SK283656B6 - Sekvencia DNA kódujúca proteín organizmu A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol, delta-7-reduktázy, proteín delta-7-Red, spôsob ich výroby, kmene transformovaných kvasiniek, aplikácie - Google Patents

Sekvencia DNA kódujúca proteín organizmu A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol, delta-7-reduktázy, proteín delta-7-Red, spôsob ich výroby, kmene transformovaných kvasiniek, aplikácie Download PDF

Info

Publication number
SK283656B6
SK283656B6 SK188-96A SK18896A SK283656B6 SK 283656 B6 SK283656 B6 SK 283656B6 SK 18896 A SK18896 A SK 18896A SK 283656 B6 SK283656 B6 SK 283656B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
delta
sterol
protein
sequence
seq
Prior art date
Application number
SK188-96A
Other languages
English (en)
Other versions
SK18896A3 (en
Inventor
Xavier Chenivesse
Catherine Duport
Eric Lecain
Denis Pompon
Original Assignee
Aventis Pharma S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9501723A external-priority patent/FR2730494B1/fr
Priority claimed from FR9506517A external-priority patent/FR2734839B1/fr
Application filed by Aventis Pharma S. A. filed Critical Aventis Pharma S. A.
Publication of SK18896A3 publication Critical patent/SK18896A3/sk
Publication of SK283656B6 publication Critical patent/SK283656B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Sú popísané sekvencie cDNA kódujúce proteín organizmu A. Thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy /sekvencia SEQ ID No. 1/, ako i spôsob klonovania, spôsob redukcie sterolov nenasýtených v polohe C-7 a spôsob výroby pregnenolónu. Je uvedený aj spôsob detekcie vrodenej deficiencie delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy. ŕ

Description

Oblasť techniky
Sekvencia DNA kódujúca proteín organizmu A. thaliana s aktivitou delta-5.7-sterol-dclta-7-reduktázy, proteín delta-7-Red, spôsob ich výroby, kmene transformovaných kvasiniek, aplikácie.
Predkladaný vynález sa týka sekvencie DNA kódujúcej proteín organizmu A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, proteínu delta-7-Red, spôsobu ich výroby, kmeňov transformovaných kvasiniek a ich aplikácií.
Doterajší stav techniky
Delta-5,7-sterol-delta-7-reduktáza (E.C.1.3.1.21) je mikrozómový enzým, ktorého prítomnosť bola dokázaná na základe jeho účinku v homogenátoch potkanej pečene (M. E. Dempsey a kol., Methods Enzymol., 15, 501 - 514, 1969), ako aj v prípravkoch z rastlín Zea mays (M. Taton a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 465 - 473, 1991). Táto reduktáza je závislá od NADPH a redukuje in vitro 7-dehydrocholesterol na cholesterol.
Steroly sú základnými zložkami membrán eukaryotov, ale ich štruktúra má rozdiely podľa druhov. V bunkách eukarytov, ako sú napríklad kvasinky, je hlavným sterolom ergosterol, ktorý má dvojnásobnú nenasýtenú väzbu na C-5 a C-7, bočný rozvetvený reťazec na C-24 a nenasýtenosť, C-22, zatiaľ čo u cicavcov je to cholesterol s nenasýtenosťou na C-5 a nasýteným bočným reťazcom. Sitosterol, stigmasterol a campesterol, najčastejšie steroly rastlín, majú bočný reťazec rozvetvený, ale nasýtený, a rovnako, ako je to u stavovcov, nemajú nenasýtenosť na C-7. Enzým spôsobujúci tieto štruktúrne rozdiely sterolového jadra je delta-5,7-sterol-delta-7-reduktáza.
Delta-5,7-sterol-delta-7-reduktáza nebola nikdy pripravená v dokonale čistej forme a čiastočne čistá forma bola len opísaná (M. E. Dempsey a kol., K. Taton a kol., citované skôr). Proteín nebol nikdy charakterizovaný svojimi fyzikálno-chemickými vlastnosťami. Nebola podaná žiadna písomná informácia o sekvencií proteínu ani o protilátkach, ktoré proti nemu pôsobia. Na druhej strane bola opísaná zjavná deficiencia 7-dehydrocholesterolreduktázy u človeka, viazaná k syndrómu RSH/Smith-Lemli-Opitz (STO) (J. M. Opitz a kol., Am. J. Med. Genet., 50, 326 - 338, 1994).
Klonovanie cDNA, kódujúcej delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázu, ktoré dovoľuje identifikovať príslušnú proteínovú sekvenciu rovnako ako charakterizovať ľudský gén alebo dokázať jeho vrodenú deficienciu, teda nie je možné uskutočniť známymi metódami, používajúcimi napríklad hybridizačnú techniku a/alebo imunologickú detekciu. Je teda osobitne dôležité vypracovať metódy hybridizačného prehľadávania, dovoľujúce uskutočnenie klonovania, a to najmä pri nedostatku informácií o proteíne.
Ergosterol, základný sterol membrán húb, obsahuje pár dvojitých konjugovaných väzieb na -C-5,7, čo dáva zlúčeninám zo skupiny polyénov. ako je napríklad nystatin, antimykotický účinok (R. Bittman a kol., J. Biol. Chem., 260, 2884 - 2889, 1985). Silná závislosť účinku nystatínu od koncentrácie sterolov nenasýtených na C-5,7 v membránach umožňuje u S. cerevisiae, vypestovať kmene mutantov vzhľadom na akumulované steroly (S. W. Molzahn a kol., J. Gén. Microbiol., 72, 339 - 348, 1972). Mutanty erg2 a erg3 akumulujú steroly, ktoré nemajú konjugované dvojité väzby na C-5,7, a to vzhľadom na deficienciu sterol-delta-8,7-izomerázy (W. Ashman a kol., Lipids, 26, 628, 1991) a/alebo sterol-delta-5-dehydrogenázy (B. Arthington a kol., Gene, 102, 39, 1991). Tieto mutanty sú životaschopné, pretože ergosterol, prirodzený základný sterol kvasiniek, môže byť za istých podmienok nahradený inými susbstitučnými sterolmi, zahŕňajúcimi cholesterol.
Podstata vynálezu
Výhody zvýšenia rezistencie kmeňov kvasiniek, obohatených sterolmi neobsahujúcimi dvojnásobnú nenasýtenosť na C-5,7, na nystatin boli vynálezcami využité na klonovanie cDNA kódujúcej heterologický proteín s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy metódou preosievania, využívajúcou metabolickú interferenciu v .S' cerevisiae. Úspešnosť tejto metódy, výhodnej v tom, že nevyžaduje znalosť sekvencie DNA, prípadne proteínu, a okrem toho umožňuje detekciu založenú výhradne na enzymatickej aktivite, však nie je zaručená, pretože sa jej stavia do cesty rad technických prekážok.
Prvé obmedzenie vychádza z toho, že spôsob pôsobenia nystatínu nie je doteraz úplne objasnený (L. W. Parks a kol. CRC Critical Reviews in Microbiology, 301 - 304, 1978). Tak sa napríklad dá očakávať malá špecifita selekcie pomocou nystatínu vzhľadom na jej nepriamu povahu, ktorá vedie pri kvasinkách k spontánnej selekcii genómových mutácií, ako sú napríklad mutanty erg (S. W. Molzahn a kol., citovaní skôr) a/alebo genómových mutácií, majúcich rezistenciu nezávislú od povahy sterolov. Takto môžu bunky premenené bankou exprimovať heterologické gény udeľujúce rezistenciu na nystatin bez ohľadu na povahu sterolov.
Ďalší príklad obmedzenia uvedenej metódy vychádza z toho, že heterologické proteíny môžu byť v bunke málo aktívne, čo vedie k absencii alebo oslabeniu rezistencie proti nystatínu, napríklad z nasledujúcich dôvodov:
1. gén kódujúci delte-5,7-sterol-delta-7-reduktázu je slabo vyjadrený,
2. proteín je málo aktívny alebo neaktívny, pretože je nesprávne replikovaný alebo vzniká z nesprávnej subcelulárncj adrcsácie,
3. rastlinné proteíny neprijímajú vlastné steroly kvasiniek ako substrát a/alebo
4. steroly, ktoré môžu byť ako substrát, sa nachádzajú v esterifikovanej forme a/alebo sú uložené vo vezikulách a nie sú v kontakte s enzýmom.
Je teda možné očakávať, že takto akumulované steroly sa vyhnú pôsobeniu delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, o ktorej sa uvádza, že je pri eukarytoch lokalizovaná v mikrozómoch.
Predkladaný vynález sa týka klonovania cDNA organizmu A. thaliana, kódujúcej proteín s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a nazvaný delta-7-Red, a to klonovaním pomocou metabolickej interferencie v kvasinkách, založenej na rezistencii proti nystatínu. Proteín delta-7-Red umožňuje redukovať steroly, ktoré majú násobnú väzbu na C-7, pomocou biologickej redukcie, ktorá navyše ponúka výhodné riešenie problému selektívnej redukcie väzby C-7 pri steroloch alebo steroidoch s dvojnásobnou nenasýtenosťou na C-5,7, čo metódy redukcie chemickou cestou neumožňujú.
Vynález sa týka aj buniek transformovaných kvasiniek exprimujúcich proteín delta-7-Red, ktoré, čo je prekvapujúce, akumulujú látky nasýtené v polohe C-7 a pripadne i v C-22, ktoré na rozdiel od ergosterolu sú substrátmi na štiepenie bočného reťazca cholesterolu, t. j. cytochrómu P450SCC.
Tieto neočakávané vlastnosti umožňujú použitie transformovaných kvasiniek podľa vynálezu na výrobu sterolov alebo steroidov, ktoré sú priemyselne alebo farmakologicky významné, špeciálne na výrobu pregnenolu biologickou oxidáciou endogénnych sterolov kvasiniek, redukovaných na C-7, pôsobením cytochrómu P450SCC (P450SCC) za prítomnosti adrenodoxínreduktázy (ADR) a adrenodoxínu (ADX). Transformované kvasinky podľa vynálezu sa môžu používať aj pri výrobe steroidov, ktoré sú medziproduktmi metabolického reťazca premeny cholesterolu na hydrokortizón u cicavcov a ďalších stavovcov. Výhodou tohto spôsobu je skutočnosť, že umožňuje prípravu hydrokortizónu alebo medziproduktov biologickou oxidáciou, v ktorej nie je potrebné používať ako východiskovú látku exogénny sterol, ako je napríklad cholesterol, čím je možné vyhnúť sa problémom spojeným s prenikaním sterolov do kvasiniek, ktorých nepriepustnosť pre exogénne steroly za podmienok aerobiózy bola opísaná (R. T. Lorentz a kol., J. Bocteriology, 981 -985, 1886).
Vynález sa týka aj použitia postupnosti nukleotidov získaných klonovanim podľa vynálezu. Sekvencia DNA alebo RNA, kódujúca delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázu, môže byť používaná na diagnostiku alebo liečenie chorôb, pri ktorých majú úlohu produkty génu delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy. Napríklad sa predpokladá, že nedostatok delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, ktorá premieňa 7-dehydrocholesterol na cholesterol, sa vyskytuje v prípade syndrómu RSH/SLO. Sekvencia ľudskej DNA sa teda môže používať ako diagnostická sonda na diagnózu deficiencie dclta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a môže byť používaná aj v génovej terapii, korigujúcej takú deficienciu.
Predkladaný vynález sa teda týka sekvencie nukleovej kyseliny, obsahujúcej sekvenciu kódujúcu proteín s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, pričom uvedená nukleová kyselina je DNA alebo RNA a výhodne cDNA.
Enzymatický účinok delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy sa môže dokázať napríklad pomocou enzýmových testov in vitro opísaných ďalej v experimentálnej časti opisu.
Vynález sa týka predovšetkým sekvencie DNA, v ktorej kódujúci proteín A. thaliana má účinok delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID No. 1:
CTGTCAGTAA TTTAWTCAA CACACATCXC AATCTOAGCC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA«0
AXGCÄGXACA AGAAZ ATC GCC GAG ACT CIA CAT TCT CCG ATC CTT ACT TACJll
Mat Ala Clu Thr Val Hla Ser Fro J la Val Thr Tyr
A 510
CCA TCC ATG ΤΤΛ TCG CTT CTC CCC TTC TGT CCA CCT TTC CTC ATT CTC 1S9
Ala Ser Het 1S Leu Sar Lau Lau Ala 20 Phe Cye Pro Pro Pha Val Zla Leu 25
CTA , TGG TAC ACA ATG G7T CAT CAG GXT GGT TCT CTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Xet Val Hla Cln Asp Cly sar val Thr Gin Thr Pha
30 35 40
GGC TTC TTT TGG GAG AAT CGA CTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Clu Aan Cly val Gin Cly Leu 11· Aen u· Trp Pro
45 50 55 6Q
AGA CCC ..-f TTC ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Lau Ila Ala Trp Lye Ila Zla Phe cya Tyr Gly Ala Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTC CCT CCT XXA AGA CTT CAC CGT CCA 351
Glu Ala íle Lau Cln Leu Leu Leu Pro Gly ty· Arg Val Gltt Gly Pro
60 *5 90
ATA TCT CCA GCC GCA AAC CCA CCA GTT TAG AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
11· Ser Pro Ala Gly Aan Arg Pro val Tyr Lye Ala Asr. Gly Lau Ala
99 100 105
CCT TAC TTT 1 GTC . ACA CTA CCA ACC CAT CTT CGT CTT TCG TGG TTT GCA 447
Ala Tyr Pha ' Val ' Thr Leu Ma Thr Hla Leu Gly Lau Trp Trp Phe Gly
110 115 120
ATC TTC AAC CCT OCA ATT OTC TXT βΑΤ CAC TTG GOT GAA ΑΤΑ TTT TCG49$
II· phe Aen Pre Alt lla val Tyr Asp Hla Leu Gly Glu Ila Phe ser
12$ 130 135 140
CCA , CTA > ATA . TTC : CGA AGC TTC ATA TTT TGT CTT TTG TTG TAC ATA AAA $43
Ale . Leu Zla Phe Gly Ser Phe Zle Phe Cya Val Leu Lau tyr Ila lye
145 150 15$
GCC : CXT CTT CCA CCT TCA TCA ACT CAC TCT CGT TCA TGT GCT AAC CTA .591
Gly Hla val Ala Pro Ser Sar Ser Aep Ser Oly ser cye Gly Aen Leu
160 16S 170
ATA ATT GAC TTC TXT TGG GGC MG GAC TTG TAC CCT CCA ATT GGT AAG 639
TI· 11· Aep Pha Tyr Trp Gly Het Clu Lau Tyr Pro Arg íle Cly ty ·
173 180 X8S
AGC TTT CAC ATC AAG GTC TTT ACT AAT TGC ACA ttc GGA ATG ATG TCT 6B7
Sar Ph· Α·ρ Ila Lye Val Ph· Thr han Cye Xrg Phe Gly Kat. Het Sar
190 19$ 200
TCG GCA CTT CTT GCA GTC ACC TAC TGC ATA AAA CAC TAT GAA ATA AAT 735
Trp Ale Val Leu Ala val Thr Tyr Cya íle Lye Gin Tyr Glu íle Aen
205 210 215 220
GGC AAA CTA TCT GAT TCA ATC CTG GTC AAC ACC ATC CTG ATG CTC CTG 783
Gly ty· Val Ser Aap Ser Het Lau Val Aen Thr íle Leu Het Lau Val
225 230 23$
TAT CTC ACA AAA TTC TTC TCG TGG ΟΑΛ GCT CCT TXT TGG AAC ACC ATG 931
Tyr Val thr ty· Ph· Ph· Trp trp Glu Ala Gly Tyr Trp Xsn Thr Met
240 245 250
CAC ATT GCA CAT CAC CGA GCT CCA TTC TAT ATA TCC TGG GGT TCT CTA 87»
;x»P 11· Ala Nie Aap Arg Ala Cly Phe Tyr íle cya Trp Cly Cye Leu
25$ 260 265
GTC TCC CTC CCT TCT CTC TAC ACT TCT CCA GGC A TO TAC CTT CTG AAC 92?
Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Mat Tyr leu val Aen
270 275 200
CAC CCC GTC GAA CTC GCA ACT CAG TTG CCA ATA TAC ATT CTC CTT CCA975
Hla Pro val clu Leu Gly Thr Gin Leu Ala Zla Tyr H· Leu Val Al· í 85 290 29S300
0GA ATT CTG TGG ATT TAC ATA AAG TAT GAG TGT GAT AGA CAA MQ CAA1023
Gly 71· Leu cya Ila Tyr II· Lye Tyr Aap Cya Asp Arg Gin Arg Gin
30S 310315
CAC TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG CTT TCG CGA AGA GCC CCG 1C7J
G1U Phe Arg Arg Thr Aen Cly Lya Cys Leu Val Trp Cly Arg Ala Pro
320 325 330
TCA AKG ATt CTG GCC TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AXA XCT 1119
Ser ty» Zle Val Ala Sar Tyr Thr Thr Thr Sar Gly Glu Thr tys Thr
339 340 34S
ACT CTT CTC ΓΤΧ ACC TCT GGA TGG TGG GGA TTC GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu Lau Leu Thr Ser Cly frp Trp Gly Lau Ala Arg Mle Phe Kle
350 399 360
TAT CTT CCT GAG ATC TTX AGT GCT TTC TTC TCG ACC G TA CCO GCT CTC 121$
Tyr Val Pro Clu íle Leu sar Ala Pha pha Trp Thr Val pro Ala Leu
365 370 376 380
TTC CAT AAC TTC TTC GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTI CTT CTC TTT1263
Pha Aap Aan Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe
3·$ 390395
CAT CGA GCC AA0 ACA CAC CAT CAC CCA TCC CCA TCA AAG TAT CCC AAA1311
Asp Arg Ala Lya Arg Xap Aap Asp Xrg Cya Arg Str Lye Tyr ClyLya
400 4034JO
TXT TCC AAO CTC TAT TCT CXC AXA CTC AAA TAC AGG ATC ATT CCC CCA1359
Tyr Trp Lye Leu Tyr Cye Clu Lye Val Lya Tyr Xrg Ila Íle PreCly
416 42042$
ΧΓΤ TAT TGATTCTXAC CAACTCTGTT GTTCtCATTT TCTACTTATT ACCTTAATTC1415 ľla Tyr
430
CAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGACCCA XAACAAAAAT íCXXATTCAT CMXTACXCA 147$
TTCTTTTCCT GAAAAXXAAX h
1496 ako aj alelové modifikácie tejto sekvencie.
Sekvencia DNA, opísaná skôr, kóduje proteín skladajúci sa zo 430 aminokyselín a zodpovedajúci sekvencií znázornenej na obrázku 3 (SEQ ID No. 2), je sekvencia cDNA, ktorá môže byť získaná napríklad klonovanim v kvasinkách, vychádzajúc z génovej banky úsekov expresií A. thaliana využívajúc pritom metódu hybridizačného prehľadávania, založenú na vzniku rezistencie kvasiniek proti nystatínu, a to za podmienok, ktoré sú podrobnejšie opísané ďalej.
Znalosť nukleotidovej sekvencie SEQ ID No. 1, opísanej skôr, umožňuje reprodukovať postupy podľa vynálezu metódami známymi odborníkom v odbore, napríklad chemickou syntézou alebo pomocou presievania génovej banky alebo banky cDNA pomocou sondovania syntetizovaných oligonukleotidov technikami hybridizácie alebo amplifikácie pomocou PCR (polymerázové reťazové reakcie).
Vynález sa týka aj sekvencie DNA kódujúcej proteín s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, hybridizujúci postupnosť SEQ ID No. 1 v podmienkach priemernej alebo zvýšenej stringencie a ktorý sa s touto sekvenciou zhoduje na 60 alebo viac percent.
Sekvencie, ktoré zistiteľným spôsobom hybridizujú sekvenciu SEQ ID No. 1, ju hybridizujú za štandardných podmienok priemernej stringencie, napríklad hybridizácie pri 42 °C, počas 12 hodín v 50.
Percento zhody nukleotidových sekvencii môže byť určené napríklad programom BLAST „basic local alignment search tool“ (S. F. Altschul a kol., J. Mol. Biol., 215, 403 až 410, 1990) na servere NCBI.
Vynález sa týka aj sekvencie DNA, kódujúcej proteín s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a amplifikovaný technikou PCR, pričom ako prímery sa používajú oligonukleotidy, kódujúce spoločnú sekvenciu aminokyselín SEQ IDNo.3:
Leu Leu Xea Xee Gly Trp Xaa Gly Xae Xea Arg Xaa Xaa Xaa Tyr , 15 10 15 v ktorej Xaa v pozícii 7 je Trp alebo Tyr a Xaa v pozícii 12 je His alebo Lys.
Sekvencia SEQ ID No. 3, opísaná neskôr, zodpovedá novej spoločnej sekvencii, ktorá bola definovaná pomocou porovnávania sekvencii aminokyselín medzi novou sekvenciou SEQ ID No. 2, odvodenou z nukleotidovej sekvencie SEQ ID No. 1, a sekvenciami známymi buď z iných sterolových reduktáz so špecifickým pôsobením na inú polohu, ako je poloha C-7, alebo z receptorov lamínu B tak, ako je to podrobnejšie ďalej opísané v experimentálnej časti. Vychádzajúc z informácie nachádzajúcej sa v sekvencii SEQ ID No. 3 je možné definovať a syntetizovať prímery, predstavované nanajvýš 45 nukleotidmi, ktoré spoločne s druhým prímerom oligodT (17 nukleotidov) ako východiskovou sekvenciou umožňuje s využitím komerčnej súpravy pre PCR (napríklad Stratagenu) amplifikovať DNA kódujúcu proteín s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7reduktázy.
Vynález sa týka aj proteínu A. thaliana, ktorý má účinok delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, ktorý má sekvenciu aminokyselín SEQ ID No. 2:
Alt Clu Thr Val Hl· Ser Pro 11« Val Thr Tyr Ala ser Mat Leu
1 5 10 1$
Ser Leu Leu Ale Phe Cya Pro Pro Phe Val Xle Leu Leu Trp Tyr Thr
20 2$ 30
Met Val Hl· Gin Aap Gly Ser Val Thr Oln Thr Phe Cly Phe Pha Trp
35 40 45
Clu Aen Gly Val Gin Gly Leu Zle A.n Zle Trp Pro Arg Pre Thr Leu
SO 55 50
11« Ala Trp L/· Íle r 11« Phe : Cyi i Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Zle Leu
65 70 75 80
Cín Leu Leu Leu pro Gly Lya Arg Val Glu Gly Pro Xle Ser Pro Ala
85 00 95
Gly A«n Arg Pro v* L Tyr Ly· Ala . Aen i Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
1OO 105 110
Thr : Leu Ala Thr Hla Leu Gly Leu Trp i Trp Phe Cly íle Phe Aan Pro
»15 120 12S
Ala íle Val Tyr Aep Hla Leu Cly Clu íle Pha Ser Ala Leu íle Phe
130 135 140
cly Ser Phe íle Phe Cya Val Leu Leu Tyr Zle Lya Gly Hla Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Ser Ser Α·Ρ Ser Gly Ser Cya Cly Asn Leu Zle Zle Asp Phe
165 170 17$
Tyr Trp Gly Het Glu Leu Tyr Pro Arg Zle Cly Lya Ser Phe Aap íle
160 165 190
Lya Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu
19S 200 205
Ala Val Thr Tyr Cys Zle Ľya Gin Tyc Glu Xle Asn Gly Lys Val Ser
210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Aan Thr íle Leu Het Leu Val Tyr Val Thr Lya
225 230 235 240
Phe •'Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Het Asp íle Ala Hla
245 250 255
Asp Arg Ala Gly Phe Tyr íle cya Trp Gly cya Leu val Trp Val Pro
260 26$ 270
Ser val Tyr Thr Sar Pro Gly Met Tyr Leu val Aan Hla Pro Val Glu
275 260 285
Lev i Gly Thx i Gin Leu Ala , 11« 1 zyr Zle Leu Val Ala Gly Xle Leu i Cya
2 90 295 300
Zle ; Tyr Xle Lya i Tyx Aap Cya Asp Arg Gin , Arg Gin < Glu Phe > Arg ' Arg
305 310 315 320
Thr Aan Cly Lya Cya Leu Val Trp Gly ’ Arg Ala Pro Ser Lya íle val
325 330 335
Ala Sar Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Clu Thr Lya Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 3S0
Thr Sar Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg Hla Phe His Tyr Val Pro clu
355 360 365
íle Leu Ser Ala Pha Phe Trp Thr val Pro Ala Leu Phe Aap Aan Phe
370 37S 360
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe A»p Arg Ala Ly.
385 390 39$ 400
Arg Asp . ABp Αβρ Arg Cya , Arg : sar Lya Tyr Gly ty· Tyr Trp Lye Leu
405 410 415
Tyr cys < 31u Lya Val Lya Tyr J krg íle íle : Pro Gly 11· Tyr
420 42S 430 ako aj alelové obmeny a analógy tejto sekvencie.
Medzi alely a analógy sa zahŕňajú sekvencie modifikované substitúciou, vynechávaním a/alebo pridávaním jednej alebo viacerých aminokyselín tak, aby vzniknutý produkt si zachovával pôvodnú funkciu. Modifikované sekvencie môžu byť napríklad pripravené využívajúc techniku riadenej mutagenézy, dobre známej odborníkom.
Vynález sa týka najmä proteínu A. thaliana, ktorý má účinok delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a iná sekvenciu aminokyselín SEQ ID No. 2, opísanú skôr, a je nazvaný delta-7-Red.
Vynález sa týka aj proteínu, ktorý má účinok delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a má sekvenciu aminokyselín, ktorá sa na 60 alebo viac percent zhoduje so sekvenciou SEQ ID No. 2.
Percento zhodnosti môže byť určené napríklad programom BLAS ľ, uvedeným skôr.
Vynález sa týka aj proteínu s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a so vzájomnou imunologickou reaktivitou s proteínom A. thaliana delta-7-Red, definovaným skôr.
Proteín sa môže detegovať napríklad imunoprecipitáciou pomocou antiséra smerovaného proti proteínu delta-7-Red, pripraveného známymi metódami.
Jeden z nárokov vynálezu sa týka proteínu, ktorý má účinok delta-5,7-sterol-dclta-7-reduktázy a ktorý je získaný expresiou v hostiteľskej bunke obsahujúcej sekvenciu DNA, definovanú skôr a osobitne sa týka proteínu A. thaliana, získaného expresiou v hostiteľskej bunke obsahujúcej sekvenciu DNA, kódujúcu sekvenciu aminokyselín SEQ ID No. 2, opísanú skôr.
Ak je proteín podľa vynálezu získaný expresiou v hostiteľskej bunke, je pripravovaný metódami génového inžinierstva a prípravy bunkových kultúr, ktoré sú odborníkom v odbore známe.
Expresia sa môže realizovať v prokaryotickej hostiteľskej bunke, napríklad v E. coli a/alebo v hostiteľskej bunke eukaryotickej, napríklad v bunke cicavca, v bunke hmyzu alebo kvasiniek, obsahujúcej sekvenciu kódujúcu delta-7-Red podľa vynálezu pripravovanej vhodným promótorom.
Získaný rekombinačný proteín môže byť glykolyzovaný a/alebo neglykolyzovaný.
Vynález sa menovite týka proteínu podľa vynálezu, získaného expresiou v kvasinkách.
Vynález sa týka i protilátok proti proteínu, ktorý má účinok dclta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a ktorý bol definovaný skôr. Protilátky môžu byť polyklonálne protilátky alebo monoklonálne protilátky, pripravené spôsobom, známym odborníkom.
Vynález sa týka aj vektora expresie, ktorý obsahuje sekvenciu DNA definovanú skôr, rovnako ako hostiteľskej bunky, transformovanej týmto vektorom.
Vektory expresie sú známe vektory, ktoré umožňujú expresiu proteínu pod kontrolou vhodného promótora. V prokaryotických bunkách môže byť promótorom napríklad promótor lac, promótor trp, promótor tac, promótor β-laktamázy alebo promótor PL. V bunkách cicavcov môže byť promótorom promótor SV40 alebo promótor adenovírusu. Na expresiu v bunkách hmyzu sa môžu použiť aj vektory typu Baculovirus. V bunkách kvasiniek môže byť promótorom napríklad promótor PGK, promótor ADH, promótor CYC1 alebo promótor GAL10/CYC1.
Hostiteľskými bunkami môžu byť bunky prokaryotické alebo bunky eukaryotické. Prokaryotické bunky sú napríklad E. coli, Bacillus alebo Streptomyces. Eukarytické hostiteľské bunky, obsahujúce kvasinky a vláknité huby, rovnako ako aj bunky vyšších organizmov, napríklad bunky cicavcov alebo bunky hmyzu. Bunky cicavcov môžu byť bunky CHO chrčka/alebo bunky Cos opice. Bunky hmyzu môžu byť napríklad bunky SF9. Bunky kvasiniek môžu byť Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe alebo Kluyveromyces lactis.
Vynález sa týka postupu klonovania nukleovej kyseliny, kódujúcej proteín, ktorý má účinok delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy v mikroorganizme, ktorý zahŕňa metódu preosievania zvolenú spomedzi nasledujúcich postupov:
- rezistencia mikroorganizmu na nystatín alebo na analogickú zlúčeninu, ktorej toxicita závisí od prítomnosti sterolov, nesúcich násobnú väzbu v polohe C-7,
- hybridizácia nukleovej kyseliny s nukleotidovou sekvenciou SEQ ID No. 1, opísanou skôr,
- identifikácia nukleovej kyseliny informatickými metódami medzi náhodne izolovanými sekvenciami DNA,
- priama expresia proteínu, nasledovaným imunodetekciou s použitím protilátok proti proteínu so sekvenciou aminokyselín SEQ ID No. 2, opísanú skôr.
Mikroorganizmom sa mienia kvasinky, ako sú napríklad S. cerevisiae, S. pombe alebo K. lactis.
Zlúčeninami analogickými nystatínu sa rozumie napríklad amphotericin B alebo filipin.
Pod hybridizáciou sa rozumie hybridizácia za podmienok strednej alebo zvýšenej stringencie za štandardných a známych podmienok (T. Maniatis a kol., citovaný skôr).
Identifikácia informatickou cestou sa môže uskutočňovať napríklad pomocou programu BLAST, uvedeného skôr.
Ide o druh identifikácie DNA sekvencie použitím programu BLAST („basic local alignement search tool“).
Príklad postupu klonovania opisovaného skôr, v ktorom použitá metóda preosievania využíva rezistenciu proti nystatínu v kvasinkách, je opísaná ďalej v experimentálnej časti.
Predmetom vynálezu je aj sekvencia nukleových kyselín, DNA alebo RNA, získaných klonovaním opísaným skôr. Sekvencia nukleovej kyseliny môže byť prokaryotického alebo eukaryotického pôvodu podľa toho, ktorý východiskový materiál bol na klonovanie použitý, môže byť napríklad ľudského pôvodu.
Vynález sa týka aj hostiteľských buniek, transformovaných vektorom obsahujúcim sekvenciu DNA získanú skôr opísaným klonovaním. Hostiteľská bunka môže byť prokarytická alebo eukaryotická. Príklady hostiteľských buniek a vektorov už boli uvedené skôr.
Vynález má špeciálne ako predmet hostiteľské bunky zvolené spomedzi kvasiniek alebo vláknitých húb, transformovaných vektorom obsahujúcim sekvenciu DNA podľa vynálezu, definovanú skôr, alebo sekvenciu DNA získanú opísaným klonovaním.
Vynález sa týka aj spôsobu výroby proteínu s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, v ktorom sa kultivuje transformovaná hostiteľská bunka podľa vynálezu a izoluje sa príslušný proteín, a týka sa najmä spôsobu výroby, v ktorom hostiteľská bunka je transformovaná bunka, v ktorej je kódujúca sekvencia DNA podrobená pôsobeniu promótora kvasiniek.
Vynález sa týka redukcie in vitro sterolu nenasýteného v polohe C-7, v ktorom sa inkubuje sterol určený na redukciu s proteínom, získaným opísaným postupom, a izoluje sa prípadne získaný redukovaný sterol.
Vynález sa týka aj spôsobu redukcie in vivo exogénneho sterolu nenasýteného v polohe C-7, pri ktorom sa inkubuje sterol s transformovanými hostiteľskými bunkami podľa vynálezu a izoluje sa pripadne získaný redukovaný sterol. Hostiteľská bunka môže byť prokaryotická alebo eukaryotická bunka, najmä kvasinka/alebo vláknitá huba.
