加样量
		杂交DNA	20µL
0.15MMgCl<sub>2</sub>Solution	3µL
		SURVEYOR Enhancer S	1µL
SURVEYOR Nuclease S	1µL
		Total	25µL

将反应体系配置完毕后，置于42℃反应1小时，最后加入2.5µL的Stop Solution，将上述反应液通过2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的大小。检测结果见图4，结果表明gRNA具有活性，可以介导Cas9对靶位序列进行切割。

实施例5 Tβ4同源重组载体的构建。

靶位点上下游1000bp左右的序列作为同源臂序列，设计含有BglII和BamHI酶切位点的上游同源臂引物及含有SalI和BamHI酶切位点的下游同源臂引物。以山羊胎儿成纤维细胞的基因组为模板，扩增带酶切位点的上游同源臂和下游同源臂，上游同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示，下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。反应体系（50µL）为：La Taq预混酶25µL，上、下游引物（引物序列如SEQ ID NO:7-10所示）各1µL，基因模板2µL，灭菌水21µL。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，反应35个循环；72℃10min，16℃60min。PCR产物进行电泳检测，条带正确，PCR产物胶回收后连入pMD19-T，转化Trans-110，涂板，12h后，挑取单菌落，摇菌，保菌并送华大基因公司测序，测序正确的菌液留用。

在骨架载体pDsRed2-1-Kap6.1-NRP-1的基础上通过酶切连接的方法得到Tβ4同源重组载体，构建顺序及过程如下：用SacI和EcoRI酶切pDsRed2-1-Kap6.1-NRP-1骨架载体，用T4连接酶将Tβ4基因连入酶切后的骨架载体上构成pDsRed2-1-Kap6.1- Tβ4重组质粒。然后用SalI和BamHI酶切pDsRed2-1-Kap6.1-Tβ4重组质粒，胶回收pDsRed2-1-Kap6.1-Tβ4质粒上5513bp大片段，用T4连接酶将下游同源臂连入酶切后回收的质粒片段，连接后转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落摇菌，对重组质粒进行菌液PCR初步鉴定，正确后送华大基因公司测序确定下游同源臂正向连入pDsRed2-1-Kap6.1-Tβ4质粒。

最后，用BglII单酶切重组质粒，酶切过程中加入去磷酸化酶防止质粒末端自连，用T4连接酶将上游同源臂与酶切后的重组质粒连接 (BglII和BamHI为同尾酶)，连接产物转化、涂板、挑取单菌落，摇菌后进行菌液PCR初步鉴定，正确后送华大基因公司测序确定上游同源臂正向连入重组质粒，即Tβ4同源重组载体构建成功。Tβ4同源重组载体质粒图谱见图5，Tβ4同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。

实施例6 单克隆细胞系的筛选。

本实施例旨在筛选Tβ4基因定点敲入单克隆细胞系。

将CRISPR/Cas9环状质粒3µg、455bp的gRNA3µg，线性化的Tβ4同源重组载体4µg(用BglII限制性内切酶将Tβ4同源重组载体酶切后纯化) 通过电穿孔法转染山羊骨骼肌卫星细胞，细胞转染24小时后，用0.25%胰蛋白酶消化2-3分钟，再用含有20%的胎牛血清及10%马血清的DMEM/F12培养液终止消化，并轻轻吹打贴壁细胞，使其脱离培养皿壁形成细胞悬液并收集与10mL离心管中，1500rpm离心5分钟。再用PBS重悬上述细胞，获得Tβ4基因敲入总细胞，并取部分细胞提取基因组DNA，PCR扩增跨靶位点序列并进行测序分析。再通过三种方法挑取单克隆细胞。方法一，利用流式细胞仪分选成单细胞，将单细胞接种于预先平衡后含有细胞培养液的96孔细胞培养板中。方法二，利用口吸管挑取单克隆细胞系，用玻璃管拉制成保证可以使单个细胞通过的合适直径口吸管，在显微镜下无菌操作，将单细胞分别接种于预先平衡后含有细胞培养液的96孔细胞培养板中，进行细胞培养。方法三，用含20%胎牛血清及10%马血清的DMEM/F12培养液重悬制成细胞悬液，将细胞悬液稀释，直至每100µL细胞悬液中含有1-2个细胞，用100µL的移液枪将细胞接种于预先处理好的96孔板中。细胞接种至96孔板后，第10d时，观察细胞（见图6），将汇合度达90%的细胞克隆传代至24孔板中，24h后对细胞进行换液，当细胞生长达到90%以上时，消化，细胞悬液一部分吹入24孔板中继续培养，一部分收样提基因组用于鉴定。

实施例7 单克隆细胞系的鉴定。

以单克隆细胞系的基因组DNA作为模板，以跨上下游同源臂的引物进行PCR扩增。具体的PCR反应引物为：跨上游同源臂鉴定引物F：ACGTGGCTACACAACATCCA，跨上游同源臂鉴定引物R：GCTAAACCAAGTCCCTTATCAACA。跨下游同源臂鉴定引物F：GGAAACGCAAGAGAAAAATCCACT，跨下游同源臂鉴定引物R：TAGGGTGGTGTTCAGCTTACAA。反应体系（25µL）为：La Taq预混酶12.5µL，上、下游引物各1µL，模板DNA 3µL，灭菌水7.5µL。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，反应35个循环；72℃10min，16℃60min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，上游检测结果如图7，下游检测结果如图8。将出现目的条带的送往华大基因公司测序。经测序分析共有5株单克隆细胞系实现了Tβ4基因定点整合。上游检测的测序结果如SEQ ID NO:18所示，下游检测的测序结果如SEQ ID NO:19所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古大学

