ES2339833T3 - Secuencia de adn que codifica una proteina de a. thaliana que tiene una actividad delta-5,7-esterol-delta-7-reductasa, la proteina delta-7-red, procedimiento de produccion, las cepas de levaduras transformadas, aplicaciones. - Google Patents
Secuencia de adn que codifica una proteina de a. thaliana que tiene una actividad delta-5,7-esterol-delta-7-reductasa, la proteina delta-7-red, procedimiento de produccion, las cepas de levaduras transformadas, aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA UNA PROTEINA DE A. TALIANA QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DELTA-5,7 ESTEROL, DELTA-7 REDUCTASA(SECUENCIA SEQ ID N (GRADOS) 1). PROCEDIMIENTO DE CLONACION. PROCEDIMIENTO DE REDUCCION DE UN ESTEROL INSATURADO EN POSICION C-7. PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE PREGNENOLONA.
Description
Secuencia de ADN que codifica una proteína de
A. thaliana que tiene una actividad
delta-5,7-esterol-delta-7-reductasa,
la proteína delta-7Red, procedimiento de producción,
las cepas de levaduras transformadas, aplicaciones.
La presente invención se refiere a una secuencia
de ADN que codifica una proteína de A. thaliana que tiene
una actividad
delta-5,7-esterol-delta-7
reductasa, la proteína delta-7Red, a su
procedimiento de producción, a las cepas de levaduras transformadas
y a sus aplicaciones.
La delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa
(E.C.1.3.1.21) es una enzima microsomal cuya presencia ha sido
puesta en evidencia por su actividad en los homogenatos de hígado de
rata (M. E. Dempsey et al., Methods Enzymol., 15,
501-514, 1969) así como en las preparaciones de
plantas de Zea mays (M. Taton et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 181, 465-473, 1991). Esta reductasa depende
del NADPH y reduce in vitro el
7-deshidrocolesterol a colesterol.
Los esteroles son los constituyentes principales
de las membranas en las eucariotas pero presentan diferencias de
estructura según las especies. En las células de eucariotas tales
como las levaduras, el esterol principal es el ergosterol que
contiene una doble insaturación en C-5 y
C-7, una cadena lateral ramificada en
C-24 y una insaturación en C-22
mientras que en los mamíferos el colesterol se caracteriza por una
insaturación en C-5 y una cadena lateral saturada.
El sitosterol, el estigmasterol y el campesterol, que representan
los esteroles más comunes en las plantas, tienen una cadena lateral
ramificada pero saturada y, como los esteroles de los vertebrados,
no tienen una insaturación en C-7. La enzima
responsable de esta diferencia de estructura del núcleo esterol es
la delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa.
La delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa no ha sido
nunca purificada de modo homogéneo y solamente ha sido descrita una
purificación parcial (M. E. Dempsey et al.; M. Taton et
al., ya citado). La proteína no ha sido caracterizada por sus
propiedades físico-químicas. No se ha descrito
ninguna información sobre la secuencia de la proteína y ningún
anticuerpo dirigido contra ésta. Por otro lado, una aparente
deficiencia en 7-deshidrocolesterol reductasa ha
sido descrita en el hombre asociada al síndrome
RSH/Smith-Lemli-Opitz (SLO) (J. M.
Opitz et al., Am. J. Med. Genet., 50,
326-338, 1994).
La clonación de un ADNc que codifica la
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa, que pueda
permitir identificar la secuencia de la proteína correspondiente
así como la caracterización del gen humano o la puesta en evidencia
de una deficiencia congénita de éste, no es por tanto realizable con
los métodos conocidos que hacen uso por ejemplo de las técnicas de
hibridación y/o de detección inmunológica. Por tanto es
particularmente buscada la obtención de métodos inventivos de
cribado que permitan realizar la clonación, especialmente en
ausencia de informaciones sobre la proteína.
El ergosterol, principal esterol de las
membranas de los hongos, contiene un par de dobles enlaces
conjugados en C-5,7 que confiere una actividad
antimicótica a los compuestos de la familia de los polienos tales
como la nistatina (R. Bittman et al., J. Biol. Chem., 260,
2884-2889, 1985). La fuerte dependencia de la acción
de la nistatina de la concentración membranal de esteroles
insaturados en C-5,7 ha permitido seleccionar en el
S. cerevisiae cepas de mutantes frente a los esteroles
acumulados (S. W. Molzahn et al., J. Gen. Microbiol., 72,
339-348, 1972). Así los mutantes erg2 y erg3
acumulan esteroles que no tienen los dobles enlaces conjugados en
C-5,7 debido a una deficiencia en esterol
delta-8,7 isomerasa (W. Ashman et al.,
Lipids, 26, 628, 1991) y en esterol delta-5
deshidrogenasa (B. Arthinton et al., Gene, 102, 39, 1991)
respectivamente. Tales mutantes son viables porque el ergosterol,
el esterol natural principal de la levadura, puede ser reemplazado
en ciertas condiciones por diferentes esteroles de sustitución
incluyendo el colesterol.