Vynález sa týka aj spôsobu redukcie in vivo endogénneho sterolu, nenasýteného v polohe C-7, v ktorom sa kultivuje transformovaný hostiteľský kmeň podľa vynálezu, zvolený spomedzi kvasiniek a vláknitých húb, a prípadne sa izoluje redukovaný akumulovaný sterol.
Vynález sa týka najmä redukcie in vitro alebo in vivo, opísanej skôr, v ktorej je získaný redukovaný sterol substrát enzýmu štiepenia bočného reťazca cholesterolu (P45(ISCC) a špeciálne sa týka spôsobu redukcie in vivo, v ktorom endogénny sterol určený na redukciu je ergosta-5,7-dién-3-ol, ergosta-5,7,24(28)-trién-3-ol alebo ergosta-5,7,22-trién-3-ol, alebo aj ich zmes.
Vynález sa týka aj spôsobu výroby pregnenolónu, v ktorom sa kultivuje transformovaná hostiteľská bunka podľa vynálezu, zvolená medzi kvasinkami alebo vláknitými hubami, prípadne sa izoluje akumulovaný endogénny sterol alebo steroly, redukované v polohe C-7, redukované steroly sa inkubujú v prítomnosti P450SCC, prípadne v prítomnosti adrenohexfnreduktázy (ADB) a adrenohexínu (ADX) a prípadne sa izoluje získaný pregnenolón.
Vynález sa týka aj spôsobu výroby pregnenolónu, opísaného skôr, v ktorom sú hostiteľskými bunkami kvasinky.
Vynález sa týka aj spôsobu výroby pregnenolónu, v ktorom sa kultivuje transformovaná kvasinka jedným alebo viacerými vektormi umožňujúcimi koexpresiu proteínu s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a P450SCC, ADR, ADX, najmä spôsob výroby, v ktorom proteín s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy je proteín A. thaliana delta-7-Red,a osobitne takého spôsobu výroby, v ktorom kmeň kvasiniek je kmeň EC01/pCD63.
Príklady výroby pregnenolónu podľa vynálezu sú podané ďalej v experimentálnej časti.
Transformované kvasinky, používané na uskutočňovanie spôsobu výroby pregnenolónu podľa vynálezu opísaného skôr, môžu byť napríklad kvasinky kotransformované vektorom expresie podľa vynálezu, obsahujúcim sekvenciu DNA kódujúcu proteín s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a vektor expresie cytochrómu P450SCC a prípadne ADX alebo ADR. Vektory expresie cytochrómu P450SCC a/alebo ADX sú známe a spôsoby ich výroby sú opísané napríklad v prihláške európskeho patentu EP 0340878, ako aj ďalej v experimentálnej časti.
Používané transformované kvasinky môžu byť aj kvasinky, v ktorých sekvencia DNA, kódujúca proteín s účinkom delta-5,7-sterol-7delta-7-reduktázy je integrovaný do určitého miesta genómu, napríklad miesta ADE2, v ktorom ergosterol už nie je majoritným sterolom v podmienkach expresie delta-7-reduktázy. Získané „integrované“ kvasinky potom môžu byť transformované génmi expresie alebo vektormi expresie, obsahujúcimi sekvenciu DNA, kódujúcu cytochróm P450SCC a prípadne aj ADX a ADR.
Príklad vytvorenia kmeňa kvasiniek, produkujúceho in vivo pregnenolón alebo jeho ester s kyselinou octovou, je podaný ďalej v experimentálnej časti.
Vynález sa týka aj kmeňa transformovaných kvasiniek koexprimujúcich proteín s účinkom delta-5,7-stcrol-delta-7-reduktázy, P450SCC, ADR a ADX a akumulujúci voľný alebo esterifikovaný pregnenolón, najmä uvedený kmeň kvasiniek, v ktorom proteín s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy je proteín A. thaliana delta-7-Red a špeciálne kmeň kvasiniek pomenovaný EC01/pCD63, ktorého detailná konštrukcia je opísaná ďalej v experimentálnej časti.
Vynález sa týka aj sekvencie ľudskej DNA, získanej klonovaním spôsobom opísaným skôr, používanej ako sonda na diagnostikovanie vrodenej deficiencie delta-5,7-steroly-delta-7-reduktázy. Deficiencia delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy zahŕňa napríklad deflcienciu 7-dehydrocholesteroireduktázy, spôsobujúcu anormálne nízky podiel cholesterolu v plazme.
Vynález sa týka aj metódy detekcie deficiencie delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, spočívajúcej v inkubácii vzorky, obsahujúcej ľudskú genómovú DNA so sondou definovanou skôr za štandardných podmienok hybridizácie a v dokázaní fixácie alebo absencie fixácie sondy na genómovú DNA, pričom absencia fixácie alebo jej redukcia indikuje vrodenú defícienciu delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy.
Metóda podľa vynálezu umožňuje napríklad detegovať vrodenú defícienciu delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy v prenatálnom období alebo u novorodencov, ako aj u pacientov s rôznymi druhmi porúch a menovite u pacientov, u ktorých sa klinicky prejavuje syndróm RSH-SLO.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Pripojené obrázky ilustrujú niektoré aspekty vynálezu.
Obrázok 1 predstavuje celkový podiel sterolov extrahovaných z klonu F22 rezistentného proti nystatínu a získaný presievaním banky A. thaliana v kvasinkách FY 1679. A nalýza sa uskutočňuje pomocou RP-HPLC pri 205 nm alebo 285 nm (obrázok 1A), alebo pomocou plynovej chromatografie v porovnaní s netransformovanými kvasinkami FY 1679 (obrázok 1B).
Obrázok 2 predstavuje reštrikčnú mapu fragmentu Not I plazmidu pF22 a stratégiu sekvenácie.
Obrázok 3 predstavuje nukleotidovú sekvenciu cDNA delta-7-Red (SEQ ID No. 1) a príslušnú sekvenciu aminokyselín (SEQ ID No. 2).
Obrázok 4 znázorňuje meranie účinku in vitro delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy z mikrozómovej frakcie FY 1679 transformovanej vektorom indukovateľnej expresie „delta-7/V8“. Analýza je uskutočňovaná plynovou chromatografiou a ukazuje transformáciu substrátu 7-dehydrocholesterolu (TR = 16,528 min.) na cholesterol (TR = = 15,887 min.) v prítomnosti endogénnych sterolov ergosta-5,22-dién-3-ol (TR = 16,682 min.), ergosterolu (TR = = 17,249 min.) a ergosta-5-én-3-olu (TR = 17,664 min.).
Obrázok 5 ilustruje produkciu pregnenolónu in vitro štiepením čistého ergosta-5-én-3-olu (obr. 5A), ergosta-5,24(28)-dién-3-olu (5B) alebo ergosta-5,22-dién-3-olu (5C) z transformovaných kvasiniek exprimujúcich delta-7-Red, potom inkubovaných s P45oSCC, ADX a ADR. Analýza je uskutočňovaná plynovou chromatografiou v porovnaní s kontrolným štiepením cholesterolu (plná čiara).
Obrázok 6 ilustruje konštrukciu integrovaného piazmidu pADA7, ktorý' umožňuje integráciu cDNA kódujúcej delta-7-Red (sterol-A7-reduktáza) v mieste ADF.2.
Obrázok 7 predstavuje výsledky plynovej chromatografie sterolov extrahovaných alkalickým zmydelnením kmeňa FY 1679 a integrovaného kmeňa ELR01, kultivovaných v prítomnosti galaktózy.
Obrázok 8 podáva schematicky konštrukciu člnkového (shuttle) vektora E. coli - S. cerevisiae VI3, obsahujúceho jediné miesto Sali (Sa) v mieste viacnásobného klonovania.
Obrázok 9 predstavuje etapy konštrukcie integrovaných plazmidov pCD62-l a pCD62-2, ktorá umožňuje inzerciu génu expresie ADR do medzigénovej oblasti génov Ieu2 a spllA.SCMl a SCM2: viacnásobné klonovateľné miesta.
Obrázok 10 ukazuje stratégiu konštrukcie kmeňa CDR01.
Obrázok 11 predstavuje etapy konštrukcie plazmidu expresie pCD63, obsahujúceho dva gény expresie ADX a P450SCC.
Obrázok 12 predstavuje analýzu plynovou chromatografiou sterolov, extrahovaných z buniek (ceíulámy lyzát) alebo z kultúry (kultivačná pôda) a získaných z kmeňa EC01/pCD63 po indukcii galaktózou počas 9 hodín (obrázok 12a) alebo 24 hodín (obrázok 12b).
Obrázok 13 predstavuje štruktúru plazmidu pTG 7457.
Obrázok 14 predstavuje štruktúru plazmidu pTG 7453.
Obrázok 15 predstavuje štruktúru plazmidu pTG 10014. Obrázok 16 predstavuje štruktúru plazmidu pTG 10004. Obrázok 17 predstavuje štruktúru plazmidu pTG 10031. Obrázok 18 predstavuje štruktúru plazmidu pTG 10033.
Nasledujúce príklady ilustrujú vynález bez toho, aby ho obmedzovali.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Klonovanie cDNA, kódujúcej delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázu (delta-7-Red) A. thaliana
A. Presievanie banky expresie A. thaliana v kvasinkách
Východisková banka expresie DNA je banka opísaná M. Minetom a kol. (Plánt J., 2, 417 - 422, 1992), ktorá bola pripravená z RNAm A. thaliana v štádiu odklíčenia do štádia s dvoma listami a ktorej cDNA ohraničené miestom Not I boli vložené do miesta Bst XI génu expresie člnkového vektora E. coli/S. cerevisiae pFL61. Tento gén obsahuje sekvencie promótora a terminátora génu fosfoglycerátkinázy (PGK). Počiatok replikácie kvasinky odvodený zo sekvencie 2 μ a marker selekcie URA3 zaručujú propagáciu vektora do kvasinky. Propagácia vektora E. coli je odvodená od plazmidu pUC19.
Kmeň kvasiniek FY 1679 (Mata), ktorý je izogenický kmeňu S288C, ktorý opísal A. Thierry a kol. (Yeast, 6, 521 až 534, 1990) bol transformovaný bankou cDNA s použitím metódy lítiumacetátu, ktorú opísal D. Gietz a kol. (Nucleic Acids Res., 20,1425, 1992).
Bunky boli rozotreté na syntetickej kultivačnej pôde SGI, obsahujúcej 7 g/1 „yeast nitrogen base“ (Difco), 1 g/1 bactocasaminokyseliny (Difco), 20 g/1 glukózy, 20 mg/1 tryptofánu a zbavenej uracilu. Získalo sa 105 transformátov prototrofných na uracil. Tie sa potom zoskupili a znovu umiestnili na syntetickú kultivačnú pôdu zbaveného uracilu a obsahujúceho 2 alebo 5 pg/ml nystatinu po 5 x 104 buniek na misku. Takto sa pre každú koncentráciu nystatinu presievalo 106 buniek. Po 3 dňoch inkubácie pri 28 °C bolo približne 100 klonov, ktoré vyrástli pri koncentrácii 2 pg/ml nystatinu, zoskupených do skupín po 5 klonoch, pri ktorých sa analyzovalo zloženie stcrolov vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou v inverznej fáze (označovanej ďalej RP-HPLC), zatiaľ čo jediný rezistentný kloň, označený F22, sa získal pri koncentrácii 5 pg/ml nystatinu.
B - Analýza akumulovaných sterolov v klone F22
Získané steroly sú preparované metódou alkalickej saponiflkácie, ktorú opísal L. Parks a kol. (Methods in Enzymol. 111, 333 - 346, 1985) a potom analyzované RP-HPLC a/alebo chromatografiou v plynnej fáze (GPC).
Rezíduum získaných sterolov sa rozpustí v zmesi etanol-tetrahydrofurán-voda (65 : 10 : 25, objemovo) a potom analyzuje RP-HPLC na kolóne očkovanej silice C18 Applied Biosystems (100 x 2,1 mm) pri prietoku 1 ml/mn a 55 °C pri lineárnom gradiente metanolu vo vode /50.
Zmes sterolov je analyzovaná aj plynovou chromatografiou (GPC) na kapilárnej kolóne SE-30 Alltech (30 m x x 0,32 mm) s héliom ako plynným nosičom pri teplotách od 280 °C do 310 °C pre injektor a detektor, s počiatočným zvýšením teploty zo 110 °C na 245 °C pri rýchlosti 45 °C/min., potom 3 °C/min. až na 280 °C.
Analýza pomocou RP-HPLC (obrázok 1A) a analýza plynovou chromatografiou (obrázok 1B) ukazuje rozloženie akumulovaných sterolov v klone F22 získaného postupom opísaným skôr, vyznačujúce sa takmer úplným vymiznutím ergosterolu, ktorý je pritom majoritným sterolom netransformovaného kmeňa FY 1679, a jeho nahradením dvoma majoritnými sterolmi v obdobných množstvách, ktoré neabsorbujú 285 nm, a teda podľa analýzy pomocou RP-HPLC neobsahujú dvojitú konjugovanú nenasýtenosť.
Na obrázku 1A campesterol (Sigma) (24-R-ergosta-5-én-3-ol) obsahuje približne 35
C - Klonovanie cDNA delta-7-Red
Plazmidy pochádzajúce z klonu F22 sú amplifikované v E. coli metódou opísanou J. N. Strathenom a kol. (Methods in Enzymol,, 194, 319 - 329, 1991), potom natrávené pomocou Not I. Získal sa fragment s približne 600 pármi báz a fragment s 1600 pármi báz. Kmeň FY 1679 sa transfor moval každým z uvedených fragmentov. Zloženie sterolov v každom z klonov transformovaných kvasiniek sa analyzovalo opísaným spôsobom, čo umožnilo rozlíšiť plazmidy nesúce gén spôsobujúci modifikovaný profil sterolov. Takto identifikovaný plazmid sa označil ako pF22.
D - Určenie sekvencie cDNA delta-7-Red
Vložená cDNA plazmidu pFF22 sa klonovala do miesta Not I vektora pUC9N odvodeného od pUC9 (Pharmacia), v ktorom sa miesto EcoRI viacnásobného klonovacieho miesta nahradilo vložením reštrikčného miesta Not I, pričom sa zachovala čítacia fáza génu LacZ. Potom sa určila reštrikčná mapa (obrázok 2).
Reštrikčné fragmenty s externým miestom Not I a internými miestami EcoRI, PvuII alebo HindlII sa klonovali v plazmide pBluescript (Stratagen). Nukleotidová sekvencia sa určila Sangerovou metódou pomocou DNA-polymerázy Sequenase (kit Stratagen) na dvoch vláknach využívajúc pritom priame a inverzné primery pUC9, T3 a T7 plazmidu pBluescript alebo špecifické primery odvodené z nukleotidovej sekvencie cDNA.
Kompiláciou súboru získaných sekvencií podáva nukleotidová sekvencia cDNA delta-7-Red organizmu A. thaliana (SEQ ID No. 1), znázornená na obr. 3. Táto sekvencia zahŕňa 1496 nukleotidov a je ukončená sekvenciou polyadenylácie. Predstavuje otvorený čítací segment začínajúci iniciačným metionínom v nuleotide 76 a zakončený terminačným kodónom v nukleotide 1366, čo dáva dohromady 1290 nukleotidov, kódujúcich proteín obsahujúci 430 aminokyselín. Kódujúca oblasť cDNA delta-7-Red kóduje proteín delta-7-Red, ktorého odvodená sekvencia aminokyselín (SEQ ID No. 2) je ukázaná na obrázku 3. Sekvencia proteínu obsahuje 430 aminokyselín a má vypočítanú molekulovú hmotnosť 49286 kDa.
Vzorka kmeňa E. coli DH5-1, obsahujúca cDNA delta-7-Red vo vektore pUC9N (označenú ako cDNA delta7red-pUC9N) bola deponovaná pri CNCM 10. februára 1995 pod číslom 1-1535.
