CN108359691B - 利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及方法 - Google Patents

利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用mito‑CRISPR/Cas9系统编辑异常线粒体DNA的方法及试剂盒，该试剂盒包括用于人类或鱼类等线粒体DNA片段、打靶线粒体gRNA和mito‑CRISPR/Cas 9表达系统。mito‑CRISPR/Cas 9系统包括线粒体定位信号mNLS和mCas 9蛋白或mCas 9的mRNA及相关表达载体。本发明利用mito‑CRISPR/Cas9系统靶向删除人类和鱼类细胞中异常线粒体DNA，从而使得正常线粒体比例增加，占主导地位，并纠正突变位点从而达到治疗线粒体疾病的目的。

Description

利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及 方法
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及一种利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及方法。
背景技术
线粒体起源于一种变形菌纲，在15亿年前它与单细胞真核生物共生。线粒体是双层膜结构的细胞器，通过氧化磷酸化过程产生大量的ATP用于能量代谢、钙的贮存和细胞凋亡等。一个细胞中含有大量的线粒体，而一个线粒体当中又有几十个线粒体DNA(mtDNA)。mtDNA编码了氧化磷酸化(OXPHOS)系统中的多肽链和必需RNA(2个核糖体RNA和22个转移RNA)，这对细胞内的蛋白翻译至关重要。
通常情况下，突变的线粒体DNA(mtDNA)与正常的mtDNA在线粒体共存的比例很低。一旦突变的mtDNA的拷贝数超过一个阈值，线粒体疾病就会随之发生。生化和临床缺陷的突变mtDNA阈值水平通常在60％-95％的范围内，这取决于突变的严重程度。之前的研究表明，线粒体疾病的治疗可以通过限制内切酶、TALENs和CRISPR/Cas9系统减少有缺陷的mtDNA，从而减少有缺陷的mtDNA的百分比。Tanaka等人运用了一个表达SmaI酶的质粒，切断突变的mtDNA。Bacman等人使用了两种不同的细胞系，分别含有10％和45％的正常的mtDNA，他们发现，在使用14459a-mitoTALEN治疗后，正常的mtDNA比例增加到85％和90％。Jo和他的同事用CRISPR/Cas9也得出了同样的结果。虽然很多方法都可以用于剪切突变的mtDNA，从而使正常线粒体比例上升，但是至今还没有用mito-CRISPR/Cas9拯救线粒体突变的例子。
Morel和他的同事们发现，在果蝇的线粒体体外实验中，用抗生素诱导可以修复断裂的双链DNA。其中非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)被认为是修复断裂双链DNA的两种方式。NHEJ中的很多相关蛋白都在线粒体中合成，而对于HR，一些研究表明，从哺乳动物体细胞中提取的线粒体蛋白质可以催化HR。这就意味着，HR过程可能应用到线粒体DNA的修复。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及方法，用于解决现有技术中异常线粒体DNA敲除系统操作复杂、构建困难等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种用于敲除异常线粒体DNA的试剂盒，包括用于人或斑马鱼线粒体的同源重组DNA片段或表达所述同源重组DNA片段的表达盒或重组载体、外源插入序列ssDNA、mito-CRISPR/Cas 9系统或表达mito-CRISPR/Cas9系统的表达盒或重组载体；所述CRISPR/Cas 9系统包括gRNA和Cas 9或Cas 9的mRNA。
在本发明的一些实施例中，打靶载体mito-CRISPR/Cas9的定位信号序列分别为人线粒体和斑马鱼线粒体定位信号序列，人线粒体定位信号序列如SEQ ID NO.5所示，斑马鱼线粒体定位信号序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一些实施例中，所述外源插入序列ssDNA包括两端25bp的同源臂和打靶线粒体DNA。
在本发明的一些实施例中，所述外源插入序列ssDNA包括人和斑马鱼的ssDNA序列。
在本发明的一些实施例中，人的ssDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一些实施例中，斑马鱼的ssDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第二方面提供两种ssDNA在治疗线粒体DNA疾病中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述ssDNA包括人的ssDNA序列、斑马鱼的ssDNA序列，所述人的ssDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述斑马鱼的ssDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第三方面提供一种利用mito-CRISPR/Cas9系统编辑异常线粒体DNA的方法，包括如下步骤：
步骤A:分别设计人和鱼的线粒体DNA的打靶位点序列，合成gRNA；
步骤B:设计人和鱼的ssDNA序列，其都由两个同源臂和打靶线粒体DNA序列组成；
步骤C:构建pSpCas9(BB)-Mito(mito-CRISPR/Cas9)载体；
步骤D:将pSpCas9(BB)-Mito(mito-CRISPR/Cas9)载体和ssDNA序列转染至人胚肾细胞中；
步骤E:体外转录mito-CAS9mRNA；
步骤F:将鱼的gRNA、CAS9mRNA和ssDNA序列共同注射进待处理鱼类的单细胞期受精卵中，实现编辑线粒体基因组。
在本发明的一些实施例中，所述步骤A中，人的目的打靶基因为ND1(可扩充到其他基因)，打靶位点为紧邻NGG特征序列之前的20bp序列，即为候选的打靶序列。
在本发明的一些实施例中，所述鱼为斑马鱼，斑马鱼的目的打靶基因为Dloop(可扩充到其他基因)，打靶位点为紧邻NGG特征序列之前的20bp序列，即为候选的打靶序列。
在本发明的一些实施例中，所述步骤B中，所述鱼为斑马鱼，人的ssDNA序列如SEQID NO.1，斑马鱼的ssDNA序列SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一些实施例中，所述鱼为线粒体编辑后的斑马鱼。