La ventaja del crecimiento de la resistencia a
la nistatina de cepas de levadura enriquecidas en esteroles que no
tienen la doble insaturación en C-5,7 ha sido
percibida por los inventores para clonar un ADNc que codifica una
proteína heteróloga que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa con un
método de cribado que utiliza una interferencia metabólica en S.
cerevisiae. El éxito de este método que ofrece la ventaja de
ser independiente del conocimiento de las secuencias del ADN o de la
proteína así como de una detección basada solamente sobre la
actividad enzimática, no es sin embargo previsible debido a las
numerosas dificultades técnicas a superar.
Una primera limitación viene del hecho de que el
modo de acción de la nistatina no está totalmente elucidado (L. W.
Parks et al., CRC Critical Reviews in Microbiology,
301-304, 1978). Por ejemplo, la débil especificidad
de la selección por la nistatina es previsible debido a la
naturaleza indirecta de ésta que lleva en el caso de la levadura a
la selección de mutaciones genómicas espontáneas tales como los
mutantes erg (S. W. Molzahn et al. ya citado) o las
mutaciones genómicas que arrastran resistencias independientes de la
vía de los esteroles. Del mismo modo, las células transformadas por
un banco pueden expresar genes heterólogos que confieren una
resistencia a la nistatina sin relación con la vía de los
esteroles.
Otro ejemplo de limitación esperada se refiere
al hecho de que la proteína heteróloga puede ser débilmente activa
en la célula, lo que conduce a la ausencia de resistencia o a una
débil resistencia a la nistatina por ejemplo por una de las
siguientes razones: 1) el gen que codifica la
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa está
débilmente expresado; 2) la proteína es poco o nada activa porque
está mal replegada o porque resulta de un tratamiento subcelular
incorrecto; 3) la proteína de la planta no reconoce los esteroles
propios de la levadura como sustratos o 4) los esteroles que pueden
ser sustratos están en forma esterificada o almacenados en las
vesículas y no están en contacto con la enzima. Se puede prever por
tanto que los esteroles así acumulados escapen a la acción de la
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa que, en
los eucariotas, se supone que está localizada en los
microsomas.
La presente invención se refiere a la clonación
de un ADNc de A. thaliana que codifica una proteína que tiene
una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa,
denominada delta-7Red, según un procedimiento de
clonación realizado en una levadura por interferencia metabólica
basada sobre la resistencia a la nistatina. La proteína
delta-7Red permite reducir los esteroles que tienen
una insaturación en C-7 por un procedimiento de
reducción biológica que proporciona además una solución ventajosa
al problema de la reducción selectiva en C-7 de
esteroles o de esteroides que tienen una doble insaturación en
C-5,7, que los métodos de reducción por vía química
no permiten.
La invención se refiere igualmente a las células
de levadura transformadas que expresan la delta-7Red
que, de forma sorprendente, acumulan productos saturados en
C-7 y eventualmente saturados en
C-22 que, contrariamente al ergosterol, son
sustratos de la enzima de escisión de la cadena lateral del
colesterol, es decir el citocromo P_{450}SCC.
Estas propiedades inesperadas permiten una
utilización de las levaduras transformadas de la invención en un
procedimiento de preparación de esteroles o de esteroides que tiene
un interés industrial y/o farmacológico, en particular la
preparación de pregnenolona por oxidación biológica de los esteroles
endógenos de levadura, reducidos en C-7, por el
citocromo P_{450} SCC (P_{450}SCC) en presencia de adrenodoxina
reductasa (ADR) y de adrenodoxina (ADX). Las levaduras
transformadas de la invención se pueden utilizar también en un
procedimiento de preparación de los esteroides intermedios de la
vía de metabolización del colesterol en hidrocortisona en los
mamíferos y otros vertebrados. Esta utilización presenta la ventaja
de permitir la preparación de la hidrocortisona o de sus
intermedios en un procedimiento de oxidación biológica que no
necesita el empleo de un esterol exógeno tal como el colesterol
como sustrato inicial y de esquivar así el problema de la
penetración de un esterol en la levadura cuya impermeabilidad a los
esteroles exógenos en condiciones de aerobiosis ha sido descrita
(R. T. Lorentz et al., J. Bacteriology,
981-985, 1986).
La invención se refiere también a la utilización
de las secuencias nucleotídicas obtenidas con ayuda del
procedimiento de clonación de la invención. Una secuencia de ARN o
ADN que codifica la delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa se puede
utilizar para el diagnóstico o el tratamiento de afecciones que
implican el producto del gen de la delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa. Por
ejemplo, una deficiencia en delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa que
convierte el 7-deshidrocolesterol en colesterol se
supone que está implicada en el síndrome RSH/SLO. Así una secuencia
de ADN humano se puede utilizar como sonda para diagnosticar una
deficiencia en delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y se
puede utilizar también en terapia génica para corregir tal
deficiencia.