<120> 一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法

<130> 一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9553

<212> DNA

<213> hCas9质粒

<400> 1

atggtggtgt cgaagtactt gaaggctgca ggcgcgccca agttggtcag agtaaacaag 60

tggataatgt tttctgcctg ctccctgatg ggcttatccc tgtgcttatt gtaagcagaa 120

agcaccttat cgaggttagc gtcggcgagg atcactcttt tggagaattc gcttatttgc 180

tcgatgatct catcaaggta gtgtttgtgt tgttccacga acagctgctt ctgctcatta 240

tcttcgggag accctttgag cttttcatag tggctggcca gatacaagaa attaacgtat 300

ttagagggca gtgccagctc gttacctttc tgcagctcgc ccgcactagc gagcattcgt 360

ttccggccgt tttcaagctc aaagagagag tacttgggaa gcttaatgat gaggtctttt 420

ttgacctctt tatatccttt cgcctcgaga aagtcgatgg ggtttttttc gaagcttgat 480

cgctccatga ttgtgatgcc cagcagttcc ttgacgcttt tgagtttttt agacttccct 540

ttctccactt tggccacaac cagtacactg taagcgactg taggagaatc gaatccgccg 600

tatttcttgg ggtcccaatc ttttttgcgt gcgatcagct tgtcgctgtt ccttttcggg 660

aggatacttt ccttggagaa gcctccggtc tgtacttcgg tctttttaac gatgttcacc 720

tgcggcatgg acaggacctt ccggactgtc gcgaaatccc tacccttgtc ccacacgatt 780

tctcctgttt ctccgtttgt ttcgataagt ggtcgcttcc gaatctctcc attggccagt 840

gtaatctcgg tcttgaaaaa attcataata ttgctgtaaa agaagtactt agcggtggcc 900

ttgcctattt cctgctcaga ctttgcgatc attttcctaa catcgtacac tttatagtct 960

ccgtaaacaa attcagattc aagcttggga tattttttga taagtgcagt gcctaccact 1020

gcattcaggt aggcatcatg cgcatggtgg taattgttga tctctctcac cttataaaac 1080

tgaaagtcct ttctgaaatc tgagaccagc ttagacttca gagtaataac tttcacctct 1140

cgaatcagtt tgtcattttc atcgtacttg gtgttcatgc gtgaatcgag aatttgggcc 1200

acgtgcttgg tgatctggcg tgtctcaaca agctgccttt tgatgaagcc ggctttatcc 1260

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agtttggcgt tcagcagctg ccgccaataa tttttcattt tcttgacaac ttcttctgag 1380

gggacgttat cactcttccc tctattttta tcggatcttg tcaacacttt attatcaata 1440

gaatcatctt tgagaaaaga ctggggcacg atatgatcca cgtcgtagtc ggagagccga 1500

ttgatgtcca gttcctgatc cacgtacatg tccctgccgt tctgcaggta gtacaggtag 1560

agcttctcat tctgaagctg ggtgttttca actgggtgtt ccttaaggat ttgggacccc 1620

agttctttta taccctcttc aatcctcttc atcctttccc tactgttctt ctgtcccttc 1680

tgggtagttt ggttctctcg ggccatctcg ataacgatat tctcgggctt atgccttccc 1740

attactttga cgagttcatc cacgacctta acggtctgca gtattccctt tttgatagct 1800

gggctacctg caagattagc gatgtgctcg tgaagactgt ccccctggcc agaaacttgt 1860

gctttctgga tgtcctcctt aaaggtgaga gagtcatcat ggatcaactg catgaagttc 1920

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cggatcccat tgatcagttt tcttgacagc cgcccccatc ctgtatatcg gcgcctcttg 2040

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tttttgaaat agtcttcttt gagctgtttc acggtaactt tccggttcgt cttgaagagg 2340

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gtgacgtatt tgaccttggt gagctcgtta taaactgtga agtactcgta cagcagagag 2460

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tcttctgatt tgcgagtcat ccacgcgaat ctggaatttc cccgggcgag ggggcctaca 2640

tagtagggta tccgaaatgt gaggattttc tcaatctttt ccctgttatc tttcaaaaag 2700

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aaaatttcct tgtacttctc aggcagttgc tgtctgacaa gggccttcag caaagtcaag 3000

tcttggtggt gctcatcata gcgcttgatc atactagcgc tcagcggagc tttggtgatc 3060

tccgtgttca ctcgcagaat atcactcagc agaatggcgt ctgacaggtt ctttgccgcc 3120

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taggtgtctt tgctcagttg aagcttggca tcttcggcca ggtcgaagtt agatttaaag 3240

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ccagggagct gtgcgatgag gttttcgagc cgccgggatt tggacagcct agcgctcagg 3360