如上所述，本发明的一种利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及方法，具有以下有益效果：本发明利用mito-CRISPR/Cas9系统靶向敲除或纠正人类和斑马鱼中异常线粒体DNA，从而导致异常线粒体比例减少，达到治疗线粒体疾病的目的。同时采用同源重组的方式将外源单链DNA插入线粒体DNA的靶位点中，实现线粒体基因组编辑。这些研究表明，mito-CRISPR/Cas9介导的同源重组可能是修复人类和其他动物线粒体DNA突变的一种有效方法。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中的产生mito-CRISPR/Cas9载体的结构图。
图2显示为特异性标记人的线粒体的载体与特异性标记人的线粒体的载体的共聚焦结果，绿色是mito-CRISPR/Cas9载体的表达，红色是特异性标记人的线粒体的载体的表达，蓝色是细胞核，红色与绿色完全重合(黄色)证明特异性标记人的线粒体的载体的表达位置就在线粒体。
图3显示为人的ssDNA序列插入到HEK-293T细胞线粒体中的检测结果，包括琼脂糖凝胶电泳结果和测序结果。
图4显示为HEK-293T细胞线粒体拷贝数检测。
图5显示为斑马鱼的ssDNA序列插入到斑马鱼线粒体中的检测结果，包括琼脂糖凝胶电泳结果和测序结果。
图6显示为斑马鱼线粒体拷贝数检测结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所说明的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
本发明采用一种新型的mito-CRISPR/Cas9系统结合两种不同的导向RNA(gRNAs)，分别对人类细胞和斑马鱼的mtDNA进行编辑。在此，我们首先提出了一种直接的活体证据，即由新型的mito-CRISPR/Cas9系统诱导人类细胞和斑马鱼线粒体中的双链DNA断裂可以通过同源重组(HR)介导的外源单链DNA(ssDNA)来修复。结果表明，由异常mtDNA引起的线粒体疾病可以通过mito-CRISPR/Cas9系统介导的HR来治疗。
以下实施例中，天根生化科技(北京)有限公司简称天根公司。
实施例1
一.打靶位点的选择
本发明选择人类线粒体中的ND1基因和斑马鱼线粒体中的Dloop基因。根据CRISPR/CAS9的编辑特点，位点一般为紧邻NGG特征序列之前的20bp序列，所以在ZIFITTargeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx)网站上设计靶位点序列。
二.质粒构建相关元件的选择
本发明中实现线粒体基因修饰的技术包括基因克隆技术、CRISPR/CAS9基因编辑技术和同源重组技术。本发明在实施例中，运用克隆技术将原始载体pSpCas9(BB)-2A-eGFP中的核定位信号替换成线粒体定位信号，实现目的基因的敲除。
此外，同时插入外源单链DNA(ssDNA)，ssDNA序列由20bp的同源臂和loxp序列组成，使之能与基因组中的基因融合，检测这一技术的可行性。
三.基因整合的方法与鉴定
将构建好的mito-CRISPR/Cas9载体和人的ssDNA序列转染到HEK-293T细胞中或者将构建好的ssDNA与mito-CAS9mRNA以及gRNA通过显微注射同时注射到待处理斑马鱼的受精卵中。24h后，PCR检测ssDNA序列。
四.获得线粒体疾病编辑的子代
通过上述操作后可获得疾病症状改善的人细胞系及斑马鱼后代。
实施例1
采用同源重组的方法将外源ssDNA序列插入到人类HEK-293T细胞中
步骤1：构建打靶序列的gRNA序列
首先在NCBI(美国国家生物技术信息中心)的网站上查到人的ND1基因的基因组序列。找到CDs区域，锁定的目标序列为GGGGGTTGGGTATGGGGAGG。
然后，为构建打靶序列gRNA，合成以下引物；
ND1-gRNA-F:ACACCGGGGGTTGGGTATGGGGAGGG
ND1-gRNA-R:AAAACCCTCCCCATACCCAACCCCCG
以终浓度为5μM的ND-gRNA-F和ND-gRNA-R为引物扩增gRNA的DNA序列。
配方如表1所示：
表1
Figure BDA0001578971810000051
PCR程序设计：
第一步：95℃2min；
第二步：95℃20s；
第三步：55℃20s；
第四步：72℃10s；
第五步：返回到第二步，循环35次；
第六步：72℃10min；
反应结束。
步骤2：构建mito-CRISPR/Cas9载体
(1)将原始载体pSpCas9(BB)-2A-GFP(购自addgene)的核定位信号序列替换成线粒体定位信号序列。线粒体定位信号序列如SEQ ID NO.5所示。
(2)酶切
将步骤(1)中的载体线性化处理。步骤如下：取800ng质粒，加入BbsI内切酶1μL，10X缓冲液2μL，余量为ddH20，配成20μL的酶切体系，放在37℃的的水浴锅内酶切2小时。
反应结束后，向体系中加入1/20体积的0.5M EDTA，1/10体积的5M NH4acetate，2倍体积的无水乙醇。混匀，-20℃下冷冻20分钟后取出。放在小离心管中，最高转速离心15分钟。吸取并丢弃上清液，晾干。加入ddH20溶解，保证最终浓度在0.5-1μg/μL。产物中加入浓度为100μg/mL的蛋白酶K和0.5％SDS，在50℃水浴中反应30分钟。将反应产物通过胶回收试剂盒的柱子回收DNA(全式金)。首先，混合3倍体积GSB溶液，加入胶回收柱子，静置1分钟。12,000rpm离心1min。加入500μL漂洗液，14000g离心1分钟。加入45μL水洗脱，12,000rpm离心一分钟，得到线性化产物。
(3)连接
在10μL的连接体系中加入1μL步骤(2)中的线性化产物、2μL步骤1中的gRNA产物、2μL T4连接buffer、0.1μL T4连接酶，加水补足至10μL体系，混匀后22℃恒温1h。
(4)转化涂板，提质粒测序
连接产物转化和涂板：将连接产物加入感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，冰浴30min，加入到42℃水浴锅中30s，立即至于冰上2min，加入800μL的LB培养基，37℃摇床内复苏1h后取出，6000rpm离心3min，弃去500μL上清，将余下部分混匀后涂板，涂在Amp+抗性的平板上，待液体完全干为止，平板放在37℃培养箱中过夜后摇菌提质粒。
提质粒的步骤如下(天根试剂盒)：向吸附柱CP3中加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集管中，向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱，将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加35μL ddH2O，静置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