E - Určenie spoločnej sekvencie SEQ ID No. 3
Prehľadaním bánk sekvencií (Genbank a EMBL) pomocou informatických metód sa dokázalo, že sekvencia proteínu delta-7-Red A. thaliana má istú podobnosť so sekvenciami ostatných stcrolrcduktáz, špeciálne so sterol-C-14-reduktázou S. cerevisiae, ktorú opísal R. T. Lorentz a kol. (DNA CellBiol., 11, 685 - 692, 1992) a sterol-C-24(28)-reduktázou S. cerevisiae, opísanou W. Chenom a kol. (Yeast, 7, 305 - 308, 1991), ako aj s produktmi génu sts 1+ S. pombe, ktoré opísal M. Shimanuki a kol. (Mol. Biol. Celí, 3. 263 - 273, 1992) a so sterol-C-14-reduktázou Neurospora crassa (No. X77955 v báze EMBL). Navyše proteín delta-7-Red má podobnosť so 400 aminokyselinami C-terminálneho konca receptora kuracieho laminu Bas obdobnými aminokyselinami príslušného ľudského receptora, ktoré boli opísané H. J. Wormanom a kol. (J. Celí Biol., 111, 1535 - 1542, 1990) a E. Schulerom a kol. (J. Biol. Chem., 269, 11312- 11317, 1994).
Uskutočnilo sa porovnanie zhody sekvencie aminokyselín SEQ ID No. 2 odvodenej z cDNA delta-7-Red získanej uvedeným spôsobom s tromi sterolreduktázami kvasiniek a dvoma receptormi laminu B a určila sa nová spoločná podsekvencia aminokyselín (SEQ ID No. 3):
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr ,
10 15 v ktorej Xaa v pozícii 7 je Trp alebo Tyr a Xaa v pozícii 12 je His alebo Lys, na prípravu oligonukleotidov použiteľných ako prímery na amplifikáciu pomocou PCR nových sekvencii genómovej DNA alebo cDNA kódujúcej protein s účinkom delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy.
F - Expresia proteínu delta-7-Red v kvasinkách
a) Konštrukcia expresívneho vektora delta-7/V8, indukovateľného v kvasinkách.
Uskutočnilo sa vynechanie nekódujúcich oblastí cDNA v pF22 technikou ampliíikácie PCR využívajúc nasledujúce špecifické oligonukleotidy:
S'CGCGGATCCA TGGCCGAGAC TGTACATTC 3’ (SEQ ID NoJ) a
5’CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3' (SEQ ID No. 5) ktoré boli definované s cieľom vložiť reštrikčné miesto BamHI bezprostredne na počiatku inicializačného kodónu a reštrikčné miesto KpnI na samom konci stop kodónu.
cDNA bola amplifikovaná vychádzajúc z 1 ng plazmidu „cDNA delta7red/pUC9N“ za prítomnosti 2 jednotiek Pfii DNA-polymerázy a 0,2 μΜ každého z uvedených prímerov, a to za nasledujúcich podmienok: 94 °C, 10 s; 52 °C, 50 s; 74 °C, 90 s; 33 cyklov so súpravou PCR Stratagcnu.
Získaný fragment s veľkosťou približne 1300 párov báz bol natrávený reštrikčnými enzýmami BamHI a KpnI a inzertovaný do miest BamHI a PKpnI člnkového vektora E. coli/S. cerevisiae pYeDPl (8 - 2), ktorý je nazývaný V8/, opísaného C. Cullinom a kol. (Gene, 65, 203 - 217, 1988). V8 nesie marker selekcie URA3 a obsahuje gén expresie v kvasinkách, obsahujúci promótor GAL10-CYC1 a terminačnú sekvenciu génu PGK. Takto získaný vektor, nazvaný delta-7/V8, dovoľuje expresiu proteínu delta-7-Red indukovateľnou galalaktózou.
b) Príprava proteínu delta-7-Red
Kmeň FY 1679 kvasiniek (Mata) bol transformovaný plazmidom delta-7/V8 získaným skôr, používajúc pritom metódu lítiumacetátu, ktorú opísal D. Gictz a kol. (citované skôr).
Transformované kvasinky sa kultivovali pri teplote 27 °C na selektívnej kultivačnej pôde SGI, opísanej skôr, ale v ktorej koncentrácia glukózy bola 5 g/1, a to až do dosiahnutia nasýtenia bunkovej hustoty (D06oonm = 12). Kultúra sa potom zriedi pridaním úplnej kultivačnej pôdy YP (10 g/1) kvasinkového extraktu (Difco) a 10 g/1 bactopeptónu (Difco), potom sa pridá etanol /1,5.
Postup sa uskutočnil aj na minimálnej selektívnej kultivačnej pôde SLI, ktorá zodpovedá kultivačnej pôde SGI, v ktorej je glukóza nahradená galaktózou s koncentráciou 20 g/1 a kde sa dosiahla bunková koncentrácia 2 x 107 buniek/ml.
c) Enzymatický test in vitro účinku delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy
Expresia proteínu delta-7-Red sa dokázala pomocou enzýmového testu, ktorý opísal M. Tatom a kol. (Biochem. Bioph. Res. Commun., 181, 465 - 473, 1991), ale bez systému regenerácie NADPH, s mikrozómovými alebo cytozolickými časťami buniek kvasiniek, pripravených postupmi uvedenými skôr.
Bunkové frakcie sa získali mechanickou deštrukciou získaných buniek a izoláciou frakcií ultracentrifugáciou podľa metódy, ktorú opísal P. Urban a kol. (Eur. J. Biochem., 222, 843 - 850, 1994). Bunky sa dvakrát premývajú tlmivým roztokom TE-KC1 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM, KC1 0,1 M) a suspendujú lyžujúcim tlmivým roztokom TE-sorbitol 0,6 M. Pridajú sa sklené guľôčky s priemerom 0,45 - 0,5 mm do výšky hladiny bunkovej suspenzie, ktorá sa mieša 5 min. pri 4 °C. Bunkový lyzát na povrchu sa zoberie a sklené guľôčky sa trikrát premyjú lyzačným tlmivým roztokom. Lyzát a premývací roztok sa spoja a potom centrifugujú pri 20 000 g 13 minút pri 4 °C, aby sa eliminovali mitochondriálne frakcie. Časť odobrená z povrchu sa centrifuguje 1 hodinu pri 100 000 g a pri 4 °C. Usadenina, ktorá obsahuje mikrozómovú frakciu, a povrchová zložka, ktorá predstavuje cytozolickú frakciu, sa získajú oddelene.
Mikrozómová a cytozolická frakcia sa separátne inkubujú 90 minút pri 37 °C v tlmivom roztoku Tris/Hcl 100 mM a pH 7,3, ktorý obsahuje ako substrát 7-dehydrocholesterol 150 μΜ emulzifikovaný s tween 80 (1,5 g/1) a v prítomnosti NADPH 2 mM. Steroly sa extrahujú pridaním 3 objemových dielov zmesi metanoldichlórmetán (50 : 50 objemovo) a potom analyzujú plynovou chromatografiou a porovnávajú s kontrolnou vzorkou.
Tvorbu cholesterolu (TR = 15,887 min.) zo 7-dehydrocholesterolu (TR = 16,528 min.) ukazuje obrázok 4, kde je znázornená frakcia mikrozómová (3,5 mg/ml proteínu), získaná postupom opísaným skôr z kvasiniek FY 1679 transformovaných vektorom delta-7/V8, pôsobiacim 3 hodiny, takže jeho endogénne steroly majú čas na vyššiu retenciu (TR= 16,682 min. pre ergosta-5-22-dién-3-ol;
TR = 17,249 min. pre ergosterol a TR = 17,664 min. pre ergosta-5-én-3-ol).
Tieto výsledky ukazujú, že protein delta-7-Red je najprv exprimovaný v transformovaných kvasinkách a ďalej, že má účinok delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy.
Príklad 2
Redukcia in vivo endogénnych sterolov kvasiniek nenasýtených v polohe C-7
Kmene kvasiniek, ktorých majoritné steroly majú dvojitú väzbu v polohe C-5,7 boli transformované vektorom delta-7/V8 získaným v príklade 1, potom kultivované a indukované tak, ako je to opísané v príklade 1. Endogénne steroly, ktorých profil je analyzovaný plynovou chromatografiou, boli extrahované a purifikované pomocou RP-HPLC tak, ako už bolo opísané v príklade 1, používajúc preparatívnu kolónu CI8 (100 x 4,6 mm), a potom identifikované pomocou IR, UV, hmotnostným spektrografom a NMR. Použili sa nasledujúce tri kmene:
- kmeň FY 1679, opísaný v príklade 1,
- kmeň mutant erg5, nazvaný PLC 1051, vyznačený defíciencou sterol-C-22-denaturázy, ktorý' bol pripravený krížením medzi kmeňmi FY 1679 a originálnym kmeňom pol5, ktorý opísal S. W. Molzahn a kol. (J. Gen. Microbiol., 72, 339 - 348, 1972) a ktorý akumuluje ergosta-5,7-dicn-3-ol,
- kmeň dvojitý mutant erg4,5, pomenovaný PLC 1451, vyznačený deficienciou sterol-C-22-denaturázy (erg5) a sterol-C-24-(28)-reduktázy (erg4), ktorý bol pripravený krížením medzi kmeňom FY 1679 a kmeňom poI5, opísaným
S. W. Molzahnom (citované skôr), ktorý získal spontánnu rezistenciu proti nystatínu počas systematického hybridizačného prehľadávania kvasiniek pri hľadaní mutantov sterolu, a ktorý' akumuluje ergosta-5,7,24-(28)-trién-3-ol. Vzniknutý haploidný kmeň, ktorý nesie dvojitú mutáciu erg4, erg5, rastie v prítomnosti galaktózy a nefermentovateľného substrátu a je auxotropný pre uracil, tryptofán a histidín. Kmene PLC 1051 a PLC 1451 boli deponované na CNCM dňa 10. februára 1995 pod číslami 1-1536 a 1-1537.
Redukované majoritné steroly identifikované pri uvedených troch transformovaných kmeňoch sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
Východiskový km f ň
Irtlclílny majoritný endogénny štekol
Majoritný endogénny sterol redukovaný v C-7
FY 1679 erg? PLC 105» erg4,5 PLC 145» ergosta-5,7(22-trién-3-ol ergo3ta-5-én-3-ol /ergostvrol·/ /áihydrobrôssicaeteroV
8rgO8te-5,22-diín-j-oi Zbuseieasterol/ orgoste~5,7-dién-3-ol er<03ta-5-én-3-el ergosta-5,7-24Í28)-trién- ergoata-5,24(28)-diéni-ol 3-ol /ostreasterol/
Príklad 3
Príprava pregnenolónu in vitro štiepenín endogénnych sterolov kvasiniek redukovaných v C-7
Príprava pregnenolónu sa uskutočňuje pomocou enzýmového testu štiepenia bočného reťazca cholesterolu in vitro, ktorý opísal Wada a kol. (Árch. Biochem. Biophys., 290, 376 - 380, 1991), v ktorom 260 μΜ sterolu redukovaného v C-7 a získaného v príklade 2 sa inkubuje v 150 μί fosfátového tlmivého roztoku 10 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, tween 20 0,3. Reakcia sa začne pridaním 150 μΜ NADPH. Po inkubácii 80 minút pri 37 °C sa reakcia zastaví pridaním jedného objemového dielu zmesi metanoldichlórmetán (50 : 50 objemovo). Steroly sa extrahujú a analyzujú plynovou chromatografiou, ako je opísané v príklade 1.
Obrázok 5 ukazuje, že keď ergosta-5-én-3-ol (obr. 5A), ergosta-5,24(28)-dién-3-ol (obr. 5B) a ergosta-5,22-dién-3-ol (obr. 5C) sú substráty cytochrómu P4J0SCC, vedú k produktu, ktorý má TR identické hodnote pregnenolónu, získaného za rovnakých podmienok štiepením cholesterolu.
Získané výsledky ukazujú, že transformované kvasinky exprimujúce delta-7-Red akumulujú steroly priamo použiteľné na prípravu pregnenolónu biologickou oxidáciou in vitro.
Príklad 4
Konštrukcia kmeňov kvasiniek, produkujúcich in vivo pregnenolón alebo jeho ester s kyselinou octovou
A - Konštrukcia kmeňa ELR01, obsahujúceho gén expresie pre delta-7-Red A. thaliana, integrovaná do miesta ADE2 haploidného kmeňa FY 1679 matingového typu a (FY 1679 Mata)
a) Konštrukcia integrovaného plazmidu pADdelta-7(pADA7):
Konštrukcia plazmidu pADA7 bola vedená tak, ako je opísaná na obrázku 6. Fragment BglII (2244pb) obsahujúci gén ADE2 S. cerevisiae bol izolovaný z plazmidu pASZ 11 (A. Stoltz a kol., Gene, 95, 91, 1990) a vložený do vektora pBluescriptII KS+ (Stratagen) od miesta BamHI do viacnásobného klonovacieho miesta.
Získaný plazmid, označený pBS-ADE2, bol potom linearizovaný vo svojom jedinom mieste Stul a defosforylovaný.
Fragment s veľkosťou asi 2,44 kb, obsahujúci promótor GAL10/CYC1, kódujúci fázu delta-7-Red (sterol-A7-reduktázu) a terminátor PGK (tPGK), bol získaný z plazmidu delta-7/V8, získaného v príklade 1F technikou PCR, využívajúc ako printery nasledujúce oligonukleotidy:
5' GATTACGCCA AGCTTTTCGA CCA 3' (SEQ ID No. 6) a
5' AGATCTTGAG AAGATGCCGC CAGCAAAAC 3' (SEQ ID No. 7) ktoré boli určené na to, aby sa pripárovali na koncoch 3' pri tPGK a 3' génu URA3. Ako matrica (80 ng) sa použil plazmid delta-7/V8, ďalej sa použili nukleotidy opísané skôr (0,5 μΜ každý), Pfu DNA prírodné polymerázy (1 jednotka v tlmivom roztoku doporučenom Stratagenom), a to za týchto podmienok: 35 cyklov; 1 min. pri 95 °C; 5 s pri 95 °C; 30 s pri 56 °C; 4 min. 30 s pri 70 °C. Fragment získaný amplifikáciou sa potom klonoval za voľné konce v plazmide pBS-ADE2 linearizovanom skôr, čím sa získal plazmid pADA7, v ktorom fragment Notl-Pstl s veľkosťou asi 4720 pb nesie gén ADE2, prerušený génom expresie delta-7-Red.
b) Chromozómová integrácia v kmeni kvasiniek FY 1679 Mata:
Fragment Notl-PSTI (4720 bp), izolovaný z plazmidu pADA7 natráveného reštrikčnými enzýmami Nôti a PstI, bol vložený do kvasiniek FY 1679 Mata využívajúc metódu lítiumacetátu, ktorú opísal D. Gietz a kol. (citované skôr).
Transformanty, do ktorých bol tento fragment vložený homologickou rekombináciou, sa selektovali na základe ich rezistencie proti nystatínu, pričom tento fenotyp vyšiel z expresie delta-7-Red, ktorý konvertoval delta-5,7-steroly kvasiniek na delta-5-steroly.
Transformované bunky boli inkubované pri 28 °C hodiny na úplnej kultivačnej pôde YP, opísanej v príklade 1F a obsahujúcej glukózu (20 g/1) a doplnenej adenínom (20 mg/1). Tie potom boli koncentrované a rozotreté na minimálnu kultivačnú pôdu SLI-agar (1 g/1 bactocasaminokyseliny; 7 g/1 „yeast nitrogen base“; 20 g/1 galaktózy; 201 mg/1 adenínu; 20 g/1 agaru) a inkubovali sa jednu noc pri 28 °C, aby sa indukovala expresia génu delta-7-Red. Neprítomnosť uracilovej komplementácie umožňuje obmedziť pribúdanie buniek. Klony sú zhromaždené, nanesené do misiek na úplnú kultivačnú pôdu YL, obsahujúcu galaktózu (20 g/1) doplnenú adenínom (20 mg/1) a v prítomnosti rastúcich koncentrácií nystatínu (0 pg/ml, 1 pg/ml, 2 pg/ml, pg/ml, 20 pg/ml). Štvrtý deň sa v koncentrácii 5 pg/ml nystatínu vytvorilo približne 20 klonov. Dvanásť z týchto klonov sa presadilo na minimálnu kultivačnú pôdu WO (7 g/1 „yeast nitrogen base“ bez aminokyselín, 20 g/1 glukózy) obohatenú uracilom, leucinom, tryptofánom, histidínom a adenínom (20 mg/1 každého).
Autotrofia na adenín, spôsobovaná prerušením génu ADE2, bola potom potvrdená pozorovaním neprítomnosti rastu na kultivačnej pôde WO, obohatenej uracilom, leucínom, tryptofánom, histidínom, ale bez adenínu.
Prítomnosť génu expresie v genóme kvasiniek sa určovala amplifikáciou získaných klonov pomocou PCR vychádzajúc z genómovej DNA a používajúc prímery so sekvenciou SEQ ID No. 6 a SEQ ID No. 7, opísané skôr.