La presente invención tiene por tanto por objeto
una secuencia de ácido nucleico que contiene una secuencia que
codifica una proteína que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa, siendo
dicho ácido nucleico un ADN o un ARN y siendo particularmente un
ADNc.
La actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa se puede
poner en evidencia por ejemplo con ayuda de un ensayo enzimático
in vitro descrito más adelante en la parte experimental.
La invención tiene más particularmente por
objeto una secuencia de ADNc en la que la secuencia codificadora
codifica una proteína de A. thaliana que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y que
tiene la secuencia nucleotídica de la secuencia SEQ ID Nº 1:
La secuencia de ADNc anterior que codifica una
proteína que tiene 430 aminoácidos que corresponden a la secuencia
presentada en la figura 3 (SEQ ID Nº 2) es una secuencia de ADNc que
se puede obtener por ejemplo por clonación en una levadura, a
partir de un banco de expresión de A. thaliana, utilizando un
método de cribado fundado en la aparición de una resistencia de la
levadura a la nistatina, según las condiciones operatorias cuya
descripción detallada se da más adelante.
El conocimiento de la secuencia nucleotídica SEQ
ID Nº 1 anterior permite reproducir la presente invención por
métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo por
síntesis química o por cribado de un banco genómico o de un banco
de ADNc con ayuda de sondas de oligonucleótidos de síntesis por las
técnicas de hibridación o por amplificación por PCR.
La invención tiene también por objeto una
secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y que se
hibrida con la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 1 en condiciones de
rigurosidad media o elevada o que presenta una identidad de
secuencia de aproximadamente 60 y más con esta secuencia.
Las secuencias que se hibridan de forma
detectable con la secuencia SEQ ID Nº 1, se hibridan en las
condiciones estándar de rigurosidad media, por ejemplo una
hibridación a 42ºC, durante 12 horas en una solución de formamida
al 50%, SSCX6 seguida de lavados o de rigurosidad menos elevada, por
ejemplo una hibridación a 42ºC durante 24 horas en una solución de
formamida al 20%, SSCX6 seguida de lavados en las condiciones
estándar conocidas (T. Maniatis et al., Molecular cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
El porcentaje de identidad de secuencia
nucleotídica se puede determinar utilizando por ejemplo el programa
BLAST "basic local alignment search tool" (S. F. Altschul et
al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) sobre el
servidor NCBI.
La invención se refiere también a una secuencia
de ADN que codifica una proteína que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y que es
amplificable por la técnica de PCR utilizando como cebadores los
oligonucleótidos que codifican una secuencia de consenso que tiene
la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 3:
en la que Xaa en la posición 7 es
Trp o Tyr y Xaa en la posición 12 es His o Lys asociados a un
cebador oligo
dT.
La secuencia SEQ ID Nº 3 anterior corresponde a
una secuencia de consenso nueva que ha sido definida por
alineamiento de identidad de secuencias de aminoácidos entre la
secuencia nueva SEQ ID Nº 2, deducida de la secuencia nucleotídica
SEQ ID Nº 1, y las secuencias conocidas ya sean de otras esterol
reductasas que tienen una especificidad de acción en una posición
distinta de la posición C-7, o ya sean de receptores
de la lámina B, como se detalla más adelante en la parte
experimental. A partir de la información dada por la secuencia de
aminoácidos SEQ ID Nº 3, se puede definir y sintetizar un cebador
constituido por más de 45 nucleótidos que, asociado a un segundo
cebador oligo dT (17 nucleótidos) como secuencia de rebote,
permitirá, con ayuda de un kit comercial de PCR (por ejemplo
Stratagen) amplificar un ADN que codifica una proteína que tiene la
actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa.
La invención se refiere también a una proteína
de A. thaliana que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y que
tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2:
La invención tiene especialmente por objeto una
proteína de A. thaliana que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y que
tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2 anterior y que se
denomina delta-7Red.
La invención se refiere también a una proteína
que tiene una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa que tiene
una secuencia de aminoácidos que presentan una identidad de
secuencia de aproximadamente 60% y más con la secuencia SEQ ID Nº
2.
El porcentaje de identidad se puede determinar
por ejemplo utilizando el programa BLAST indicado anteriormente.
La invención se refiere igualmente a una
proteína que tiene una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y que
tiene una reactividad inmunológica cruzada con la proteína de A.
thaliana delta-7Red definida antes.
\newpage
La proteína se puede detectar por ejemplo por
inmuno-precipitación con ayuda de un antisuero
dirigido contra la proteína delta-7Red, preparado
según métodos conocidos.
Uno de los aspectos de la invención se refiere a
una proteína que tiene una actividad delta 5,-7
esterol-delta-7 reductasa tal como
la obtenida por expresión en una célula hospedadora que contiene una
secuencia de ADN definida precedentemente y se refiere
especialmente a una proteína de A. thaliana tal como la
obtenida por expresión en una célula hospedadora que contiene una
secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº
2 anterior.