测序，比对序列，正确的即为构建成功的mito-CRISPR/Cas9载体，其序列如SEQ IDNO.3所示。
(5)检测mito-CRISPR/Cas9载体表达位置
将mito-CRISPR/Cas9载体与mito特异性表达载体共转染到HEK-293T细胞中，24h后共聚焦显微镜确定mito-CRISPR/Cas9载体表达位置与mito载体表达位置一致，如图2所示。
(6)转染
将mito-CRISPR/Cas9载体和ssDNA共转染到HEK-293T细胞中，24h后用CTAB法提取DNA。
步骤3：
1.分子生物学验证
(1)用PCR分子生物学手段，证实ssDNA序列是否精确无误的插入基因组中。提取步骤2(6)的RNA后进行PCR，检测前面接头处与后面接头处，引物设计如下：
ND1F：CCTAATGCTTACCGAACG
LoxpR：TAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
ND1R：GGTCTCTGCTAGTGTGGA
LoxpF：CTTCGTATAGCATACATTATAGC
配方如表2所示。
表2
Figure BDA0001578971810000071
PCR程序设计：
第一步：94℃3min；
第二步：94℃5s；
第三步：60℃15s；
第四步：72℃10s；
第五步：返回到第二步，循环35次；
第六步：72℃10min；
反应结束。
其中，PCR模板来源于HEK-293T细胞的基因组。正向和反向引物由金唯智生物公司合成，其被稀释为10μL的工作浓度。
Figure BDA0001578971810000072
Taq DNA Polymerase kit购自全式金生物公司。总的PCR体积为20μL。反应结束后，PCR管内产物放在4℃冰箱保存或直接进行下一步。
电泳：取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％的琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，测定前接头的产物条带应在300bp左右，测定后接头的产物条带应在350bp左右。切下目的片段的琼脂糖胶。
用购自天根公司的胶回收试剂盒进行胶回收，步骤如下：向胶块中加入等倍体积溶液PN，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。向吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min,12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液,将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干将吸附柱，将CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μLddH2O，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。
(2)连接
在5μL的连接体系中加入0.5μLpMD 19-T Vector(购自TAKARA生物公司)、2μLSolution I、2μLPCR产物、0.5μLH2O，混匀后16℃恒温30min。
(3)转化涂板，鉴定阳性克隆
连接产物转化和涂板：将连接产物加入感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，冰浴30min，加入到42℃水浴锅中45s，立即置于冰上2min，加入800μLLB培养基，37℃摇床内复苏1h后取出，6000rpm离心3min，弃去500μL上清，将余下部分混匀后涂板，涂在Amp+抗性的平板上，待液体完全干为止，平板放在37℃培养箱中过夜。
鉴定阳性克隆：待菌落长出来后，用10μL的枪头挑单菌落，在10μL超纯水中混匀，分别取1μL前接头的PCR产物和1μL后接头的PCR产物做模板，各加入对应的上游引物和下游引物，60℃进行PCR反应35个循环。取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。将琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，测定结果中，前接头的产物条带应在300bp左右，测定后接头的产物条带应在350bp左右，将其判断为阳性菌落。分别加入5mL带5μLAmp+的培养基摇菌，37℃过夜后提质粒。
提质粒的步骤如下(天根试剂盒)：向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集管中，向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱，将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加35μL ddH2O，静置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
(4)用M13-F作为测序引物，进行测序，比对序列，正确的即为插入片段精确地插入到基因组中，如图3所示。
2.Realtime-PCR检测线粒体的拷贝数
提取HEK-293T细胞的RNA，通过实时定量PCR(Realtime-PCR)来检测线粒体的拷贝数。根据图4结果可见，线粒体拷贝数明显降低。
实施例2
采用同源重组的方法将外源ssDNA序列插入到斑马鱼线粒体基因组中
步骤1：构建打靶序列的gRNA序列
首先在NCBI(美国国家生物技术信息中心)的网站上查到斑马鱼的Dloop基因的基因组序列。找到3’UTR区域，锁定的目标序列为GCTTTGTCACATGTATGTAC。
然后，为构建打靶序列gRNA，合成以下引物；
Dloop-gRNA-F:TAATACGACTCACTATAGGGCTTTGTCACATGTATGTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
Dloop-gRNA-R:AGCACCGACTCGGTGCCAC
以带有带有gRNA骨架的质粒为模板，以终浓度为10μM的gRNA-F和gRNA-R为引物扩增gRNA的DNA序列。
配方如表3所示：
表3
Figure BDA0001578971810000091
Figure BDA0001578971810000101
PCR程序设计：
第一步：95℃2min；
第二步：95℃20s；
第三步：55℃20s；