Funkčnosť vloženého génu delta-7-Red sa potvrdila analýzou zloženia sterolov akumulovaných v kvasinkách a extrahovaných alkalickým zmydelnením, spôsobom opísaným v príklade 1B pomocou plynovej chromatografie na kapilárnej kolóne SE 30 s dĺžkou 5 metrov (ALLtech). Analýza ukazuje modifikovanú krivku udávajúcu steroly nasýtené v C-7, ak sú klony kultivované za prítomnosti galaktózy. Získaný kmeň, označený ERL01, akumuluje ergosta-5-én-3-ol a ergosta-5,22-dién-3-ol namiesto ergosta-5,7,22-trién-3-ol (ergosterol), čo je majoritný sterol iniciálneho kmeňa FY 1679, ako je znázornené na obrázku 7.
Takto získaný kmeň ERL01 exprimuje vďaka transkripčnej kontrole promótorom GAL10/CYC1 gén delta-7-Red, ak je kultivovaný v prítomnosti galaktózy. Aj keď má jednotka exprimujúca delta-7-Red rovnaký smer transkrip cie ako gén ADE2, nie je žiadna expresia delta-7-Red detegovateľná analýzou zmesi sterolov plynovou chromatografiou, ak je kultúra pestovaná v prítomnosti glukózy', pretože táto pôsobí represiu promótora GAL10/CYC1.
B - Konštrukcia kmeňa CDR01, obsahujúceho gén expresie pre zrelú formu dobytčej adrenodoxínreduktázy (ADRm), vloženej medzi miestami LEU2 a SPL1 haploidného kmeňa FY 1679 mating typu alfa (mat alpha).
a) Konštrukcia člnkového vektora E. coli - S. cerevisiae V13
Vektor V13 zodpovedá vektoru V8 (C. Cullin a kol., citované skôr), ktorý nesie marker selekcie URA3 a gén expresie v kvasinkách obsahujúcich promótor GAL 10-CYC1 (pG/C) a v ktorom bolo vložené do viacnásobného klonovacieho miesta dodatočné miesto Sali (Sa) podľa schémy na obrázku 8.
Vektor V8 bol natrávený reštrikčnými enzýmami Hind III a BamHI a získaný fragment BamHI-HindlII (1722 pb), obsahujúci gén URA3 a promótor GAL10/CYC1 (značený ďalej ako „ura-gal“), bol klonovaný medzi príslušné miesta vektora pUC18 (Pharmacia), natráveného reštrikčnými vektormi HindlII a BamHI.
Fragment „ura-gal“ bol potom amplifikovaný pomocou PCR, vychádzajúc z 30 ng získaného plazmidu pUC18-,,ura-gal“, denaturovaného 30 s pri 95 °C za nasledujúcich podmienok: 30 cyklov; 5 s pri 86 °C; 10 s pri 95 °C; 40 s pri 38 °C; 5 s pri 55 °C a 2 min. pri 74 °C, 2 jednotky Taq DNA-polymerázy (Boehringer) v tlmivom roztoku výrobcu a 1 μΜ každého z prímerov s nasledujúcou nukleotidovou sekvenciou:
5’ GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTCTG TGTATTTGTG TTTGCG 3’ (SEQ ID No. 8) a
5' GTAAAACGAC GGCCAGT 3’ (SEQ ID No. 9)
Prímer SEQ ID No. 8 obsahuje miesto BamHI GGATCC identické miestu vo fragmente „ura-gal“, 3 za sebou nasledujúce nukleotidy v mieste BamHI, ktoré sa nehybridizujú na matrici, miesto Sali GTCGAC a sekvenciu, ktorá je homologická sekvencii GAL10-CYC1. Prímer SEQ ID No. 9 sa páruje na predchádzajúcu sekvenciu od miesta HindlII do miesta viacnásobného klonovania pU18. Fragment HindlII-BamHI s 1722 pb získaný po amplifíkácii bol natrávený Xhol a BamHI, čím sa uvoľnil fragment s 254 pb obsahujúci promótor GAL10/CYC1 (pG/C), ktorý bol potom klonovaný do vektora V8 natráveného reštrikčnými enzýmami BamHI a Xhol.
Fragment „ura-gal“ bol potom amplifikovaný pomocou PCR z 30 ng získaného plazmidu pUC18- „ura-gal“ denaturovaného 30 s pri 95 °C za nasledujúcich podmienok: 30 cyklov; 5 s pri 86 °C; 10 s pri 95 °C; 40 s pri 38 °C; 5 s pri 55 °C a 2 min. pri 74 °C, 2 jednotky Taq DNA-polymerázy (Beohringer) v tlmivom roztoku výrobcu a 1 μΜ každého z prímerov s nasledujúcimi nukleotidovými sekvenciami:
S' GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3’ (SEQ ID No. 8) a
S' GTAAAACGAC GGCCAGT 3’ (SEQ ID No. 9)
Prímer SEQ ID No. 8 obsahuje miesto BamHI GGATCC identické miestu fragmentu „ura-gal“, pričom 3 za sebou nasledujúce nukleotidy miesta BamHI nehybridizuje na matrici, miesto Sali GTCGAC a sekvenciu homologickú sekvencii promótora GAL10/CYC1. Prímer SEQ ID No. 9 sa páruje k sekvencii predchádzajúcej miesto HindlII viacnásobného klonovacieho miesta pUC18. Fragment HindlII-BamHI s 1722 pb, získaný po amplifikácii, bol natrávený pomocou Xhol a BamHI, čím sa uvoľnil fragment 254 pb obsahujúci promótor GAL10/CYC1 (pG/C), ktorý bol potom klonovaný do vektora V8 natráveného reštrikčnými BamHI a Xhol.
Vzniknutý vektor V13 obsahuje reštrikčné miesta umožňujúce ľahko klonovať cDNA, kódujúcu maturovanú dobytčiu adrenoxínreduktázu ADRm, maturovaný dobytčí adrenodoxín (ADXm) a dobytčí cytochróm P450SCC:
Z vektoru V13 boli pripravené vektory V13-ADR, vektor V13-ADX a vektor V13-SCC10 nasledujúcim spôsobom:
a) Konštrukcia vektora VI3-ADR
Fragment Sall-Knpl s 1478 pb nesúci cDNA kódujúci ADRm bol izolovaný z plazmidu pGBADR-2 opísaného v príklade 25 prihlášky európskeho patentu EP 340878 a klonovaný do príslušných miest vektora V13, čím sa získa vektor VI 3-ADR.
β) Konštrukcia vektora V13-ADX
Fragment Sali BamHI s 390 pb nesúci cDNA kódujúcu ADXm bol izolovaný z plazmidu PGBADX-1 opísaného v príklade 23 prihlášky európskeho patentu EP 340878 a klonovaný do príslušných miest vektora V13, čím sa získa vektor V13-ADX.
γ) Konštrukcia vektora V13-SCC10
Fragment Sali EcoRI s 1554 pb, nesúci cDNA kódujúcu P450SCC, bol izolovaný z plazmidu PGBSCC-I0 opísaného v príklade 6 prihlášky európskeho patentu EP 340878 a klonovaný do príslušných miest vektora V13, čím sa získa vektor V13-SCC10.
b) Konštrukcia integrovaných plazmidov pCD62-l a PCS62-2
Konštrukcia plazmidov pCD62-l a pCS62-2 sa uskutočňovala podľa obrázka 9.
a) Konštrukcia plazmidu pFL26CD
Do plazmidu pFL26 bolo vložené miesto Nôti (N. Bonneaud a kol., Yeast, 7, 609 - 615, 1991), a to v medzigénovej oblasti separujúcej gén leu2 od konca 5' génu spil (a označenej spllA) (C. Kolman a kol., J. Bacteriol., 175, 1433, 1993), používajúc nasledujúci postup:
Dva fragmenty DNA so 704 pb a 347 pb nesúce zakončenie 5' leu2 a zakončenie 3' spllA, boli syntetizované pomocou PCR, využívajúcej prímery s nasledujúcimi nukleotidovými sekvenciami:
5’ TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTC 3’ (SEQ ID No. 10) a
5' GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3' (SEQ ID No. 11) pre amplifikáciu fragmentu 704 pb a nukleotidové sekvencie:
5' CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3’ (SEQ ID
No. 12) a
5’ TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3' (SEQ ID No. 13) pre amplifikáciu fragmentu 347 pb.
Prímery SEQ ID No. 11 a SEQ ID No. 12 obsahujú sekvenciu GGCGGCCG, ktorá zodpovedá miestu NotI a v ktorom 3 bázy sa nepárujú s metricou. Prímer SEQ ID No. 10 sa páruje k sekvencii situovanej 536 pb pred kodónom stop leu2 a prímer SEQ ID No. 13 k sekvencii situovanej 194 pb pred kodónom stop spllA.
Fragmenty 704 pb a 347 pb sú najskôr amplifikované pomocou PCR, používajúc ako matricu plazmid pFL26 a ako enzým Pfu DNA-polymerázu za štandardných podmienok opísaných dodávateľom (Stratagen).
Dva získané amplifikované segmenty sa párujú na 20 pb na úrovni koncov generovaných prímerom SEQ ID No. 11 (fragment 704 pb) a prímerom SEQ ID No. 12 (fragment 347 pb) počínajúc od konca 5'; týchto príslušných 20 pb zodpovedá 20 prvým nukleotidom každého z prímerov.
Vzniknutý produkt párovania fragmentov DNA 704 pb (1 ng) a 347 pb (2 ng) bol amplifikovaný používajúc printery SEQ ID No. 10 a SEQ ID No. 13 za nasledujúcich podmienok: 30 cyklov po 10 s pri 95 °C; 5 s pri 60 °C; 1 min. pri 45 °C; 5 s pri 65 “C a 2 min. pri 72 °C, nasledované 1 cyklom 7 min. pri 72 °C; 50 pmol každého z prímerov a 1 jednotka Pfu DNA-polymerázy v 50 pl reakčného tlmivého roztoku (Stratagen). Získal sa amplifikovaný fragment 1031 pb obsahujúci štiepiteľné miesto Notl. Tento fragment bol potom natrávený enzýmami BstXI a Nsil a získaný fragment 920 pb, obsahujúci miesto Notl, bol vložený na miesto fragmentu BstXI-Nsil pôvodného pFL26, čím sa získal plazmid pFL26CD, ktorého mapa je znázornená na obrázku 9a.
β) Konštrukcia plazmidu pCD60 Príprava plazmidu pDPlC036:
Fragment Sall-BamHI s 390 pb nesúci cDNA kódujúcu maturovaný dobytčí adrenodoxín (ADXm) bol izolovaný z plazmidu V13-ADX a potom klonovaný do miest Sall-BglII miesta viacnásobného klonovania plazmidu pTG10033, ktoré je ohraničené induktibilným promótorom GAL10/CYC1 a terminátorom ter PGK. Plazmid pTG10033, ktorého mapa je znázornená na obrázku 18 a ktorý zodpovedá vektoru expresie pTGlCC31 (obrázok 17), obsahujúci promótor CYC1 a terPGK, v ktorom bol promótor CYC1 nahradený promótorom GAL10/CYC1, bol pripravený spôsobom opísaným ďalej.
Takto získaný plazmid, označený pDP10034, nesie gén expresie ADX, t. j. gén kódujúci ADXm pod transkripčnou kontrolou GAL10/CYC1 a terPGK. V nasledujúcom bude výraz „gén expresie“ používaný pre všetky gény transkripčne závislé od GAL10/CYC1 a terPGK.
Fragment HindlII s 3593 pb, nesúci marker selekcie URA3, a gén expresie ADR, bol izolovaný z plazmidu V13-ADR natráveného reštrikčným enzýmom Hindlll a potom vložený do príslušného miesta plazmidu pDP 10034, natráveného reštrikčným enzýmom HindlII. Získaný plazmid, označený pDP 10036, obsahuje gény expresie ADX a ADR oddelené navzájom od seba markerom URA3 (obrázok 9b).
Príprava plazmidu pCD60
Fragment AflIII-AccI s 2770 pb, nesúci gén ADR, bol izolovaný čiastočným natrávením plazmidu pDP10036 reštrikčným enzýmom ΑΠΙΙΙ a Accl, pričom voľné konce sa vytvorili pomocou Klenowovho fragmentu DNA-polymerázy a klonovali sa ligáciou voľných koncov do miesta Smal plazmidu pBlue-Script KS+ (Stratagen). V získanom plazmide, nazvanom pCD60, je gén expresie ADR ohraničený z jednej i druhej strany miestom Notl, pričom jedno sa nachádza 209 pb pred ligačným miestom AfllII/ Smal a pochádza z klonovaného fragmentu a druhé pochádza z miesta viacnásobného klonovania (SCM1) pBlue-Script KS+ (obrázok 9b) γ) Konštrukcia plazmidov pCD62-l a pCD62-2
Fragment Notl s 2558 pb, izolovaný z plazmidu pCD60, natráveného reštrikčným enzýmom Notl, bol potom klonovaný do jediného miesta Notl plazmidu pFL26CD.
Podľa smeru vloženia fragmentu sa získali dva plazmidy, ktoré boli označené pCD62-l a pCD62-2 (obrázok 9c).
V plazmide pCD62-l je gén expresie ADR orientovaný v smere transkripcie génu leu2, zatiaľ čo v plazmide pCD62-2 je orientácia opačná.
Plazmid pCD62-l sa ponechal pre konštrukcie opísané ďalej.
c) Chromozomatická integrácia v kmeni kvasiniek FY1679 (Matalpha):
Plazmid pCD62-l obsahuje oblasti homologické chromozómovému locusu kmeňa FY 1679. Tieto oblasti zodpovedajú po rade fragmentom BglII-Clal s 1060 pb A., EcoRI-Notl s 707 pb (B), a Notl-BglII so 602 pb (C)., znázornené na obrázku 10.
Príslušná oblasť na fragmente Clal-EcoRI so 486 pb plazmidu pCD62-l bola vynechaná v kmeni FY 1679, čo viedlo k auxotrofii tohto kmeňa vzhľadom na leucín (kmeň LEU2 ) (R. S. Sikorski a kol., Genetics, 122, 19, 1989).
Plazmid pCD62-l bol linearizovaný natrávením reštrikčným enzýmom Xbal, ktorého reštrikčné miesto je situované mimo homologickej oblasti, potom bol vložený do kmeňa FY 1679 (Matalpha s využitím metódy lítiumacetátu (D. Gietz a kol., citované skôr).
Schopnosť bunkovej opravy DNA kvasinkami („gap repair“) a selekcia rekombinantov s fenotypom LEU2+ umožnila najskôr selekciu dvoch typov rekombinantov; prvý typ sa získa homologickou rekombináciou na úrovni fragmentov A a B, druhý typ sa získa homologickou rekombináciou na úrovni fragmentov A a C. Len tento posledný typ rekombinácie dovolil navyše k obnoveniu fenotypu LEU2+ integráciu gén expresie ADR.
Pre selekciu tohto druhého typu klonu sa uskutočnilo hybridizačným prehľadávaním pomocou PCR s využitím ako prímeru SEQ ID No. 10 opísaným skôr a prímeru s nasledujúcou nukleotidovou sekvenciou:
5’ TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3’ (SEQ ID No. 14) aby bola potvrdená prítomnosť a okrem toho i presná lokalizácia génu expresie ADR v genóme kmeňa FY 1679 (Matalpha).
V tomto prehľadávaní sa primer SEQ ID No. 14 páruje výhradne na sekvenciu kódujúcu ADRm a primer SEQ ID No. 10 sa páruje na chromozómovú sekvenciu (obrázok 10).
Amplifikačná reakcia sa uskutočnila s použitím matrice tvorenej genómovou DNA (20 ng), izolovanou z kmeňa FY 1679 (Matalpha) (C. Hoffman a kol., Gene, 57, 267, 1987) Taq DNA-polymerázou (1U, Boehringer), 50 pmol každého z primárov a 30 cyklami PCR (lOs pri 95 °C, 1 min. pri 55 °C a 3 min. pri 72 °C) za štandardných podmienok opísaných dodávateľom.
Amplifikácia viedla k izolácii príslušného fragmentu 2,9 kb v prípade, že gén expresie bol integrovaný. V opačnom prípade nebol detegovaný žiadny amplifikačný produkt.