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tcgatgagga agtgtccccg aaatttgatc atatgcgcca gcgcgagata gatcaaccgc 3540

aagtcagcct tatcagtact gtctacaagc ttcttcctca gatgatatat ggttgggtac 3600

ttttcatggt acgccacctc gtccacgata ttgccaaaga ttgggtggcg ctcgtgcttt 3660

ttatcctcct ccaccaaaaa ggactcctcc agcctatgga agaaagagtc atccacctta 3720

gccatctcat tactaaagat ctcctgcagg tagcagatcc gattctttct gcgggtatat 3780

ctgcgccgtg ctgttctttt gagccgcgtg gcttcggccg tctccccgga gtcgaacagg 3840

agggcgccaa tgaggttctt ctttatgctg tggcgatcgg tattgcccag aactttgaat 3900

tttttgctcg gcaccttgta ctcgtccgta atgacggccc agccgacgct gtttgtgccg 3960

atatcgagcc caatggagta cttcttgtcc atggtggcaa gggttcgatc ctctagagtc 4020

cggaggctgg atcggtcccg gtgtcttcta tggaggtcaa aacagcgtgg atggcgtctc 4080

caggcgatct gacggttcac taaacgagct ctgcttatat agacctccca ccgtacacgc 4140

ctaccgccca tttgcgtcaa tggggcggag ttgttacgac attttggaaa gtcccgttga 4200

ttttggtgcc aaaacaaact cccattgacg tcaatggggt ggagacttgg aaatccccgt 4260

gagtcaaacc gctatccacg cccattgatg tactgccaaa accgcatcac catggtaata 4320

gcgatgacta atacgtagat gtactgccaa gtaggaaagt cccataaggt catgtactgg 4380

gcataatgcc aggcgggcca tttaccgtca ttgacgtcaa tagggggcgt acttggcata 4440

tgatacactt gatgtactgc caagtgggca gtttaccgta aatactccac ccattgacgt 4500

caatggaaag tccctattgg cgttactatg ggaacatacg tcattattga cgtcaatggg 4560

cgggggtcgt tgggcggtca gccaggcggg ccatttaccg taagttatgt aacgcggaac 4620

tccatatatg ggctatgaac taatgacccc gtaattgatt actattaata actagtcaat 4680

aatcaatgtc aacgcgtata tctggcccgt acatcgcgaa gcagcgcaaa acgcctaacc 4740

ctaagcagat tcttcatgca attgtcggtc aagccttgcc ttgttgtagc ttaaattttg 4800

ctcgcgcact actcagcgac ctccaacaca caagcaggga gcagatactg gcttaactat 4860

gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccataggg gatcgggaga tctcccgatc 4920

cgtcgacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 4980

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 5040

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 5100

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 5160

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 5220

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 5280

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 5340

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 5400

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 5460

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 5520

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 5580

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 5640

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 5700

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 5760

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 5820

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 5880

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 5940

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 6000

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 6060

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 6120

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 6180

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 6240

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 6300

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 6360

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 6420

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 6480

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 6540

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 6600

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 6660

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 6720

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 6780

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 6840

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 6900

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 6960

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 7020

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 7080

accatgatta cgccaagctc tagctagagg tcgacggtat acagacatga taagatacat 7140

tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 7200

ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttggggtggg 7260

cgaagaactc cagcatgaga tccccgcgct ggaggatcat ccagccggcg tcccggaaaa 7320

cgattccgaa gcccaacctt tcatagaagg cggcggtgga atcgaaatct cgtgatggca 7380

ggttgggcgt cgcttggtcg gtcatttcgc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg 7440

tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg 7500

aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct 7560

atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg 7620

ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg 7680

ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc 7740

tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg 7800

atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc 7860

cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga 7920

tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg 7980

agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc 8040

tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc 8100

gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag 8160

ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc 8220

atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tcagatccga aaatggatat acaagctccc 8280

gggagctttt tgcaaaagcc taggcctcca aaaaagcctc ctcactactt ctggaatagc 8340

tcagaggcag aggcggcctc ggcctctgca taaataaaaa aaattagtca gccatggggc 8400

ggagaatggg cggaactggg cggagttagg ggcgggatgg gcggagttag gggcgggact 8460

atggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg 8520

gactttccac acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct 8580

ggggagcctg gggactttcc acaccctaac tgacacacat tccacagaat taattcgcgt 8640

taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt 8700

ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc 8760

cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg 8820

gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac 8880

taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg 8940

tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag 9000

cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt 9060

ggggataccc cctagagccc cagctgcgca gatctgctat ggcagggcct gccgccccga 9120

cgttggctgc gagccctggg ccttcacccg aacttggggg gtggggtggg gaaaaggaag 9180

aaacgcgggc gtattggccc caatggggtc tcggtggggt atcgacagag tgccagccct 9240

gggaccgaac cccgcgttta tgaacaaacg acccaacacc cgtgcgtttt attctgtctt 9300

tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc ggtattgtct ccttccgtgt ttcagttagc 9360