第四步：72℃10s；
第五步：返回到第二步，循环35次；
第六步：72℃10min；
反应结束。
将PCR所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在1％琼脂糖凝胶电泳上加入10％的加样缓冲液混匀后，加入琼脂糖凝胶的样孔中，150V电压15min电泳。
切胶回收步骤(天根试剂盒)：在紫外的照射下，对比参照梯状条带(ladder)，将目的条带(100bp)切下(割胶尽可能的小,提高后续回收效率)，向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；柱平衡：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液,将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附柱，将CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μLddH2O，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。
步骤2：体外转录及RNA回收
将切胶纯化的产物转录成RNA，用mMessage mMachine Kit(购自Ambion公司)进行体外转录；
体系如表4所示：
表4
Figure BDA0001578971810000102
Figure BDA0001578971810000111
将上述混合液放入PCR仪中37℃，3h进行转录。
在RNA转录产物混合液中加入DNA酶(Deoxyribonuclease I，简称DNase I，购自Takara公司)，PCR仪中37℃孵育15min。
RNA的纯化(天根试剂盒)：在RNA样品中加入RNase-Free水补足至100μL，加入350μL溶液RK，充分混匀。加入250μL无水乙醇，充分混匀，立即进行下一步。将上一步所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12,000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR2中加入500μL已加入乙醇的漂洗液RW，室温放置2min后，12,000rpm离心30sec，弃废液，将CR2放入收集管中。12,000rpm离心5min，去除残余液体。将吸附柱CR2转入一个新离心管中，加14μL RNase-Free水，室温放置2min后，12,000rpm离心2min。得到gRNA放于-80℃保存。
步骤3：斑马鱼中mito-CRISPR/Cas9载体的建立、体外转录和RNA回收
(1)将原始载体pSpCas9(BB)-2A-GFP(购自addgene)的核定位信号序列替换成斑马鱼线粒体定位信号序列。线粒体定位信号序列如SEQ ID NO.6所示，构建成功的载体序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)PCR扩增
用以下引物PCR扩增mito-CAS9序列：
mito-CAS9-F:TTAATACGACTCACTATAGGGGACCGGTGCCACCATGGACTA
mito-CAS9-R:TCCCCAGCATGCCTGCTATT
配方如表5所示。
表5
Figure BDA0001578971810000112
PCR程序设计：
第一步：94℃3min；
第二步：94℃10s；
第三步：60℃15s；
第四步：72℃10s；
第五步：返回到第二步，循环35次；
第六步：72℃10min；
反应结束。
将PCR所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在1％琼脂糖凝胶电泳上加入10％的加样缓冲液混匀后，加入琼脂糖凝胶的样孔中，150V电压15min电泳。
切胶回收步骤(天根试剂盒)：在紫外的照射下，对比参照梯状条带(ladder)，将目的条带(4100bp)切下(割胶尽可能的小,提高后续回收效率)，向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干将吸附柱，将CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μLddH2O,室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。
(3)体外转录
用mMessage mMachine Kit(购自Ambion公司)进行体外转录，步骤如下。
按照表6所示配方：
表6
用量 组分
10μL 2×NTP/CAP
2μL 10×缓冲液
0.1μg-1μg 线性模板DNA
2μL 酶混合液
至20μL 无核酸酶水
将上述混合液放入PCR仪中37℃,3h进行转录。
向RNA产物加入祛DNA酶，PCR仪中37℃15min。
RNA的纯化(天根试剂盒)：在RNA样品中加入RNase-Free水补足至100μL，加入350μL溶液RK，充分混匀。加入250μL无水乙醇，充分混匀，立即进行下一步。将上一步所得溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12,000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液。向吸附柱CR2中加入500μL已加入乙醇的漂洗液RW，室温放置2min后，12,000rpm离心30sec，弃废液，将CR2放入收集管中。12,000rpm离心5min，去除残余液体。将吸附柱CR2转入一个新离心管中，加14μL RNase-Free水，室温放置2min后，12,000rpm离心2min。得到gRNA放于-80℃保存。
步骤4：显微注射受精卵
收卵：
在喂完晚餐30分钟后，在交配盒中，加入雌雄比2:1、总数不多于八条的斑马鱼，用隔板将雌雄分开，放入三分之二的养鱼水。第二天早晨抽去隔板，雄鱼开始追逐雌鱼，一般在15分钟雌鱼开始排卵，雄鱼将精子排入水中使卵受精，收集卵到平板培养皿中，去除死卵和杂物，用养鱼水洗涤几次，等待注射。
注射：
制备注射皿，将30mL的2％琼脂糖加热融化，倒入直径10cm的玻璃皿中，将模具轻轻覆盖于脚面，待胶凝固后，移走模具。加入少量养鱼水，保持界面湿润。准备注射针，将外径为1.02mm、内径为0.58mm的玻璃毛细管用拉针仪拉成针形。
受精卵排出后，再过约10分钟，卵膜膨胀，随后数分钟内细胞形态变得规整，此时可以开始注射。用无齿镊在体视镜的最高倍放大率下将针头折断少许，尽量断成斜切面。用微量上样吸头吸取1-5μL胚胎纤维注射液从针尾穿入注射针上样，随后将注射针插入持针器中固定。将胚胎清洗后，放入注射模具中，排列成行，吸去多余的液体，使液面刚刚没过鱼卵。