Cuando se obtiene la proteína de la invención
por expresión en una célula hospedadora, ésta se realiza según los
métodos de ingeniería genética y de cultivo celular conocidos por
los expertos en la técnica.
La expresión se puede realizar en una célula
hospedadora procariota, por ejemplo E. coli o en una célula
hospedadora eucariota, por ejemplo una célula de mamífero, una
célula de insecto o una levadura que contiene la secuencia que
codifica la delta-7 Red de la invención precedida de
un promotor conveniente.
La proteína recombinante obtenida puede ser
glucosilada o no glucosilada.
La invención se refiere especialmente a una
proteína según la invención tal como la obtenida por expresión en
una levadura.
La invención se refiere también a un anticuerpo
dirigido contra una proteína que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa definida
precedentemente. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o
un anticuerpo monoclonal preparado según los métodos conocidos por
los expertos en la técnica.
La invención se refiere también a un vector de
expresión que contiene una secuencia de ADN definida precedentemente
así como a una célula hospedadora transformada por este vector.
Los vectores de expresión son vectores conocidos
que permiten la expresión de la proteína bajo el control de un
promotor conveniente. Para las células procariotas, el promotor
puede ser por ejemplo el promotor lac, el promotor trp, el promotor
tac, el promotor \beta-lactamasa o el promotor PL.
Para las células de mamíferos, el promotor puede ser por ejemplo el
promotor SV40 o los promotores del adenovirus. También se pueden
utilizar vectores de tipo Baculovirus para la expresión en células
de insectos. Para las células de levadura, el promotor puede ser
por ejemplo el promotor PGK, el promotor ADH, el promotor CYC1 o el
promotor GAL10/CYC1.
Las células hospedadoras pueden ser células
procariotas o células eucariotas. Las células procariotas son por
ejemplo E. coli, Bacillus o Streptomyces. Las células
hospedadoras eucariotas comprenden levaduras y hongos filamentosos
así como células de organismos superiores, por ejemplo células de
mamíferos o células de insectos. Las células de mamíferos pueden
ser células CHO de hámster o células Cos de mono. Las células de
insectos son por ejemplo células SF9. Las células de levadura pueden
ser por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe o Kluyveromyces lactis.
La invención tiene también por objeto un
procedimiento de clonación de un ácido nucleico que codifica una
proteína que tiene una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa en un
microorganismo, que comprende un método de cribado elegido
entre
- \bullet
- la resistencia del microorganismo a la nistatina o a un compuesto análogo cuya toxicidad depende de la presencia de esteroles que tienen una insaturación en la posición C-7,
- \bullet
- la hibridación del ácido nucleico con la secuencia nucleotídica de la secuencia SEQ ID Nº 1 anterior,
- \bullet
- la identificación del ácido nucleico por vía informática según el programa BLAST entre las secuencias de ADN aisladas al azar.
Por microorganismo, se entiende una levadura tal
como por ejemplo S. cerevisiae, S. pombe o K.
lactis.
Los compuestos análogos a la nistatina
comprenden por ejemplo la anfotericina B o la filipina.
Por hibridación, se entiende una hibridación en
condiciones de rigurosidad media o elevada según las condiciones
estándar conocidas (T. Maniatis et al., ya citado).
La identificación por vía informática se realiza
según el programa BLAST indicado anteriormente.
Un ejemplo de procedimiento de clonación
anterior en el que el método de cribado utiliza la resistencia a la
nistatina en una levadura, se describe más adelante en la parte
experimental.
La invención tiene especialmente por objeto una
célula hospedadora, elegida entre una levadura o un hongo
filamentoso, transformada por un vector que contiene una secuencia
de ADN de la invención definida precedentemente.
Uno de los objetos de la invención se refiere
también a un procedimiento de preparación de una proteína que tiene
una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa en el que
se cultiva una célula hospedadora transformada de la invención y se
aísla la proteína expresada y se refiere particularmente a un
procedimiento en el que la célula hospedadora es una levadura
transformada en la que la secuencia de ADN codificadora está bajo el
control de un promotor de levadura.
Uno de los objetos de la invención se refiere
también a un procedimiento de reducción in vitro de un
esterol insaturado en la posición C-7, en el que se
incuba el esterol a reducir con la proteína obtenida por
procedimiento anterior y se aísla eventualmente el esterol reducido
obtenido.
Uno de los objetos de la invención se refiere
también a un procedimiento de reducción in vivo de un esterol
exógeno insaturado en la posición C-7, en el que se
incuba el esterol con una célula hospedadora transformada de la
invención y se aísla eventualmente el esterol reducido obtenido. La
célula hospedadora puede ser una célula procariota o una célula
eucariota, en particular una levadura o un hongo filamentoso.
