HU220587B1 - A delta-7-Red elnevezésű A. thaliana fehérjét kódoló DNS-szekvencia, a delta-7-Red-fehérje, eljárás előállításukra, a szekvenciával transzformált élesztőtörzsek, és felhasználásuk - Google Patents

A delta-7-Red elnevezésű A. thaliana fehérjét kódoló DNS-szekvencia, a delta-7-Red-fehérje, eljárás előállításukra, a szekvenciával transzformált élesztőtörzsek, és felhasználásuk Download PDF

Info

Publication number
HU220587B1
HU220587B1 HU9600325A HUP9600325A HU220587B1 HU 220587 B1 HU220587 B1 HU 220587B1 HU 9600325 A HU9600325 A HU 9600325A HU P9600325 A HUP9600325 A HU P9600325A HU 220587 B1 HU220587 B1 HU 220587B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
gly
tyr
phe
ile
Prior art date
Application number
HU9600325A
Other languages
English (en)
Inventor
Xavier Chenivesse
Catherine Duport
Eric Lecain
Denis Pompon
Original Assignee
Hoechst Marion Roussel
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9501723A external-priority patent/FR2730494B1/fr
Priority claimed from FR9506517A external-priority patent/FR2734839B1/fr
Application filed by Hoechst Marion Roussel filed Critical Hoechst Marion Roussel
Publication of HUP9600325A1 publication Critical patent/HUP9600325A1/hu
Publication of HUP9600325A3 publication Critical patent/HUP9600325A3/hu
Publication of HU220587B1 publication Critical patent/HU220587B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát a delta-7-Red elnevezésű, delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású A. thaliana-fehérjét kó- doló DNS-szekvencia, adelta-7-Red-fehérje, eljárások előállításukra, valamint aszekvenciával transzformált élesztőtörzsek és azok felhasználásaképezi. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások C7-pozícióbantelítetlen szterinek in vitro és in vivo redukálására – példáulpregnenolon előállítása céljából –, valamint veleszületett delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz deficiencia diagnosztizálására. ŕ

Description

A találmány tárgyát a delta-7-Red elnevezésű, delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitású A. thaliana-fehs^ét kódoló DNS-szekvencia, a delta-7-Red-fehéije, eljárások előállításukra, valamint a szekvenciával transzformáit élesztőtörzsek és azok felhasználása képezi.
A találmány szerinti megoldás alkalmas C7-pozícióban telítetlen szterinek in vitro és in vivő redukálására - például pregnenolon előállítása céljából -, valamint veleszületett delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz deficiencia diagnosztizálására.
A delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz (E.C.1.3.1.21) egy mikroszomális enzim, melynek jelenlétét aktivitása alapján mutatták ki patkánymájból készült homogenizátumban [Μ. E. Dempsey és munkatársai: Methods Enzymol., 75, 501 (1969)], valamint a Zea mays növényfajból készített preparátumokban [M. Taton és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun., 181, 465 (1991)]. Ez a reduktáz egy NADPH-függő reduktáz, amely in vitro redukálja a 7-dehidrokoleszterint koleszterinné.
A szterinek az eukarióta membránok fő alkotórészei, a különböző fajokban található szterinek azonban szerkezetileg különböznek egymástól. Az olyan eukarióta sejtekben, mint például az élesztők, a legnagyobb mennyiségben megtalálható szterin az ergoszterin, amely két telítetlen kötést tartalmaz a C-5- és expozíciókban, a C-24-pozícióban tartalmaz egy elágazó láncot, és tartalmaz egy telítetlen kötést a C-22-pozícióban, az emlőssejtekben található koleszterinre pedig a C-5-pozícióban található telítetlen kötés és egy telített oldallánc jellemző. A szitoszterinben, sztigmaszterinben és kampeszterinben, melyek a legelteijedtebb növényi szterinek, elágazó, de telített oldallánc található, és a gerincesekben előforduló szterinekhez hasonlóan nincs bennük telítetlen kötés a C-7-pozícióban. A szterinmolekula magjában meglévő említett különbözőségért a delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz enzim felelős.
A delta-5,7-szterin delta-7-reduktázt sohasem tisztították meg homogenitásig, és a technika állása szerint csak részleges tisztítási eljárás ismeretes (Μ. E. Dempsey és munkatársai: M. Taton és munkatársai: lásd fent). A fehérjét eddig még nem jellemezték fizikai-kémiai sajátságai alapján. Mindeddig nem közöltek a fehérje szekvenciájával kapcsolatos adatokat, és nem írtak le a fehérjéhez kötődő ellenanyagot sem. Ember esetében leírták továbbá, hogy az új RSH/Smith-LemliOpitz (SLO) szindrómával asszociáltan kimutatható defrciencia jelentkezik a 7-dehidrokoleszterin-reduktáz működésében [J. M. Opitz és munkatársai: Am. J. Med. Génét., 50, 326 (1994)].
Az eddig elmondottakból következik, hogy a delta5,7-szterin delta-7-reduktázt kódoló cDNS megklónozása - ami lehetővé tenné a megfelelő fehérje szekvenciájának meghatározását, csakúgy, mint a megfelelő humángén jellemzését, vagy a génnel kapcsolatos veleszületett rendellenesség feltárását - nem lehetséges olyan ismert eljárások alkalmazásával, melyek például hibridizáción és/vagy immunológiai azonosításon alapulnak. Éppen ezért nagy erőkkel folyik a kutatás olyan inventív szűrővizsgálati eljárás kidolgozása irányában, amely lehetővé tenné a klónozást a fehérjére vonatkozó konkrét információk hiányában is.
A gombák membránjaiban legnagyobb mennyiségben előforduló szterinben, az ergoszterinben a C-5,7pozíciókban két konjugált kettős kötés található, amely sajátosság a polién vegyületek családjának olyan tagjai számára, mint például a nystatin, gombaellenes hatást kölcsönöz [R. Bittman és munkatársai: J. Bioi. Chem., 260, 2884 (1984)]. Az a tény, hogy a nystatin hatása nagymértékben függ a C-5,7-pozíciókban telítetlen szterinek membránkoncentrációjától, lehetővé tette olyan 5. cerevisiae törzsek szelektálását, melyekben bizonyos szterinek felhalmozódtak [S. W. Molzahn és munkatársai: J. Gén. Microbiol., 72, 339 (1972)]. Az elmondottak szerint izolált erg2 és erg3 jelű mutánsokban olyan szterinek halmozódtak fel, melyek a C-5,7-pozíciókban nem tartalmaznak konjugált kettős kötéseket, mivel hiányzik belőlük sorrendben a szterin delta-8,7-izomeráz [W. Ashman és munkatársai: Lipids, 26, 628 (1991)] és a szterin delta-5-dehidrogenáz-aktivitás [B. Arthinton és munkatársai: Gene, 702, 39 (1991)]. Az ilyen mutánsok a szelekciós rendszerben életképesek, mivel az élesztőkben legnagyobb mennyiségben jelen levő ergoszterin bizonyos körülmények között különböző szterinekkel - többek között a koleszterinnel - helyettesíthető.
A találmány szerinti megoldás megvalósításában nagy jelentősége volt annak a felismerésnek, hogy az a tény, miszerint a C-5,7-pozíciókban kettős telítetlenséget nem tartalmazó szterinek feldúsításával az élesztő nystatinrezisztenciája fokozható, felhasználható olyan heterológ fehéijét kódoló cDNS klónozására, amely delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitással bír, egy olyan szűrővizsgálati eljárás kifejlesztése útján, amely az 5. cerevisiae faj metabolizmusának megváltoztatásán alapul. A felvázolt megközelítésmód - amely lehetővé teszi, hogy a klónozást végrehajtsuk a DNS-szekvenciák vagy a fehéije ismerete nélkül, kizárólag az enzimaktivitásra alapozva - sikeres kivitelezhetősége azonban nem előre látható, számos legyőzhető technikai nehézség következtében.
Az első ilyen nehézség abból következik, hogy a nystatin hatásmechanizmusát nem teljes mértékben ismerjük [L. W. Parks és munkatársai: CRC Critical Reviews in Mícrobiology, 301, (1978)]. Előre látható például a nystatin alkalmazásán alapuló szelekció alacsony specifitása, mivel ez a szelekció közvetett jellegű, ami az élesztőben olyan spontán genomi mutációkhoz vezet, amilyenek például az erg-mutációk (S. W. Molzahn és munkatársai: lásd fent), vagy olyan genomi mutációkhoz, melyek a szterin reakcióúttól független rezisztenciák kialakulását idézik elő. Hasonló problémát okoz az is, hogy a génkönyvtárakkal transzformált sejtek expresszálhatnak olyan heterológ géneket is, melyek a szterin reakcióúttól független nystatinrezisztencia kialakulását idézik elő.
A várható nehézségek egy másik példájaként megemlíthetjük azt a tényt is, hogy a heterológ fehéije aktivitása a sejtben alacsony lehet, ami a nystatinrezisztencia hiányához vagy alacsony mértékéhez vezet, például
HU 220 587 Bl a következő okok valamelyikének következtében: 1. a delta-5,7-szterin delta-7-reduktázt kódoló gén gyengén expresszálódik; 2. az expresszálódott fehérje kevéssé aktív vagy egyáltalán nem aktív a nem megfelelő „folding” következtében, vagy valamely helytelen szubcelluláris orientáció következtében; 3. a növényi eredetű fehérje nem ismeri fel szubsztrátként az élesztő saját szterinjeit, vagy 4. a szterinek, melyek egyébként az enzim szubsztrátjai lehetnének, észter formában vannak jelen vagy vezikulumokban tárolódnak és nem érintkeznek az enzimmel. Az elmondottak miatt feltételezhető, hogy az ilyen módon felhalmozódott szterinek elkerülik a delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz hatását, amely eukariótákban feltehetően a mikroszómákban lokalizálódik.
A találmány tárgyát képezi egy eljárás egy delta5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjét kódoló A. thaliana-etedetű cDNS klónozására, mely fehérjét delta-7-Red-fehérjének neveztünk el, egy olyan élesztőben végrehajtott klónozási eljárás alkalmazása útján, amely nystatinrezisztenciához vezető metabolikus beavatkozáson alapul. A delta-7-Red-fehérje megvalósítja a C-7-pozícióban telítetlen szterinek biológiai úton történő redukcióját, mely biológiai redukció előnyös megoldást biztosít a C-5,7-pozíciókban kettős telítetlenséget tartalmazó szterinek és szteroidok C-7-pozícióban történő szelektív redukciójának problémájára, mely probléma kémiai redukciós módszerekkel nem oldható meg.
A találmány tárgyát képezik továbbá a delta-7-Redfehéqét expresszáló transzformált élesztősejtek, melyekben meglepő módon C-7-pozícióban telített termékek halmozódnak fel, és adott esetben C-22-pozícióban telített termékek, melyek az ergoszterinnel szemben szubsztrátjai a koleszterin oldallánc restrikciós enzimének, azaz a citokróm-P450SCC-nek.
A találmány szerinti élesztőtörzsek fenti váratlan sajátságai lehetővé teszik a törzsek felhasználását iparilag és/vagy gyógyászatilag hasznos szterinek vagy szteroidok előállítási eljárásaiban. A találmány szerinti transzformáit élesztőtörzsek különösen alkalmasak pregnenolon előállítására, C-7-pozícióban redukált endogén élesztőszterinek citokróm-P450SCC (P450SCC) alkalmazásával adrenodoxinreduktáz (ADR) és adrenodoxin (ADX) jelenlétében végrehajtott biológiai oxidáció útján. A találmány szerinti transzformált élesztőtörzsek alkalmasak emlősök és egyéb gerincesek koleszterinből hidrokortizonba vezető metabolikus reakcióútja intermedier szteroidjainak előállítására is. Ez az alkalmazás azzal az előnnyel jár, hogy lehetővé válik a hidrokortizon és intermedieijei biológiai oxidáció útján történő előállítására egy olyan eljárás során, amelyben kiindulási szubsztrátként nincs szükség exogén szterinre, például koleszterinre, és ily módon megkerülhetővé válik az a probléma, hogy a szterinnek be kellene hatolnia az élesztősejtekbe, melyek membránjáról viszont leírták, hogy aerobiózis körülményei között exogén szterinek számára átjárhatatlan [R. T. Lorentz és munkatársai: J. Bacteriology, 981, (1986)].
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszekvenciák alkalmazása is. A delta-5,7-szterin delta-7-reduktázt kódoló RNS- vagy DNS-szekvenciák alkalmasak olyan rendellenességek diagnosztizálására és kezelésére, melyekben szerepet játszik a delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz gén terméke. Feltételezhető például, hogy az RHS/SLO szindrómában szerepet játszik egy delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz működési rendellenesség, mely enzim felelős a 7dehidrokoleszterin koleszterinné alakításáért. Az elmondottak értelmében a fenti humán DNS-szekvencia alkalmazható delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz működési rendellenességet diagnosztizáló hibridizációs próbaként, de ugyanez a szekvencia felhasználható génterápiás eljárásban is, az említett rendellenesség kiküszöbölésére.
Az elmondottak értelmében a találmány tárgyát képezi egy olyan nukleinsavszekvencia, amely tartalmaz egy delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjét kódoló szekvenciát, mely nukleinsav lehet DNS vagy RNS, különösen pedig cDNS. A delta-5,7-szterin delta7-reduktáz-aktivitást mérhetjük például in vitro enzimatikus vizsgálati eljárás alkalmazásával, mely eljárást a későbbiekben ismertetett példákban fogjuk részletezni.
A találmány tárgyát képezi közelebbről egy olyan cDNS-szekvencia, amelyben a kódolószekvencia egy delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású A. thaliawa-fehérjét kódol, és amely szekvencia megegyezik az alábbiakban bemutatott 1. azonosító számú szekvenciával, vagy annak allélikus variánsaival:
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
Met Alá Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr
5 10
GCA TCG ATG TTA Leu TCG CTT CTG GCC TTC TGT Cys CCA CCT TTC Phe 25 GTC Val ATT Ile CTC Leu 159
Al a Ser Met 15 Ser Leu Leu Al a 20 Phe Pro Pro
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Me t Val Hi s Gin Asp Gly Ser Val Thr Gin Thr Phe
30 35 40
HU 220 587 Β1
GGC Gly 45 TTC Phe TTT Phe TGG Trp GAG Glu AAT Asn 50 GGA Gly GTT Va 1 CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gin Gly Leu 55 Ile Asn Ile Trp Pro 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile 65 Al a Trp Ly s Ile He 70 Phe Cys Tyr Gly Al a 75 Phe
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Al a Ile Leu 80 Gin Leu Leu Leu Pro 85 Gly Ly s Arg Val Glu 90 Gly Pro
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro 95 Al a Gly Asn Arg Pro 100 Val Tyr Ly s Al a Asn 105 Gly Leu Al a
GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447
Al a Tyr 110 Phe Val Thr Leu Alá 115 Thr Hi s Leu Gly Leu 120 Trp Trp Phe Gly
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile 125 Phe Asn Pro Al a Ile 130 Val Tyr As p Hi s Leu 135 Gly Glu Ile Phe Ser 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Al a Leu Ile Phe Gly 145 Ser Phe Ile Phe Cys 150 Val Leu Leu Tyr Ile 155 Ly s
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly Hi s Val Al a 160 Pro Ser Ser Ser As p 165 Ser Gly Ser Cys Gly 170 Asn Leu
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Asp 175 Phe Tyr Trp Gly Me t 180 Glu Leu Tyr Pro Arg 185 Ile Gly Lys
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe 190 Asp Ile Ly s Val Phe 195 Thr Asn Cys Arg Phe 200 Gly Me t Me t Ser
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp 205 Al a Va 1 Leu Al a Val 210 Thr Tyr Cy s Ile Ly s 215 Gin Tyr G1 u Ile Asn 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser Asp 225 Ser Me t Leu Val Asn 230 Thr Ile Leu Me t Le u 235 Val
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831
Tyr Va 1 Thr Lys 240 Phe Phe Trp Trp Glu 245 Al a G1 y Tyr Trp As n 250 Thr Me t
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879
As p Ile Alá 255 Hi s As p Arg Al a Gly 260 Phe Tyr Ile Cys Trp 265 Gly Cy s Leu
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp 270 Val Pro Ser Val Tyr 275 Thr Ser Pro Gly Me t 280 Tyr Leu Va 1 Asn
HU 220 587 Bl
CAC Hi s 285 CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG Gin TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
Pro Val Glu Leu Gly 290 Thr Leu Alá I le 295 Tyr I le Leu Val Al a 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly He Leu Cy s 11 e 305 Tyr I le Ly s Tyr Asp 310 Cy s Asp Arg Gin Arg 315 Gin
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg 320 Thr Asn Gly Ly s Cy s 325 Leu Va 1 Trp Gly Arg 330 Alá Pro
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Ly s I le 335 Val Al a Ser Tyr Thr 340 Thr Thr Ser Gly Glu 345 Thr Ly s Thr
AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu 350 Leu Leu Thr Ser Gly 355 Trp Trp Gly Leu Al a 360 Arg Hi s Phe Hi s
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr 365 Va 1 Pro Glu I le Leu 370 Ser Al a Phe Phe Trp 375 Thr Val Pro Al a Leu 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe As p Asn Phe Leu 385 Al a Tyr Phe Tyr Val 390 Leu Thr Leu Leu Leu 395 Phe
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
As p Arg Al a Ly s 400 Arg As p Asp As p Arg 405 Cy s Arg Ser Ly s Tyr 410 Gly Lys
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG CGA 1359
Tyr Trp Lys 415 Leu Tyr Cys Glu Lys 420 Val Lys Tyr Arg I le 425 I le Pro Gly
ATT I le TAT Tyr 430 TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475 1496
A fenti cDNS-szekvencia egy 430 aminosavat tartalmazó fehéqét kódol, melynek szekvenciája megegyezik a 3. ábrán látható szekvenciával (2. azonosító számú szekvencia), és a fenti cDNS-szekvenciát előállíthatjuk például oly módon, hogy egy A. thaliana expressziós könyvtárból kiindulva a klónozást élesztőben hajtjuk végre, olyan szelekciós eljárás alkalmazásával, mely eljárás az élesztőben megjelenő nystatinrezisztenciát használja ki, és amely eljárás végrehajtásának részletes körülményeit a későbbiekben fogjuk ismertetni. Az 1. azonosító számú szekvencia ismeretében szakember a technika állása szerint ismert eljárások alkalmazásával képes a találmány tárgyát reprodukálni, például kémiai szintézis útján, vagy oly módon, hogy egy génkönyvtárat vagy egy cDNS-könyvtárat szintetikus oligonukleotid hibridizációs próbák felhasználásával és hibridizációs technikák vagy PCR-amplifikáció alkalmazásával szűrővizsgálatnak vet alá.