ctcccccgtt taaactcatt actaaccggt agggatcgaa ccctttcaca ccttcctctt 9420

cttcttgggg tcagccctgc tgtctccacc gagctgagag aggtcgattc ttgtttcata 9480

gagccccgta attgactgat gaatcagtgt ggcgtccagg acctcctttg tagaggtgta 9540

ccgctttctg tct 9553

<210> 2

<211> 3868

<212> DNA

<213> CCR5基因组序列

<400> 2

ccaactcaga agaaactgca tttcctactt ttatgctgtc tatatgtttg acttgcacag 60

ctcagctggt cagaggagtt gagacatccg ttcccctacg agaatctctc tcggtaagtt 120

ctctctcagc taactttgcc tatttcttag cgcagcttga gtgatgagta aaagccttta 180

caggaaacca tagaaaacat cagaaataca ccaggcgttc actgaactat cttaaactat 240

aatctttaag taaggaaaaa gttaagagtt tagaatcagt ttcagactgt gataacatca 300

aagatacaaa acaggattat gaatggaaga ctataaaaag ccctcacctt tcaaaagaaa 360

gatattttcg gagaataatt actggccaaa actttgacag acatgatctt ttggttagga 420

gaaataaaac ctcctcagca ggatgccctc tgaacatgtg cccaaccaca agctgtgtct 480

aagtctcctt ttatttctgc caaggaaaga aggaagcctg aaaattggcc aaattaataa 540

caagttataa atatcaaatc aactttcata gcaaatctag ttgattcttt ttctggctca 600

gaatttaaag gagagatttt tctgtgagct tttcccagct gcttaatctg aggtactggg 660

agcttgagtc tcacagggac taattagaga aaattctcag tcaagcggtg ggacctaaat 720

agaccaggca agttagtggg ttgcgaagga acaaagctaa tacaggatgt atgctaggag 780

atgaaacact gtccacttga ccacttctta tgtattaggg gagggggtcc ttaatcatag 840

cagctcagaa actacaaaca caaacttcag agaaaatgtg agaatgggaa tcgggacttg 900

acaactggct gctggctcct atgaccttct ccagggactc gggcatcagt ctgtctcatt 960

ttgactacat caaggctcca ggctgacaat cctgcttgta gttctctcac caaggagtga 1020

aagacaggga ccacagcaga taagttacag tcagcactgc ctgccttcaa aattagttgc 1080

ttactccctg tgggtctttg gggaagttac tcatcttctc tgtgctctga ggttcttatt 1140

tgcaaaacgg ggacaataaa cctgacctgc ctcactgagt caccttgagg attaactgaa 1200

tgaatgaagt gaagcttaga acagtgctta gcaagcaaag tgccctagag aactgttcat 1260

tatcaccagc aagcccctaa tgatgctatg tgtaagctaa ctccagggaa tgacagtaag 1320

aacagacacg gttggacagt tcctgaccca gtttctggac attgttatca cagcttcatt 1380

cactgcacgt ggctacacaa catccaattt tatttggtga gatgattgat gctctccgtc 1440

tagtaaacag agtgttagtc gctcaggcgt gtctgactct tatgacccca tggattgtag 1500

cccaccaggc tccactgacc atggaattct ccaggcaaga atactggagt gggttgccat 1560

ttccttctcc aggggatctt cccaacccag ggatcgaatc caggtctcct gcattgcagg 1620

cagattcttt accatctgag ccaccacgga aacccaaagc agagaagcta gcagcaaact 1680

aatataaaaa gttcactgtt tgacaaaaaa aaggacttca gttaaatgta gaaatctacg 1740

tatcaatttt taaaacctac ttaagtatat aaaacggttt gcattcatga tggactgcta 1800

aggacattct aggactttat aaaacacctt ttctttattt acagagtcaa gcaaaatgga 1860

ttatcaaaca tcaactcccc tctatgacat tgattatggg atgtcagagc catgccaaaa 1920

aatcaacgtg aggcaaattg caggccagct cttgccccca ctctactcgc tggtgttcat 1980

ctttggtttt gtgggcaact tgctggttgt cctcatcctg ataaactgca aaaagctgaa 2040

gagcatgact gacatctatc tgctcaactt ggccatctct gacctacttt tcatcatcac 2100

tatcccattc tgggctcact acgctgcaga ccagtgggta tttggaaata caatgtgcca 2160

gttattcaca gggttctatt tcattggtta ttttggtgga atcttcttca tcatcctctt 2220

gacaatcgat aggtacctgg ctatcgttca tgctgtgttt gctttaaaag ccagaacagt 2280

cacctttggg gcagtgacaa gtggggtcac gtgggtggtg gctatgtttg cctctctccc 2340

aggaattatc tttaccaaat cccaaaagga aggctctcgt catacgtgca gcccacattt 2400

cccatccaat cagtatcatt tctggaagag tttccaaact ttaaagatag tcatcttggg 2460