Uno de los objetos de la invención se refiere
también a un procedimiento de reducción in vivo de un esterol
endógeno insaturado en la posición C-7, en el que
se cultiva una cepa hospedadora transformada de la invención
elegida entre una levadura o un hongo filamentoso y se aísla
eventualmente el esterol reducido acumulado.
La invención se refiere particularmente a un
procedimiento de reducción in vitro o in vivo definido
antes, en el cual el esterol reducido obtenido es un sustrato de la
enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol
(P_{450}SCC) y se refiere muy particularmente a un procedimiento
de reducción in vivo en el cual el esterol endógeno a
reducir es el ergosta 5,7 dien 3-ol, el ergosta
5,7,24(28) trien 3-ol o el ergosta 5,7,22
trien 3-ol o una mezcla de estos.
La invención tiene también por objeto un
procedimiento de producción de pregnenolona, en el cual se cultiva
una célula hospedadora transformada de la invención elegida entre
una levadura o un hongo filamentoso, se aísla eventualmente el
esterol o los esteroles endógenos reducidos en la posición
C-7 acumulados, se incuban los esteroles reducidos
en presencia de P_{450}SCC, y eventualmente en presencia de
adrenodoxina reductasa (ADR) y de adrenodoxina (ADX), y se aísla
eventualmente la pregnenolona obtenida.
La invención tiene particularmente por objeto un
procedimiento de producción de la pregnenolona definido antes en el
que la célula hospedadora es una levadura.
La invención se refiere también a un
procedimiento de producción de pregnenolona en el que se cultiva una
levadura transformada por uno o varios vectores que permiten la
coexpresión de una proteína que tiene la actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y de
P_{450}SCC y eventualmente de la ADR y de la ADX y se aísla
eventualmente la pregnenolona libre o esterificada.
La invención se refiere particularmente al
procedimiento anterior en el que se cultiva una levadura
transformada que coexpresa una proteína que tiene la actividad
delta-5,7 esterol delta-7 reductasa,
el P_{450}SCC, la ADR y la ADX, muy particularmente el
procedimiento anterior en el que la proteína que tiene la actividad
delta-5,7 esterol delta-7 reductasa
es la proteína de A. thaliana delta-7Red y
especialmente el procedimiento anterior en el que la cepa de
levadura es la cepa EC01/pCD63.
Ejemplos de producción de pregnenolona según la
invención se dan más adelante en la parte experimental.
La levadura transformada utilizada para la
realización del procedimiento de producción de pregnenolona anterior
puede ser por ejemplo una levadura co-transformada
por un vector de expresión de la invención que contiene una
secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y un
vector de expresión del citocromo P_{450}SCC y eventualmente de la
ADX y de la ADR. Los vectores de expresión del citocromo
P_{450}SCC y/o de la ADX son conocidos y las preparaciones están
descritas por ejemplo en la solicitud de patente europea EP 0340878
así como más adelante en la parte experimental.
La levadura transformada utilizada puede ser
igualmente una levadura en la que la secuencia de ADN que codifica
la proteína que tiene la actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa está
integrada en un locus particular del genoma, por ejemplo en el
locus ADE2 y en la que el ergosterol no es ya el esterol mayoritario
en las condiciones de expresión de la delta-7
reductasa. La levadura "integrada" obtenida puede ser
transformada a continuación por casetes de expresión integradas o
por vectores de expresión que contienen una secuencia de ADN que
codifica el citocromo P_{450}SCC y eventualmente la ADX y la
ADR.
Un ejemplo de construcción de cepas de levadura
que producen in vivo la pregnenolona o su éster acético se da
más adelante en la parte experimental.
La invención tiene por tanto igualmente por
objeto una cepa de levadura transformada que coexpresa una proteína
que tiene la actividad delta-5,7 esterol
delta-7 reductasa, el P_{450}SCC, la ADR y la ADX
y que acumula pregnenolona libre o esterificada, particularmente
una cepa de levadura anterior en la que la proteína que tiene la
actividad delta-5,7 esterol delta-7
reductasa es la proteína de A. thaliana
delta-7Red y especialmente una cepa de levadura
denominada EC01/pCD63 cuya construcción detallada se da más adelante
en la parte experimental.
La invención se extiende también a una secuencia
de ADN humano tal como el obtenido según el procedimiento de
clonación definido anteriormente, utilizada como sonda para
diagnosticar una deficiencia congénita en delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa. La
deficiencia en delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa comprende
por ejemplo la deficiencia en 7-deshidrocolesterol
reductasa responsable de tasas anormalmente bajas de colesterol en
el plasma.
La invención se refiere igualmente a un método
de detección de la deficiencia en delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa que
comprende la incubación de una muestra que contiene ADN genómico
humano con la sonda definida anteriormente en condiciones de
hibridación estándar y la puesta en evidencia de la fijación o de la
ausencia de fijación de la sonda al ADN genómico, la ausencia de
fijación o la reducción de ésta lo que indica una deficiencia
congénita en delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa.