A találmány tárgyát képezi egy olyan DNS-szekvencia is, amely delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjét kódol, és képes hibridizálódni az 1. azonosító számú nukleotidszekvenciával átlagosan vagy nagyon sztringens körülmények között, valamint azok a DNS-szekvenciák, melyek körülbelül 60%-ban vagy annál nagyobb mértékben azonosak az 1. azonosító számú szekvenciával.
Azok a szekvenciák, melyek kimutatható mértékben hibridizálódnak az 1. azonosító számú szekvenciával, átlagosan sztringens, standard körülmények között hibridizálódnak hozzá, ilyen körülmények például: hibridizáció 42 °C-on, 12 órán keresztül 50%-os formamidoldatban, 6 χ SSC-pufferben, majd ezt követően mo5
HU 220 587 Β1 sásokat alkalmazunk, vagy alkalmazhatunk kevésbé sztringens körülményeket is, mint például: hibridizáció 42 °C-on 24 órán át, 20%-os formamidoldatban, x SSC-pufferben, melyet ismert standard körülmények között mosások követnek [T. Maniatis és munka- 5 társai: „Molecular cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)].
Két szekvencia közötti nukleotidazonosság százalékos értéke megbecsülhető például az „NCBI” szerveren található „BLAST”-program („basic local alignment search tool”) alkalmazásával [S. FI. Altschul és munkatársai: J. Mól. Bioi., 215, 403 (1990)].
A találmány tárgyát képezi továbbá egy delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehéqét kódoló DNSszekvencia, amely PCR-eljárással amplifikálható olyan konszenzusszekvenciájú oligonukleotid láncindítók alkalmazásával, melyek a következő aminosavsorrendet kódolják (szekvenciaazonosító szám: 3):
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 15 10 15 ahol a 7. pozícióban található Xaa jelentése: Trp vagy Tyr és a 12. pozícióban található Xaa jelentése: His 15 vagy Lys.
A fenti 3. azonosító számú szekvencia egy új konszenzusszekvenciának felel meg, mely konszenzusszekvenciát úgy azonosítottunk, hogy az 1. azonosító számú szekvenciából levezetett 2. azonosító számú új 20 aminosavszekvenciát összehasonlítottuk olyan ismert szekvenciákkal, melyek vagy olyan szterinreduktázokat kódolnak, melyek nem a C-7-pozícióban katalizálják a redukciót, vagy lamin-B-receptorokat kódolnak, ahogy azt a későbbiekben a példákban részletesen is- 25 mertetni fogjuk. A 3. azonosító számú szekvenciában található információ alapján előállítható egy olyan maximálisan 45 nukleotidhosszúságú láncindító oligonukleotid, amely - amennyiben egy 2. oligo-dT-láncindítóval kombináljuk, amely ellenkező irányú láncindítóként szolgál - lehetővé teszi, hogy valamely kereskedelmi forgalomban beszerezhető PCR-reagenskészlet (beszerezhető például a Stratagene cégtől) alkalmazásával olyan DNS-t amplifikáljunk, amely delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjét kódol.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitású A. thaliana-eredetá fehérje, melynek szekvenciája megegyezik az alábbi 2. azonosító számú szekvenciával, valamint az említett szekvencia allélikus variánsai és analógjai:
Me t 1 Al a Glu Thr Val 5 Hi s Ser Pr o Ile Val 10 Thr Tyr Al a Ser Me t 15 Leu
Ser Leu Leu Al a 20 Phe Cy s Pro Pro Phe 25 Val Ile Leu Leu Trp 30 Tyr Thr
Me t Va 1 Hi s 35 Gin As p Gly Ser Val 40 Thr Gin Thr Phe Gly 45 Phe Phe Trp
Glu Asn 50 Gly Val Gin Gly Leu 55 Ile Asn Ile Trp Pro 60 Arg Pro Thr Leu
Ile 65 Al a Trp Ly s Ile Ile 70 Phe Cys Tyr Gly Alá 75 Phe Glu Al a Ile Leu 80
Gin Leu Leu Leu Pro 85 Gly Lys Arg Val Glu 90 Gly Pro Ile Ser Pro 95 Al a
Gly Asn Arg Pro 100 Val Tyr Lys Al a Asn 105 Gly Leu Al a Alá Tyr 110 Phe Val
Thr Leu Al a 115 Thr Hi s Leu Gly Leu 120 Trp Trp Phe Gly Ile 125 Phe Asn Pro
Al a Ile 130 Val Tyr Asp Hi s Leu 135 Gly Glu Ile Phe Ser 140 Al a Le u Ile Phe
Gly 145 Ser Phe Ile Phe Cys 150 Val Leu Leu Tyr Ile 155 Lys Gly Hi s Val Al a 160
HU 220 587 Bl
Pro Ser Ser Ser Asp 165 Ser Gly Ser Cy s Gly 170 As n Leu Ile Ile Asp 175 Phe
Tyr Trp Gly Me t Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe As p Ile
180 185 190
Ly s Va 1 Phe Thr Asn Cy s Arg Phe Gly Me t Me t Ser Trp Al a Val Leu
195 200 205
Al a Val Thr Tyr Cy s Ile Ly s Gin Tyr Glu Ile Asn Gly Ly s Val Ser
210 215 220
As p Ser Me t Leu Val Asn Thr Ile Leu Me t Leu Val Tyr Va 1 Thr Ly s
225 230 235 240
Phe Phe Trp Trp Glu Al a Gly Tyr Trp Asn Thr Me t As p I 1 e Al a Hi s
245 250 255
As p Arg Al a Gly Phe Tyr Ile Cy s Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro
260 265 270
Ser Va 1 Tyr Thr Ser Pro Gly Me t Tyr Leu Va 1 Asn Hi s Pro Val Glu
275 280 285
Leu Gly Thr Gin Leu Al a Ile Tyr Ile Leu Va 1 Al a Gly Ile Leu Cys
290 295 300
Ile Tyr Ile Ly s Tyr Asp Cy s Asp Arg Gin Arg Gin Glu Phe Arg Arg
305 310 315 320
Thr Asn Gly Ly s Cys Leu Va 1 Trp Gly Arg Al a Pro Ser Ly s Ile Va 1
325 330 335
Al a Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu
340 345 350
Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Al a Arg Hi s Phe Hi s Tyr Va 1 Pro Glu
355 360 365
Ile Leu Ser Al a Phe Phe Trp Thr Va 1 Pro Al a Leu Phe As p Asn Phe
370 375 380
Leu Al a Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Le u Phe Asp Arg Al a Ly s
385 390 395 400
Arg As p As p As p Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Ly s Leu
405 410 415
Tyr Cys Glu Ly s Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pr o Gly Ile Tyr
420 425 430
Egy szekvencia alléljén és analógján olyan szekvenciát értünk, amely az eredeti szekvenciához képest egy vagy több aminosav szubsztitúcióját, delécióját vagy addícióját tartalmazza, minden olyan változat alléinak vagy analógnak számít, amely megtartja az eredeti fehérje funkcióját. Ilyen módosított szekvenciákat előállíthatunk például a szakember számára jól ismert helyspecifikus mutagenezises eljárások alkalmazásával.
A találmány tárgyát képezi tehát egy delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitású A. thaliana-fehérje, melynek aminosavsorrendje megegyezik a 2. azonosító számú szekvenciával, amely fehérje elnevezése: delta7-Red.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérje, melynek aminosavsorrendje körülbelül 60%-ban vagy nagyobb mértékben azonos a 2. azonosító számú szekvenciával.
HU 220 587 Bl
Két szekvencia közötti azonosság százalékos értéke meghatározható például a fent említett „BLAST”-program alkalmazásával.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehéije, amely a fent definiált delta-7-Red elnevezésű A. thaliana-fehéijéhez hasonló immunológiai reaktivitású. A fenti fehéije kimutatható például a delta-7-Red-fehéije ellen a technika állása szerint ismert eljárások alkalmazásával termeltetett ellenszérum alkalmazásával immunprecipitáció útján.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehéije, melyet olyan gazdasejtben történő expresszió útján állítottak elő, mely gazdasejt tartalmazta a korábbiakban definiált DNS-szekvenciát, és kifejezetten a találmány tárgyát képezi az olyan A. thaliana-eredetíi fehéije, melyet olyan gazdasejtben végrehajtott expresszió útján állítottak elő, mely gazdasejt a 2. szekvenciaazonosító számú szekvenciával megegyező aminosavsorrendet kódoló DNS-szekvenciát tartalmazott.
Amennyiben a találmány szerinti fehérjét gazdasejtben végrehajtott expresszió útján állítjuk elő, az előállításkor szakember számára jól ismert genetikai manipulációs és sejttenyésztési eljárásokat alkalmazunk.
Az expressziót végrehajthatjuk prokarióta gazdasejtben, például E. co/z'-sejtben, de végrehajthatjuk eukarióta gazdasejtben is, például emlőssejtben, rovarsejtben vagy élesztősejtben, mely gazdasejtek tartalmazzák a találmány szerinti delta-7-Red-fehérjét kódoló szekvenciát, mely kódolószekvenciától 5’-irányban egy alkalmas promoter található.
Az előállított találmány szerinti rekombináns fehérje lehet glikozilált vagy glikozilálatlan.
A találmány tárgyát képezi közelebbről egy élesztősejtben történő expresszióval előállított találmány szerinti fehérje.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy ellenanyag, amelyet az előzőekben definiált delta-5,7-szterin delta7-reduktáz-aktivitású fehéije ellen termeltettek.
A találmány szerinti ellenanyag lehet mind poliklonális, mind pedig monoklonális ellenanyag, melyet szakember számára ismert eljárások alkalmazásával állítottak elő.
A találmány tárgyát képezik továbbá az előzőekben definiált DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorok, valamint az ilyen vektorokkal transzformált gazdasejtek.
Az expressziós vektorok olyan ismert vektorok, melyek lehetővé teszik, hogy egy fehéije egy alkalmas promoter szabályozása alatt expresszálódjék. Prokarióta sejtekben történő expresszió esetén alkalmas promoter például a lac-promoter, a trp-promoter, a tac-promoter, a β-laktamáz-promoter, valamint a PL-promoter. Emlőssejtekben történő expresszió esetén alkalmas promoterek például az SV40-promoter és az adenovírus promoterei. Rovarsejtekben történő expresszióra alkalmasak például a baculovírus típusú vektorok. Élesztősejtekben történő expresszió esetén alkalmas promoterek például a PGK-promoter, az ADH-promoter, a CYC1-promoter, valamint a GAL10/CYC1 promoter.
Gazdasejtként alkalmazhatunk prokarióta és eukarióta sejteket is. Alkalmas prokarióta sejtek például az E. coli, a Bacillus és a Streptomyces sejtek. Alkalmas eukarióta gazdasejtek például az élesztősejtek és a fonalas gombák sejtjei, csakúgy mint a magasabb rendű élőlények, például emlősök vagy rovarok sejtjei. Alkalmas emlőssejtek például a hörcsögeredetű CHO-sejtek vagy a majomeredetű COS-sejtek. Alkalmas rovarsejtek például az SF9-sejtek. Alkalmas élesztősejtek például a Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe és Kluyveromyces lactis fajhoz tartozó sejtek.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás delta5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjét kódoló nukleinsav klónozására valamely mikroorganizmusban, mely eljárás az alábbi szelekciós eljárások valamelyikét tartalmazza:
- szelektálás a klónozáshoz használt mikroorganizmus nystatinnal vagy analóg vegyülettel szembeni rezisztenciájára, mely vegyület toxicitása a mikroorganizmusban jelen lévő C-7-pozícióban telítetlen kötést tartalmazó szterinek jelenlétének függvénye,
- a fent megadott 1. azonosító számú szekvenciával megegyező szekvenciájú nukleinsavval végzett hibridizáció útján történő szelekció,
- a keresett nukleinsavszekvencia azonosítása és kiválasztása adatfeldolgozó eljárások alkalmazásával véletlenszerűen izolált DNS-szekvenciák közül,
- közvetlenül expresszált klónozott fehéijék azonosítása immundetekció útján a fenti 2. azonosító számú szekvenciával azonos szekvenciájú fehéije ellen termeltetett ellenanyagok alkalmazásával.
A fenti eljárásban „mikroorganizmus” kifejezés alatt élesztősejteket értünk, például S. cerevisiae, S. pombe vagy K. lactis sejteket.
Nystatinnal analóg vegyületek például az amphotericin B vagy a filipin.
A fenti eljárás vonatkozásában a „hibridizáció” kifejezés alatt átlagosan vagy nagyon sztringens körülmények között végrehajtott hibridizációt értünk, az ismert standard körülményekhez viszonyítva (T. Maniatis és munkatársai: lásd fent).
Az adatfeldolgozó eljárások alkalmazásával végrehajtott azonosítás megoldható például a fent ismertetett „BLAST”-program alkalmazásával.
A fenti klónozási eljárás egy példáját - amelyben szelekciós módszerként élesztősejtek nystatinrezisztenciára történő szelektálását alkalmaztuk - a későbbiekben, a példákban részletesen ismertetni fogjuk.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti klónozási eljárással előállított DNS- vagy RNS-szekvenciák. A találmány szerinti nukleinsavszekvenciák lehetnek mind prokarióta, mind pedig eukarióta eredetűek, attól függően, hogy a klónozási eljárást milyen kiindulási anyagból hajtottuk végre, lehetnek például emberi eredetűek.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti klónozási eljárással előállított DNS-szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált gazdasejtek. A találmány szerinti gazdasejt lehet mind prokarióta, mind pedig eukarióta sejt. Alkalmas gazdasejtek és vek8
HU 220 587 Bl torok példáit a korábbiakban már megemlítettük. A találmány tárgyát képezik közelebbről olyan élesztővagy fonalasgomba-eredetű gazdasejtek, melyek a korábbiakban definiált találmány szerinti DNS-szekvenciát vagy a fenti találmány szerinti klónozási eljárással előállított DNS-szekvenciát tartalmazó vektorral vannak transzformálva.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérje előállítására, mely eljárás szerint a találmány szerinti transzformáit gazdasejtet tenyésztjük, és az expresszált fehérjét izoláljuk, különös tekintettel az olyan eljárásokra, melyekben gazdasejtként transzformált élesztősejtet alkalmazunk, mely gazdasejtekben a kódoló DNS-szekvencia valamely élesztőpromoter szabályozása alá van helyezve.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy in vitro eljárás valamely C-7-pozícióban telítetlen szterin redukálására, mely eljárás szerint a redukálni kívánt szterint a találmány szerinti eljárással előállított fehérjével érintkeztetjük, és a kapott redukált szterint adott esetben izoláljuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy in vivő eljárás C-7-pozícióban telítetlen exogén szterin redukálására, mely eljárás szerint a redukálni kívánt szterint a találmány szerinti gazdasejttel érintkeztetjük, és a kapott redukált szterint adott esetben izoláljuk. A találmány szerinti gazdasejt lehet mind prokarióta, mind pedig eukarióta sejt, előnyösen pedig élesztő- vagy fonalasgombasejt.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy in vivő eljárás C-7-pozícióban telítetlen endogén szterin redukálására, mely eljárás szerint a találmány szerinti élesztővagy fonalasgomba-eredetű gazdasejtet tenyésztjük, és a felhalmozott redukált szterint adott esetben izoláljuk.
A találmány tárgyát képezi közelebbről egy fenti in vitro vagy in vivő redukciós eljárás, amely szerint olyan redukált szterint állítunk elő, amely a koleszterin oldallánca restrikciós enzimének (P450SCC) szubsztrátja, és kifejezetten a találmány tárgyát képezi egy olyan in vivő redukciós eljárás, amely szerint a redukálni kívánt endogén szterin az ergoszta-5,7-dién-3-ol, az ergoszta5,7,24(28)-trién-3-ol vagy az ergoszta-5,7,22-trién-3-ol, vagy ezek keveréke.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás pregnenolon előállítására, mely szerint a találmány szerinti élesztő- vagy fonalasgomba-eredetű transzformált gazdasejtet tenyésztjük, a felhalmozódott C-7-pozícióban redukált szterint vagy szterineket adott esetben izoláljuk, a redukált szterineket P450SCC-enzimmel érintkeztetjük, és adott esetben a szterineket adrenodoxinreduktáz (ASR) és adrenodoxin (ADX) jelenlétében érintkeztetjük a P450SCC-vel, és a kapott pregnenolont adott esetben izoláljuk.
A találmány tárgyát képezi közelebbről a fenti eljárás pregnenolon előállítására, mely eljárás szerint gazdasejtként élesztősejtet alkalmazunk.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás pregnenolon előállítására, mely eljárás szerint olyan egy vagy több vektorral transzformált élesztősejteket tenyésztünk, mely vektorok lehetővé teszik egy delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérje, a P450SCC, valamint adott esetben az ADR és ADX együttes expresszióját, és adott esetben izoláljuk a szabad vagy észteresített pregnenolont.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti eljárás, amely szerint olyan transzformált élesztősejteket tenyésztünk, melyek együttesen expresszálnak delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehéijét, P450SCC-t, ADR-t és ADX-et. A találmány tárgyát képezi közelebbről a fenti eljárás, amely szerint az expresszált delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérje az A. thaliana delta-7-Red-fehérjéje, és a találmány tárgyát képezi még közelebbről a fenti eljárás, amely szerint az alkalmazott élesztőtörzs az EC01/pCD63-törzs.
A találmány szerinti pregnenolon-előállítási eljárás példáit a későbbiekben, a példákban részletesen ismertetni fogjuk.
A fenti pregnenolon-előállítási eljárás végrehajtására alkalmas transzformált élesztősejtek lehetnek, például olyan élesztősejtek, melyek kotranszformálva vannak egy találmány szerinti expressziós vektorral, amely tartalmazza a delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehéijét kódoló találmány szerinti DNS-szekvenciát, valamint egy olyan expressziós vektorral, amely alkalmas a citokróm-P450SCC és adott esetben az ADX és ADR expresszálására. A citokróm-P450SCC és/vagy ADX expresszálására alkalmas vektorok ismertek, és ilyen készítmények leírásra megtalálható későbbiekben bemutatott példákban.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott élesztősejtek lehetnek olyan élesztősejtek is, melyekben a delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjét kódoló szekvencia a genom egy bizonyos lokuszába be van integrálódva, például az ADE2-lokuszba, és amely élesztősejtekben a delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz expressziójára alkalmas körülmények között már nem az ergoszterin a legnagyobb mennyiségben előforduló szterin. A beintegrálódott szekvenciát tartalmazó élesztősejteket transzformálhatjuk olyan integrálódó expressziós egységekkel, vagy expressziós vektorokkal, melyek olyan DNS-szekvenciát tartalmaznak, melyek a citokróm-P450SCC enzimet és adott esetben az ADX-et vagy ADR-t kódolják.