gctggtgctg cctctgcttg tcatgatcgt ctgctactcg ggaatcataa aaaccctgct 2520

ccagtgtcgc agcgagaaga agaagcacaa ggctgtgagg ctcatcttcg tgatcatgat 2580

tgtctacttt ctcttctggg ctccctacaa catcgtcctc ctcctgagca ccttccagga 2640

attcttcggc ttgaataact gcagtgactc taacaggctg gaccaagcca tgcaggtgac 2700

agagaccctg gggatgacgc actgctgcat caaccccatc atctatgcct tcgtggggga 2760

gaagttccga aactatctcc tacggttctt ccgaaagtac atcgccagcc gcttctgcaa 2820

aggctgtcca gtcttccagg gagaggctcc agagcgagtg agctccgttt acacacgatc 2880

cacgggagaa caggaagtct ctgttggctt gtgatctgac tcagttcata tatgcaaact 2940

gtgggggagc agttcaagag gaaattactg tcaacaaggg tttaagattc atccatcaat 3000

ttggcatcag ctctaaatat attagatatt tcaagcccat caattctaga aagccaaagc 3060

aaaacacgct gatgaaatag caatcttctc accgcccccc tccacataca acaatttatt 3120

ggcaagctct cccctcacta caaaaggttc aatgtttaaa aaaaaaaatc ctcagagaat 3180

tattaattcc tgagtttggt tacctgaaca ggaataacaa aatgaactga ggaaagtatt 3240

gtatagtttc ttatctgggt agggcaatag ccaggttgca aatgtgatta aaataggtcc 3300

ttctcttgcc atggggagaa aagacatgcc ggtgatcaga taaggaatga catcttccat 3360

gtgggatctc tcccaaaagg tacgttaata agttccacag acactgatgc caaggaagag 3420

ccctgtggtc tgctgagagc tgggaaggct tcttcgcaga aaaggtactg gaggccaatg 3480

gtctgtcagc ggagaaggaa gctgagctcc aggatgcagg cactgcacag gcaaaacttg 3540

gctgtgggga gacaggcact ggctggggga gctcctggga ggaaaaatga ggctggtgca 3600

tgagaaaact ggacggcatt gctcatcaaa ttcagagagc agagtgggga gccctggcca 3660

atgttgcaga aagctcattc tgtaaccaaa ggatggcctg gaaaggtgag cattcaggtc 3720

aaggagacca gcaacaatgt gatcaagtga ggaggctcca ctaaagttga agccagagat 3780

gggaaggatg gataccacct cacagcactg aggatgagag ccagcagaat ttggggtgga 3840

tttggcttgg cagtgaaggg cagagagg 3868

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA靶位点

<400> 3

tcgtggggga gaagttccga 20

<210> 4

<211> 455

<212> DNA

<213> gRNA质粒

<400> 4

tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60

gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120

gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180

tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240

gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 300

tggaaaggac gaaacaccgt cgtgggggag aagttccgag ttttagagct agaaatagca 360

agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 420

ttctagaccc agctttcttg tacaaagttg gcatt 455

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 跨靶序列的扩增引物CCR5-F

<400> 5

gtggtggcta tgtttgcctc tc 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 跨靶序列的扩增引物CCR5-R

<400> 6

agagctgatg ccaaattgat ggatg 25

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 上游同源臂引物-F

<400> 7

ggaagatcta ttctttacca tctgagccac ca 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 上游同源臂引物-R

<400> 8

cgcggatcca ggcatagatg atggggttga tg 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 下游同源臂引物-F

<400> 9

acgcgtcgac aactatctcc tacggttctt cc 32

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 下游同源臂引物-R

<400> 10

cgcggatccc ttcactgcca agccaaatcc 30

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 跨上游同源臂鉴定引物F

<400> 11

acgtggctac acaacatcca 20

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 跨上游同源臂鉴定引物R

<400> 12

gctaaaccaa gtcccttatc aaca 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 跨下游同源臂鉴定引物F