El método de la invención puede permitir por
ejemplo detectar una deficiencia congénita en
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa prenatal
o en el recién nacido así como en los pacientes con afecciones
variadas y especialmente en los pacientes que tienen las
manifestaciones clínicas del síndrome RSH/SLO.
Las figuras anexas ilustran ciertos aspectos de
la invención:
La figura 1 representa el perfil en esteroles
totales extraídos a partir del clon F22 resistente a la nistatina
obtenido por cribado del banco de A. thaliana en la levadura
FY 1679. El análisis se hace por RP-HPLC a 205 nm o
a 285 nm (figura 1A) o por CPG en comparación con la levadura FY1679
no transformada (figura 1B).
La figura 2 representa una carta de restricción
del fragmento Not I del plásmido pF22 y la estrategia de
secuenciación.
La figura 3 representa la secuencia nucleotídica
del ADNc delta-7Red (SEQ ID Nº 1) y la secuencia de
aminoácidos correspondiente (SEQ ID Nº 2).
La figura 4 ilustra la medida in vitro de
la actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa de una
fracción microsomal de FY1679 transformada con el vector de
expresión inducible "delta-7/V8". El análisis
se hace por CPG y muestra la transformación del sustrato de
7-deshidrocolesterol (TR = 16,528) en colesterol (TR
= 15,887) en presencia de los esteroles endógenos ergosta 5,22 dien
3-ol (TR = 16,682); ergosterol (TR = 17,249);
ergosta 5-en 3-ol (TR = 17,664).
La figura 5 ilustra la producción de
pregnenolona in vitro por escisión de ergosta
5-en 3-ol (fig. 5A); de ergosta
5,24(28) dien 3-ol (5B) o de ergosta 5,22
dien 3-ol (5C) purificada a partir de una levadura
transformada que expresa la delta-7Red, e incubada
después con P_{450}SCC, ADX y ADR. El análisis se hace por CPG en
comparación con un testigo de escisión de colesterol (trazo
lleno).
La figura 6 ilustra la construcción del plásmido
integrativo pAD\Delta7 que permite la integración del ADNc que
codifica la delta-7Red (esterol \Delta7 reductasa)
en el locus ADE2.
La figura 7 representa el análisis por CPG de
los esteroles totales extraídos por saponificación alcalina de la
cepa FY1679 y de la cepa integrada ELR01 cultivadas en presencia de
galactosa.
La figura 8 esquematiza la construcción del
vector bifuncional E. coli-S. cerevisiae V13
que contiene un sitio único SalI (Sa) en el sitio de clonación
múltiple.
La figura 9 representa las etapas de la
construcción de los plásmidos integrativos pCD62-1 y
pCD62-2 que permiten insertar la casete de expresión
ADR en la región intergénica de los genes leu2 y spll\Delta.
SCM1 y SCM2: sitios de clonación múltiples.
La figura 10 representa la estrategia de la
construcción de la cepa CDR01.
La figura 11 representa las etapas de la
construcción del plásmido de expresión pCD63 que contiene las dos
casetes de expresión ADX y P_{450}SCC.
La figura 12 representa el análisis por CPG de
los esteroles extraídos a partir de las células (lisado celular) o
del medio de cultivo (medio) aisladas a partir de la cepa EC01/pCD63
después de una inducción por la galactosa de 9 h (figura 12a) o de
24 h (figura 12b).
La figura 13 representa la estructura del
plásmido pTG 7457.
La figura 14 representa la estructura del
plásmido pTG 7453.
La figura 15 representa la estructura del
plásmido pTG 10014.
La figura 16 representa la estructura del
plásmido pTG 10004.
La figura 17 representa la estructura del
plásmido pTG 10031.
La figura 18 representa la estructura del
plásmido pTG 10033.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención,
sin limitarla.
El banco de expresión de ADNc de partida es el
banco descrito por M. Minet et al. (Plant J., 2,
417-422, 1992) que ha sido preparado a partir de
ARNm de A. thaliana en fase de germinación en la fase de dos
hojas y cuyos ADNc bordeados por el sitio Not I han sido insertados
en el sitio Bst XI de la casete de expresión del vector bifuncional
E. coli/S. cerevisiae pFL61. Esta casete contiene las
secuencias del promotor y del terminador del gen de la
fosfoglicerato-quinasa (PGK). El origen de la
replicación de la levadura derivada de la secuencia 2 \mu y un
marcador de selección URA3 aseguran la propagación del vector en la
levadura. La propagación del vector en E. coli se deriva del
plásmido pUC19.
La cepa de levadura FY 1679 (Mata), que es una
cepa isogénica de la cepa S288C descrita por A. Thierry et
al. (Yeast, 6, 521-534, 1990), ha sido
transformada por el banco de ADNc utilizando el método del acetato
de litio descrito por D. Gietz et al. (Nucleic Acids Res.,
20, 1425, 1992).