A későbbiekben a példák között ismertetni fogjuk olyan élesztőtörzsek előállítását, melyek in vivő pregnenolont termelnek, vagy annak ecetsavas észterét.
Az elmondottak értelmében a találmány tárgyát képezi egy transzformált élesztőtörzs, amely együttesen expresszál egy delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjét, a P450SCC-t, az ADR-t és az ADX-et, és képes szabad vagy észteresített pregnenolont akkumulálni, a találmány tárgyát képezik közelebbről az olyan fenti élesztőtörzsek, melyek delta-5,7-szterin delta-7reduktáz-aktivitású fehérjeként az A. thaliana delta-7Red-fehéijéjét expresszálják, és a találmány tárgyát képezi még közelebbről egy EC01/pCD63 jelű élesztőtörzs, mely törzs előállításának pontos menetét a későbbiekben a példák között ismertetjük.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti találmány szerinti klónozási eljárás alapján előállított hu9
HU 220 587 Bl mán DNS-szekvenciák, melyek hibridizációs próbaként alkalmazva alkalmasak delta-5,7-szterin delta-7reduktáz deficienciából eredő veleszületett betegségek diagnosztizálására. A delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz deficiencia magában foglalja például a 7-dehidrokoleszterin-reduktáz deficienciát, amely a plazma abnormálisán alacsony koleszterinszintjéért felelős.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz deficiencia kimutatására, mely eljárás szerint humán genomi DNS-t tartalmazó mintát a fentiekben definiált hibridizációs próbával érintkeztetünk standard hibridizációs körülmények között, majd kimutatjuk a hibridizációs próba genomi DNS-hez történő kötődését vagy genomi DNS-hez történő kötődésének elmaradását, és a kötődés elmaradása vagy a kötődés mértékének csökkenése alapján veleszületett delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz deficienciára következtetünk.
A találmány szerinti eljárás alkalmas többek között a veleszületett delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz deficiencia születés előtti vagy újszülött korban történő kimutatására, csakúgy mint a különböző betegségekben szenvedő páciensek diagnosztizálására, különös tekintettel az olyan páciensek diagnosztizálására, akikben az RSH/SLO-szindróma már klinikailag manifesztálódott.
A csatolt ábrákkal a találmány szerinti megoldás bizonyos részleteit kívánjuk szemléltetni.
Az 1. ábrán az FY1679-jelű élesztőtörzsben klónozott A. thaliana-génkönyvtái átvizsgálása során azonosított nystatinrezisztens F22-klónból izolált összes szteroid elválasztási profilját láthatjuk. Az analízist RPHPLC-eljárás alkalmazásával hajtottuk végre 205 vagy 285 nm-nél (1A. ábra) vagy GC-eljárással, kontrollként a nem transzformált FY1679-élesztőtörzset alkalmazva (1B. ábra).
A 2. ábrán a pF22-plazmid Notl-ffagmensének restrikciós térképét láthatjuk, valamint annak szekvenálási stratégiáját.
A 3. ábrán a delta-7-Red-DNS nukleotidszekvenciáját láthatjuk (szekvenciaazonosító szám: 1), valamint az annak megfelelő aminosavsorrendet (szekvenciaazonosító szám: 2).
A 4. ábrán a „delta-7/V8”-jelzésű indukálható expressziós vektorral transzformált FY1679-törzs mikroszóma frakciója delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitásának in vitro meghatározását láthatjuk. Az analízist GC-eljárással hajtottuk végre, és láthatjuk, hogy a Ίdehidrokoleszterin-szubsztrát (RT = 16,528) átalakult koleszterinné (RT= 15,887), a következő endogén szterinek jelenlétében: 5,22-dién-3-ol (RT=16,682); ergoszterin (RT=17,249) és ergoszta-5-én-3-ol (RT=17,664).
Az 5. ábrán egy in vitro pregnenolon előállítási eljárást láthatunk, mely eljárás során delta-7-Red-fehéqét expresszáló transzformált élesztősejtekből tisztított ergoszta-5-én-3-ol (5A. ábra); ergoszta-5,24(28) dién-3ol (5B. ábra) vagy ergoszta-5,22-dién-3-ol (5C. ábra) restrikciós emésztése útján állítottuk elő a pregnenolont, P450SCC, ADX és ADR jelenlétében végzett inkubálás útján. Az analízist GC-eljárással hajtottuk végre, kontrollként egy koleszterin restrikciós emésztésével előállított mintát alkalmaztunk (folytonos vonal).
A 6. ábrán a pADdelta-7 jelű integrálódó plazmid előállítását láthatjuk, amely lehetővé teszi a delta-7Red (szterin delta-7-reduktáz) fehérjét kódoló cDNS ADE2-lokuszba történő integrálódását.
A 7. ábrán az FY1679-törzsből és az integrálódott szekvenciát tartalmazó galaktóz jelenlétében tenyésztett ELROl-törzsből lúgos szaponifikálással izolált összes szterin GC-eljárással végrehajtott analízisének eredményét láthatjuk.
A 8. ábrán a V13 jelű E. coli - S. cerevisiae ingázóvektor előállításának vázlatát láthatjuk, mely vektor a többszörös klónozóhelyén egy egyedi Sall-hasítóhelyet (Sa) tartalmaz.
A 9. ábrán a pCD62-l és pCD62-2 jelű integrálódó plazmidok előállításának lépéseit láthatjuk, mely plazmidok lehetővé teszik, hogy az ADR-expressziós egység beintegrálódjék a leu2- és spll delta-gének közötti intergenikus régióba.
MCS1 ésMCS2: többszörös klónozóhelyek.
A 10. ábrán a CDR01-törzs előállításának stratégiáját mutatjuk be.
All. ábrán az ADX és P450SCC expressziós egységeket tartalmazó pCD63 jelű expressziós plazmid előállításának lépéseit mutatjuk be.
A 12. ábrán az EC01/pCD63-törzs sejtjeiből (sejtlizátum) és táptalajából (táptalaj) a galaktózos indukciót követően 9 óra elteltével (12A. ábra) és 24 óra elteltével (12B. ábra) izolált szterinek GC-analízisének eredményeit láthatjuk.
A 13. ábrán a pTG7457-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 14. ábrán a pTG7453-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 15. ábrán a pTG10014-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 16. ábrán a pTG10004-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 17. ábrán a pTG 10031-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
A 18. ábrán a pTG10033-plazmid szerkezetét mutatjuk be.
Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldást kívánjuk részletesebben szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
Az A. thaliana delta-5,7-szterin delta-7-reduktázát (delta-7-Red) kódoló cDNS klónozása
A-A. thaliana expressziós könyvtár átvizsgálása élesztösejtekben
Kiindulási könyvtárként az M. Minet és munkatársai által leírt [Plánt J., 2, 417 (1992)] expressziós cDNSkönyvtárt használtuk, melyet kétleveles csírázási fázisban A. thaliana növényekből izolált mRNS-ből állítottak elő, és amely könyvtárban a cDNS-szekvenciákat Notl-hasítóhelyek szegélyezik, és amely cDNS-szekvenciák a pFL61 jelű E. coli/S. cerevisiae ingázóvektor expressziós egységének BstXI hasítóhelyére lettek beinszer10
HU 220 587 Β1 tálva. Ez az expressziós egység a foszfoglicerát kináz gén (PGK) promoter és terminátor szekvenciáit tartalmazza. Az élesztőben működőképes replikációs origó a 2p-szekvenciából származik, és az URA3 jelű szelekciós indikátorgén biztosítja a vektor élesztősejtekben történő fennmaradását. A vektor E. coliban történő fennmaradását biztosító részlete a pUC19-plazmidból származik.
Az FY1679 (Mata) elnevezésű élesztőtörzset, amely az A. Thierry és munkatársai által leírt S288C-törzs izogenikus törzse [Yeast, 6, 521 (1990)], a D. Gietz és munkatársai által leírt [Nucleic Acids Rés., 20, 1425 (1992)] lítium-acetátos eljárással transzformáltuk, a cDNS-könyvtárral.
A sejteket szintetikus SGI-táptalajra szélesztettük, amely a következő összetevőket tartalmazta: 7 g/1 „yeast nitrogén base” (Difco), 1 g/1 „bactocasaminoacids” (Difco), 20 g/1 glükóz, 20 mg/1 triptofán, és a táptalaj nem tartalmazott uracilt. A kapott 105 uracilprototróf transzformánst csoportokba osztottuk, majd ismét szélesztettük őket azonos szintetikus táptalajra, mely szintén nem tartalmazott uracilt, tartalmazott viszont 2 vagy 5 pg/ml nystatint. A szélesztést 5χ 104 sejt/tenyésztőtálca sűrűséggel végeztük. Az ismertetett módon mindegyik nystatinkoncentráció esetén 106 sejtet vizsgáltunk meg. Háromnapos 28 °C-on végzett inkubáció után összegyűjtöttünk körülbelül 100 darab 2 pg/ml nystatinkoncentráció mellett növekedő kiónt, a kiónokat ötös csoportokba osztottuk, és a csoportok szterinösszetételét fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás eljárással (a továbbiakban: RP-HPLC-eljárás) analizáltuk, és egyetlen olyan kiónt kaptunk, amely képes volt 5 pg/ml nystatin jelenlétében növekedni, ezt a kiónt F22-klónnak neveztük el.
B - Az F22-klónban felhalmozódott szterinek analízise
Az élesztősejtekből L. Parks és munkatársai [Methods in Enzymol.: 111, 333 (1985)] lúgos szaponifikálási eljárása alkalmazásával állítottunk elő össz-szterin preparátumot, majd a preparátumot RP-HPLC-eljárással és/vagy gázkromatográfiás eljárással (továbbiakban: GC-eljárás) analizáltuk.
Az előállított szterinmaradékot etanol-tetrahidrofurán-víz (térfogatarány=65:10:25) elegyben feloldottuk, majd RP-HPLC-eljárással analizáltuk, Applied Biosystem által forgalmazott C18-kötött szilikaoszlopon (100x2,1 mm), folyási sebesség: 1 ml/perc, hőmérséklet: 55 °C, elúció: lineáris vizes metanolgradienssel (50%-tól 100%-ig, 18 perc alatt), az eljárás során fotometriás detektálást végeztünk 205 nm-en és 285 nm-en, kontrollként ergoszterin-, kampeszterin- és koleszterinstandardokat alkalmaztunk.
A szterinösszetételt GC-eljárással is analizáltuk, „Alltech SE-30” kapilláris oszlop alkalmazásával (30 m χ 0,32 mm), hordozógáz: hélium, injektor hőmérséklete: 280 °C, detektor hőmérséklete: 310 °C, a hőmérséklet emelését kezdetben 110 °C-ról 245 °C-ra 45 °C/perc sebességgel hajtottuk végre, majd a további melegítést 3 °C/perc sebességgel hajtottuk végre a 280 °C eléréséig.
Az RP-HPLC-analízis (1A. ábra) és a GC-analízis (IB. ábra) eredményeit ábrázoló grafikonok alapján megállapíthatjuk, hogy a fentiek szerint előállított F-22klón felhalmozott szterin-profiliára jellemző, hogy az ergoszterin látszólag teljesen eltűnt a szterinek közül, amely a nem transzformált FY1679-törzs legnagyobb mennyiségben előforduló szterinje, és az ergoszterin helyett két fő szterinösszetevő mutatható ki, melyek hasonló mennyiségben fordulnak elő és 285 nm-en nincs fényelnyelésük, amiből az RP-HPLC-analízis eredményei alapján arra következtethetünk, hogy nem található bennük konjugált kettős kötés.
Az 1A. ábrán látható kampeszterin (24-R-ergoszta5-én-3-ol) minta (Sigma) tartalmaz körülbelül 35% dihidrobrasszikaszterint (24-S-ergoszta-5-én-3-ol) is.
C - A delta-7-Red-cDNS klónozása
Az F22-klónból izolált plazmidokat E. coli-sejtekben sokszorosítottuk, J. N. Strathem és munkatársai eljárása szerint [Methods in Enzymol. 194, 319 (1991)], majd az izolált plazmidot Notl-enzimmel emésztettük. Az emésztés eredményeként, egy körülbelül 600 bázispáros (bp) és egy 1,6 kilobázisos (kb) fragmenst kaptunk. Az FY1679-törzset külön-külön mindkét ffagmenssel transzformáltuk. Valamennyi transzformáns élesztőklón szterinösszetételét a fentiek szerint analizáltuk, mely eljárás lehetővé tette, hogy a módosult szterinösszetételért felelős gént hordozó plazmidot azonosítsuk. Az ily módon azonosított plazmidot pF22-plazmidnak neveztük el.
D - A delta-7-Red cDNS szekvenciájának meghatározása
A pF22-plazmid cDNS-inszertjét a pUC9-vektorból (Pharmacia) előállított pUC9N-vektor Notl-hasítóhelyére szubklónoztuk, a pUC9N-vektorban a pUC9plazmid többszörös klónozóhelyében található EcoRIhasítóhelyet egy NotI restrikciós hasítóhelyre cseréltük, oly módon, hogy a LacZ-gén leolvasási fázisa megmaradjon. Ezután meghatároztuk a kialakított plazmid restrikciós térképét (2. ábra).
Azokat a restrikciós ffagmenseket, melyek mindkét végükön a Notl-hasítóhelyet, belsejükben pedig EcoRI-, PvuII- vagy HindlII-hasítóhelyet tartalmaztak, a pBluescript-plazmidba (Stratagene) szubklónoztuk. A ffagmensek nukleotidszekvenciáját a Sanger-féle eljárással határoztuk meg, a szekvenáz elnevezésű DNS-polimeráz (Stratagene reagenskészlet) alkalmazásával, a szekvenálást mind a két szálon elvégeztük, a pBluescript, a pUC9-rendszerhez kifejlesztett direkt és inverz láncindító nukleotidok alkalmazásával (T3 és T7), vagy pedig a már meghatározott cDNS-nukleotidsorrendből származtatott specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával.
A kapott szekvenciaadatok kombinálásával meghatároztuk az A. thaliana delta-7-Red-cDNS-ének teljes nukleotidsorrendjét (szekvenciaazonosító szám: 1), melyet a 3. ábrán mutatunk be. A cDNS-szekvencia 1496 nukleotidot tartalmaz, és poliadenilációs szekvenciával végződik. A szekvenciában található egy nyílt leolvasási fázis, amely a 76. nukleotidnál kezdődő metionin startkodonnal kezdődik, és az 1366. nukleotidnál talál11
HU 220 587 Bl ható terminációs kodonnál végződik. Az említett nyílt leolvasási fázis tehát 1290 nukleotidot tartalmaz, és egy 430 aminosavat tartalmazó fehérjét kódol. A delta7-Red-cDNS kódoló régiója a delta-7-Red-fehérjét kódolja, melynek kikövetkeztetett aminosavsorrendjét (szekvenciaazonosító szám: 2) a 3. ábrán láthatjuk.
A fehérje aminosavsorrendje 430 aminosav hosszúságú, és a fehéqe számított molekulatömege 49,286 kD.
A delta-7-Red-cDNS a pUC9N-vektorban tartalmazó (jelzése: delta-7-Red/pUC9N-cDNS) E. coli DH5-1- 10 törzset 1995. február 10-én helyeztük letétbe a CNCM intézetben, 1-1535 deponálási számon.
E -A3. azonosító számú konszenzusszekvencia meghatározása
Szekvencia-adatbázisok („Genbank” és „EMBL”) 15 számítógépes átvizsgálása útján kimutattuk, hogy az A. thaliana delta-7-Red-fehéqéje tartalmaz bizonyos szekvenciahasonlóságokat egyéb szterinreduktázok szekvenciáival, különösen az S. cerevisiae fajból izolált szterin C-14-reduktáz és szterin C-24(28)-reduktáz szekvenciájával, melyeket R. T. Lorenz és munkatársai [DNA Cell
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa 1 5 ahol a 7. pozícióban található Xaa jelentése: Trp vagy Tyr és a 12. pozícióban található Xaa jelentése: His vagy Lys. Az azonosított konszenzusszekvencia alkalmas arra, hogy alapján olyan oligonukleotidokat állítsunk elő, melyek láncindító oligonukleotidként alkalmasak arra, hogy felhasználásukkal PCR-eljárással olyan új genomi DNS- vagy cDNS-szekvenciákat amplifikáljunk, melyek delta-5,7-szterin delta-7-reduktázaktivitású fehérjéket kódolnak.
F - A delta-7-Red-fehérje expresszálása élesztősejtekben
a) Az élesztősejtekben indukálható delta-6/V8 expressziós vektor előállítása
A pF22-plazmidban található cDNS nem kódoló régióit PCR-amplifikáció útján elimináltuk, az alábbi láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:
’-CGCGGATCCATGGCGGAGACTGTAC ATTC-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 4) és 5 '-CAGGGTACCTCAATAAATTCCCGGAATG-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 5).
A láncindító oligonukleotidokat úgy terveztük, hogy az amplifikált szekvenciában egy BamHI-hasítóhely keletkezzék közvetlenül 5'-irányban a startkodontól, és egy KpnI-hely keletkezzék közvetlenül 3’-irányban a stopkodontól.
A cDNS-szekvenciát 1 ng „delta-7-Red/pUC90cDNS”-plazmidot templátként alkalmazva amplifikáltuk, két egység Pfu DNS-polimeráz és 0,2-0,2 pmol/l láncindító oligonukleotid jelenlétében, az alábbi körülmények között: 94 °C, 10 másodperc; 52 °C, 50 másodperc; 74 °C, 90 másodperc; 33 ciklus, az amplifikált ciklusreakciót a Stratagene által forgalmazott PCR-reagenskészlet alkalmazásával hajtottuk végre.
Az amplifikáció eredményeként egy 1300 bázispáros fragmenst kaptunk, melyet megemésztettünk
Bioi., 11, 685 (1992)] és W. Chen és munkatársai: [Yeast, 7, 305 (1991)] írtak le, és jelentős hasonlóságok találhatók az S. pombe stsl+ -génje termékének szekvenciájával, mely gént M. Shimanuki és munkatársai ír5 tak le [Mól. Bioi. Cell, 3, 263 (1992)], valamint a Neurospora crassa szterin C4-reduktázának szekvenciájával („EMBL” adatbázis: No. X77955). Ezenfelül a delta-7Red-fehéije szekvenciája hasonlít a csirke lamin-B-receptora C-terminális 400 aminosavának szekvenciájához, valamint az ennek megfelelő humán receptor szekvenciájához, melyeket H. J. Worman és munkatársai [J. Cell Bioi., 111, 1535 (1990)] és E. Schuler és munkatársai: [J. Bioi. Chem., 269, 11312 (1994)] írtak le.