Takto získaný kmeň FZ1679 (Matalpha), obsahujúci vložený gén expresie ADR bol pomenovaný CDR01.
Expresia ADR týmto kmeňom bola dokázaná pomocou cytozolických bunkových frakcií pripravených postupom opísaným v príklade 1F imunodetekciou proteínu protilátkami anti-ADR.
Funkčnosť ADR expriminovancho kmeňom CDR01 bola potvrdená testom enzýmového štiepenia bočného reťazca cholesterolu in vitro, ako bol opísaný v príklade 3 a v ktorom purifikovaná ADR (0,28 pmol) bola nahradená cytozolickou bunkovou frakciou kmeňa CDR01, obsahujúcou celkovo 100 pg proteínov. Pozorovala sa biokonverzia cholesterolu na pregnenolón s výťažkom asi 25.
C - Konštrukcia diploidného kmeňa EC01 koexprimujúceho delta-7-Red A. thaliana a ADRm.
Diploidný kmeň EC01 bol získaný krížením haploidných kmeňov CDR01 a ELR01 postupom, opísaným G. Spraguom a kol. (Methods in Enzymology, 194, 77, 1991).
Pomocou prvej selekcie na minimálnej kultivačnej pôde WO, opísanej skôr a obohatenej uracilom, tryptofánom a histidínom (20 mg/1 každého), ale neobsahujúcej leucín, boli získané diploidné klony LEU2+ (prototrofný typ, dokazujúci prítomnosť génu expresie ADR). Tieto klony sa potom testovali na odolnosť na nystatín pri 5 pg/ml (rezistencia, ktorá dokazuje prítomnosť génu expresie delta-7-Red) na pevnej syntetickej kultivačnej pôde SLI-agar, opísanej skôr.
Jeden kmeň, označený EC01, bol takto izolovaný náhodným spôsobom z klonov rezistentných na nystatín.
D - Konštrukcia kmeňa EC01-pCD63 produkujúceho pregnenolón apregnenolón-3-octan
a) Konštrukcia plazmidu expresie pCD63
Konštrukcia plazmaidu pCD63 sa uskutočňovala spôsobom opísaným na obrázku 11.
Fragment Nôti so 4961 pb obsahujúci gén expresie ADX, marker selekcie URA3 a gén expresie ADR sa izolovali z plazmidu pDP 10036, pripraveného opísaným spôsobom a natrávili reštrikčným enzýmom Nôti, potom klonovali do miesta Nôti v mieste viacnásobného klonovania plazmidu pFL45L. (N. Bonneaud a kol., Yeast 7, 609, 1991). Takto získaný vektor, označený pDP10037, je znázornený na obrázku 11.
Najskôr bol plazmid pDP10037 linearizovaný natrávením enzýmom Tthlllll, ktorého reštrikčné miesto sa nachádza v géne kódujúcom ADRm. Okrem toho bol z plazmidu V13-SCC10 získaného opísaným spôsobom purifikovaný fragment PvuII-EcoRV s 3476 pb obsahujúci gén expresie P450SCC a koniec 5' markeru URA3 a natrávený reštrikčnými enzýmami PvuII a EcoRV.
Dve lineárne DNA získané týmito spôsobmi majú homologické oblasti zodpovedajúce na jednej strane konci 5' génu URA3 a GAL10/CYC1, na druhej strane terPGK tak, ako je to znázornené na obrázku 11a.
Tieto dva fragmenty sa potom vložili do kmeňa kvasiniek FY 1679 (Mata) kotransformáciou pomocou metódy lítiumacetátu (D. Gietz, citované skôr).
Nasledujúca selekcia rekombinátov prototropných na uracil a tryptofán (URA3+, TRP1+) umožnila izolovať klony, v ktorých zlom dvojitého vlákna vyvolaný natrávením reštrikčným enzýmom Tthl 1II bol opravený integráciou génu expresie P450SCC homologickou rekombináciou.
Selekcia rekombinantov (URA3+, TRP1+) sa uskutočnila na minimálnej kultivačnej pôde WO obohatenej leucínom, histidínom a leucínom (20 mg/1 každý), ale zbavenej uracilu a tryptofánu. Z celkovo 50 klonov bola DNA extrahovaná metódou, ktorú opísal C. Hoffman a kol. (Gene 57, 267, 1987) a potom elektroporáciou vložená do kmeňa
E. coli XLl-Blue (Stratagen). Klony transformované plazmidom generovaným pomocou „gap repair“ boli selektované na obohatenej kultivačnej pôde LB /trypton 1.
b) Transformácia kmeňa EC01 plazmidom pCD63.
Do získaného kmeňa EC01 sa vložil plazmid pCD63 transformáciou pomocou metódy lítiumacetátu (G. Dietz a kol., citované skôr). Transformované kvasinky sa potom kultivovali na minimálnej kultivačnej pôde WO opísanej skôr a zbavenej uracilu, tryptofánu, adenínu a leucínu, ale obohatenej histidínom (20 mg/1).
Takto bol získaný kmeň, nazvaný EC01/pCD63. Vzorka tohto kmeňa sa deponovala pod referenciou ECO1-pCD63 10. februára 1995 na CNCM pod číslom 1-1538.
c) Produkcia in vivo pregnenolónu a pregnenolón-3-octanu
Kmeň EC01/pCD63 sa kultivoval pri 28 °C v aerobióze (130 t/min.) v Erlenmeyerovej banke s objemom 3 litre až do dosiahnutia stacionárnej fázy rastu (DO600 = 12 až 13) na selektívnej kultivačnej pôde SGI opísanom v príklade 1A a v ktorom koncentrácia glukózy je 5 g/1. Kultúra sa potom zriedi pridaním jedného objemu úplnej kultivačnej pôdy YP opísanej skôr a potom pridaním etanolu /0,5,
Koexpresia týchto štyroch génov sa dokázala analýzou sterolov nazhromaždených v bunkách a na povrchu kultúry nasledujúcim spôsobom:
Dve vzorky po 50 ml kultúry sa zoberú po 9 a 24 hodinách indukcie. Každá vzorka sa centrifuguje (4000 g, 10 min., 4 °C), aby sa bunky separovali od kultivačnej pôdy.
Na jednej strane sa bunky lyžujú mechanickým lámaním v prítomnosti sklených guľôčok podľa metódy opísanej v príklade 1F. Zo získaného lyzátu sa potom extrahujú medzibunkové steroly pridaním hexánu.
Na druhej strane steroly nachádzajúce sa v kultivačnej pôde sa extrahujú priamo pridaním hexánu.
Zmes extrahovaných sterolov je analyzovaná plynovou chromatografíou tak, ako je to písané v príklade 1, a výsledky sa porovnajú vzhľadom na štandardné vzorky.
Výsledky získané po 9 hodinách a po 24 hodinách indukcie sú znázornené na obrázkoch 12a a 12b.
Obrázok 12 a ukazuje, že po 9 hodinách:
- bunkovom lyzáte je majoritnou zlúčeninou látka s retenčným časom rovnakým ako má štandardný octan pregnenolónu (TB = 11,8 min.), zatiaľ čo retenčnému času pregnenolónu (TR = 9,9 min.) zodpovedá len veľmi slabé zvýšenie. Malé množstvá endogénnych sterolov kvasiniek, redukovaných na C-7 (ergosta-5-én-3-ol a ergosta-5,22-di-én-3ol) sú identifikované pri TR = 18 min. a TR = 17 min. Alkalické zmydelnenie bunkového lyzátu pred analýzou vedie k prítomnosti majoritnej zlúčeniny komigrujúcej s pregnenolónom. To umožňuje potvrdiť, že akumulované zlúčeniny s TR = 11,8 min. zodpovedajú octanu pregnenolónu.
- kultivačnej pôde je zistená dokázateľná absencia pregnenolónu i jeho octanu.
Obrázok 12b ukazuje, že po 24 hodinách indukcie:
- bunkovom lyzáte je zistená prítomnosť malého množstva pregnenolónu (TR = 10,2 min.) a octanu pregnenolónu (TR = 12 min.) rovnako, ako aj redukovaných endogénnych sterolov kvasiniek (TR = 17 min. a TR = 18 min.). Cholesterol (TR = 16,2 min.) je vnútorný štandard pridaný pred extrakciou.
- kultivačnej podeje dokázaná majoritná prítomnosť octanu pregnenolónu a minoritné množstvo pregnenolónu.
Pokusy uskutočňované simultánne s kmeňom EC01 transformovaným referenčným plazmidom, ako je napríklad pFL45L, už citovaným, nevykázali žiadny pík zodpovedajúci voľnému pregnenolónu alebo jeho octanu.
Identifikácia takto pripravených sterolov ukazuje, že kmeň kvasiniek F.C01-pCD63 akumuloval pregnenolón a octan pregnenolónu za absencie akéhokoľvek zdroja exogénnych sterolov, a to po indukcii v prítomnosti galaktózy a s najväčšou produkciou po inkubácii počas 9 hodín.
Tieto výsledky ukazujú na jednej strane účinnú mobilizáciu endogénnych sterolov redukovaných v polohe C-7 kmeňa EC01 a na druhej strane veľmi vysokú účinnosť štiepenia bočného reťazca endogénnych sterolov.
Tabuľka: rekapitulácia integrovaných kmeňov.
Rekapitulačná tabuľka integrovaných kmeňov
Kmeň Integračné nieeto Integroval gén ý Tranal plazali Plastiiď aarker Gén na pltžttlde S«l«vený earkar
CDR01 (Mate) LEU-SPL1 ADRm • HIS3.URA3, TRPÍ
ERL01 (Mate) ADE2 delta7Red ADE2.URA3 LEU2.HIS3 TRPÍ
EC01 (diploiání LEU2-SPL1 +ADE2 ADRm delta7Red - - HIS3.URA3, TRPÍ
EC01/ pCD63 LEU2-SPL1 + ADE2 ADRm delta 7Red pCD63 URA3 TRPÍ ADXm P450SCC HIS3
Príprava príkladu 4: konštrukcia plazmidu pTG10033
1. Derivát pUC19 s novým miestom viacnásobného klonovania:
Klonovací vektor M13mpl9 (C. Zanish-Peron a kol., Gene, 33, 103, 1985) bol mutagenizovaný s použitím nasledujúceho oligonukleotidu:
5' GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3’ SEQ ID No.15 čím sa vloží miesto Nôti do sekvencie skráteného génu lacl, a tým vznikne plazmid M13TG724.
Potom sa do miesta EcoRI plazmidu M13TG724 vloží „polylinker“ obsahujúci miesta EcoRI, SnaBl aNotl využívajúc nasledujúce oligonukleotidové sekvencie:
5’ AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3’ SEQ ID No. 16 a
5’ AATTCATACG TACGCGGCCG C 3’ SEQ ID No. 17 čím sa dostane plazmid M13TG7244, v ktorom bola v štádiu amplifikácie pozorovaná modifikácia inzertu. Inzert plazmidu M13TG7244 má nasledujúcu nukleotidovú sekvenciu:
v ktorej miesta EcoRI, SnaBl a Nôti sú podčiarknuté a sekvencia lacZ pUC19 je napísaná kurzívou.
Po natrávení plazmidu M13TG7244 reštrikčnými enzýmami EcoRI a SstI bol vložený „polylinker“ obsahujúci miesta Mlul a AvrlI s použitím nasledujúcich oligonukleotidov:
5’ CAACGCGTCC TAGG 3' SEQ ID No. 18 a
5’ AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3’ SEQ ID No. 19.
Po natrávení enzýmom PvuII sa získaný fragmct PvuII klonoval do pUC!9 (C. Yanish-Perron a kol., citované skôr), čím sa získal plazmid pTG7457 (obrázok 13).
2. Klonovanie terminátora PGK:
plJCl 9 bol natrávený reštrikčnými enzýmami BamHI a EcoRI a vložený bol nový „polylinker“ BamlII SstI používajúc nasledujúce oligonukleotidy:
5’ GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3’ SEQ ID No.
5' AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3' SBQ ID No. 21
5' CTTGAGCTCT ACCCAGCTCG TCGACAACCTA GGAG 3’ SEQ ID Na 22 &
5' AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3’ SEQ ID No. 23.
Takto získaný plazmid pTG7453 (obrázok 14), ktorý bol potom natrávený reštrikčným enzýmom BamHI a SstI. Miesta „polylinkera“ medzi BamHI a SstI sa vložili do derivátu plazmidu pTG7457 získaného skôr a natrávili reštrikčnými enzýmami BamHI a SstI. Takto získaný nový plazmid obsahuje miesta PvuII, HindlII, BamHI, EcoRI, Xbal, Smal, BglII, SstI (= Sací), Mlul, AvrlI, EcoRI, SnaBl, Nôti, SnaBl, Pvul.
Tento nový plazmid bol natrávený reštrikčnými enzýmami BglII a HindlII a potom bol do neho vložený fragment BglII-IIindlII, obsahujúci promótor PGK (R. A. Hitzeman a kol., Yeast, 5, 497, 1989), čim sa získa plazmid pTG10014 (obrázok 15).
3. Klonovanie promótorov:
a) Promótor CYC1
Miesta „polylinkera“ plazmidu pTG7453 medzi BamHI a SstI boli vložené do derivátu plazmidu pTG7457 opísaným spôsobom. Novo získaný plazmid sa štiepil reštrikčným enzýmom SnaBl a potom sa vložil do neho fragment Rsal-Dral so 456 pb plazmidu pEMBL8 (L. Dente a kol., Nucleic Acid Res., 11, 1645 1983) obsahujúci miesto počiatku replikácie fágu fl, a tým vznikol plazmid pTG7503.
Fragment BamHI HindlII s 0,78 kb plazmidu pGBSCC-9, získaný podľa príkladu 6 v prihláške európskeho patentu EP 0340378 a obsahujúci promótor CYC1 S. cerevisiae, „polylinker“ a terminátor laktázy K. lactis boli potom klonované do plazmidu pTG7503 netráveného reštrikčným enzýmom HindlII a BamHI, a tým sa získal plazmid pTG10004 (obrázok 16).
Miesta Xhol a Mlul promótora CYC1 boli potom eliminované riedenou mutagenézou dvojvláknovej DNA plazmidu pTG 10004 s použitím nasledujúceho oligonukleotidu:
5’ GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3' SEQ ID No. 24.
Plazmid pTG 10005, ktorý sa tým získal, bol potom natrávený reštrikčnými enzýmami Sali a Xhol a potom sa vložilo miesto Mlul s použitím nasledujúcich oligonukleotidov:
5’ TCGACGGACG CGTGG 3’ SEQ ID No. 25 a
5’ TCGACCACGC GTCC 3’ SEQ 1D No. 26, čím vznikol plazmid pTG 10006.
b) Promótor GAL10/CYC1
Plazmid pYeDPl/8-2 (C. Culin a kol., Gene, 203, 1988) bol otvorený reštrikčným enzýmom Xhol. Vytvorené kohezívne konce sa doplnili Klenowovým fragmentom DNA-polymerázy a potom sa plazmid opätovne spojil. Plazmid pTGlOOlO, získaný týmto spôsobom, v ktorom promótor GAL10/CYC1 už neobsahuje miesto Xhol, sa používa ako matrica pre amplifikáciu pomocou PCR.
4. Konštrukcia vektora expresie pTG10031
Zvyšná časť sekvencie kódujúcej lacZ bola v plazmide pTG7503 eliminovaná riadenou mutagenézou s použitím nasledujúceho oligonukleotidu:
5’ TCCCCGTCCT TTTACTOCTG CGCCTGATGC GGTAT 3' SEQ ID No. 27 a tým vznikol plazmid pTG7549.
Promótor LacZ prítomný v plazmide pTG7549 bol potom vypustený s použitím nasledujúceho oligonukleotidu:
5’ GGCCGCAAAA CCAAA 3’ SEQ ID No. 28 a
5’ AGCTTTTGGT TTTGC 3’ SEQ ID No. 29, ktoré boli potom vložené do plazmidu natráveného predtým reštrikčnými enzýmami Nôti a HindlII a ktoré obnovili tieto dve miesta, čím vznikol plazmid pTG7553.
Fragment BamHI Mlul, obsahujúci promótor CYC1, sa získal z plazmidu natráveného reštrikčnými enzýmami BamHI a Mlul a fragment Mlul HindlII, obsahujúci promótor PGK bol izolovaný z plazmidu pTG10015 natráveného reštrikčnými enzýmami Mlul a HindlII. Tieto dva fragmenty boli spojené a ligačný produkt bol vložený do plazmidu pTG7553 natráveného predtým reštrikčnými enzýmami Mlul a HindlII.