注射时，注射针从胚胎动物极插入到细胞质中和从卵黄中穿过抵达胞质中。将mito-CRISPR/Cas9mRNA(稀释至300ng/μL)、gRNA(20ng/μL)和ssDNA(20ng/μL)共同打入斑马鱼的单细胞期受精卵中。每枚卵注射25pg mito-CRISPR/Cas9mRNA、25pg gRNAmRNA、25pgssDNA。用针尖拨动注射凹槽中的胚胎使细胞质方向与针尖方向一致或者相对，与水平面约成45°下针，扎入到位后踩动踏板注射，略保持后迅速退针，整个过程注意手不要抖动。
注射结束后，将胚胎移至含有养鱼水的10cm培养皿中，再转移到28.5℃的环境中培养，等待孵化。这段时间需要定期检测，去除死胚胎和脱下的卵膜，并更换养鱼水。大约到4-5天时，胚胎可以进食草履虫，此时应转移至小鱼喂养盒中。幼鱼12天起可以开始用草履虫和卤水混合喂养，注意及时清理鱼缸，保持水质良好。待幼鱼全部吃卤水时(此时幼鱼的腹部呈红色)，可转入鱼房喂养。
步骤5：嵌合体F0的筛选与鉴定
1.分子生物学验证
(1)用PCR分子生物学手段，证实ssDNA序列是否精确无误地插入基因组中。挑出10条左右的幼鱼，提取基因组后进行PCR，检测前面接头处与后面接头处，引物设计如下：
DL1F：ATAAGGCACTCCAATG
LoxpR：TAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT
DL1R：CCAGATACCAGGAATAG
LoxpF：CTTCGTATAGCATACATTATAGC
配方如表7所示。
表7
Figure BDA0001578971810000141
PCR程序设计：
第一步：94℃3min；
第二步：94℃5s；
第三步：60℃15s；
第四步：72℃10s；
第五步：返回到第二步，循环35次；
第六步：72℃10min；
反应结束。
其中，PCR模板来源于斑马鱼的基因组。正向和反向引物由金唯智生物公司合成，其被稀释为10μL的工作浓度。
Figure BDA0001578971810000142
Taq DNA Polymerase kit购自于全式金生物公司。总的PCR体积为20μL。反应结束后，PCR管内产物放在4℃冰箱保存或直接进行下一步。
电泳：取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。将琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，测定前接头的产物条带应在200bp左右，测定后接头的产物条带应在150bp左右。切下目的片段的琼脂糖胶。
用购自天根的胶回收试剂盒，进行胶回收，步骤如下：向胶块中加入等倍体积溶液PN，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。向吸附柱CA2中加入500μL平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干将吸附柱，将CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μLddH2O,室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。
(2)连接
在5μL的连接体系中加入0.5μL的pMD 19-T Vector(TAKARA生物公司)2μLSolution I、2μLPCR产物、0.5μLH2O，混匀后，16℃恒温30min。
(3)转化涂板，鉴定阳性克隆
连接产物转化和涂板：将连接产物加入感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，冰浴30min，加入到42℃水浴锅中45s，立即至于冰上2min,加入800μL的LB培养基，37℃摇床内复苏1h后取出，6000rpm离心3min，弃去500μL上清，将余下部分混匀后涂板，涂在Amp+抗性的平板上，待液体完全干为止，平板放在37℃培养箱中过夜。
鉴定阳性克隆：待菌落长出来后，用10μL的枪头挑单菌落，在10μL超纯水中混匀，分别取1μL前接头的PCR产物和1μL后接头的PCR产物做模板，各加入对应的上游引物和下游引物，60℃进行PCR反应35个循环。取PCR产物，加入10％的加样缓冲液(loading buffer)混匀，加入配好的1％琼脂糖凝胶的样槽中，150V恒压15min电泳。把琼脂糖凝胶放在紫外照射下，对比参照梯状条带(ladder)，测定结果中，前接头的产物条带应在200bp左右，测定后接头的产物条带应在150bp左右，判断为阳性菌落。分别加入5mL带5μLAmp+的培养基摇菌，37℃过夜后提质粒。
提质粒的步骤如下(天根试剂盒)：向吸附柱CP3中加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3中，12,000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱CP3放入收集管中，向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加35μL ddH2O，静置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
(4)用M13-F作为测序引物，进行测序，比对序列，正确的即为插入片段精确地插入到基因组中，如图5所示。
Realtime-PCR检测线粒体的拷贝数
选取已剪尾鉴定的将重组片段精准插入基因组的可遗传F0代斑马鱼，用F0与野生型斑马鱼产卵，提取斑马鱼卵的RNA，通过实时定量PCR(Realtime-PCR)来检测线粒体的拷贝数。根据图6结果可见，线粒体拷贝数明显降低。
综上所述，本发明利用mito-CRISPR/Cas9系统靶向删除人类和鱼类细胞中异常线粒体DNA，从而使得正常线粒体比例增加，占主导地位，并纠正突变位点，从而达到治疗线粒体疾病的目的。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院重庆绿色智能技术研究院
<120> 利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及方法
<130> PCQLS181664
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人的ssDNA序列
<400> 1
ccatcgctct tctactatga acccataact tcgtatagca tacattatag caatttatag 60
tacttggtca acctcaacct aggcctcc 88