A delta-7-Red-cDNS-ből kikövetkeztetett 2. szekvenciaazonosító számú aminosavsorrendet egy számítógépes program segítségével összehasonlítottuk az említett három élesztőeredetű szterinreduktáz és a két lamin-B-receptor aminosavsorrendjével, és az összehasonlítás alapján egy új konszenzusszekvenciát határoz20 tünk meg, melynek aminosavsorrendje a következő (szekvenciaazonosító szám: 3):
Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 10 15
BamHI és KpnI restrikciós enzimekkel, és a pYeDPl/8-2 elnevezésű E. coli/S. cerevisiae ingázóvektor (rövidített elnevezés: V8) BamHI- és Kpnl-hasítóhelyeire inszertáltuk, az ingázóvektor leírása megtalálható C. Cullin és munkatársai közleményében [Gene, 65, 203 (1988)]. A V8-vektor tartalmazza az URA3 jelű szelekciós indikátorgént, és tartalmaz egy élesztőben működőképes expressziós egységet, amely magában foglalja egyrészt a GAL10/CYC1 promotert, másrészt pedig a PGK-gén terminátorszekvenciáját. Az ily módon előállított plazmid - melynek elnevezése: delta-7/V8 - lehetővé teszi a delta-7-Red-fehérje galaktózzal indukálható expresszióját.
b) A delta-7-Red-fehérje termeltetése
Az FY1679 (Mata) élesztőtörzset a fentiek szerint előállított delta-7/V8 plazmiddal transzformáltuk a D. Gietz és munkatársai által leírt lítiumacetátos eljárás alkalmazásával (lásd fent). A transzformált élesztősejteket 27 °C-on tenyésztettük a fent leírt SGI jelű szelekciós táptalajban, amelyben azonban a glükózkoncentráció 5 g/1 volt, a tenyésztést addig folytattuk, míg a telítési sejtsűrűséget el nem értük (OD600nm=12). A tenyészetet ezután meghígítottuk egy térfogat teljes YP-táptalaj hozzáadásával [élesztőkivonat (Difco: 10 g/1), „baktopepton” (Difco: 10 g/1)], majd a tenyészethez szénforrásként etanolt adtunk (1,5 térfogat%-ban). Amikor a sejttenyészet koncentrációja elérte a legalább 7 χ 107 sejt/ml értéket, a delta-7-Red-fehérje expresszióját 20 g/1 galaktóz hozzáadásával indukáltuk.
Az indukciót végrehajtottuk szelektív SLI-minimáltáptalajban is, amely olyan SGI-táptalaj, amelyben a glükóz helyett galaktóz van (20 g/1 koncentrációban), amikor a 2xl07 seji/ml-es koncentrációt a tenyészet elérte.
c) A delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitás in vitro enzimatikus vizsgálata
HU 220 587 Bl
A delta-7-Red-fehéije expresszióját egy M. Taton és munkatársai által leírt [Biochem. Bioph. Rés. Commun., 181, 465 (1991)] enzimatikus teszt segítségével mutattuk ki, azzal az eltéréssel, hogy nem használtuk a NADPH-regenerációs rendszert, az enzimatikus vizsgálati eljárást a fenti indukált élesztősejtekből készített mikroszomális vagy sejtplazmatikus preparátumokból kiindulva végeztük.
A sejtfrakciókat az indukált sejtek mechanikai feltárása útján állítottuk elő, és a következő frakciókat ultracentrifugálással izoláltuk, P. Urban és munkatársai eljárása alapján [Eur. J. Biochem., 222, 843 (1994)]. A sejteket összegyűjtöttük, majd kétszer mostuk őket TEKCl-pufferrel (50 mmol/1 Tris-HCl, pH=7,4; 1 mmol/1 EDTA, 0,1 mol/1 Kel), majd a megmosott sejteket 0,6 mol/l-es TE-szorbitol lízispufferben felszuszpendáltuk. A sejtszuszpenzióhoz ezután 0,45-0,5 mm átmérőjű üveggyöngyöket (Braun) adtunk egész addig, amíg a gyöngyök a sejtszuszpenzió felszínén keresztül láthatóvá váltak, majd a szuszpenziót 5 percig 4 °C-on erőteljesen kevertettük. Az előállított sejtlizátumot az elegy felszínéről begyűjtöttük, és az üveggyöngyöket háromszor lízispufferben megmostuk. A lizátumot és a mosófolyadékot ezután összeöntöttük, majd 20 000 g-vel 13 percig 4 °C-on centrifugáltuk, a mitokondriális frakció eltávolítása céljából. Az összegyűjtött felülúszót 1 órán keresztül 10 000 g-vel centrifugáltuk, 4 °C-on. A mikroszomális frakciót tartalmazó csapadékot és a sejtplazmatikus frakciót képviselő felülúszót külön-külön begyűjtöttük.
A fentiek szerint előállított mikroszomális és sejtplazmatikus frakciókat külön-külön 90 percen át 37 °Con inkubáltuk, 100 mmol/l-es Tris-HCl-pufferben (pH=7,3), amely szubsztrátként 150 pmol/l 7-dehidrokoleszterint tartalmazott, „Tween 80” detergenssel (1,5 g/1) emulzifikálva, 2 mmol/1 NADPH jelenlétében. A szterineket ezután 3 térfogat metanol/diklór-metán elegy (50:50, térfogatarány) hozzáadásával extraháltuk, majd az extraktumot GC-eljárással analizáltuk, standard termékekkel történő összehasonlítás útján.
A 4. ábrán látható, hogy a delta-7/V8-vektorral transzformált fentiek szerint előállított FY1679 élesztősejtek mikroszomális frakciójában (3,5 mg/mg fehéqe), a 7-dehidrokoleszterinből (RT= 16,528 perc) koleszterin (RT=15,887 perc) keletkezett, a 3 órás indukciós idő alatt, és láthatók az endogén szterinek is, melyek retenciós ideje hosszabb az előbb említetteknél (ergoszta-5-22dién-3-ol:RT=16,682; ergoszterin:RT=17,249 perc; ergoszta-5-én-3-ol: RT=17,664 perc).
Az ismertetett eredményekből kitűnik, hogy a delta7-Red-fehétje egyrészt expresszálódik a transzformált élesztősejtekben, másrészt pedig delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitással bír.
2. példa
C-7-pozícióban telítetlen endogén szterinek in vivő redukciója élesztösejtekben
Olyan élesztőtörzseket transzformáltunk az 1. példa szerint előállított delta-7/V8-vektorraí, melyekben az endogén szterinek nagy része a C-5,7-pozíciókban egy kettős kötést tartalmazott, majd a sejteket az 1. példában leírtak szerint tenyésztettük és indukáltuk. Az endogén szterineket - melyek összetételét előzőleg GC-eljárással analizáltuk - RP-HPLC-eljárással extraháltuk és tisztítottuk az 1. példában leírtak szerint, preparatív C18-oszlop (100x4,6 mm) alkalmazásával, majd az extraktumot IR-, UV-, MS- és NMR-spektroszkópiával vizsgáltuk. A kísérletekben az alábbi három törzset használtuk:
- az 1. példában leírt FY1679-törzset;
- a PLC-1051 jelű mutáns erg5-törzset, melyre jellemző, hogy szterin C-22 deszaturáz vonatkozásában deficiens, melyet úgy állítottunk elő, hogy az FY1679törzset kereszteztük az S. W. Molzahn és munkatársai által leírt [J. Gén. Microbiol.: 72, 339 (1972)] eredeti pol5-törzzsel, amelyben ergoszta-5,7-dién-3-ol halmozódik fel;
- a PLC-1451 jelű kétszeresen mutáns erg-4,5-törzset, amelyre jellemző, hogy defíciens mind szterin C-22 deszaturázra nézve (erg5), mind pedig szterin C-24 (28-reduktáz vonatkozásában erg4), mely törzset úgy állítottunk elő, hogy az FY1679-törzset kereszteztük az S. W. Molzahn és munkatársai által leírt pol5-törzzsel (lásd fent), mely törzsben spontán rezisztencia alakult ki nystatinnal szemben, egy olyan szisztematikus szűrőeljárás folyamán, melynek célja szterin metabolizmusban mutáns élesztőtörzsek előállítása volt, és amely törzsben ergoszta-5,7-24(28)-trién-3-ol halmozódik fel. A kialakított haploidtörzs, amely hordozza az erg4, erg5 kettős mutációt - galaktóz és egy nem fermentálható szubsztrát jelenlétében növekszik, és uracil, triptofán és hisztidin vonatkozásában auxotróf. A PLC1051 és PLC-1451 jelű törzseket a CNCM intézetben letétbe helyeztük 1995. február 10-én, sorrendben 1-1536 és 1-1537 deponálási szám alatt.
Az alábbi táblázatban összefoglaljuk a fent ismertetett három transzformáns törzsben azonosított nagyobb mennyiségben előforduló redukált szterineket:
Kiindulási törzs Fő szterin a kiindulási törzsben A C-7-pozícióban redukált fő endogén szterin
FY1679 ergoszta-5,7,22-trién3-ol (ergoszterol) ergoszta-5-én-3-ol (dihidrobrasszikaszterol) ergoszta-5,22-dién-3-ol (brasszikaszterol)
erg5 PLC 1051 ergoszta-5,7-dién-3-ol ergoszta-5-én-3-ol
erg4,5 ergoszta-5,7,24(28)- ergoszta-5,24(28)
PLC 1451 trién-3-ol (osztreaszterol)
HU 220 587 Bl
3. példa
Pregnenolon előállítása in vitro C-7-pozícióban redukált endogén élesztőszterinek restrikciós hasítása útján
A pregnenolon előállítását a Wada és munkatársai által leírt [Arch. Biochem. Biophys., 290, 376 (1991)] in vitro eljárás szerint hajtottuk végre, mely eljárás a koleszterin oldalláncának in vitro lehasítását teszi lehetővé enzimatikus restrikciós emésztés útján. Az eljárás szerint 260 pmol/l 2. példa szerint előállított C-7-ροζίcióban redukált szterint 150 pl alábbi összetételű pufferben inkubálunk: 10 mmol/1 foszfátpuffer (pH=7,4), 100 mmol/1 NaCl, 0,3% Twin-20, 140 nmol/1 adrenodoxin-reduktáz, 1,16 pmol adrenodoxin, 0,68 pmol/l marhaeredetű citokróm-P450SCC, melyet előállíthatunk például Seybert és munkatársai eljárása alapján [D. W. Seybert és munkatársai: J. Bioi. Chem., 254, 12088 (1979)] vese fölötti mirigyekből kiindulva.
Az enzimes reakciót 150 pmol/l NADPH hozzáadásával indítjuk. 80 percen át 37 °C-on végzett inkubálás után a reakciót egy térfogat metanol/diklór-metán elegy (térfogatarány: 50:50) hozzáadásával leállítjuk. A szterineket ezután az 1. példában leírtak szerint extraháljuk és GC-eljárással analizáljuk. Az 5. ábrán láthatjuk, hogy az ergoszta-5-én-3-ol (5A ábra), az ergoszta-5,24(28)dién-3-ol (5B. ábra) és az ergoszta-5,22-dién-3-ol (5C. ábra) szubsztrátja a citokróm-P450SCC-nek, és az enzimes reakció eredményeként olyan terméket kapunk, melynek retenciós ideje azonos a pregnenolonéval, melyet azonos körülmények között koleszterin restrikciós emésztésével állítottunk elő.
A kapott eredmények azt mutatják, hogy a delta-7Red-fehérjét expresszáló transzformált élesztősejtekben olyan szterinek halmozódnak fel, melyek közvetlenül alkalmazhatóak pregnenolon előállítására, in vitro biológiai oxidáció útján.
Olyan élesztőtörzsek előállítása, melyek képesek in vivő pregnenolon vagy pregnenolon-acetát előállítására A - Az ELROl-törzs előállítása, amely tartalmaz egy A. thaliana delta-7-Red-fehérje expresszálására alkalmas egységet, az A keresztezési típusú haploid FY1679-törzs (FY1679 Mata) ADE2-lokuszába integrálódva
a) A pADdelta-7-(pADA7) integrálódó plazmid előállítása
A pADA-plazmid előállítását a 6. ábrán bemutatottak szerint hajtottuk végre. Az S. cerevisiae ADE2-génjét tartalmazó BglII-fragmenst (2244 bázispáros) a pASZ-11-plazmidból [A. Stotz és munkatársai: Gene, 95, 91 (1990)] izoláltuk, és a fragmenst a pBLUESCRTPT-II-KS+-vektort (Stratagene) többszörös klónozóhelyének BamHI-helyére inszertáltuk.
Az így előállított plazmidot - melynek megjelölése: pBS-ADE2 - egyedi Stu-I-hasítóhelyén történő emésztéssel linearizáltuk, majd defoszforiáltuk.
Előállítottunk egy közelítőleg 2,44 kb hosszúságú fragmenst, amely tartalmazta a GAL10/CYC1 promotert, a delta-7-Red-fehérje (szterin-7-reduktáz) kódoló szakaszát, valamint a PGK-terminátort (tPGK). A fragmenst az 1F. példa szerint előállított delta-7/V8 plazmidból kiindulva PCR-eljárással állítottuk elő, az alábbi szekvenciájú láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:
’-GATTACGCCAAGCTTTTCGAAAC-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 6), valamint 5’-AGATCTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAAC-3’ (szekvenciaazonosító szám: 7), mely láncindító oligonukleotidok szekvenciáit úgy terveztük meg, hogy sorrendben a tPGK-szekvencia 3'-végével és az URA3-gén 3’-végével legyenek képesek párosodni. A PCR-reakciót az alábbi összetételű reakcióelegyben végeztük: delta-7/V8 plazmid templát (80 ng), fenti szekvenciájú láncindító oligonukleotidok (mindegyikből 0,5 pmol/l), natív Pfu DNS-polimeráz (1 egység, a Stratagene által ajánlott pufferben), és a következő reakciókörülményeket alkalmaztuk: 35 ciklus; 95 °C: 1 perc; 95 °C 5 másodperc; 56 °C: 30 másodperc; 70 °C: 4 perc 30 másodperc. Az amplifikálódott fragmenst ezután tompavég-ligálással a fenti linearizált pBSADE2 plazmidba klónoztuk, előállítva ily módon a pADA7-plazmidot, amelyben a körülbelül 4720 bázispáros Notl/PstI fragmens tartalmazza a delta-7-Red expressziós egységgel megszakított ADE2-gént.
b) Kromoszomális integráció az FY1679 Mata élesztőtörzsben
A NotI és PstI restrikciós enzimekkel emésztett pADA7-plazmidból izolált Notl/PstI fragmenst (4720 bázispáros) betranszformáltuk az FY1679 Mata élesztőtörzsbe, a Gietz és munkatársai által leírt lítiumacetátos eljárás alkalmazásával (hivatkozás: lásd fent).
A transzformánsokat, melyekbe ez a fragmens homológ rekombináció útján beintegrálódott nystatinrezisztenciájuk alapján szelektáltuk, mely transzformáns fenotípus oly módon jött létre, hogy a transzformánsokat expresszálódott a delta-7-Red-fehérje, amely az élesztősejtekben található delta-5,7-szterineket delta-5-szterinekké alakítja.
A transzformált sejteket 4 órán keresztül 24 °C-on inkubáltuk, a 1F. példában leírt YP jelű teljes táptalajban, amely tartalmazott glükózt (20 g/1) és ki volt egészítve adeninnel (20 mg/1). A transzformáns sejteket ezután betöményítettük és SLI-agar minimáltáptalajra szélesztettük őket (1 g/1 „baktocasaminoacids”; 7 g/1 „yeast nitrogén base”; 20 g/1 galaktóz; 20 mg/1 adenin; 20 g/1 agar), majd a szélesztett sejteket tartalmazó lemezeket 28 °C-on inkubáltuk egy éjszakán át, a delta-7Red-gén expressziójának indukálása céljából. Az uracilkomplementáció hiánya a sejtek növekedését korlátozza. A kiónokat ezután összegyűjtöttük, csoportokba osztottuk őket, és olyan lemezre szélesztettük a kiónokat, melyek adeninnel (20 mg/1) kiegészített galaktózt is tartalmazó (20 g/1) teljes YP-táptalajt tartalmaztak, és a lemezek növekvő koncentrációban nystatint is tartalmaztak (0 pg/ml, 1 pg/ml, 2 pg/ml, 5 pg/ml, 20 pg/ml). A 4. napon körülbelül 20 olyan kiónt találtunk, melyek képesek voltak 5 pg/ml nystatinkoncentráció mellett növekedni. Ezek közül a kiónok közül 12-t tovább tenyésztettünk WO-minimáltáptalajt tartalmazó lemezeken (7 g/1 „yeast nitrogén base”, aminosavak nélkül, 20 g/1 glükóz), mely táptalaj ki volt egészítve uracillal, leucinnel, triptofánnal, hisztidinnel és adeninnel (vala14
HU 220 587 Bl mennyi kiegészítő komponensből 20 pg/l-t tartalmazott a táptalaj).
Az ADE2-gén megszakítása következtében fellépő adenin-auxotrófiát oly módon igazoltuk, hogy megállapítottuk, hogy az illető klón képtelen növekedni a leírt uracillal, leucinnel, triptofánnal és hisztidinnel kiegészített, de adeninmentes WO-táptalajon.
A beintegrálódott expressziós egység jelenlétét az élesztősejtek genomi DNS-ében PCR-amplifikációs eljárással mutattuk ki, oly módon, hogy ez előállított kiónok genomi DNS-en a fentiekben ismertetett 6. és 7. azonosító számú szekvenciával bíró láncindító oligonukleotidok alkalmazásával PCR-reakciókat hajtottunk végre.