<400> 13

ggaaacgcaa gagaaaaatc cact 24

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 跨下游同源臂鉴定引物R

<400> 14

tagggtggtg ttcagcttac aa 22

<210> 15

<211> 1139

<212> DNA

<213> 上游同源臂序列

<400> 15

agatctattc tttaccatct gagccaccac ggaaacccaa agcagagaag ctagcagcaa 60

actaatataa aaagttcact gtttgacaaa aaaaaggact tcagttaaat gtagaaatct 120

acgtatcaat ttttaaaacc tacttaagta tataaaacgg tttgcattca tgatggactg 180

ctaaggacat tctaggactt tataaaacac cttttcttta tttacagagt caagcaaaat 240

ggattatcaa acatcaactc ccctctatga cattgattat gggatgtcag agccatgcca 300

aaaaatcaac gtgaggcaaa ttgcaggcca gctcttgccc ccactctact cgctggtgtt 360

catctttggt tttgtgggca acttgctggt tgtcctcatc ctgataaact gcaaaaagct 420

gaagagcatg actgacatct atctgctcaa cttggccatc tctgacctac ttttcatcat 480

cactatccca ttctgggctc actacgctgc agaccagtgg gtatttggaa atacaatgtg 540

ccagttattc acagggttct atttcattgg ttattttggt ggaatcttct tcatcatcct 600

cttgacaatc gataggtacc tggctatcgt tcatgctgtg tttgctttaa aagccagaac 660

agtcaccttt ggggcagtga caagtggggt cacgtgggtg gtggctatgt ttgcctctct 720

cccaggaatt atctttacca aatcccaaaa ggaaggctct cgtcatacgt gcagcccaca 780

tttcccatcc aatcagtatc atttctggaa gagtttccaa actttaaaga tagtcatctt 840

ggggctggtg ctgcctctgc ttgtcatgat cgtctgctac tcgggaatca taaaaaccct 900

gctccagtgt cgcagcgaga agaagaagca caaggctgtg aggctcatct tcgtgatcat 960

gattgtctac tttctcttct gggctcccta caacatcgtc ctcctcctga gcaccttcca 1020

ggaattcttc ggcttgaata actgcagtga ctctaacagg ctggaccaag ccatgcaggt 1080

gacagagacc ctggggatga cgcactgctg catcaacccc atcatctatg cctagatct 1139

<210> 16

<211> 1100

<212> DNA

<213> 下游同源臂序列

<400> 16

gtcgacaact atctcctacg gttcttccga aagtacatcg ccagccgctt ctgcaaaggc 60

tgtccagtct tccagggaga ggctccagag cgagtgagct ccgtttacac acgatccacg 120

ggagaacagg aagtctctgt tggcttgtga tctgactcag ttcatatatg caaactgtgg 180

gggagcagtt caagaggaaa ttactgtcaa caagggttta agattcatcc atcaatttgg 240

catcagctct aaatatatta gatatttcaa gcccatcaat tctagaaagc caaagcaaaa 300

cacgctgatg aaatagcaat cttctcaccg cccccctcca catacaacaa tttattggca 360

agctctcccc tcactacaaa aggttcaatg tttaaaaaaa aaaatcctca gagaattatt 420

aattcctgag tttggttacc tgaacaggaa taacaaaatg aactgaggaa agtattgtat 480

agtttcttat ctgggtaggg caatagccag gttgcaaatg tgattaaaat aggtccttct 540

cttgccatgg ggagaaaaga catgccggtg atcagataag gaatgacatc ttccatgtgg 600

gatctctccc aaaaggtacg ttaataagtt ccacagacac tgatgccaag gaagagccct 660

gtggtctgct gagagctggg aaggcttctt cgcagaaaag gtactggagg ccaatggtct 720

gtcagcggag aaggaagctg agctccagga tgcaggcact gcacaggcaa aacttggctg 780

tggggagaca ggcactggct gggggagctc ctgggaggaa aaatgaggct ggtgcatgag 840

aaaactggac ggcattgctc atcaaattca gagagcagag tggggagccc tggccagtgt 900

tgcagaaagc tcattctgta accaaaggat ggcctggaaa ggtgagcatt caggtcaagg 960

agaccagcaa caatgtgatc aagtgaggag gctccactaa agttgaagcc agagatggga 1020

aggatggata ccacctcaca gcactgagga tgagagccag cagaatttgg ggtggatttg 1080

gcttggcagt gaagggatcc 1100

<210> 17

<211> 7594

<212> DNA

<213> Tβ4同源重组载体序列

<400> 17

tagttattac tagcgctaga tctattcttt accatctgag ccaccacgga aacccaaagc 60

agagaagcta gcagcaaact aatataaaaa gttcactgtt tgacaaaaaa aaggacttca 120

gttaaatgta gaaatctacg tatcaatttt taaaacctac ttaagtatat aaaacggttt 180

gcattcatga tggactgcta aggacattct aggactttat aaaacacctt ttctttattt 240

acagagtcaa gcaaaatgga ttatcaaaca tcaactcccc tctatgacat tgattatggg 300

atgtcagagc catgccaaaa aatcaacgtg aggcaaattg caggccagct cttgccccca 360

ctctactcgc tggtgttcat ctttggtttt gtgggcaact tgctggttgt cctcatcctg 420

ataaactgca aaaagctgaa gagcatgact gacatctatc tgctcaactt ggccatctct 480

gacctacttt tcatcatcac tatcccattc tgggctcact acgctgcaga ccagtgggta 540

tttggaaata caatgtgcca gttattcaca gggttctatt tcattggtta ttttggtgga 600

atcttcttca tcatcctctt gacaatcgat aggtacctgg ctatcgttca tgctgtgttt 660

gctttaaaag ccagaacagt cacctttggg gcagtgacaa gtggggtcac gtgggtggtg 720

gctatgtttg cctctctccc aggaattatc tttaccaaat cccaaaagga aggctctcgt 780

catacgtgca gcccacattt cccatccaat cagtatcatt tctggaagag tttccaaact 840

ttaaagatag tcatcttggg gctggtgctg cctctgcttg tcatgatcgt ctgctactcg 900

ggaatcataa aaaccctgct ccagtgtcgc agcgagaaga agaagcacaa ggctgtgagg 960

ctcatcttcg tgatcatgat tgtctacttt ctcttctggg ctccctacaa catcgtcctc 1020

ctcctgagca ccttccagga attcttcggc ttgaataact gcagtgactc taacaggctg 1080

gaccaagcca tgcaggtgac agagaccctg gggatgacgc actgctgcat caaccccatc 1140

atctatgcct agatctttca tggggtcact aagagtcggg catgactgag cgacttcact 1200

ttcatgtatc actttcatgc attggagaag gaaatggcaa cgcactccag tgttcttgcc 1260

tggagaatcc cagggctggg ggagcctggt gcactgccat ctctggggtc gcacagagtc 1320

ggacatgact gaagagactt agcagcagca gtagcagcat gttgataagg gacttggttt 1380

agcacattaa taaacataaa tatgttagta tattggatat tttcttagaa tataaatcta 1440

acactaatga acagactagt ttgtataact gtatattcaa tttagaaaaa caagtggaga 1500

aatcagattt caagaaataa ctcctttttg cagtccttca atagaaattg agcataaatg 1560

tgaattagtc attggcatag acagaaaaat ataatgcatt ttgctcagac ttggtttact 1620

ggaaacttta actggttgga ttatgatcaa catcatggga ataaaagata cattgtagtt 1680

tcaatatagg aaagaaactg aatcactgaa gaagataatt tggatcaaga agataagaat 1740

ctttgagtaa aaaggagttg ttagtcttaa gaaaaaaatt ttaacgtttg gtgaaacaaa 1800

ctgaggtcaa gagcaaataa gattaagacc aacaaatata tttctcacta tactgaaggt 1860

gctaggtggt taaaataaaa tgtgtgacct gggacaggac tgtgtaggtg tgagtctgca 1920