Nasledujúci oligonukleotid
5' GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3’ SEQ ID No. 30 hybridizovaný s nasledujúcim oligonukleotidom
5’ CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3' SEQ ID No. 31 ktorý predstavuje „linker“ BamHI Mlul obsahujúci miesta Clal a Nôti sa pridal a ligoval, čím vznikol vektor expresie pTG 10031 (obrázok 17).
Fragment amplifikovaný PCR, získaný skôr z plazmidu pYeDPl/8-2, bol natrávený reštrikčnými enzýmami Clal a Sali a potom vložený do plazmidu pTG10031, predtým natráveného týmito reštrikčnými enzýmami, čím vznikol plazmid pTG 10033 (obrázok 18).
Zoznam sekvencií
1. Všeobecné informácie:
i) Predkladateľ:
A. Meno: Roussel Uclaf
B. Ulica: 102, Route de Noisy
C. Mesto: Romainville
D. Štát: Francúzsko
F. PSČ: 93230
G. Telefón: 49 91 49 91
H. Fax: 49 91 46 10 ii) Názov vynálezu: Sekvencie DNA kódujúce proteín organizmu A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, proteín delta-7-Red, spôsob ich výroby, kmene transformovaných kvasiniek, aplikácie.
iii) Počet sekvencií: 31 iv) Spôsob počítačovej prezentácie:
A. Typ média: pružný disk
B. Počítač: IBM PC compatible
C. Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS
D. Softvér: Patentln Release# 1.0, verše# 1.30 (OEB) vi) Opis predchádzajúcej prihlášky:
A. Číslo prihlášky: FR 9501723
B. Dátum podania: 15. február 1995 vi) Opis predchádzajúcej prihlášky:
A. Číslo prihlášky: FR 9506517
B. Dátum podania: l.jún 1995
2. Informácie pre SEQ ID No. 1:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 1496 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: cDNA vi) Pôvod:
A. Organizmus: Arabidopsis thaliana ix) Charakteristika:
A. Meno/kľuč: CDS
B. Umiestnenie: 76..1365 xi) Opis sekvencie SEQ ID No. 1:
GTGTGMTAA TTTAQGTCAA CACAGA7CA0 AATCIGAGGC TTTGGCCGM ACOAASAGAA60
AAGCAGAAGA AGAAA ATO GCC GAG ACT CTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC111
Met Ala Glu Thr Val Hla Ser Pro íle Val Thr Tyr 151C
GCA TCO ΑΤΟ TTA TCO CTT CTC G CC TTC TCT CCA CCT TTC GTC ATT CIC159
Ala Ser Het Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cya Pre Pro Phe Val íleLeu
20»
CTA TCO TAC ACA ATC GTT CAT CAO O AT OGT TCT GTT ACT CAC ACC TTT207
Leu Trp Tyr Thr Het Val Kle eln Asp Cly Ser Val Thr Gin ThrPhe
3540
GGC TTC TTT ŤCG CAO AKT GGA GTT CAA MA CTT ATC AAC ATA TGG CCA25S
Oly Fhe Phe Trp Olu Asn Oly Val Cln Cly Leu Íle Aen Zle Trp Pro
4$ 50 5560
Λ0Λ CCC ACT τη ATT OCT TC9 ΑΛΑ ATT ATA TTT TGG TAT OOA OCA TTT303
Arg Pro Thr Leu íle Ala Trp Lye Zle íle Phe Cya Tyr Oly Ala Phe
7075 caa cer att crr e*a cra ctí na cct ďct aaa aga ctt gag ggt cca351
Glu Ala íle Leu Gin Leu Leu Leu Pre Gly Lye Arg Val Glu Gly Pro eo 8190
ATA TC1 CCA GCC GGA AAC CCA CCA CTT TAC AAC CCC AAT CCT CTG OCT399
II» Ser Pro Ala Gly Aan Arg Pro Val Tyr Lye Ala Aea Gly Leu Ala
10010»
CCT TAC TTT OTC ACA CTA CCA ACC CA? CTT GGT CTT TCO TCC TTT OCA447
Ale Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr Kla Leu Cly Leu Trp Trp PheOly
110 115120
ATC TTC AAC en GCA ATT GTC TAT CAT CAC TTC CCT CAA ATA TTT TCO495
Íle Phe Aen Pre Ale Íle Val Tyr Aep Kle Leu Cly Olu íle PheSer
125 130 135140
CCA CTA ATA TTC CCA ACC TTC AJA TTT TGT CTT TTC TTC TAC ΑΤΑ AAA»43
Ala Leu íle Phe Oly Ser Phe íle Phe cye Val Lev Leu Tyr Íle Lye
145 150153
CGC CAT CTT GCA CCT TCA TCA ACT CAC TCT GCT TCA TGT GGT AAC CTA991
Cly Kle Val Alt Pro Ser Ser Ser Aep Ser Gly Ser Cye Cly AenLeu
160 165170
ATA ATT CAC TTC TAT TM CCC ATC GAG TTC TAC CCT CCA ATT CCT AAG639
II» íle Aep Phe Tyr Trp Oly Met Clu Leu Tyr Pro Arg íle ClyLye
175 180185
ACC TTT CAC ATC AAG GTC TTT ACT ΑΛΤ TCC ACA TTC GCA ATC ATC TCT667
Ser Phe Asp íle Lye Val Phe Thr Asn Cye Arg Phe Gly Met MetSer
190 195200
TCC CCA CTT CTT GCA GTC ACC TAC TCC ATA AAA CAC TAT CAA ΑΤΑ AAT735
Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cye íle Lye Gin Tyr Glu íleaen
205 210 215220
CCC AAA CTA TCT CAT TCA ATO CTC CÍC AAC ACC ATC CTG ATC CTC OTC Oly ly· Val Ser Aap Ber Met Leu Val Aen Thr íle Leu Met Leu Val
235 230235
783
TAT CTC ACA AAA TTC TTC TCC TCC CAA CCT GGT TAT TGO AAC ACC ATC
Tyr Val Thr Lye Phe phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Aen Thr Mat
240 245250
CAC ATT GCA CAT CAC CCA CCT GGA TTC TAT ATA TCC TCC GCT TCT CTAB79
Aep íle Ala Hla Aep Arg Ale Cly Phe Tyr íle Cye Trp Gly CyaLeu
255 2602(1
GTG TGG GTO CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA CCC ATO TAC CTT GTC AAC»27
Val Trp Val Pro Ber Val Tyr Thr ear Pro Oly Met Tyr Leu ValAsn
270 2752S0
CAC CCC GTC CAA CTC GGA ACT CAG TTG CCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA»75
Kle Pro Val clu Leu Gly Thr Gin tmi Ala ti· Tyr Zle Leu ValAla
285 290 295300
COA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AM TAT CAC TCT CAT ACA CAA ACC CAA1023
Oly íle Leu Cye íle Tyr Íle Lys Tyr Aap Cys Aep Arg GLn ArgGin
305 310315
GAO TTC MO ACG ACA AAC CGG AAA TCT TTC GTT TGG GGA ACA CCC CCC Olu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cye Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro 320 32S330
TCA AAG ATT GTG GCC TOC TAT ACT ACA ACA TCT OCT OAA Ber Lye íle Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr 8er Gly Glu 3J5 34034$
ACT AAA ACT
Thr Lys Thr
ACT CTT CTC TTA ACC TCT CCA TGO TGG GGA TTG GCT CCT CAT TTC CAT Ser Lea Leu Lea Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ale Arg HL· Phe Hle 350 355360
CTC
Leu
3to
TTA AGT CCT TTC TTC TCC ACC CTA CCG GCT Leu Ser Ale Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala 370 375
1071
113»
116?
1215
TAT GTT CCT GAG ATC Tyr Val Pro Clu íle 365
TfC GAT AAO TTC TTC CCA TAC TTC TAC CTC CTC Xec CTT CTT CTC TTT 1JÍ3 >h· Aap A»a Ph· Leu AU Tyr Ph« Tyr Val Lau Thr Lau Leu Lau Phe
385 390395
GAT CCA GCC ÄAO AGA GAC GAT GAC CGA TCC CCA TCA AAO ΤΑΓ GCG AAA1311 *»p Ary Al· Ly« Ary Α·ρ λ·ρ A»p Ary Cy· Asg ««r Ly· Tyr Gly Ly»
400 40541Q
TAT TGG AAC CTG TAT TCT CAG AAA CTC AAA TAC ACG ATC ATT CCG CGA135»
Tyr Trp ty· Leu Tyr Cya Clu Lye Val Lya Tyr Ary II· 11« Pro Gly
415 420425
ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTOTT CTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTMTTC1415
XI· Tyr
430
GAACGTTGGA ATCATCAXAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT CCAAATTCAT CCGATAGACA 1475
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A
1495
2. Informácie pre SEQ ID No. 2:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 430 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: proteín xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 2:
Het Al* Clu Thr val His Ser Pro 11· Val Thr Tyr Ala Sar Mat Leu
1 5 10 15
Ser Lau Leu Ala Ph· Cy. Pro Pro Ph· Val 11« L«u Leu Trp Tyr Thr
20 25 30
Mat Val Hla Gin Α·ρ Gly Ser v»l Thr Gin Thr Ph· ciy Ph· Ph· Trp
35 40 45
G1U Asn Gly Val Gin Cly Leu 11· Asn 11· Trp Pro Arg Pro Thr Leu
50 SS 60
I1S Al< Trp Ly. XI· 11· Ph· Cy. Tyr Gly AK Phe GlU AK 11« Leu
65 70 75 60
cln Lau Leu Lau Pro Cly Ly· Arg Val Glu Gly Pre Xla sar Pro Al·
B5 90 95
Cly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val
100 105 110
Thr Lau Al« Thr Hl· Lau Gly Lau Trp Trp Ph· Gly Xla Pha Xan Pro
115 120 12S
Al* 11· Val Tyr Aap Hla Lau Gly Glu 11« Ph· Sar Ala Lau lis Pha
130 13S 140
Gly str Phe 11· Phe Cya Val Leu Leu zyr II» Lys Gly HU Val Al·
145 150 155 160
Pro Sar Ser Sar Asp Sar Cly Ser Cy. Gly Asn Lau íle Xla Asp Phe
165 170 175
Tyr Trp Gly Kat Glu Lau Tyr Pro Arg Xla Gly ty· Sar Pha ASp Xla
180 185 190
Lyi Val ph· Thr Aan Cya hcg Ph· Gly Met H»t Sar Trp Al* Val Lau 195 20030S
Al· V*1 Thr Tyr Cy· 11* ty· Cln Tyr Glu II· Aen cly Lys Val Ser 210 215220
Asp Ser Hot Leu val Asn Thr íle Leu Met l«u val Tyr val Thr Ly» 225 230 235240
Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp i Aen Thr Het λορ IK AK Hla
245 250 255
Α·ρ Arg Ala Gly Pha Tyr Xla Cy· Trp Gly Cya Lau Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Val Tyr Thr ŕer Pro Gly Μ·ε Tyr Leu Val A.n Kla Pro Val Glu
275 280 285
Lau Gly Thr cln Lau Ala Xla Tyr Zla Lau Val Ale Gly íle Leu Cy·
290 293 300
íle Tyr lis Lys Tyr A«p Cys A.p Arg cln Arg Gin Glu Phe Arg Arg
305 310 315 320
Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Cly Arg Ala Pro ser Ly· íle Val
325 330 33 S
Xla Ser Tyr Thr Thr Thr Sar Cly Clu Thr Ly· Thr Sar Leu Lau Lau
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala . Arg HLs Phs Kle Tyr Val Pro Clu
355 350 365
II· Leu Ser Ala Ph· Pha Trp Thr Val Pro Ala Leu Pha λ·ρ Aen Ph·
370 375 380
Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg AlaLye
385 390 395400
Arg Aap Asp Asp Arg Cys Arg Ser Ly. Tyr Gly Ly. Tyr Trp LyaLau
4CS 410415
Tyr Cya clu Ly. Val Lys Tyr Arg Tie TI· Pro Gly Xla Tyr
420 425430
2. Informácie pre SEQ ID No.3:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 15 aminokyselín
B. Typ: aminokyselina
C. Počet vlákcn: jednoduchá ii) Typ molekuly: peptid ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: peptid
B. Umiestnenie: 7
D. Ďalšie informácie: /note = „residu 7 = Trp alebo Tyr“ ix) Charakteristika
A. Meno/kľúč: peptid
B. Umiestnenie: 12
D. Ďalšie informácie: /note = „residu 12 = His alebo Lys“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 3:
Leu Leu Xae Xee Gly Trp Xaa Gly Xee Xae Arg Xae Xee Xea Tyr
10 15
2. Informácie pre SEQ ID No. 4:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 29 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /dese = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/klúč: misc_feature
B. Umiestnenie: 10..29
D. Ďalšie informácie: /note = „SEQUENCE ID No. 1
DE 76 A 95“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 4:
CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC
2. Informácie pre SEQ ID No. 5:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 28 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: mise feature
B. Umiestnenie: komplement (10..28)
D. Ďalšie informácie, /note = „SEQUENCE ID NO. 1 COMPLEMENTAIRE DE 1350 A 1368“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 5:
CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG
2. Informácie pre SEQ ID No. 6:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 23 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nuleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: misc_feature
B. Umiestnenie: komplement (1..23) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 6:
GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC
2. Informácie pre SEQ ID No. 7:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 29 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 7:
AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAG
2. Informácie pre SEQ ID No. 8:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 46 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 8:
GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG ΓΤΤGCG
2. Informácie pre SEQ ID No. 9:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 17 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: misc_feature
B. Umiestnenie: komplement (L.7) xi) Opis sekvencie SEQ ID No. 9:
GTAAAACGAC GGCCAGT
2. Informácie pre SEQ ID No. 10:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 25 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 10:
TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG
2. Informácie pre SEQ ID No. 11:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 38 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: misc_feature
B. Umiestnenie: komplement (L.38) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 11:
GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG
2. Informácie pre SEQ ID No. 12:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 34 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 12:
caaggaggcg gccgccacac aaaaagttag gtgt
2. Informácie pre SEQ ID No. 13:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 25 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduché
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: misc_feature
B. Umiestnenie: komplement (1..25) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 13:
TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG
2. Informácie pre SEQ ID No. 14:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 20 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: misc feature
B. Umiestnenie: komplement (1..20) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 14:
TACATTAGGT CCTTTGTAGC
2. Informácie pre SEQ ID No. 15:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 25 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 15
GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG
2. Informácie pre SEQ ID No. 16:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 21 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 16:
AATTGCGGCC GCGTACGTAT G
2. Informácie pre SEQ ID No. 17:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 21 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charkteristĺka:
A. Meno/kľúč: misc_feature
B. Umiestnenie: komplement (1..21) xi) Opis sekvencie SEQ ID No. 17:
AATTCATACG TACGCGGCCG C
Informácie pre SEQ ID No. 18:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 14 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 18:
CAACGCGTCC TAGG
2. Informácie pre SEQ ID No. 19:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 22 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: misc_feature
B. Umiestnenie·, komplement (1..22) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 19:
AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT
2. Informácie pre SEQ ID No. 20:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka 33 párov báz
B Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kvselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 20:
GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT
2. Informácie pre SEQ TD No. 21:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka 39 párov báz
B. Typ: nuklcotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ i x) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: misc_feature
B. Umiestnenie: komplement (1 ..39) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 21 :
AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG
2. Informácie pre SEQ ID No. 22:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka 34 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 22:
CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG
2. Informácie pre SEQ ID No. 23:
i) Charakteristika sekvencie:
A. DÍžka 28 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: mise feature
B. Umiestnenie: komplement (1..28) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 23:
AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT
2. Informácie pre SEQ ID No. 24:
i) Charakteristika sekvencie:
A. DÍžka 40 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 24:
GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC
2. Informácie pre SEQ ID No. 25:
i) Charakteristika sekvencie:
A. DÍžka 15 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No.25:
TCGACGGACG CGTGG
2. Informácie pre SEQ ID No.26:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka 14 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: misc_feature
B. Umiestnenie: komplement (1 ..14) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 26:
TCGACCACGC GTCC
2. Informácie pre SEQ ID No. 27:
i) Charakteristika sekvencie:
A. DÍžka 35 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 27:
TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT
2. Informácie pre SEQ ID No. 28:
i) Charakteristika sekvencie:
A. DÍžka 15 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 28:
GGCCOCAAAA CCA A A
2. Informácie pre SEQ ID No. 29:
i) Charakteristika sekvencie:
A. DÍžka 15 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charakteristika:
A. Meno/kľúč: misc_feature
B. Umiestnenie: (1 ..15) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 29:
AGCTTTTGGT TTTGC
2. Informácie pre SEQ ID No. 30:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka: 20 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 30:
GATCTATCGA TGCGGCCGCG
2. Informácie pre SEQ ID No. 31:
i) Charakteristika sekvencie:
A. Dĺžka 20 párov báz
B. Typ: nukleotid
C. Počet vláken: jednoduchá
D. Konfigurácia: lineárna ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina
A. Opis: /DESC = „OLIGONUKLEOTIDE“ ix) Charkteristika:
A. Meno/kľúč: mise feature
B. Umiestnenie: komplement (L.20) xi) Opis sekvencie: SEQ ID No. 31:
CGCGCGCGGC CGCATCGATA
Priemyselná využiteľnosť
Sekvencia DNA kódujúca proteín A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, proteín delta-7-Red, ako aj spôsob jej prípravy a kmene transformovaných kvasiniek majú využitie v molekulovej genetike.