A beépített delta-7-Red-gén működőképességét az élesztősejtekben felhalmozódott szterinek összetéte- 15 lének GC-eljárással végrehajtott analízise útján mutattuk ki. Az analízist 5 méter hosszú SE-30 jelű kapilláros oszlopon (Alltech) hajtottuk végre, az 1B. példában leírtak szerint, oly módon, hogy a szterineket lúgos szaponifikációs eljárással extraháltuk. Az analízis kimu- 20 tatta, hogy amennyiben a transzformáns kiónokat galaktóz jelenlétében tenyésztettük, a szterinösszetétel úgy módosult, hogy C-7-pozícióban telített szterinek halmozódtak fel. Az előállított ERL01 jelű élesztőtörzsben az ergoszta-5,7,22-trién-3-ol (ergoszterin) helyett, 25 amely a kiindulási FY1679-törzs fő szterinje, ergoszta5-én-3-ol és ergoszta-5,22-dién-3-ol halmozódott fel, ahogy azt a 7. ábrán láthatjuk.
A fentiek szerint előállított ELR01-törzs expresszálja a delta-7-Red-gént, amennyiben galaktóz jelenlétében tenyésztjük a sejteket, mivel a gén az említett törzsben a GAL10/CYC1 promoter transzkripciós szabályozása alatt áll. Bár a delta-7-Red expressziós egység transzkripciós iránya megegyezik az ADE2-gén transzkripciós irányával, a szterinösszetétel GC-eljárás- 35 sál történő analízise alapján nem mutatható ki delta-7Red-expresszió, amennyiben a tenyésztést glükóz jelenlétében hajtjuk végre, mivel a GAL10/CYC1 promoter ebben az esetben represszálódik.
B - A CDR01 -törzs előállítása, mely törzs az alfa párosodási típusú (mát. alfa) FY1679 haploid törzs LEU2és SPLl-lokuszai közé integrálódva tartalmaz egy marhaeredetű adrenodoxin-reduktáz (ADRm) kifejezésére alkalmas expressziós egységet
a) A VI3 jelű E. coli - S. cerevisiae ingázóvektor előállítása
A V13-vektor a V8-vektor származéka (C. Cullin és munkatársai, hivatkozás: lásd fent), amely hordozza az URA3 jelű szelekciós indikátorgént, valamint egy élesztősejtekben működőképes expressziós egységet, amely tartalmazza a GAL10/CYC1 promotert (pG/C) és amelyben a többszörös klónozóhelyre egy további Sáli- (Sa) hasítóhelyet is beiktattunk, a 8. ábrán bemutatott előállítási vázlat szerint.
A V8-vektort megemésztettük HindlII és BamHI restrikciós enzimekkel, majd az izolált URA3-gént és GAL10/CYC1 promotert tartalmazó BamHI/HindlII fragmenst (1722 bázispáros; a továbbiakban „ura-gal” fragmensnek fogjuk nevezni) a HindlII- és BamHIenzimekkel megemésztett pUC18-vektor (Pharmacia) megfelelő hasítóhelyei közé szubklónoztuk.
Az ura-gal fragmenst ezt követően PCR-eljárással amplifikáltuk 30 ng pUC18/ura-gal plazmidból kiindulva, a következő körülmények között: denaturálás: 30 95 °C, 30 másodperc; ciklusok száma: 30; 86 °C, 5 másodperc; 95 °C, 10 másodperc; 38 °C, 40 másodperc; 55 °C, 5 másodperc; 74 °C, 2 perc; 2 egység Taq DNSpolimeráz (Boehringer), a gyártó által rendelkezésre bocsátott pufferben, 1-1 pmol/l alábbi szekvenciájú láncindító oligonukleotidok:
’ -GGGGATCCGTGGTCGACGTAATTTAGTGTGTGTATTTGTGTTT GCG - 3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 8) és '-GTAAAACGACGGCCAGT-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 9).
A 8. szekvenciaazonosító számú láncindító oligonukleotid az ura-gal ffagmensben találhatóval azonos BamHI-hasítóhelyet tartalmaz (GGATCC), a láncindító oligonukleotid BamHI-hasítóhelyét követő három egymás utáni nukleotid nem képes a templáthoz hibridizálódni, és a láncindító oligonukleotid tartalmaz egy Sall-hasítóhelyet is (GTCGAC), valamint tartalmaz egy GAL10/CYC1 promoterrel homológ szekvenciát. A 9. szekvenciaazonosító számú láncindító oligonukleotid szekvenciája azonos a pUC18-vektor többszörös klónozóhelyét megelőző HindlII-hasítóhely szekvenciájával. Az amlifikációs reakció eredményeként kapott 1722 bázispáros HindlII/BamHI fragmenst Xhol- és BamHI-enzimekkel emésztettük, mely emésztés eredményeként kaptunk egy 254 bázispáros fragmenst, amely tartalmazta a GÁL 10/CYC1 promotert (pG/C), mely ffagmenst azután a BamHI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztett V8-vektorba szubklónoztuk.
Az eredményül kapott V13-vektor olyan restrikciós hasítóhelyeket tartalmaz, melyek lehetővé teszik az érett marhaeredetű adrenodoxin-reduktázt (ADRm), az érett bovin adrenodoxint (ADXm) és a marhaeredetű citokróm-P450SCC-t kódoló cDNS-ek szubklónozását.
A V13-vektorból kiindulva az alábbiak szerint előállítottuk a V13-ADR-vektort, a V13-ADX-vektort és a V13-SCC10-vektort.
a) A V13-ADR-vektor előállítása
Az EP-340878 számú európai szabadalmi bejelentés 25. példájában leírt pGBADR-2-plazmidból izoláltuk az ADRm-et kódoló cDNS-t hordozó 1478 bázispáros Sall-KpnI fragmenst, és az izolált ffagmenst a V13vektor megfelelő hasitóhelyeire szubklónoztuk, előállítva ily módon a V13-ADR-vektort.
b) A VI 3-ADX-vektor előállítása
Az EP-340878 számú európai szabadalmi bejelentés 23. példájában leírt pGBADX-1-plazmidból izoláltuk az ADXm-et kódoló cDNS-t hordozó 390 bázispáros Sall/BamHI fragmenst, majd a fragmenst a VI315
HU 220 587 Β1 vektor megfelelő hasítóhelyeire szubklónoztuk, előállítva ily módon a V13-ADX-vektort.
c) A V13-SCC10-vektor előállítása Az EP-340878 számú európai szabadalmi bejelentés 6. példájában leírt pGBSCCIO-plazmidból izoláltuk a P450SCC-t kódoló cDNS-t hordozó 1554 bázispáros Sall/EcoRI fragmenst, mely fragmenst a V13-vektor megfelelő hasítóhelyeire szubklónoztuk, ily módon előállítva a V13-SCC10-vektort.
b) A pCD62-l és pCD62-2 jelű integrálódó plazmidok előállítása
A pCD62-l és pCD62-2 jelű plazmidokat a 9. ábrán bemutatott módon állítottuk elő.
a) A pFL26CD-plazmid előállítása
A pFL26-plazmidba [Bonneaud és munkatársai: Yeast, 7, 609 (1991)] az alábbiak szerint beépítettünk egy Notl-hasítóhelyet, a leu2-gént az spll-gén (továbbiakban: spll) 5’-végétől elválasztó intergenikus régióba (C. Kolman és munkatársai: J. Bacteriol., 175, 1433 (1993)].
PCR-amplifikáció útján előállítottunk egy 704 bázispáros fragmenst, amely a leu2-gén 5’-végét tartalmazta, valamint egy 347 bázispáros fragmenst, amely az Spll-gén 3’-végét tartalmazta, az alábbi szekvenciájú láncindító oligonukleotidok alkalmazásával :
5’-TTGAAGGTTCAACATCAATTGATTG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 10) és
5’-GTGTGGCGGCCGCCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 11), a 704 bázispáros fragmens amplifikálásához, és
5’-CAAGGAGGCGGCCGCCACACAAAAAGTTAGGTGT-3’ (szekvenciaazonosító szám: 12) és 5’-TCTGCTTCCCTAGAACCTTCTTATG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 13), a 347 bázispáros fragmens amplifikálásához.
A 11. és 12. azonosító számú szekvenciájú láncindító oligonukleotidokban található egy GGCGGCCG szekvenciarészlet, amely megfelel a Notl-enzim hasítóhelyének, és amely szekvenciából 3 bázis nem képes pá- 25 rosodni a templáton a megfelelő pozícióban található bázissal. A 10. azonosító számú szekvenciájú láncindító oligonukleotidok a leu2-gén stopkodonjától 5’-irányban 536 bázispámyira kezdődő szekvenciával képes párosodni a 13. azonosító számú szekvenciájú láncindító öli- 30 gonukleotid pedig az spll Δ-géntől 194 bázispámyira 5’irányban elhelyezkedő szekvenciával.
Először a 704 bázispáros és 347 bázispáros fragmenseket amplifikáltuk PCR-eljárással, templátként a pFL26-plazmidot alkalmazva, enzimként pedig a pFU DNS-polimerázt, a gyártó (Stratagene) által megadott standard reakciókörülmények között.
A két amplifikált fragmens tartalmazott egy-egy egymással párosodni képes 20 bázisos túlnyúló véget, a 20 bázis hosszúságú ragadós végeket egyrészt all. azo- 40 nősítő számú szekvenciájú láncindító oligonukleotid (704 bázispáros fragmens), másrészt pedig a 12. azonosító számú szekvenciájú láncindító oligonukleotid (347 bázispáros fragmens) tartalmazta, 5’-végüktől kezdődően; a 20 bázis hosszúságú ragadós végek a megadott láncin- 45 dító oligonukleotidok első 20-20 nukleotidjaiból keletkeztek.
A 704 bázispáros fragmens (1 ng) és a 347 bázispáros fragmens (2 ng) összepárosodása folytán kialakuló fragmenst a 10. és 13. azonosító számú szekvenciájú 50 láncindító oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk, és a PCR-reakciót a következő körülmények között végeztük: ciklusok száma: 30; 95 °C 10 másodperc; 60 °C 5 másodperc; 45 °C 1 perc; 65 °C 5 másodperc; 72 °C 2 perc; ezután egy 7 percig tartó 72 °C-os ciklus következett; a reakcióelegyben mindkét láncindító oligonukleotidok 50 pmol mennyiségben volt jelen, a reakciót 50 μΐ végtérfogatban végeztük, egy egység pFU DNS-polimeráz jelenlétében (Stratagene). Az amplifikációs reakció eredményeként egy 1031 bázispáros 60
NotI restrikciós hasítóhelyet tartalmazó fragmenst kaptunk. A kapott fragmenst BstXI- és Nsil-enzimekkel megemésztettük, majd izoláltuk a Notl-hasítóhelyet tartalmazó 920 bázispáros fragmenst, mely fragmenst a pFL26-plazmid eredeti BstXl/Nsil fragmense helyére inszertáltunk, előállítva ily módon a pFL26CD-plazmidot, melynek térképét a 9A. ábrán mutatjuk be.
b) A pCD60-plazmid előállítása
- A pD10036-plazmid előállítása:
A V13ADX-plazmidból izoláltuk az érett marhaeredetű adrenodoxint (ADXm) kódoló cDNS-t hordozó 390 bázispáros Sall/BamHI fragmenst, mely fragmenst a pTG10033-plazmid többszörös klónozóhelyén található
Sáli- és BglII-helyekre szubklónoztunk, mely klónozóhelyet a plazmidban a GAL10/CYC1 jelű indukálható promoter és a PGK-terminátor szekvenciái szegélyeznek. A PTG10033-plazmid előállításának menetét a későbbiekben adjuk meg, a plazmid térképe a 18. ábrán látható, ez a plazmid a PTG10031 expressziós vektor (17. ábra) származéka, mely plazmid tartalmazza a CYCl-promotert és a terPGK-terminátort, a PTG1OO33plazmidban pedig a CYCl-promotert a GAL10/CYC1 promoterre cseréltük.
A fentiek szerint előállított pDP10034 jelű plazmid hordozza az ADX expressziós egységet, azaz az ADXmet kódoló gént a GAL10/CYC1 promoter transzkripciós szabályozása alatt, valamint a terPGK-terminátort. A továbbiakban az „expressziós egység” kifejezést olyan génekre fogjuk alkalmazni, melyek a GAL10/CYC1 promoter és a terPGK-terminátor transzkripciós szabályozása alatt állnak.
A HindlII restrikciós enzimmel emésztett V13ADR plazmidból izoláltuk a 3593 bázispáros HindlII55 fragmenst, amely hordozta az URA3 szelekciós indikátorgént, valamint az ADR expressziós egységet, majd az izolált fragmenst a HindlII restrikciós enzimmel emésztett pDP10034-plazmid megfelelő hasítóhelyére inszertáltuk. Az ily módon előállított pDP10036 jelű plazmid tartalmazza az ADX és ADR expressziós egy16
HU 220 587 Bl ségeket, melyeket az URA3-markergén választ el egymástól (9B. ábra).
A pCD60-plazmid előállítása
Az ADR expressziós egységet hordozó 2770 bázispáros AflIII/AccI fragmenst a pDP10036-plazmid AflIII és AccI restrikciós enzimekkel végrehajtott részleges emésztése után izoláltuk, majd a fragmenst a DNS-polimeráz-1 Klenow-fragmensével tompa végűvé alakítottuk, majd a tompa végűvé alakított fragmenst a pBluescript-KS+ (Stratagene) plazmid Smal-hasítóhelyére szubklónoztuk. Az ily módon előállított, pCD60 jelű plazmidban az ADR expressziós egységet mindkét oldalról egy Notl-hasítóhely szegélyezi, melyek közül az egyik az Afl/Smal ligációs helytől 209 bázispámyira 5’irányban található, és a szubklónozott fragmensből származik, a másik Notl-hasítóhely pedig a pBluescriptKS+ plazmid többszörös klónozóhelyéből (MCS1) származik (9B. ábra).
c) A pCD62-l- és pCD62-2-plazmidok előállítása
A Notl-enzimmel emésztett pCD60-plazmidból izolált 2558 bázispáros Notl-fragmenst a pFL26CD-plazmid egyedi Notl-hasítóhelyére szubklónoztuk. A beépített fragmens orientációjától függően két különböző plazmidot kaptunk eredményül, melyeket pCD62-l- és pCD62-2-plazmidnak neveztünk el (9C. ábra).
A pCD62-l-plazmidban az ADR expressziós egység orientációja megegyezik a leu2-gén transzkripciójának irányával, a pCD62-2-plazmidban pedig az expressziós egység orientációja fordított.
A további plazmidok előállításához a pCD62-l-plazmidot használtuk fel.
c) Kromoszomális integráció azFY1679 elnevezésű élesztőtörzsben (Matalpha)
A pCD62-l-plazmid tartalmaz FY1679-törzs egy kromoszomális lokuszával homológ régiókat. Ezek a homológ régiók a következők: egy 1060 bázispáros BglII/Clal fragmens (A), egy 707 bázispáros EcoRINotl fragmens (B) és egy 602 bázispáros Notl/BglII fragmens (C), a felsorolt homológ régiókat a 10. ábrán megjelöltük. A pCD62-l-plazmid 486 bázispáros Clal/EcoRI fragmensének megfelelő régió az FY1679törzsben deléciót szenvedett, aminek következtében ez a törzs leucin-auxotróffá vált [LEU2; (R. S. Sikorski és munkatársai: Genetics, 122, 19 (1989)]. A pCD62-lplazmidot Xbal-enzimmel végzett restrikciós emésztéssel linearizáltuk, az Xbal-hasítóhely a homológ régiókon kívül található. A linearizált plazmidot ezután transzformációval az FY1679 (Matalpha) törzsbejuttattuk, a lítium-acetátos eljárás alkalmazásával (D. Gietz és munkatársai, hivatkozás: lásd fent).
Az élesztősejtekben megtalálható celluláris DNSjavító mechanizmusnak („gap repair”) és az általunk alkalmazott szelekciónak köszönhetően, amellyel LEU2+fenotípusú rekombinánsokra szelektáltunk, az első esetben lehetővé tette, hogy két különböző típusba tartozó rekombinánsokat izoláljunk. Az 1. típus esetén a homológ rekombináció az A és B fragmensek szintjén zajlott le, a 2. típusú rekombinánsok esetén a homológ rekombináció pedig az A és C fragmensek szintjén történt. Csak az utóbbi eset jelent olyan rekombinációs eseményt, amely során az ADR expressziós egység a kromoszómába integrálódott, és ezen felül a LEU2+-fenotípus is helyreállt.
Oly módon szelektáltunk 2. típusú rekombináns kiónokra, hogy a kiónokat PCR-eljáráson alapuló szűrővizsgálatnak vetettük alá, a fent bemutatott 10. azonosító számú szekvenciájú láncinditó oligonukleotid, valamint az alábbi szekvenciájú láncindító oligonukleotid alkalmazásával:
’-TACATTAGGTCCTTTGTAGC-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 14), ily módon meg tudtunk győződni az FY1679-törzs (Matalpha) genomjában az ADR expressziós egység jelenlétéről és helyes lokalizációjáról is.
A fent említett szűrővizsgálati eljárás során az 14. azonosító számú szekvenciájú láncindító oligonukleotid kizárólag az ADRm-gén kódolószekvenciájához képes hibridizálódni, a 10. azonosító számú szekvenciájú láncindító oligonukleotid pedig egy kromoszomális szekvenciához (10. ábra).
Az amplifikációs reakcióhoz templátként az FY1679 (Matalpha) törzsből izolált genomi DNS-t (20 ng) használtuk fel [C. Hoffinan és munkatársai: Gene, 57, 267, (1987)], az amplifikációs reakciót Taq DNS polimerázzal (egy egység, Boehringer), 50-50 pmol láncindító oligonukleotid jelenlétében, 30 ciklusban végeztük (95 °C 10 másodperc, 55 °C 1 perc, 72 °C 3 perc), a gyártó által megadott standard reakciókörülmények között.
Abban az esetben, ha az expressziós egység a vizsgált klón genomi DNS-ébe integrálódott, az amplifikációs reakció eredményeként egy 2,9 kilobázisos fragmenst kaptunk. Amennyiben az expressziós egység nem integrálódott, amplifikációs terméket nem kaptunk.
A fent leírt eljárás szerint izolált FY1679 (Matalpha) törzset, amely tartalmazta az integrálódott ADR expressziós egységet, CDROl-nek neveztük el.
A fentiek szerint izolált törzs ADR-expresszióját oly módon igazoltuk, hogy az 1F. példában leírtak szerint sejtplazma-frakciókat állítottunk elő, és az ADRfehérje jelenlétét anti-ADR-ellenanyagok alkalmazásával, immundetekcióval mutattuk ki.