tctcctctca ttcaattcct taactggata agaggaatct aaactgagat gtcaacacag 1980

caagcctgct gaatttctct gaggtttcat ctttggttgt gaacaacaag ctaattagtc 2040

cagtcataaa gttagccaat ggcatgaagg tgtggtgggt cacacccaca ctgagagcat 2100

ataaaaggcc ctctgcaggg agaaatgtcc acactcaagt gacacttcta ctctcattct 2160

ctacccgaga acaacctcaa caagcaacac gagctcatgt ctgacaaacc cgatatggct 2220

gagattgaga agttcgataa gtcgaaattg aagaaaacgg aaacgcaaga gaaaaatcca 2280

ctgccttcga aagaaacgat tgaacaggag aagcaagcag gcgagtcgta agaattcaac 2340

ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 2400

aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttag 2460

tcgacaacta tctcctacgg ttcttccgaa agtacatcgc cagccgcttc tgcaaaggct 2520

gtccagtctt ccagggagag gctccagagc gagtgagctc cgtttacaca cgatccacgg 2580

gagaacagga agtctctgtt ggcttgtgat ctgactcagt tcatatatgc aaactgtggg 2640

ggagcagttc aagaggaaat tactgtcaac aagggtttaa gattcatcca tcaatttggc 2700

atcagctcta aatatattag atatttcaag cccatcaatt ctagaaagcc aaagcaaaac 2760

acgctgatga aatagcaatc ttctcaccgc ccccctccac atacaacaat ttattggcaa 2820

gctctcccct cactacaaaa ggttcaatgt ttaaaaaaaa aaatcctcag agaattatta 2880

attcctgagt ttggttacct gaacaggaat aacaaaatga actgaggaaa gtattgtata 2940

gtttcttatc tgggtagggc aatagccagg ttgcaaatgt gattaaaata ggtccttctc 3000

ttgccatggg gagaaaagac atgccggtga tcagataagg aatgacatct tccatgtggg 3060

atctctccca aaaggtacgt taataagttc cacagacact gatgccaagg aagagccctg 3120

tggtctgctg agagctggga aggcttcttc gcagaaaagg tactggaggc caatggtctg 3180

tcagcggaga aggaagctga gctccaggat gcaggcactg cacaggcaaa acttggctgt 3240

ggggagacag gcactggctg ggggagctcc tgggaggaaa aatgaggctg gtgcatgaga 3300

aaactggacg gcattgctca tcaaattcag agagcagagt ggggagccct ggccagtgtt 3360

gcagaaagct cattctgtaa ccaaaggatg gcctggaaag gtgagcattc aggtcaagga 3420

gaccagcaac aatgtgatca agtgaggagg ctccactaaa gttgaagcca gagatgggaa 3480

ggatggatac cacctcacag cactgaggat gagagccagc agaatttggg gtggatttgg 3540

cttggcagtg aagccgcggg cccgggatcc accggtcgcc accatggcct cctccgagaa 3600

cgtcatcacc gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag ggcaccgtga acggccacga 3660

gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggccacaaca ccgtgaagct 3720

gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc cccagttcca 3780

gtacggctcc aaggtgtacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactaca agaagctgtc 3840

cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggcgac 3900

cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg ctgcttcatc tacaaggtga agttcatcgg 3960

cgtgaacttc ccctccgacg gccccgtgat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc 4020

caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc gagacccaca aggccctgaa 4080

gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagtcc atctacatgg ccaagaagcc 4140

cgtgcagctg cccggctact actacgtgga cgccaagctg gacatcacct cccacaacga 4200

ggactacacc atcgtggagc agtacgagcg caccgagggc cgccaccacc tgttcctgta 4260

gcggccgcga ctctagatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt 4320

aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt 4380

taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 4440

aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 4500

ttaaggcgta aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 4560

tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 4620

agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 4680

tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 4740

catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 4800

aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 4860

ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 4920

taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc 4980

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 5040

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtcctg 5100

aggcggaaag aaccagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc 5160

cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa 5220

gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac 5280

catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc 5340

tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc 5400

tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaagatcg 5460

atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt 5520

ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct 5580

gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga 5640

ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg 5700

ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact 5760

ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg 5820

agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct 5880

gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg 5940

gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt 6000

tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg 6060

cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc 6120

ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag 6180

agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt 6240

cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt 6300

cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc 6360

cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca 6420

gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccctagg gggaggctaa ctgaaacacg 6480