Claims (37)

1. Sekvencia nukleovej kyseliny obsahujúca sekvenciu kódujúcu proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, pričom uvedená nukleová kyselina je buď DNA, alebo RNA.
2. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 1, v ktorom nukleová kyselina je cDNA.
3. Sekvencia cDNA podľa nároku 2, v ktorej kódujúca sekvencia kóduje proteín A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID No. 1, ako aj alelové variácie a analógy tejto sekvencie s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy.
4. Sekvencia DNA kódujúca proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, ktorá hybridizuje so sekvenciou definovanou v nároku 3 za podmienok strednej alebo vysokej stringencie a/alebo sa zhoduje so sekvenciou definovanou v nároku 3 na 60.
5. Sekvencia DNA kódujúca proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a amplifikovateľná technikou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), v ktorej sú ako prímery použité oligonukleotidy kódujúce sekvenciu, ktorá má nasledujúcu sekvenciu aminokyselín SEQ ID No. 3:
Leu Lea Xia Xaa Gly Trp Xaa Giy Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr ] 5 10 15 v ktorej Xaa v polohe 7 je Trp alebo Tyr a Xaa v polohe 12 je His alebo Lys.
6. Proteín A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a so sekvenciou aminokyselín SEQ ID No. 2 ako aj alelové variácie a analógy tejto sekvencie s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy.
7. Proteín A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a so sekvenciou aminokyselín SEQ ID No. 2 a označený delta-7Red.
8. Proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy so sekvenciou aminokyselín, ktorá sa zhoduje so sekvenciou SEQ ID No. 2 definovanou v nároku 7 na 60.
9. Proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a so skríženou imunologickou reaktivitou s proteinom A. thaliana delta-7Red, definovaným v nároku 7.
10. Proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, získaný expresiou v hostiteľskej bunke obsahujúcej sekvenciu DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
11. Proteín A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a získaný expresiou v hostiteľskej bunke obsahujúcej sekvenciu DNA kódujúcu sekvenciu aminokyselín SEQ ID No. 2.
12. Proteín podľa nároku 10 alebo nároku 11, v ktorom hostiteľskou bunkou je kvasinka.
13. Protilátky proti proteínu s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 12.
14. Vektor expresie obsahujúci sekvenciu DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
15. Hostiteľská bunka transformovaná vektorom podľa nároku 14.
16. Spôsob klonovania nukleovej kyseliny kódujúcej proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy v mikroorganizme, zahŕňajúci metódu prehľadávania pomocou hybridizácie a zodpovedajúci jednej z nasledujúcich možností:
- rezistencia mikroorganizmu proti nystatínu alebo proti analogickej zlúčenine, ktorej toxicita závisí od prítomnosti sterolov s nenasýtenosťou v polohe C-7,
- hybridizácia nukleovej kyseliny s nukleotidovou sekvenciou SEQIDNo. 1,
- identifikácia nukleovej kyseliny informatickou metódou medzi náhodne izolovanými sekvenciami (sekvenciou) DNA,
- priama expresia proteínu nasledovaná imunodetekciou pomocou protilátok proti proteínu so sekvenciou aminokyselín SEQ IDNo. 2.
17. Sekvencia nukleovej kyseliny, DNA alebo RNA, získaná spôsobom podľa nároku 16.
18. Hostiteľská bunka transformovaná vektorom obsahujúcim sekvenciu DNA podľa nároku 17.
19. Hostiteľská bunka transformovaná vektorom podľa nároku 15 alebo nároku 18, v ktorej hostiteľom je kvasinka alebo vláknitá huba.
20. Spôsob výroby proteínu s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, v ktorom je kultivovaná hostiteľská bunka transformovaná podľa ktoréhokoľvek s nárokov 15, 18 alebo 19 a izolovaný exprimovaný proteín.
21. Spôsob podľa nároku 20, v ktorom je hostiteľská bunka transformovaná kvasinka, v ktorej sa na kódujúcu sekvenciu DNA pôsobí promótorom kvasinky.
22. Spôsob redukcie in vitro sterolu nenasýteného v polohe C-7, v ktorom sa sterol určený na redukciu inkubuje s proteínom získaným podľa nároku 20 alebo 21 a prípadne izoluje získaný redukovaný sterol.
23. Spôsob redukcie in vi vo exogénneho sterolu nenasýteného v polohe C-7, v ktorom sa sterol inkubuje s transformovanou hostiteľskou bunkou podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15, 18 alebo 19 a prípadne sa izoluje získaný redukovaný sterol.
24. Spôsob redukcie in vivo endogénneho sterolu nenasýteného v polohe C-7, v ktorom sa kultivuje hostiteľský kmeň transformovaný podľa nároku 19 a prípadne sa izoluje akumulovaný redukovaný sterol.
25. Spôsob redukcie in vitro alebo in vivo podľa ktoréhokoľvek z nárokov 22 až 24, v ktorom získaný sterol je substrát enzýmu štiepenia bočného reťazca cholesterolu (P45oSCC).
26. Spôsob redukcie in vivo podľa nároku 25, v ktorom endogénny sterol určený na redukciu je ergosta-5,7-dién-3-ol, ergosta-5,7,24(28) -trién-3-ol alebo ergosta-5,7,22-trién-3-ol a/alebo ich zmes.
27. Spôsob výroby pregnenolónu, v ktorom sa kultivujú hostiteľské bunky transformované podľa nároku 19, prípadne sa izoluje akumulovaný endogénny sterol alebo steroly redukované v polohe C-7, redukované steroly sa inkubujú v prítomnosti P450SCC a pripadne aj adrenodoxínreduktázy (ADR) a adrenodoxínu (ADX) a prípadne sa izoluje získaný pregnenolón.
28. Spôsob podľa nároku 27, v ktorom hostiteľská bunka je kvasinka.
29. Spôsob výroby pregnenolónu, v ktorom sa kultivujú kvasinky transformované jedným alebo viacerými vektormi umožňujúcimi koexpresiu proteínu s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy a P450SCC a prípadne aj ADR a ADX a prípadne sa izoluje voľný alebo esterifikovaný pregnenolón.
30. Spôsob výroby pregnenolónu podľa nároku 29, v ktorom sa kultivujú transformované kvasinky koexprimujúce proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, P450SCC, ADR a ADX.
31. Spôsob podľa nároku 30, v ktorom proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy je proteín A. thaliana delta-7Red.
32. Spôsob podľa nároku 31, v ktorom kmeň kvasiniek je kmeň EC01/pCD63.
33. Transformovaný kmeň kvasiniek, koexprimujúci proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy, P45OSCC, ADR a ADX a akumulujúci voľný alebo esterifikovaný pregnenolón.
34. Kmeň kvasiniek podľa nároku 33, v ktorom proteín s aktivitou delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy je proteín A. thaliana delta-7Red.
35. Kmeň kvasiniek podľa nároku 34, označený EC01/pCD63.
36. Sekvencia ľudskej DNA podľa nároku 17, používaná ako sonda na in vitro diagnostiku vrodenej deficiencie delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy.
37. Spôsob in vitro detekcie defíciencie delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy spočívajúci v inkubácii vzorky obsahujúcej ľudskú genómovú DNA so sondou podľa nároku 36 za štandardných hybridizačných podmienok a v dokázaní fixácie alebo absencie fixácie sondy na genómovú DNA, pričom absencia fixácie alebo malý rozsah fixácie dokazuje vrodenú deficienciu delta-5,7-sterol-delta-7-reduktázy.
SK188-96A 1995-02-15 1996-02-13 Sekvencia DNA kódujúca proteín organizmu A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol, delta-7-reduktázy, proteín delta-7-Red, spôsob ich výroby, kmene transformovaných kvasiniek, aplikácie SK283656B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9501723A FR2730494B1 (fr) 1995-02-15 1995-02-15 Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta7-red, procede de production, souches de levures transformees, applications
FR9506517A FR2734839B1 (fr) 1995-06-01 1995-06-01 Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta-7red, procede de production, souches de levures transformees, applications.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK18896A3 SK18896A3 (en) 1996-10-02
SK283656B6 true SK283656B6 (sk) 2003-11-04

Family

ID=26231759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK188-96A SK283656B6 (sk) 1995-02-15 1996-02-13 Sekvencia DNA kódujúca proteín organizmu A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol, delta-7-reduktázy, proteín delta-7-Red, spôsob ich výroby, kmene transformovaných kvasiniek, aplikácie

Country Status (24)

Country Link
US (3) US5759801A (sk)
EP (1) EP0727489B1 (sk)
JP (1) JP4082469B2 (sk)
KR (1) KR100422293B1 (sk)
CN (2) CN1216995C (sk)
AR (2) AR003407A1 (sk)
AT (1) ATE457354T1 (sk)
BR (1) BRPI9600729B8 (sk)
CA (1) CA2169524C (sk)
CZ (1) CZ294860B6 (sk)
DE (1) DE69638123D1 (sk)
DK (1) DK0727489T3 (sk)
ES (1) ES2339833T3 (sk)
FI (1) FI120877B (sk)
HR (1) HRP960078B1 (sk)
HU (1) HU220587B1 (sk)
IL (4) IL116872A (sk)
PL (1) PL185569B1 (sk)
PT (1) PT727489E (sk)
RU (1) RU2242517C2 (sk)
SI (1) SI0727489T1 (sk)
SK (1) SK283656B6 (sk)
TR (1) TR199600116A2 (sk)
UA (1) UA72172C2 (sk)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2258571A1 (en) * 1996-06-21 1997-12-24 The General Hospital Corporation Plant sterol reductases and uses thereof
DE19739940A1 (de) * 1997-09-11 1999-03-18 Hartmut Prof Dr Med Glossmann Protein mit Aminosäuresequenz der DELTA7-Sterolreduktase, isoliertes cDNA-Molekül, das für das Protein kodiert, rekombinanter DNA-Vektor und biologisch aktive Zusammensetzungen, die das Protein oder das cDNA-Molekül enthalten
FR2774393B1 (fr) * 1998-02-05 2000-03-24 Hoechst Marion Roussel Inc Souches de levure ayant le gene atf2 interrompu et leurs applications
US6465717B1 (en) * 1998-11-20 2002-10-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sterol metabolism enzymes
FR2812884B1 (fr) * 2000-08-08 2002-11-08 Aventis Pharma Sa Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens
FR2820145B1 (fr) 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
US7193169B2 (en) * 2003-10-29 2007-03-20 Alcon, Inc. Ergonomic footswitch
FR2869914B1 (fr) 2004-05-06 2012-11-09 Aventis Pharma Sa Souches de levure produisant du cholesterol et leurs applications
AU2006227634B2 (en) * 2005-03-16 2010-07-08 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
KR100672006B1 (ko) * 2005-08-03 2007-01-19 길병옥 폐자재를 이용한 형강의 제조방법 및 그 제조방법에 의해생산된 형강
AU2008340017B2 (en) 2007-12-21 2012-04-05 Novartis Ag Organic compounds
DE102009022772A1 (de) 2009-05-21 2010-11-25 Organobalance Gmbh Mikroorganismus zur Expression eines humanen Membranproteins
FR2961218A1 (fr) 2010-06-10 2011-12-16 Sanofi Aventis Methode de detection de composes modulateurs du metabolisme du cholesterol
CN102286053B (zh) * 2011-06-20 2012-09-05 河北联合大学 孕甾烯醇酮吡咯化合物及其制备方法
TWI654300B (zh) * 2013-06-17 2019-03-21 賽諾菲公司 用於細胞色素ｐ４５０單加氧酶生物催化作用之全細胞系統
CN110903993A (zh) * 2019-12-20 2020-03-24 河北兰升生物科技有限公司 一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
CN112813129B (zh) * 2021-02-05 2023-09-08 江南大学 利用区室化提高酵母菌中7-脱氢胆固醇产量的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1042567A (zh) * 1988-09-23 1990-05-30 吉斯特-布罗卡迪斯公司 类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞
JP2645130B2 (ja) * 1989-03-31 1997-08-25 日清製粉株式会社 ステロイド誘導体
US5547868A (en) * 1993-06-09 1996-08-20 Regents Of The University Of California Cholesterol disposal fusion enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
SK18896A3 (en) 1996-10-02
IL116872A0 (en) 1996-07-23
BRPI9600729B8 (pt) 2021-07-06
JP4082469B2 (ja) 2008-04-30
DK0727489T3 (da) 2010-05-31
BRPI9600729A (pt) 1997-12-23
RU2242517C2 (ru) 2004-12-20
FI120877B (fi) 2010-04-15
KR960031607A (ko) 1996-09-17
TR199600116A2 (tr) 1996-08-21
PL185569B1 (pl) 2003-06-30
FI960663A0 (fi) 1996-02-14
US5965417A (en) 1999-10-12
IL116872A (en) 2004-12-15
ES2339833T3 (es) 2010-05-25
CN1664107A (zh) 2005-09-07
CN1145953A (zh) 1997-03-26
HUP9600325A3 (en) 1999-07-28
AR053931A2 (es) 2007-05-23
IL162476A0 (en) 2005-11-20
CZ294860B6 (cs) 2005-04-13
HRP960078A2 (sk) 1998-02-28
ATE457354T1 (de) 2010-02-15
AR003407A1 (es) 1998-08-05
FI960663A (fi) 1996-08-16
CA2169524C (fr) 2012-05-01
US5989881A (en) 1999-11-23
BRPI9600729B1 (pt) 2017-06-20
HRP960078B1 (en) 2011-11-30
DE69638123D1 (de) 2010-03-25
JPH08289793A (ja) 1996-11-05
SI0727489T1 (sl) 2010-05-31
CZ43296A3 (en) 1996-12-11
HU220587B1 (hu) 2002-03-28
PL312828A1 (en) 1996-08-19
KR100422293B1 (ko) 2004-06-14
IL162477A0 (en) 2005-11-20
EP0727489A1 (fr) 1996-08-21
EP0727489B1 (fr) 2010-02-10
CA2169524A1 (fr) 1996-08-16
PT727489E (pt) 2010-04-27
US5759801A (en) 1998-06-02
CN1216995C (zh) 2005-08-31
HUP9600325A1 (en) 1996-11-28
IL162476A (en) 2005-12-18
UA72172C2 (uk) 2005-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7977065B2 (en) Yeast strains autonomously producing steroids
SK283656B6 (sk) Sekvencia DNA kódujúca proteín organizmu A. thaliana s aktivitou delta-5,7-sterol, delta-7-reduktázy, proteín delta-7-Red, spôsob ich výroby, kmene transformovaných kvasiniek, aplikácie
EP2386634A1 (en) Sterol side chain-cleaving enzyme protein and use thereof
CA2285686C (fr) Souches de levure ayant le gene atf2 interrompu et leurs applications
AU707957B2 (en) DNA sequence coding for a protein of A. thaliana having a delta-5,7sterol,delta-7 reductase activity, delta7-red protein, production process, strains of transformed yeasts, uses
FR2734839A1 (fr) Sequence d&#39;adn codant pour une proteine d&#39;a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta-7red, procede de production, souches de levures transformees, applications.
AU780186B2 (en) Method for preparing steroids modified by yeast fermentation
IL154294A (en) Modified yeast, their methods and uses, in particular for the production of steroid histories and non-cellular preparations

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20160213