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 斑马鱼的ssDNA序列
<400> 2
tacatatgtg tggatacaca cgtatgtata acttcgtata gcatacatta tagcaattta 60
ttggttacat attatgcatg tattagga 88
<210> 3
<211> 9355
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 含有人线粒体核定位信号序列的mito-CRISPR/Cas9载体
<400> 3
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360
agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420
aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 900
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 960
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc 1020
tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 1080
accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 1140
ctgagcaaga ggtaagggtt taagggatgg ttggttggtg gggtattaat gtttaattac 1200
ctggagcacc tgcctgaaat cacttttttt caggttggac cggtgccacc atggactata 1260
aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat gacgataaga 1320
tggccatgtc cgtcctgacg ccgctgctgc tgcggggctt gacaggctcg gcccggcggc 1380
tcccagtgcc gcgcgccaag atccattcgt tgggtatcca cggagtccca gcagccgaca 1440
agaagtacag catcggcctg gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc gtgatcaccg 1500
acgagtacaa ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg caacaccgac cggcacagca 1560
tcaagaagaa cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc gaggccaccc 1620
ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa gaaccggatc tgctatctgc 1680
aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag cttcttccac agactggaag 1740
agtccttcct ggtggaagag gataagaagc acgagcggca ccccatcttc ggcaacatcg 1800
tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga aagaaactgg 1860
tggacagcac cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc cacatgatca 1920
agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc gacgtggaca 1980
agctgttcat ccagctggtg cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac cccatcaacg 2040
ccagcggcgt ggacgccaag gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc agacggctgg 2100
aaaatctgat cgcccagctg cccggcgaga agaagaatgg cctgttcgga aacctgattg 2160
ccctgagcct gggcctgacc cccaacttca agagcaactt cgacctggcc gaggatgcca 2220
aactgcagct gagcaaggac acctacgacg acgacctgga caacctgctg gcccagatcg 2280
gcgaccagta cgccgacctg tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc atcctgctga 2340
gcgacatcct gagagtgaac accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc tctatgatca 2400
agagatacga cgagcaccac caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg cggcagcagc 2460
tgcctgagaa gtacaaagag attttcttcg accagagcaa gaacggctac gccggctaca 2520
ttgacggcgg agccagccag gaagagttct acaagttcat caagcccatc ctggaaaaga 2580
tggacggcac cgaggaactg ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg cggaagcagc 2640
ggaccttcga caacggcagc atcccccacc agatccacct gggagagctg cacgccattc 2700
tgcggcggca ggaagatttt tacccattcc tgaaggacaa ccgggaaaag atcgagaaga 2760
tcctgacctt ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc caggggaaac agcagattcg 2820