A CDR01-törzs által expresszált ADR-fehérje működőképességét oly módon Igazoltuk, hogy a 3. példában leirt koleszterin oldallánc in vitro enzimatikus restrikciós emésztésén alapuló vizsgálati eljárásban a tisztított ADR-fehéijét (0,28 pmol) 100 pg összfehérjét tartalmazó CDROl-törzsből izolált citoplazmatikus sejtfrakcióval helyettesítettük. A fenti eljárással a koleszterint 25%-os biokonverziós kitermeléssel sikerült pregnenolonná alakítanunk, mely kitermelés összehasonlítható volt a tisztított ADR-fehéijével elérhető kitermeléssel. C - Az EC01 jelű A. thaliana delta-7-Red-fehérj ét és ADRm-et együttesen expresszáló diploid törzs előállítása
Az EC01 jelű diploid törzset oly módon állítottuk elő, hogy a CDR01 és ELR01 jelű haploid törzseket G. Sprague és munkatársai eljárásaival [Methods in Enzymology, 194, 77 (1991)] kereszteztük.
Az első szelekciós lépést uracillal, triptofánnal és hisztidinnel kiegészített (valamennyi 20 mg/1), korábbiakban leírt WO-minimáltáptalajon végeztük, mely táp17
HU 220 587 Bl talaj leucint nem tartalmazott. Ez a szelekciós lépés lehetővé tette Leu2+-klónok izolálását (ezek a kiónok prototróf jellegűek, ami arra utal, hogy a kiónban jelen van az ADR expressziós egység). Az ily módon izolált kiónokat azután a korábbiakban leírt szintetikus szilárd SLI-agar táptalajon teszteltük nystatinrezisztencia vonatkozásában (5 pg/ml; a rezisztens sajátság azt jelzi, hogy a kiónban jelen van a delta-7-Red expressziós egység).
A nystatinrezisztens kiónok közül önkényesen kiválasztottunk egyet, és ezt ECOl-klónnak neveztük el.
D - A pregnenolont és apregnenolon-3-acetátot termelő EC01/pCD63-törzs előállítása
a) A pCD63 expressziós plazmid előállítása
A pCD63 plazmidot all. ábrán bemutatott módon állítottuk elő.
A fentiek szerint előállított pDP10036-plazmidot NotI restrikciós enzimmel megemésztettük, és izoláltuk a 4961 bázispáros Notl-ffagmenst, amely tartalmazta az ADX expressziós egységet, az URA3 szelekciós indikátorgént, valamint az ADR expressziós egységet, majd az izolált ffagmenst a pFL45L-plazmid [N. Bonneaud és munkatársai: Yeast, 7, 609 (1991)] többszörös klónozóhelyének Notl-hasítóhelyére klónoztuk. Az ily módon előállított plazmid - a pDP10037-píazmid - vázlatát all. ábrán láthatjuk.
Ezután a pDP10037-plazmidot Tthllll-enzimmel végzett emésztéssel linearizáltuk, mely enzim restrikciós hasítóhelye az ADRm-fehérjét kódoló génben található.
Egy másik kísérletben a korábbiakban előállított V13-SCC10-plazmidot PvuII és EcoRV restrikciós enzimekkel emésztettük, majd izoláltuk a 3476 bázispáros PvuII/EcoRV fragmenst, amely tartalmazta a P450SCC expressziós egységet, valamint az URA3-markergén 5’-végét.
A fentiek szerint előállított két lineáris DNS-molekula tartalmaz egymással homológ régiókat, melyek közül az egyik az URA3-gén 5’-végét és a GAL10/CYC1 promotert tartalmazza, a másik homológ régió pedig a terPGK-terminátor, ahogy azt a 11 A. ábrán bemutatjuk.
Ezt a két fragmenst azután a lítium-acetátos eljárás (D. Gietz és munkatársai, hivatkozás: lásd fent) alkalmazásával, kotranszformáció útján bemuttattuk az FY1679 (Mata) élesztőtörzsbe.
A transzformálás után uracil- és triptofán-prototróf rekombinánsokra szelektáltunk (URA3+, RTP1+), és ily módon olyan kiónokat izoláltunk, melyekben a TthlllI restrikciós enzimes emésztés következtében létrejött hasítás regenerálódott, azáltal, hogy a P450SCC expressziós egység homológ rekombinációval a DNSbe integrálódott.
A rekombinánsokat (URA3+, RTP1+) leucinnal, hisztidinnel, és leucinnal kiegészített (valamennyi 20 mg/1) WO-minimáltáptalajon szelektáltuk, mely táptalaj uracilt és triptofánt nem tartalmazott. Összegyűjtöttünk 50 szelektált kiónt, és a sejtekből C. Hoffman és munkatársai eljárása szerint [Gene, 57, 267 (1987)] össz-DNS-t izoláltunk, majd az izolált DNS-t elektroporáció útján E. coli XLE-Blue-törzsbe (Stratagene) juttattuk. A „gap repair” következtében keletkezett plazmidokkal transzformált kiónokat 50 mg/1 ampicillint tartalmazó LB jelű gazdag táptalajon szelektáltuk (1% „tripton”, 0,5% élesztőkivonat, 1% NaCl). Ezután az egyik szelektált klónból J. Sambrook és munkatársai eljárása szerint [„Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)] plazmidot izoláltunk, mely plazmidot pCD63-plazmidnak neveztünk el. Az ily módon előállított pCD63-plazmid tartalmazza az ADX és P450SCC expressziós egységeket, melyek egymástól az URA3 szelekciós indikátorgén választ el egymástól, a plazmid szerkezetét a 11B. ábrán láthatjuk.
b) Az EC01-törzs transzformálása a pCD63-plazmiddal
A pCD63-plazmidot a fentiek szerint előállított ECOl-törzsbe a lítium-acetátos transzformációs eljárás alkalmazásával juttattuk be (D. Gietz és munkatársai: hivatkozás lásd fent). A transzformált élesztőtörzset azután hisztidinnel kiegészített (20 mg/1), uracilt, triptofánt, adenint és leucint nem tartalmazó korábbiakban ismertetett összetételű WO-minimáltáptalajon tenyésztettük.
Az EC01/pCD63 elnevezésű törzset a fentiek szerint izoláltuk. A törzset EC01/pCD63 megjelöléssel 1995. február 10-én deponáltuk a CNCM intézetnél, 1-1538 deponálási számon.
c) Pregnenolon és pregnenolon-3-acetát termelése in vivő
Az EC01/pCD63-törzset aerob körülmények között (130 fordulat/perc) 28 °C-on tenyésztettük egy 3 literes Erlenmeyer-lombikban, amíg a tenyészet el nem érte a stacionárius növekedési fázist (OD600=12-13), az 1A. példa szerinti SGI szelektív táptalajban, amely 5 g/1 glükózt tartalmazott. A tenyészetet ezután egy térfogat fentiek szerinti YP jelű teljes táptalajjal hígítottuk, majd a tenyészethez szénforrásként etanolt (0,5 térfogat%) adtunk. Amikor a tenyészet ismételten stacionárius növekedési fázisba került (OD600= 12-13), a tenyészethez galaktózt adtunk (20 g/1) - koncentrált oldat formájában (500 g/1) - és ily módon egyidejűleg indukáltuk az ADXm-, ADRm-, P450SCC- és delta-7-Red-fehérjéket kódoló géneket, mely gének a tenyésztett törzsben valamennyiben a GAL10/CYC1 promoter szabályozása alatt állnak.
A négy gén együttes expresszióját a sejtekben felhalmozódott szterinek analízise útján igazoltuk, valamint a tenyészet felülúszójában található szterinek analízisével, az alábbi eljárás szerint:
Az indukció után 9 és 24 órával a tenyészetből 50-50 ml-es mintát vettünk. A mintákat lecentrifugáltuk (4000 g, 10 perc, 4 °C), és a sejteket ily módon elválasztottuk a táptalajtól. Az elkülönített sejteket az IF. példában leírtak szerint üveggyöngyök jelenlétében mechanikai feltárással lizáltattuk. Az ily módon előállított lizátumból az intracelluláris szterineket egy térfogat hexán hozzáadásával extraháltuk.
A tenyészet felülúszójában található szterineket külön kísérletben egy térfogat hexén hozzáadásával extraháltuk.
HU 220 587 BI
A fentiek szerint extrahált szterinelegyek összetételét GC-eljárással analizáltuk az 1. példában leírtak szerint, kontrollként standard termékeket alkalmaztunk.
Az indukció után 9 és 24 órával vett minták analízisének eredményeit sorrendben a 12A. és 12B. ábrákon láthatjuk.
Az indukció után 9 órával vett minta analízisének eredményei, ahogy az a 12A. ábrán látható:
- a sejtlizátumban a legnagyobb mennyiségben jelen lévő vegyület retenciós ideje azonos a pregnenolon-acetát standard retenciós idejével (RT = 11,8 perc), ugyanakkor a pregnenolon retenciós idejénél (RT=9,9 perc) csak egy rendkívül gyenge csúcsot láthatunk. Kis menynyiségben azonosíthatjuk az élesztősejtek C7-pozícióban redukált endogén szterinjeit is (ergoszta-5-én-3-ol és ergoszta-5,22-dién-3-ol, retenciós idők sorrendben: RT=18 perc és RT=17 perc). Amennyiben a sejtlizátumot analízis előtt lúgos szaponifikációs eljárásnak vetjük alá, a legnagyobb mennyiségben kimutatott vegyület a pregnenolonnal azonos retenciós idejű lesz. Ez a kísérlet megerősíti azt a feltételezést, hogy a sejtekben legnagyobb mennyiségben felhalmozódott vegyület, melynek retenciós ideje 11,8 perc, a pregnenolon-acetát,
-a sejtmentes táptalajban szembetűnő a pregnenolon és a pregnenolon-acetát hiánya.
Az indukció után 24 órával vett minta analízise a következő eredményeket adta, amint az a 12B. ábrán látható:
- a sejtlizátumban kis mennyiségben megfigyelhetjük pregnenolon (RT=10,2 perc), pregnenolon-acetát (RT=12 perc), valamint redukált endogén élesztőszterinek jelenlétét (RT=17 perc és RT=18 perc). Az ábrán látható koleszterincsúcs (RT=16,2 perc) az extrakció előtt a lizátumhoz adott belső standardnak felel meg,
- a sejtmentes táptalajban nagy mennyiségben jelen van pregnenolon-acetát és kis mennyiségben pregnenolon is kimutatható.
A kontrollplazmiddal - például a korábbiakban leírt pFL45L-plazmiddal - transzformált ECOl-törzzsel végrehajtott párhuzamos kísérletekben nem kaptunk szabad pregnenolonnak vagy pregnenolon-acetátnak megfelelő csúcsot.
A fentiek szerint végrehajtott szterinanalízis alapján kimutattuk, hogy az EC01/pCD63 jelű élesztőtörzsben exogén szterinek hozzáadása nélkül pregnenolon és pregnenolon-acetát halmozódott fel, galaktózzal végrehajtott indukció után, az indukció után 9 órával nagymértékű felhalmozódást tapasztaltunk.
A bemutatott eredmények egyrészt a C7-pozícióban redukált endogén szterinek effektív mobilizációját demonstrálják az ECO 1-törzsben, másrészt pedig az endogén szterinek oldallánca restrikciós emésztési reakciójának rendkívül hatékony kapcsoltságát.
Az integrált DNS-t tartalmazó törzsek összefoglaló táblázata
Törzsek Integrációs iokusz Integrálódott gén Transzfotmáns plazmid Plazmid- marker A plazmidon található gén(ek) Szelekciós indikátorok
CDR01 (Mata) intergenikus LEU2-SPL1 ADRm - - - HIS3, URA3, TRP1
ELR01 (Mata) ADE2 delta-7-Red - - - ADE2, URA3, LEU2, HIS3, TRP1
ECO1 (diploid) intergenikus LEU2-SPL1+ADE2 ADRm delta-7-Red - - - HIS3, URA3, TRP1
EC01/pCD63 intergenikus LEU2-SPL1+ADE2 ADRm delta-7-Red pCD63 URA3 TRP1 ADXm P450SCC HIS3
4. példa
A pTG10033-p!azmid előállítása
1. Új többszörös klónozóhelyet tartalmazó pUC19-származék előállítása:
Az M13mpl9 jelű klónozó vektort [C. Yanish-Peron és munkatársai: Gene, 33, 103 (1985)] az alábbi szekvenciájú oligonukleotid alkalmazásával mutagenizáltuk:
’-GCGCTCAGCGGCCGCTTTCCAGTCG-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 15), és ily módon a csonkított lacl-génbe bejuttattunk egy Notl-hasítóhelyet, és az előállított plazmidot M13TG724-nek neveztük el.
Az M13TG724-plazmid EcoRI-hasítóhelyére ezután bejuttattunk egy EcoRI-, SnaBI-, és Notl-hasítóhelyeket tartalmazó „polilinker” szekvenciát, az alábbi szekvenciájú oligonukleotidok alkalmazásával:
'-AATTGCGGCCGCGTACGTATG-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 16) és '-AATTCATACGTACGCGGCCGC-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 17), előállítva ily módon az M13TG7244-plazmidot, amelyben az amplifikáció során a beépített inszert módosulását észleltük. Az M13TG7244-plazmid inszertjének a szekvenciája az alábbi:
GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCC
GGTACGTATAATT
CACTGGCCGT, mely szekvenciában az EcoRI-, SnaBI- és Sstlhasítóhelyeket aláhúzással jelöltük, a pUC19-vek19
HU 220 587 Bl tor lacZ-génjéhez tartozó szekvenciát pedig dőlt betűkkel.
Az M13TG7244-plazmidot ezután EcoRI és SstI restrikciós enzimekkel megemésztettük, és egy Miül- és AvrII-hasítóhelyeket tartalmazó „polilinker” szekvenciát építettünk be az alábbi szekvenciájú nukleotidok alkalmazásával:
5’-CAACGCGTCCTAGG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 18) és '-AATTCCTAGGACGCGTTGAGCT-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 19).
Az így előállított plazmidot PvuII-enzimmel megemésztettük, és az izolált PvuII-fragmenst a pUC19vektorba szubklónoztuk (C. Yanish-Peron és munkatársai: hivatkozás: lásd fent), előállítva ily módon a pTG7457-plazmidot (13. ábra).
2. A PGK-terminátor szubklónozása:
A pUC19-plazmidot megemésztettük BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel, és egy BamHI- és Sstlhasítóhelyeket tartalmazó új „polilinker” szekvenciát építettünk be a plazmidba, az alábbi szekvenciájú oligonukleotidok alkalmazásával:
5’-GATCCGCAGATATCATCTAGATCCCGGGTAGAT-3’ (szekvenciaazonosító szám: 20), 5’-AGAGCTCAAGATCTACCCGGGATCTAGATGATATCTGCG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 21), 5’-CTTGAGCTCTACGCAGCTGGTCGACACCTAGGAG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 22), valamint 5’AATTCTCCTAGGTGTCGACCAGCTGCGT-3’ (szekvenciaazonosító szám: 23).
A fentiek szerint előállított plazmidot pTG7453-nak neveztük el (14. ábra), és az előállított plazmidot BamHI és SstI restrikciós enzimekkel megemésztettük. A „polilinker” szekvencia BamHI- és Sstl-hasítóhelyek közötti részét egy BamHI és SstI restrikciós enzimekkel megemésztett fentiek szerint előállított pTG7457-plazmidba inszertáltuk. Az ily módon előállított új plazmid a következő hasítóhelyeket tartalmazza: PvuII, HindlII, BamHI, EcoRI, Xbal, Smal, BglII, SstI (=SacI), Miül, AvrII, EcoRI, SnaBI, Notl, SnaBI, Pvul.
Ezt az új plazmidot megemésztettük BglII és HindlII restrikciós enzimekkel, majd beleépítettünk egy PGK-promotert tartalmazó BglII/HindlII-fragmenst [R. A. Hitzeman és munkatársai: Nucleic Acids Rés., 10, 7791 (1982); G. Loison és munkatársai: Yeast, 5, 497 (1989)], és az előállított plazmidnak a pTG10014 nevet adtuk (15. ábra).
3. Promoterek szubklónozása:
a) A CYC1-promoter szubklónozása:
A pTG7453-pIazmid polilinker szekvenciájának BamHI- és Sstl-hasítóhely közötti részét beépítettük a fentiek szerint előállított pTG7457-plazmid egy származékába. Az ily módon előállított új plazmidot a SnaBI restrikciós enzimmel megemésztettük, majd beleépítettük az fl-fág replikációs origóját tartalmazó 456 bázispáros pEMBL8-plazmidból származó [L. Dente és munkatársai: Nucleic Acid Rés., 11, 1645 (1983)] Rsal/Dral fragmenst, előállítva ily módon a pTG7503-plazmidot.
Az EP 0340378 számú európai szabadalmi bejelentés 6. példája szerint előállított pGBSCC-9-plazmid 0,78 kilobázisos BamHI/HindlII fragmensét, mely tartalmazta az S. cerevisiae CYCl-promoterét, egy Polliinkért és a K. lactis laktáz terminátorát, a HindlII és BamHI restrikciós enzimekkel megemésztett pTG7503plazmidba szubklónoztuk, előállítva ily módon a pTG10004-plazmidot (16. ábra).
A CYCl-promoterben található Xhol- és Mlulhasítóhelyeket ezután a kettős szálú DNS helyspecifikus mutagenezisével a pTG10004-plazmidból elimináltuk, az alábbi szekvenciájú oligonukleotid alkalmazásával :
5’-GCGGATCTGCTCGAAGATTGCCTGCGCGTTGGGCTTGATC-3’ (szekvenciaazonosító szám: 24).
A fentiek szerint előállított pTG10005-plazmidot azután Sáli és Xhol restrikciós enzimekkel megemésztettük, majd az alábbi szekvenciájú oligonukleotidok alkalmazásával a plazmidba egy Mlul-hasítóhelyet építet- 45 tünkbe:
5’-TCGACGGACGCGTGG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 25) és
5’-TCGACCACGCGTCC-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 26), előállítva ily módon a pTG10006-plazmidot. 50 b) GAL10/CYC1 promoter szubklónozása
A pYeDPl/8-2-plazmidot [C. Cullin és munkatársai: Gene, 203, (1988)] Xhol restrikciós enzimmel végzett hasítással felnyitottuk. A restrikciós hasítás eredményeként keletkezett ragadós végeket a DNS-poIimeráz Klenow-fragmensével feltöltöttük, majd a plazmidot újra ligáltuk. Az ily módon előállított pTGlOOlO-plazmidot - amelyben a GAL10/CYC1 promoter már nem tartalmaz Xhol-hasítóhelyet - használtuk templátként egy PCR-ampliftkációs reakcióban.