Las células se han extendido sobre un medio
sintético SGI que contiene 7 g/l de "base de nitrógeno para
levaduras" (Difco), 1 g/l de bactocasaminoácidos (Difco), 20 g/l
de glucosa, 20 mg/l de triptófano y que está desprovisto de
uracilo. Se han obtenido 10^{5} transformantes prototrofos para el
uracilo, después se han agrupado y se han extendido de nuevo sobre
el mismo medio sintético desprovisto de uracilo y que contiene 2 o 5
\mug/ml de nistatina a razón de 5x10^{4} células por placa. Se
han cribado así 10^{6} células para cada concentración de
nistatina. Después de 3 días de incubación a 28ºC, se han recuperado
aproximadamente 100 clones, que han llegado hasta la concentración
de 2 \mug/ml de nistatina, constituyendo los grupos de 5 clones
cuya composición en esteroles ha sido analizada por cromatografía
de líquidos de alta resolución en fase inversa (denominada
RP-HPLC en el texto que sigue) mientras que se ha
obtenido un solo clon resistente, denominado F22, a la concentración
de 5 \mug/ml de nistatina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los esteroles totales de la levadura se preparan
según el método de saponificación alcalina descrito por L. Parks
et al. (Methods in Enzymol., 111, 333-346,
1985), después se analizan por RP-HPLC y/o por
cromatografía en fase gaseosa (denominada CPG).
El residuo de esteroles obtenido se disuelve en
la mezcla
etanol-tetrahidrofurano-agua
(65:10:25 v/v) y después se analiza por RP-HPLC
sobre una columna de sílice injertada C18 Applied Biosystems (100 x
2,1 mm) a un caudal de 1 ml/min y a 55ºC con ayuda de un gradiente
lineal de metanol en agua (50% a 100% en 18 min) y una detección
fotométrica a 205 nm y 285 nm en comparación con los estándares de
ergosterol, campesterol y colesterol.
La composición en esteroles se analiza también
por CPG sobre una columna capilar SE-30 Alltech (30
m x 0,32 mm) con helio como gas portador, una temperatura de 280ºC y
310ºC para el inyector y el detector respectivamente, con un aumento
inicial de la temperatura de 110ºC a 245ºC a la velocidad de
45ºC/min, después de 3ºC/min hasta alcanzar 280ºC.
El análisis por RP-HPLC (figura
1A) y el análisis por CPG (figura 1B) muestran el perfil de los
esteroles acumulados en el clon F22 obtenido anteriormente
caracterizado por la desaparición casi completa del ergosterol,
esterol mayoritario de la cepa no transformada FY 1679, y su
reemplazamiento por dos esteroles mayores y en cantidad análoga que
no absorben a 285 nm y que no tienen una doble insaturación
conjugada según el análisis por RP-HPLC.
En la figura 1A, el campesterol (Sigma)
(24-R-ergosta 5-en
3-ol) contiene aproximadamente 35% de
dihidrobrasicasterol (24-S-ergosta
5-en 3-ol).
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos que provienen del clon F22 han
sido amplificados en E. coli según el método descrito por J.
N. Strathern et al. (Methods in Enzymol., 194,
319-329, 1991), y han sido digeridos después por Not
I. Se ha obtenido un fragmento de 600 pares de bases (bp)
aproximadamente y un fragmento de 1,6 kbp. La cepa FY1679 ha sido
transformada con cada uno de los fragmentos anteriores
respectivamente. La composición en esteroles de cada clon de
levadura transformada ha sido analizada como se ha indicado
anteriormente y ha permitido distinguir el plásmido que lleva el gen
responsable del perfil modificado en esteroles. El plásmido así
identificado se ha denominado pF22.
El inserto de ADNc de pF22 ha sido subclonado en
el sitio Not I del vector pUC9N derivado de pUC9 (Pharmacia) en el
cual el sitio Eco RI del sitio múltiple de clonación está
reemplazado por la inserción de un sitio de restricción Not I
conservando siempre la fase de lectura del gen LacZ. A continuación
se ha determinado una carta de restricción (figura 2).
Los fragmentos de restricción que tienen el
sitio externo Not I y los sitios internos EcoRI, PvuII o HindIII
respectivamente, han sido subclonados en el plásmido pBluescript
(Stratagen). La secuencia nucleotídica ha sido determinada por el
método de Sanger con la ADN polimerasa Sequenase (kit Stratagen)
sobre las dos cadenas utilizando los cebadores directo e inverso de
pUC9, T3 y T7 de pBluescript o cebadores específicos deducidos de
la secuencia nucleotídica del ADNc.
La compilación del conjunto de las secuencias
obtenidas da la secuencia nucleotídica del ADNc
delta-7Red de A. thaliana (SEQ ID Nº 1)
representada en la figura 3. Esta secuencia contiene 1496
nucleótidos que terminan por una secuencia de poliadenilación.