cctggatgac cagaaagagc gaggaaacca tcaccccctg gaacttcgag gaagtggtgg 2880
acaagggcgc ttccgcccag agcttcatcg agcggatgac caacttcgat aagaacctgc 2940
ccaacgagaa ggtgctgccc aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc gtgtataacg 3000
agctgaccaa agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc ctgagcggcg 3060
agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg accgtgaagc 3120
agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa atctccggcg 3180
tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga tctgctgaaa attatcaagg 3240
acaaggactt cctggacaat gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc gtgctgaccc 3300
tgacactgtt tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat gcccacctgt 3360
tcgacgacaa agtgatgaag cagctgaagc ggcggagata caccggctgg ggcaggctga 3420
gccggaagct gatcaacggc atccgggaca agcagtccgg caagacaatc ctggatttcc 3480
tgaagtccga cggcttcgcc aacagaaact tcatgcagct gatccacgac gacagcctga 3540
cctttaaaga ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc ctgcacgagc 3600
acattgccaa tctggccggc agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag acagtgaagg 3660
tggtggacga gctcgtgaaa gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc gtgatcgaaa 3720
tggccagaga gaaccagacc acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag agaatgaagc 3780
ggatcgaaga gggcatcaaa gagctgggca gccagatcct gaaagaacac cccgtggaaa 3840
acacccagct gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg cgggatatgt 3900
acgtggacca ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac catatcgtgc 3960
ctcagagctt tctgaaggac gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga agcgacaaga 4020
accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg aagaactact 4080
ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat ctgaccaagg 4140
ccgagagagg cggcctgagc gaactggata aggccggctt catcaagaga cagctggtgg 4200
aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg aacactaagt 4260
acgacgagaa tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag tccaagctgg 4320
tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac aactaccacc 4380
acgcccacga cgcctacctg aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa aagtacccta 4440
agctggaaag cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg aagatgatcg 4500
ccaagagcga gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac agcaacatca 4560
tgaacttttt caagaccgag attaccctgg ccaacggcga gatccggaag cggcctctga 4620
tcgagacaaa cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat tttgccaccg 4680
tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag gtgcagacag 4740
gcggcttcag caaagagtct atcctgccca agaggaacag cgataagctg atcgccagaa 4800
agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctattctg 4860
tgctggtggt ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt gtgaaagagc 4920
tgctggggat caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc gactttctgg 4980
aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct aagtactccc 5040