4. A pGT10031 expressziós vektor előállítása
A pTG7503-plazmidból a lacZ-szekvencia megmaradt részletét helyspecifikus mutagenezissel elimináltuk az alábbi szekvenciájú oligonukleotid alkalmazásával :
5’-TGGCCGTCGTTTTACTCCTGCGCCTGATGCGGTAT-3’ (szekvenciaazonosító szám: 27), előállítva ily módon a pTG7549-plazmidot.
A pTG7549-plazmidban található LacZ-promotert ezután deletáltuk, oly módon, hogy a plazmidot Notl és HindlII restrikciós enzimekkel megemésztettük, majd 60 az alábbi szekvenciájú oligonukleotidokat a plazmidba inszertáltuk:
'-GGCCGCAAAACCAAA-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 28) és
HU 220 587 Bl
5’-AGCTTTTGGTTTTGC-3’ (szekvenciaazonosító szám: 29), a beinszertált oligonukleotidok a NotI- és HindlIIhasítóhelyeket helyreállították, és így kaptuk meg a pTG7553-pIazmidot.
a BamHI és Miül restrikciós enzimekkel megemésztett pTGIOOOó-plazmidból izoláltuk a CYC-promotert tartalmazó BamHI/MluI fragmenst, és az Miül és Hindlll restrikciós enzimekkel megemésztett pTG10015-plazmidból izoláltuk a PGK-promotert tartalmazó MluI/HindlII fragmenst. Ezt a két fragmenst összeligáltuk, és a ligáit terméket a pTG7553-plazmidba inszertáltuk, melyet előzőleg Miül és Hindlll restrikciós enzimekkel megemésztettünk.
Ezután az alábbi szekvenciájú oligonukleotidhoz:
5’-GATCTATCGATGCGGCCGCG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 30) hozzáhibridizáltuk az alábbi szekvenciájú oligonukleotidot:
’-CGCGCGCGGCCGCATCGATA-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 31), mely két oligonukleotid összehibridizálódva egy Clal- és Notl-hasítóhelyeket tartalmazó BamHI/MluI „linker” szekvenciát alkot. Az összehibridizált oligonukleotidokat azután az előbbi plazmidba lígáltuk, előállítva ily módon a pTG10031 jelű expressziós vektort (17. ábra).
A pYeDPl/8-2-plazmidból a fentiek szerint PCRamplifikációval előállított fragmenst Clal és Sáli restrikciós enzimekkel megemésztettük, majd a Clalés SalI-enzimekkel megemésztett pTG10031-plazmidba lígáltuk, előállítva ily módon a pTG10033-plazmidot (18. ábra).
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1496 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
EREDETI FORRÁS: Arabidopsis thaliana
NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS
ELHELYEZKEDÉS: 76-1365
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60
AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
Met Alá Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr
5 10
GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT Cys CCA Pro CCT Pro TTC Phe 25 GTC Val ATT Ile CTC Leu 159
Al a Ser Me t 15 Leu Ser Leu Leu Al a 20 Phe
CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207
Leu Trp Tyr Thr Me t Val Hi s Gin As p Gly Ser Val Thr Gin Thr Phe
30 35 40
GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255
Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gin G1 y Leu Ile Asn Ile Trp Pro
45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303
Arg Pro Thr Leu Ile Alá Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Al a Phe
65 70 75
GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351
Glu Al a Ile Leu Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro
80 85 90
ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399
Ile Ser Pro Al a Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Al a Asn Gly Leu Al a
95 100 105
HU 220 587 Bl
GCT Al a TAC Tyr 110 TTT Phe GTG Val ACA CTA GCA ACC Thr CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT Phe GGA Gly 447
Thr Leu Alá 115 Hi s Le u Gly Leu 120 Trp Trp
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495
Ile Phe Asn Pro Al a Ile Val Tyr Asp Hi s Leu Gly Glu Ile Phe Ser
125 130 135 140
GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543
Al a Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cy s Va 1 Leu Leu Tyr Ile Ly s
145 150 155
GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591
Gly Hi s Val Al a Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu
160 165 170
ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639
Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Me t Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Ly s
175 180 185
AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687
Ser Phe As p Ile Ly s Val Phe Thr Asn Cy s Arg Phe Gly Me t Me t Ser
190 195 200
TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735
Trp Al a Val Leu Al a Val Thr Tyr Cy s Ile Ly s Gin Tyr Glu Ile Asn
205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783
Gly Lys Val Ser As p Ser Me t Leu Val Asn Thr 1 le Leu Me t Leu Val
225 230 235
TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831
Tyr Val Thr Ly s Phe Phe Trp Trp Glu Al a Gly Tyr Trp Asn Thr Me t
240 245 250
GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879
Asp Ile Al a Hi s As p Arg Al a Gly Phe Tyr Ile Cy s Trp Gly Cy s Leu
255 260 265
GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927
Val Trp Val Pro Ser Va 1 Tyr Thr Ser Pro Gly Me t Tyr Leu Va 1 Asn
270 275 280
CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975
Hi s Pro Val Glu Leu Gly Thr Gin Leu Al a Ile Tyr Ile Leu Va 1 Al a
285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023
Gly Ile Leu Cy s Ile Tyr Ile Ly s Tyr As p Cy s As p Arg Gin Arg Gin
305 310 315
GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071
Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Ly s Cys Leu Va 1 Trp Gly Arg Al a Pro
320 325 330
TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119
Ser Ly s Ile Va 1 Al a Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Ly s Thr
335 340 345
HU 220 587 Bl
AGT CTT CTC TTA Leu ACG TCT GGA TGG Trp TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167
Ser Leu 350 Leu Thr Ser Gly 355 Trp Gly Leu Al a 360 Arg Hi s Phe Hi s
TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215
Tyr 365 Va 1 Pro Glu Ile Leu 370 Ser Al a Phe Phe Trp 375 Thr Val Pro Al a Leu 380
TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263
Phe As p Asn Phe Leu 385 Al a Tyr Phe Tyr Val 390 Leu Thr Leu Leu Leu 395 Phe
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311
Asp Arg Al a Lys 400 Arg As p As p Asp Arg 405 Cy s Arg Ser Lys Tyr 410 Gly Ly s
TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359
Tyr Trp Ly s 415 Leu Tyr Cy s Glu Ly s 420 Val Ly s Tyr Arg Ile 425 Ile Pro Gly
ATT Ile TAT Tyr 430 TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415
GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 430 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehérje
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Al a Glu Thr Va 1 5 Hi s Ser Pro Ile Val 10 Thr Tyr Al a Ser Me t 15 Leu
Ser Leu Leu Al a 20 Phe Cys Pro Pro Phe 25 Val Ile Leu Leu Trp 30 Tyr Thr
Me t Val Hi s 35 Gin As p Gly Ser Val 40 Thr Gin Thr Phe Gly 45 Phe Phe Trp
Glu Asn 50 Gly Val Gin Gly Leu 55 Ile Asn Ile Trp Pro 60 Arg Pro Thr Leu
Ile 65 Al a Trp Lys Ile Ile 70 Phe Cy s Tyr Gly Alá 75 Phe Glu Al a Ile Leu 80
Gin Leu Leu Leu Pro 85 Gly Lys Arg Val Glu 90 Gly Pro Ile Ser Pro 95 Al a
Gly Asn Arg Pro 100 Va 1 Tyr Ly s Al a Asn 105 Gly Le u Al a Al a Tyr 110 Phe Val
Thr Leu Al a 115 Thr Hi s Leu Gly Leu 120 Trp Trp Phe Gly Ile 125 Phe Asn Pro
HU 220 587 Β1
Alá lle 130
Gly Ser 145
Pro Ser
Tyr Trp
Lys Val
Alá Val 210
Asp Ser 225
Phe Phe
Asp Arg
Ser Val
Leu Gly 290 lle Tyr 305
Thr Asn
Alá Ser
Thr Ser lle Leu 370
Leu Alá 385
Arg Asp
Val Tyr
Phe lle
Ser Ser
G1 y Me t 180
Phe Thr 195
Thr Tyr
Met Leu
Trp Trp
Alá Gly 260
Tyr Thr 275
Thr Gin lle Lys
Gly Lys
Tyr Thr 340
Gly Trp 355
Ser Alá
Tyr Phe
Asp Asp
Tyr Cys
Glu Lys 420
Asp His
Phe Cys 150
Asp Ser 165
Glu Leu
Asn Cys
Cys lle
Val Asn 230
Glu Alá 245
Phe Tyr
Ser Pro
Leu Alá
Tyr Asp 310
Cys Leu 325
Thr Thr
Trp Gly
Phe Phe
Tyr Val 390
Arg Cys 405
Val Lys
Leu 135 Gly
Val Leu
Gly Ser
Tyr Pro
Arg Phe 200
Ly s 215 Gin
Thr lle
Gly Tyr
lle Cy s
Gl y Me t 280
lle 295 Tyr
Cys As p
Val Trp
Ser Gly
Leu Al a 360
Trp 375 Thr
Leu Thr
Arg Ser
Tyr Arg
Glu lle
Leu Tyr
Cys Gly 170
Arg lle 185
G1 y Me t
Tyr Glu
Leu Met
Trp Asn 250
Trp Gly 265
Tyr Leu lle Leu
Arg Gin
Gly Arg 330
Glu Thr 345
Arg His
Val Pro
Leu Leu
Lys Tyr 410 lle lle 425
Phe Ser 140 lle Lys 155
Asn Leu
Gly Lys
Met Ser lle Asn 220
Leu Val 235
Th r Me t
Cys Leu
Val Asn
Val Alá 300
Arg Gin 315
Alá Pro
Lys Thr
Phe His
Alá Leu 380
Leu Phe 395
Gly Lys
Pro Gly
Alá Leu
Gly His lle lle
Ser Phe 190
Trp Alá 205
Gly Lys
Tyr Val
Asp lle
Val Trp 270
His Pro 285
Gly lle
Glu Phe
Ser Lys
Ser Leu 350
Tyr Val 365
Phe Asp
Asp Arg
Tyr Trp lle Tyr 430 lle Phe
Val Alá 160
Asp Phe 175
Asp lle
Val Leu
Val Ser
Thr Lys 240
Alá His 255
Val Pro
Val Glu
Leu Cys
Arg Arg 320 lle Val 335
Leu Leu
Pro Glu
Asn Phe
Alá Lys 400
Lys Leu 415
HU 220 587 Bl
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 15 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés=„7. aminosav=Trp vagy Tyr”
SAJÁTSÁG:
ELHELYEZKEDÉS: 12 NÉV/MEGJELÖLÉS: peptid
EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés=„12. aminosav=His vagy Lys”
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr
10 15
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 29 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature ELHELYEZKEDÉS: 10...29
EGYÉB INFORMÁCIÓ: az 1. azonosító számú szekvencia 76-95. pozíciói között A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 29
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :
HOSSZA: 28 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (10.. .28)
EGYÉB INFORMÁCIÓK: megjegyzés=„az 1. komplementer azonosító számú szekvencia 1350-1368. pozíciói között”
Az 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 28
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 23 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: mlscfeature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1.. .23)
HU 220 587 Bl
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 29 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 29
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 46 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS : „OLIGONUKLEOTID”
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGGGATCCGTGGTCGACGTAATTTAGTGTGTGTATTTGTG
TTTGCG 46
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...17)
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTAAAACGAC GGCCAGT 17
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 25
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 38 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS : egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
HU 220 587 Bl
NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1.. .38)
All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 38
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 34 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 34
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: miscjeature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1.. .25)
A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 25
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1.. .20)
A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TACATTAGGT CCTTTGTAGC 20
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGCTCAGCG GCCGTTTCC AGTCG 25
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy
HU 220 587 Β1
TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 21
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...21)
A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTCATACG TACGCGGCCG C 21
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 14 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAACGCGTCC TAGG 1 4
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 22 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: miscjfeature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1.. .22)
A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 22
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 33
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 39 bázispár TÍPUSA: nukleinsav
HU 220 587 Bl
HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: misc feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1.. .39)
A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 39
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 34 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 34
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 28 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...28)
A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 28
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 40 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 40
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 15 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGACGGACG CGTGG 15
A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 14 bázispár
HU 220 587 Β1
TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: miscfeature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...14)
A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCGACCACGC GTCC 14
A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 35 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 35
A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 15 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGCCGCAAAA CCAAA 15
A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 15 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...15)
A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGCTTTTGGT TTTGC 1 5
A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCTATCGA TGCGGCCGCG 20
A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HU 220 587 Bl
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁS: „OLIGONUKLEOTID”
SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: misc_feature ELHELYEZKEDÉS: komplementer (1...20)
A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCGCGCGGC CGCATCGATA 20

Claims (37)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. cDNS- vagy annak megfelelő RNS-nukleinsavszekvencia, amely tartalmaz egy A. thaliana-eredeXa delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjét kódoló szekvenciát.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, 20 azzal jellemezve, hogy cDNS-szekvencia.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti cDNS-szekvencia, azzal 15 jellemezve, hogy delta-5,7-szterin delta-7-reduktázaktivitású fehérjét kódoló szekvenciaként A. thalianaeredetű fehérjét kódoló szekvenciát tartalmaz, melynek szekvenciája megegyezik az alábbi 1. azonosító számú szekvenciával vagy annak valamely allélikus variánsával:
    GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG
    AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA
    AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111
    Met Alá Glu Thr Val His Ser Pro I le Val Thr Tyr
    1 5 10
    GCA Al a TCG Ser ATG Me t 15 TTA Leu TCG Ser CTT CTC GCC TTC TGT CCA Pro CCT Pro TTC GTC ATT CTC Leu 159 Leu Leu Al a 20 Phe Cys Phe 25 Val Ile CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207 Leu Trp Tyr Thr Me t Val Hi s Gin Asp Gly Ser Val Thr Gin Thr Phe 30 35 40 GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255 Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gin Gly Leu I le Asn Ile Trp Pro 45 50 55 60 AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303 Arg Pro Thr Leu I le Al a Trp Ly s I le I le Phe Cys Tyr Gly Al a Phe 65 70 75 GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351 Glu Alá I le Leu Gin Leu Leu Leu Pro Gly Ly s Arg Val Glu Gly Pro 80 85 90 ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399 I le Ser Pro Al a Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Al a Asn Gly Leu Al a 95 100 105 GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447 Al a Tyr Phe Val Thr Leu Al a Thr Hi s Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly 110 115 120 ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495 I le Phe Asn Pro Al a I le Val Tyr As p Hi s Leu Gly Glu Ile Phe Ser 125 130 135 140
    HU 220 587 Bl
    GCA Al a CTA Leu ATA Ile TTC GGA AGC TTC ATA TTT Phe TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA Ly s 543 Phe Gly 145 Ser Phe Ile Cys 150 Val Leu Leu Tyr Ile 155 GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591 Gly Hi s Va 1 Al a 160 Pro Ser Ser Ser As p 165 Ser Gly Ser Cy s Gly 170 Asn Leu ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639 Ile Ile Asp 175 Phe Tyr Trp Gly Me t 180 Glu Leu Tyr Pro Arg 185 Ile Gly Lys AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687 Ser Phe 190 As p Ile Ly s Val Phe 195 Thr Asn Cy s Arg Phe 200 Gly Me t Me t Ser TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735 Trp 205 Al a Val Leu Al a Va 1 210 Thr Tyr Cy s Ile Ly s 215 Gin Tyr Glu Ile Asn 220 GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783 Gly Ly s Val Ser As p 225 Ser Me t Leu Val Asn 230 Thr Ile Leu Me t Leu 235 Val TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831 Tyr Val Thr Lys 240 Phe Phe Trp Trp Glu 245 Al a Gly Tyr Trp As n 250 Thr Me t GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879 As p Ile Alá 255 Hi s As p Arg Al a Gly 260 Phe Tyr Ile Cys Trp 265 Gly Cys Leu GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927 Val Trp 270 Val Pro Ser Val Tyr 275 Thr Ser Pro Gly Me t 280 Tyr Leu Val Asn CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975 His 285 Pr o Val Glu Leu Gly 290 Thr Gin Leu Alá Ile 295 Tyr Ile Leu Val Alá 300 GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023 Gly Ile Leu Cys Ile 305 Tyr Ile Ly s Tyr As p 310 Cy s As p Arg Gin Arg 315 Gin GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071 Glu Phe Arg Arg 320 Thr Asn Gly Ly s Cys 325 Leu Va 1 Trp Gly Arg 330 Al a Pro TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119 Ser Ly s Ile 335 Val Al a Ser Tyr Thr 340 Thr Thr Ser Gly Glu 345 Thr Lys Thr AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167 Ser Leu 350 Leu Leu Thr Ser Gly 355 Trp Trp Gly Leu Al a 360 Arg Hi s Phe Hi s TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215 Tyr 365 Val Pro Glu Ile Leu 370 Ser Al a Phe Phe Trp 375 Thr Va 1 Pro Al a Leu 380
    HU 220 587 Β1
    TTC Phe GAT As p AAC Asn TTC Phe TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT Leu CTT CTC TTT Phe 1263 Leu 385 Al a Tyr Phe Tyr Val 390 Leu Thr Leu Leu 395 GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311 As p Arg Al a Ly s 400 Arg Asp Asp As p Arg 405 Cys Arg Ser Ly s Tyr 410 Gly Ly s TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359 Tyr Trp Ly s Leu Tyr Cys Glu Ly s Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly
    415 420 425
    ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415 Ile Tyr
    430
    GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475
    TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496
  4. 4. DNS-szekvencia, amely delta-5,7-szterin delta-7reduktáz-aktivitású fehérjét kódol, azzal jellemezve, hogy képes a 3. igénypont szerinti szekvenciához hibridizálódni átlagosan sztringens vagy nagyon sztringens körülmények között, vagy szekvenciája körülbelül 90%-ban vagy annál nagyobb mértékben azonos a 3. igénypont szerinti szekvenciával.
  5. 5. DNS-szekvencia, amely delta-5,7-szterin delta-7reduktáz-aktivitású fehérjét kódol, azzal jellemezve, hogy PCR-eljárással amplifikálható, láncindító oligonukleotidként az alábbi, 3. azonosító számú konszen25 zus aminosavszekvenciát kódoló oligonukleotidok alkalmazásával :
    Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr, 15 10 15 ahol a 7. pozícióban Xaa jelentése: Trp vagy Tyr, és a
    12. pozícióban Xaa jelentése His vagy Lys.