gaaggagaca ataccggaag gaacccgcgc tatgacggca ataaaaagac agaataaaac 6540

gcacggtgtt gggtcgtttg ttcataaacg cggggttcgg tcccagggct ggcactctgt 6600

cgatacccca ccgagacccc attggggcca atacgcccgc gtttcttcct tttccccacc 6660

ccacccccca agttcgggtg aaggcccagg gctcgcagcc aacgtcgggg cggcaggccc 6720

tgccatagcc tcaggttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 6780

taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 6840

gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 6900

tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 6960

ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 7020

gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 7080

tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 7140

cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 7200

gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 7260

actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 7320

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 7380

gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 7440

atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 7500

tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 7560

tgattctgtg gataaccgta ttaccgccat gcat 7594

<210> 18

<211> 1499

<212> DNA

<213> 上游检测测序结果

<400> 18

gatgctctcc gtctagtaac agagtgttag tcgctcaggc gtgtctgact cttatgaccc 60

catggattgt agcccaccag gctccactga ccatggaatt ctccaggcaa gaatactgga 120

gtgggttgcc atttccttct ccaggggatc ttcccaaccc agggattgaa tccaggtctc 180

ctgcattgca ggcagattct ttaccatctg agccaccacg gaaacccaaa gcagagaagc 240

tagcagcaaa ctaatataaa aagttcactg tttgacaaaa aaaaggactt cagttaaatg 300

tagaaatcta tgtatcaatt tttaaaacct acttaagtat ataaaacggt ttgcattcat 360

gatggactgc taaggacatt ctaggacttt ataaaacacc ttttctttat ttacagagtc 420

aagcaaaatg gattatcaaa catcaactcc cctctatgac attgattatg ggatgtcaga 480

gccatgccaa aaaatcaacg tgaggcaaat tgcaggccag ctcttgcccc cactctactc 540

gctggtgttc atctttggtt ttgtgggcaa cttgctggtt gtcctcatcc tgataaactg 600

caaaaagctg aagagcatga ctgacatcta tctgctcaac ttggccatct ctgacctact 660

tttcatcatc actatcccat tctgggctca ctacgctgca gaccagtggg tatttggaaa 720

tacaatgtgc cagttattca cagggttcta tttcattggt tattttggtg gaatcttctt 780

catcatcctc ttgacaatcg ataggtacct ggctatcgtt catgctgtgt ttgctttaaa 840

agccagaaca gtcacctttg gggcagtgac aagtggggtc acgtgggtgg tggctatgtt 900

tgcctctctc ccaggaatta tctttaccaa atcccaaaag gaaggctctc gtcatacgtg 960

cagcccacat ttcccatcca atcagtatca tttctggaag agtttccaaa ctttaaagat 1020

agtcatcttg gggctggtgc tgcctctgct tgtcatgatc gtctgctact cgggaatcat 1080

aaaaaccctg ctccagtgtc gcagcgagaa gaagaagcac aaggctgtga ggctcatctt 1140

cgtgatcatg attgtctact ttctcttctg ggctccctac aacatcgtcc tcctcctgag 1200

caccttccag gaattcttcg gcttgaataa ctgcagtgac tctaacaggc tggaccaagc 1260

catgcaggtg acagagaccc tggggatgac gcactgctgc atcaacccca tcatctatgc 1320

ctggatcttt catggggtca ctaagagtcg ggcatggctg agcgacttca ctttcatgta 1380

tcactttcat gcattggaga aggaaatggc aacgcactcc agtgttcttg cctggagaat 1440

cccagggctg ggggagcctg gtgcactgcc atctctgggg tcgcacagag tcggacatg 1499

<210> 19

<211> 1463

<212> DNA

<213> 下游检测测序结果

<400> 19

tcgggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac 60

ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg tgttgggtcg tttgttcata aacgcggggt 120

tcggtcccag ggctggcact ctgtcgatac cccaccgaga ccccattggg gccaatacgc 180

ccgcgtttct tccttttccc caccccaccc cccaagttcg ggtgaaggcc cagggctcgc 240

agccaacgtc gggacggcag gccctgccat aggtcgacaa ctatctccta cggttcttcc 300

gaaagtacat cgccagccgc ttctgcaaag gctgtcagtc ttccagggag aggctccaga 360

gcgagtgagc tccgtttaca cacgatccac gggagaacag gaagtctctg ttggcttgtg 420

atctgactca gttcatatat gcaaactgtg ggggagcagt tcaagaggaa attactgtca 480

acaagggttt aagattcatc catcaatttg gcatcagctc taaatatatt agatatttca 540

agcccatcaa ttctagaaag ccaaagcaaa acacgctgat gaaatagcaa tcttctcacc 600

gcccccctcc acatacaaca atttattggc aagctctccc ctcactacaa aaggttcaat 660

gtttaaaaaa aaaaatcctc agagaattat taattcctga gtttggttac ctgaacagga 720

ataacaaaat gaactgagga aagtattgta tagtttctta tctgggtagg gcaatagcca 780

ggttgcaaat gtgattaaaa taggtccttc tcttgccatg gggagaaaag acatgccggt 840

gatcagataa ggaatgacat cttccatgtg ggatctctcc caaaaggtac gttaataagt 900

tccacagaca ctgatgccaa ggaagagccc tgtggtctgc tgagagctgg gaaggcttct 960

tcgcagaaaa ggtactggag gccaatggtc tgtcagtgga gaaggaagct gagctccagg 1020

atgcaggcac tgcacaggca aaacttggct gtggggagac aggcactggc tgggggagct 1080

cctgggagga aaaatgaggc tggtgcatga gaaaactgga cggcattgct catcaaattc 1140

agagagcaga gtggggagcc ctggccagtg ttgcagaaag ctcattctgt aaccaaagga 1200

tggcctggaa aggtgagcat tcaggtcaag gagaccagca acaatgtgat caagtgagga 1260

ggctccacta aagttgaagc cagagatggg aaggatggat accacctcac agcactgagg 1320

atgagagcca gcagaatttg gggtggattt ggcttggcag tgaagggcag agaggaatca 1380

gagactccct agatttgagg caagcatcag aggtgcccta aaagagacat caagcatgga 1440

aggaggagga ggtttaggtc aaa 1463

Claims (6)

1.一种基于CRISPR-Cas9系统介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法，其特征在于，其是根据山羊的CCR5基因的第2外显子序列，sgRNA靶序列为5′-TCGTGGGGGAGAAGTTCCGA-3′，构建基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体和Tβ4同源重组载体，然后将优化后的CRISPR-Cas9载体和上述构建的sgRNA表达载体及Tβ4同源重组载体共同转入山羊骨骼肌卫星细胞中，获得Tβ4基因定点敲入的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述山羊为阿尔巴斯绒山羊。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA表达载体的核苷酸序列如SEQID NO:4所示，所述CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述方法获得的山羊Tβ4基因定点敲入的细胞系。

5.根据权利要求4所述的山羊Tβ4基因定点敲入的细胞系在制备基因编辑山羊中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，以权利要求5所述山羊Tβ4基因定点敲入的细胞为核移植供体细胞，离体的山羊卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得山羊克隆胚胎，然后将克隆胚胎通过胚胎移植技术移入山羊子宫内妊娠，获得Tβ4基因定点敲入的山羊。

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