tgttcgagct ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa ctgcagaagg 5100
gaaacgaact ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc agccactatg 5160
agaagctgaa gggctccccc gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg gaacagcaca 5220
agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga gtgatcctgg 5280
ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat aagcccatca 5340
gagagcaggc cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac caatctggga gcccctgccg 5400
ccttcaagta ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta caccagcacc aaagaggtgc 5460
tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg atcgacctgt 5520
ctcagctggg aggcgacaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag gcaaaaaaga 5580
aaaaggaatt cggcagtgga gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg 5640
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cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg 5880
accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc 5940
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gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 6060
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tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 6540
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 含有斑马鱼线粒体核定位信号序列的mito-CRISPR/Cas9载体
<400> 4
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
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t 9361
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> 人线粒体的核定位信号序列
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<212> DNA
<213> Artificial
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acgatcaccc agcgagccaa cctcgttacg cga 93

Claims (4)

1.一种用于敲除异常线粒体DNA的试剂盒，其特征在于，包括用于人或斑马鱼线粒体的同源重组DNA 片段或表达所述同源重组DNA的表达盒或重组载体、外源插入序列ssDNA、mito-CRISPR/Cas 9 系统或表达mito-CRISPR/Cas9蛋白的表达盒或重组载体；所述外源插入序列ssDNA包括人和斑马鱼的ssDNA序列，人的ssDNA序列如SEQ ID NO.1所示，斑马鱼的ssDNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述mito-CRISPR/Cas 9 系统包括gRNA 和mito-Cas 9蛋白或mito-Cas 9 的mRNA；打靶载体mito-CRISPR/Cas9的核定位信号分别替换为人线粒体和斑马鱼线粒体的定位信号，人线粒体的定位信号序列如SEQ ID NO.5所示，斑马鱼线粒体的定位信号序列如SEQ ID NO.6所示。
2.两种ssDNA在制备权利要求1所述的试剂盒中的应用，所述ssDNA包括人的ssDNA序列、斑马鱼的ssDNA序列，所述人的ssDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述斑马鱼的ssDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A:分别设计人和斑马鱼的线粒体DNA的打靶位点序列，合成gRNA；
步骤B:设计人和斑马鱼的ssDNA序列，其都由两个同源臂和打靶线粒体DNA序列组成；
步骤C: 将原始载体pSpCas9(BB)-2A-GFP的核定位信号序列分别替换成人线粒体和斑马鱼线粒体的定位信号序列，构建得到mito-CRISPR/Cas9载体，含有人线粒体核定位信号序列的mito-CRISPR/Cas9载体的序列如SEQ ID NO.3所示，含有斑马鱼线粒体核定位信号序列的mito-CRISPR/Cas9载体的序列如SEQ ID NO.4所示；
步骤D:将mito-CRISPR/Cas9载体和ssDNA序列转染至人胚肾细胞中；
步骤E: 体外转录mito-CAS9 mRNA；
步骤F: 将鱼的gRNA、CAS9mRNA和ssDNA序列共同注射进待处理鱼类的单细胞期受精卵中，实现编辑线粒体基因组。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤A中，人的目的打靶基因为ND1，打靶位点为紧邻NGG特征序列之前的20bp序列，即为候选的打靶序列；所述鱼为斑马鱼，斑马鱼的目的打靶基因为Dloop，打靶位点为紧邻NGG特征序列之前的20bp序列，即为候选的打靶序列。
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