  6. 6. A. thaliana-ercdeíü fehéqe, amely delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitással bír és aminosavsor- 35 rendje megegyezik az alábbi 2. azonosító számú aminosavszekvenciával, vagy annak valamely allélikus variánsával vagy analógjával:
    Me t 1 Alá Glu Thr Va 1 5 Hi s Ser Pro Ile Val 10 Thr Tyr Al a Ser Me t 15 Leu Ser Leu Leu Al a 20 Phe Cy s Pro Pro Phe 25 Val Ile Leu Leu Trp 30 Tyr Thr Me t Va 1 Hi s 35 Gin As p Gly Ser Va 1 40 Thr Gin Thr Phe Gly 45 Phe Phe Trp Glu Asn 50 Gly Val Gin Gly Leu 55 Ile Asn Ile Trp Pro 60 Arg Pro Thr Leu Ile 65 Al a Trp Ly s Ile Ile 70 Phe Cy s Tyr Gly Al a 75 Phe Glu Al a Ile Leu 80 Gin Leu Leu Leu Pro 85 Gly Lys Arg Val Glu 90 Gly Pro Ile Ser Pro 95 Al a Gly Asn Arg Pro 100 Val Tyr Lys Al a Asn 105 Gly Leu Al a Al a Tyr 110 Phe Va 1 Thr Leu Al a 115 Thr Hi s Leu Gly Leu 120 Trp Trp Phe Gly Ile 125 Phe Asn Pro
    HU 220 587 Β1
    Alá Ile 130 Val Tyr Asp His Leu 135 Gly Glu Ile Phe Ser 140 Al a Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly Hi s Val Al a 145 150 155 160 Pro Ser Ser Ser As p Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe 165 170 175 Tyr Trp Gly Me t G1 u Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Ly s Ser Phe As p Ile 180 185 190 Ly s Val Phe Thr Asn Cy s Arg Phe Gly Me t Me t Ser Trp Al a Va 1 Leu 195 200 205 Al a Val Thr Tyr Cy s Ile Ly s G1 n Tyr Glu Ile Asn Gly Ly s Va 1 Ser 210 215 220 Asp Ser Me t Leu Val Asn Thr Ile Leu Me t Le u Va 1 Tyr Val Thr Ly s 225 230 235 240 Phe Phe Trp Trp Glu Al a Gly Tyr Trp Asn Thr Me t As p I 1 e Al a Hi s 245 250 255 Asp Arg Al a Gly Phe Tyr Ile Cy s Trp Gly Cy s Leu Va 1 Trp Va 1 Pro 260 265 270 Ser Va 1 Tyr Thr Ser Pro Gly Me t Tyr Leu Va 1 Asn Hi s Pro Val Glu 275 280 285 Leu Gly Thr Gin Leu Al a Ile Tyr Ile Leu Va 1 Al a Gly Ile Leu Cy s 290 295 300 Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gin Arg Gin Glu Phe Arg Arg 305 310 315 320 Thr Asn Gly Lys Cy s Leu Va 1 Trp Gly Arg Al a Pro Ser Ly s Ile Va 1 325 330 335 Al a Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Ly s Thr Ser Leu Leu Leu 340 345 350 Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Al a Arg Hi s Phe Hi s Tyr Val Pro Glu 355 360 365 Ile Leu Ser Al a Phe Phe Trp Thr Val Pro Alá Leu Phe As p Asn Phe 370 375 380 Leu Al a Tyr Phe Tyr Val Le u Thr Leu Leu Le u Phe As p Arg Al a Ly s 385 390 395 400 Arg As p As p As p Arg Cy s Arg Ser Ly s Tyr Gly Ly s Tyr Trp Ly s Leu 405 410 415 Tyr Cy s Glu Ly s Val Ly s Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr
    420 425 430
  7. 7. A. thaliana-eredetű fehérje, amely delta-5,7-szte- rendje megegyezik a 2. azonosító számú aminosavszek rin delta-7-reduktáz-aktivitással bír és aminosavsor- venciával, és elnevezése delta-7-Red-fehérje.
    HU 220 587 Bl
  8. 8. Fehéqe, amely delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitással bír és aminosavsorrendje körülbelül 90%-ban vagy nagyobb mértékben megegyezik a 7. igénypont szerinti 2. azonosító számú aminosavszekvenciával.
  9. 9. Fehérje, amely delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitással bír és immunológiailag keresztreakciót ad a 7. igénypont szerinti A. thaliana-eredetű delta-7Red-fehétjével.
  10. 10. Fehéqe, amely delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitással bír és az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmazó gazdasejtben termelődött.
  11. 11. A. thaliana-exedetű fehérje, amely delta-5,7szterin delta-7-reduktáz-aktivitással bír és a 2. azonosító számú aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó gazdasejtben termelődött.
  12. 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztősejtben termelődött.
  13. 13. Ellenanyag, melyet a 6-12. igénypontok bármelyike szerinti delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérje ellen termeltettek.
  14. 14. Expressziós vektor, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz.
  15. 15. Gazdasejt, amely a 14. igénypont szerinti vektorral van transzformálva.
  16. 16. Eljárás delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjét kódoló nukleinsav mikroorganizmusban történő klónozására, azzal jellemezve, hogy a kívánt nukleinsavmolekulát önmagában ismert módon mikroorganizmusba juttatjuk, majd klónszelekciós lépésként azokat a kiónokat választjuk ki, melyek:
    a) rezisztensek nystatinnal vagy valamely olyan analóg vegyülettel szemben, melynek toxicitása a C7-pozícióban telítetlen szterinek jelenlététől függ,
    b) hibridizálnak az 1. azonosító számú nukleotidszekvenciával,
    c) a Hónokból véletlenszerűen izolált DNS-szekvenciákon végrehajtott számítógépes adatfeldolgozó eljárás alapján a megfelelő nukleinsavszekvenciát tartalmazzák, vagy
    d) olyan fehéqét expresszálnak, amely immunológiailag kimutatható olyan ellenanyagok alkalmazásával, melyeket 2. azonosító számú aminosavszekvenciájú fehérje ellen termeltettek.
  17. 17. DNS- vagy RNS-nukleinsavszekvencia, melyet 16. igénypont szerinti eljárással állítottak elő.
  18. 18. Gazdasejt, amely 17. igénypont szerinti DNSszekvenciát tartalmazó vektorral van transzformálva.
  19. 19. A 15. vagy 18. igénypont szerinti gazdasejt, amely élesztő- vagy fonalasgombasejt.
  20. 20. Eljárás delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehéqe előállítására, azzal jellemezve, hogy a 15., 18. vagy 19. igénypont szerinti gazdasejtet tenyésztjük, és az expresszált fehéqét izoláljuk.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként olyan élesztősejtet alkalmazunk, amelyben a fehéqét kódoló DNS-szekvencia egy élesztőpromoter szabályozása alatt áll.
  22. 22. Eljárás C7-pozícióban telítetlen szterin in vitro redukálására, azzal jellemezve, hogy a redukálandó szterint a 20. vagy 21. igénypont szerint előállított fehérjével érintkeztetjük, és adott esetben a kapott redukált szterint izoláljuk.
  23. 23. Eljárás C7-pozícióban telítetlen exogén szterin in vivő redukálására, azzal jellemezve, hogy a szterint 15., 18. vagy 19. igénypont szerinti gazdasejttel érintkeztetjük, és a kapott redukált szterint adott esetben izoláljuk.
  24. 24. Eljárás C7-pozícióban telítetlen endogén szterin in vivő redukálására, azzal jellemezve, hogy a 19. igénypont szerinti gazdasejtet tenyésztjük, és adott esetben a felhalmozódott redukált szterint izoláljuk.
  25. 25. A 22-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy redukált szterinként olyan szterint állítunk elő, amely szubsztrátja a koleszterin oldalláncát restrikciósán hasító enzimnek (P450SCC-nek),
  26. 26. A 25. igénypont szerinti in vivő eljárás, azzal jellemezve, hogy endogén szterinként ergoszta-5,7-dién3-olt, ergoszta-5,7,24(28)-trién-3-olt vagy ergoszta5,7,22-trién-3-olt, vagy ezek keverékét redukáljuk.
  27. 27. Eljárás pregnenolon előállítására, azzal jellemezve, hogy 19. igénypont szerinti gazdasejtet tenyésztünk, adott esetben a sejtben felhalmozódott C7-pozícióban telítetlen szterint vagy szterineket izoláljuk, a redukált szterineket P450SCC-vel érintkeztetjük, adott esetben adrenodoxin-reduktáz (ADR) és adrenodoxin (ADX) jelenlétében, és a kapott pregnenolont adott esetben izoláljuk.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztősejtet alkalmazunk.
  29. 29. Eljárás pregnenolon előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan élesztősejtet tenyésztünk, amely egy vagy több olyan vektorral van transzformálva, amely lehetővé teszi egy delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehéqe és a P450SCC, valamint adott esetben az ADR és az ADX együttes expresszióját, és adott esetben a szabad vagy észteresített pregnenolont izoláljuk.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan élesztősejtet tenyésztünk, amely együttesen expresszál delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-, P450SCC-, ADR- és ADX-aktivitású fehérjéket.
  31. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjeként A. thaliana delta-7-Red-fehéijét expresszáló élesztősejtet tenyésztünk.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztősejtként az EC01/pCD63 jelű törzshöz tartozó sejtet tenyésztünk.
  33. 33. Transzformált élesztőtörzs, amely képes együttesen expresszálni delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-, P450SCC-, ADR- és ADX-aktivitású fehérjéket, és szabad vagy észteresített pregnenolon halmozódik fel benne,
  34. 34. A 33. igénypont szerinti élesztőtörzs, amely delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz-aktivitású fehérjeként az A. thaliana delta-7-Red-fehéijéjét expresszálja.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti élesztőtörzs, melynek jelzése EC01/pCD63.
    HU 220 587 Bl
  36. 36. A 17. igénypont szerinti emberi eredetű DNSszekvencia alkalmazása veleszületett delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz deficiencia diagnosztizálására.
  37. 37. Eljárás delta-5,7-szterin delta-7-reduktáz deficiencia kimutatására, azzal jellemezve, hogy humán ge- 5 nomi DNS-mintát standard hibridizációs körülmények között 36. igénypont szerinti szekvenciájú hibridizációs próbával érintkeztetünk, és vizsgáljuk a hibridizációs próba genomi DNS-hez történő kötődését vagy a kötődés elmaradását.
HU9600325A 1995-02-15 1996-02-14 A delta-7-Red elnevezésű A. thaliana fehérjét kódoló DNS-szekvencia, a delta-7-Red-fehérje, eljárás előállításukra, a szekvenciával transzformált élesztőtörzsek, és felhasználásuk HU220587B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9501723A FR2730494B1 (fr) 1995-02-15 1995-02-15 Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta7-red, procede de production, souches de levures transformees, applications
FR9506517A FR2734839B1 (fr) 1995-06-01 1995-06-01 Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta-7red, procede de production, souches de levures transformees, applications.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9600325A1 HUP9600325A1 (en) 1996-11-28
HUP9600325A3 HUP9600325A3 (en) 1999-07-28
HU220587B1 true HU220587B1 (hu) 2002-03-28

Family

ID=26231759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9600325A HU220587B1 (hu) 1995-02-15 1996-02-14 A delta-7-Red elnevezésű A. thaliana fehérjét kódoló DNS-szekvencia, a delta-7-Red-fehérje, eljárás előállításukra, a szekvenciával transzformált élesztőtörzsek, és felhasználásuk

Country Status (24)

Country Link
US (3) US5759801A (hu)
EP (1) EP0727489B1 (hu)
JP (1) JP4082469B2 (hu)
KR (1) KR100422293B1 (hu)
CN (2) CN1664107A (hu)
AR (2) AR003407A1 (hu)
AT (1) ATE457354T1 (hu)
BR (1) BRPI9600729B8 (hu)
CA (1) CA2169524C (hu)
CZ (1) CZ294860B6 (hu)
DE (1) DE69638123D1 (hu)
DK (1) DK0727489T3 (hu)
ES (1) ES2339833T3 (hu)
FI (1) FI120877B (hu)
HR (1) HRP960078B1 (hu)
HU (1) HU220587B1 (hu)
IL (4) IL162476A (hu)
PL (1) PL185569B1 (hu)
PT (1) PT727489E (hu)
RU (1) RU2242517C2 (hu)
SI (1) SI0727489T1 (hu)
SK (1) SK283656B6 (hu)
TR (1) TR199600116A2 (hu)
UA (1) UA72172C2 (hu)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997048793A1 (en) * 1996-06-21 1997-12-24 The General Hospital Corporation Plant sterol reductases and uses thereof
DE19739940A1 (de) * 1997-09-11 1999-03-18 Hartmut Prof Dr Med Glossmann Protein mit Aminosäuresequenz der DELTA7-Sterolreduktase, isoliertes cDNA-Molekül, das für das Protein kodiert, rekombinanter DNA-Vektor und biologisch aktive Zusammensetzungen, die das Protein oder das cDNA-Molekül enthalten
FR2774393B1 (fr) * 1998-02-05 2000-03-24 Hoechst Marion Roussel Inc Souches de levure ayant le gene atf2 interrompu et leurs applications
US6465717B1 (en) * 1998-11-20 2002-10-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sterol metabolism enzymes
FR2812884B1 (fr) * 2000-08-08 2002-11-08 Aventis Pharma Sa Levures modifiees et utilisations, notamment pour la production de derives steroidiens
FR2820145B1 (fr) * 2001-01-31 2004-01-23 Aventis Pharma Sa Souche de levure produisant des steroides de facon autonome
US7193169B2 (en) * 2003-10-29 2007-03-20 Alcon, Inc. Ergonomic footswitch
FR2869914B1 (fr) * 2004-05-06 2012-11-09 Aventis Pharma Sa Souches de levure produisant du cholesterol et leurs applications
CA2600882C (en) * 2005-03-16 2013-02-26 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
KR100672006B1 (ko) * 2005-08-03 2007-01-19 길병옥 폐자재를 이용한 형강의 제조방법 및 그 제조방법에 의해생산된 형강
PT2227549E (pt) * 2007-12-21 2015-10-08 Novartis Ag Sistema de seleção para cultura de células eucarióticas com base num gene de recetor de folato ligado à membrana
DE102009022772A1 (de) 2009-05-21 2010-11-25 Organobalance Gmbh Mikroorganismus zur Expression eines humanen Membranproteins
FR2961218A1 (fr) 2010-06-10 2011-12-16 Sanofi Aventis Methode de detection de composes modulateurs du metabolisme du cholesterol
CN102286053B (zh) * 2011-06-20 2012-09-05 河北联合大学 孕甾烯醇酮吡咯化合物及其制备方法
KR20160019451A (ko) * 2013-06-17 2016-02-19 사노피 시토크롬 p450 모노옥시게나제 생체촉매작용을 위한 전세포 시스템
CN110903993A (zh) * 2019-12-20 2020-03-24 河北兰升生物科技有限公司 一种产生菜籽甾醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
CN112813129B (zh) * 2021-02-05 2023-09-08 江南大学 利用区室化提高酵母菌中7-脱氢胆固醇产量的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1042567A (zh) * 1988-09-23 1990-05-30 吉斯特-布罗卡迪斯公司 类固醇多步氧化方法和所用的遗传工程细胞
JP2645130B2 (ja) * 1989-03-31 1997-08-25 日清製粉株式会社 ステロイド誘導体
US5547868A (en) * 1993-06-09 1996-08-20 Regents Of The University Of California Cholesterol disposal fusion enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
HUP9600325A3 (en) 1999-07-28
PT727489E (pt) 2010-04-27
CN1145953A (zh) 1997-03-26
ATE457354T1 (de) 2010-02-15
JPH08289793A (ja) 1996-11-05
DK0727489T3 (da) 2010-05-31
AR003407A1 (es) 1998-08-05
JP4082469B2 (ja) 2008-04-30
IL162476A (en) 2005-12-18
TR199600116A2 (tr) 1996-08-21
EP0727489A1 (fr) 1996-08-21
KR960031607A (ko) 1996-09-17
IL116872A (en) 2004-12-15
CN1664107A (zh) 2005-09-07
US5989881A (en) 1999-11-23
FI960663A (fi) 1996-08-16
EP0727489B1 (fr) 2010-02-10
HRP960078B1 (en) 2011-11-30
ES2339833T3 (es) 2010-05-25
IL162476A0 (en) 2005-11-20
HRP960078A2 (hu) 1998-02-28
UA72172C2 (uk) 2005-02-15
PL185569B1 (pl) 2003-06-30
HUP9600325A1 (en) 1996-11-28
US5965417A (en) 1999-10-12
CA2169524C (fr) 2012-05-01
CZ294860B6 (cs) 2005-04-13
SI0727489T1 (sl) 2010-05-31
AR053931A2 (es) 2007-05-23
KR100422293B1 (ko) 2004-06-14
PL312828A1 (en) 1996-08-19
IL162477A0 (en) 2005-11-20
FI960663A0 (fi) 1996-02-14
CN1216995C (zh) 2005-08-31
BRPI9600729B8 (pt) 2021-07-06
DE69638123D1 (de) 2010-03-25
US5759801A (en) 1998-06-02
SK18896A3 (en) 1996-10-02
IL116872A0 (en) 1996-07-23
CZ43296A3 (en) 1996-12-11
BRPI9600729B1 (pt) 2017-06-20
FI120877B (fi) 2010-04-15
BRPI9600729A (pt) 1997-12-23
SK283656B6 (sk) 2003-11-04
RU2242517C2 (ru) 2004-12-20
CA2169524A1 (fr) 1996-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7977065B2 (en) Yeast strains autonomously producing steroids
HU220587B1 (hu) A delta-7-Red elnevezésű A. thaliana fehérjét kódoló DNS-szekvencia, a delta-7-Red-fehérje, eljárás előállításukra, a szekvenciával transzformált élesztőtörzsek, és felhasználásuk
JP2963711B2 (ja) ステロイドの生化学的酸化方法及びそのために用いられる遺伝子操作した細胞
EP0340878B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor
HU218111B (hu) Eljárás szteroidok többszörös oxidálására, valamint ehhez alkalmazható, genetikailag módosított sejtek
US5869283A (en) Expression cassette operable in a recombinant host
AU707957B2 (en) DNA sequence coding for a protein of A. thaliana having a delta-5,7sterol,delta-7 reductase activity, delta7-red protein, production process, strains of transformed yeasts, uses
PL198376B1 (pl) Zmodyfikowany szczep drożdży, transformowany szczep drożdży, szczepy S. cerevisiae oraz sposób utleniania in vivo substratu z wykorzystywaniem transformowanego szczepu drożdży
FR2734839A1 (fr) Sequence d'adn codant pour une proteine d'a. thaliana ayant une activite delta-5,7 sterol, delta-7 reductase, proteine delta-7red, procede de production, souches de levures transformees, applications.
IE83307B1 (en) Process for the biochemical oxidation of steroids and genetically engineered cells to be used therefor