Presenta una fase de lectura abierta que comienza por una metionina
iniciadora en el nucleótido 76 y que termina por un codón de
terminación en el nucleótido 1366. Resulta una fase de lectura
abierta de 1290 nucleótidos que codifica una proteína de 430
aminoácidos. La región codificadora del ADNc
delta-7Red codifica la proteína
delta-7Red cuya secuencia deducida en aminoácidos
(SEQ ID Nº 2) se muestra en la figura 3. La secuencia de la
proteína comprende 430 aminoácidos que tienen una masa molecular
calculada de 49.286 kDa.
Una muestra de la cepa E. coli
DH5-1 que contiene el ADNc
delta-7Red en el vector pUC9N (denominado ADNc
delta7red/pUC9N) ha sido depositada en la CNCM el 10 febrero de 1995
con el número I-1535.
Por investigación informatizada en las bases de
secuencias (Genbank y EMBL), se ha puesto en evidencia que la
secuencia de la proteína delta-7Red de A.
thaliana presenta ciertas similitudes de secuencia con otras
esterol reductasas, en particular la esterol C-14
reductasa y la esterol C-24(28) reductasa de
S. cerevisiae descritas por R. T. Lorentz et al.
(DNA Cell Biol., 11, 685-692, 1992) y W. Chen et
al. (Yeast, 7, 305-308, 1991) respectivamente
así como el producto del gen sts 1+ de S. pombe descrito por
M. Shimanuki et al. (Mol. Biol. Cell, 3,
263-273, 1992) y de la esterol C-14
reductasa de Neurospora crassa (Nº X77955 en la base EMBL). Además,
la proteína delta-7Red presenta una similitud con
los 400 aminoácidos del extremo C-terminal del
receptor de la lámina B de pollo y con la del receptor humano
correspondiente descritos por H. J. Worman et al. (J. Cell
Biol., 111, 1535-1542, 1990) y E. Schuler et
al. (J. Biol. Chem., 269, 11312-11317,
1994).
Se han establecido alineaciones de identidad de
secuencia entre la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2 deducida
del ADNc delta-7Red obtenido anteriormente y las de
las tres esterol reductasas de levadura y de los dos receptores de
la lámina B y después se ha definido una secuencia de consenso nueva
que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID Nº 3):
en la que Xaa en la posición 7 es
Trp o Tyr y Xaa en la posición 12 es His o Lys, para preparar los
oligonucleótidos utilizables como cebadores para amplificar por PCR
nuevas secuencias de ADN genómico o de ADNc que codifica una
proteína que tiene una actividad delta-5,7
esterol-delta-7
reductasa.
La deleción de las regiones no codificadoras del
ADNc de pF22 se ha efectuado por la técnica de amplificación PCR
utilizando los oligonucleótidos específicos siguientes:
| 5'CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3' | (SEQ ID Nº 4) |
y
| 5'CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3' | (SEQ ID Nº 5) |
que han sido definidos para introducir un sitio
de restricción BamH I inmediatamente corriente arriba del codón de
iniciación y un sitio Kpn I inmediatamente corriente abajo del codón
de terminación.
El ADNc ha sido amplificado a partir de 1 ng de
plásmido "ADNc delta7red/pUC9N" en presencia de 2 unidades de
Pfu DNA polimerasa y una concentración 0,2 \muM de cada uno de los
cebadores anteriores utilizando las condiciones de amplificación
siguientes: 94ºC, 10 s; 52ºC, 50 s; 74ºC, 90 s; 33 ciclos con el kit
PCR de Stratagen.
Se ha obtenido un fragmento de 1300 bp
aproximadamente, y después se ha digerido por las enzimas de
restricción BamH I y Kpn I y se ha insertado en los sitios BamH I y
Kpn I del vector bifuncional E. coli/S. cerevisiae
pYeDP1/8-2 (denominado V8) descrito por C. Cullin
et al. (Gene, 65, 203-217, 1988). V8 lleva el
marcador de selección URA3 y contiene una casete de expresión en la
levadura que contiene el promotor GAL10/CYC1 y la secuencia
terminadora del gen PGK. El vector así obtenido, denominado
delta-7/V8, permite la expresión inducible por la
galactosa de la proteína delta-7Red.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de levadura FY 1679 (Mata) ha sido
transformada con el plásmido delta-7/V8 obtenido
anteriormente utilizando el método del acetato de litio descrito
por D. Gietz et al. (ya citado).
La levadura transformada ha sido cultivada a
27ºC, en medio selectivo SGI descrito anteriormente pero en el cual
la concentración de glucosa es de 5 g/l, hasta la obtención de una
saturación de densidad celular (DO_{600 \ nm} = 12). El cultivo se
diluye a continuación por adición de un volumen de medio completo YP
(10 g/l en extracto de levadura (Difco) y 10 g/l en bactopeptona
(Difco)), y después adición de etanol (1,5% v/v) como fuente de
carbono. Cuando el crecimiento ha permitido alcanzar una
concentración celular de al menos 7x10^{7} células/ml, la
expresión de la delta-7Red ha sido inducida por
adición de galactosa a la concentración de 20 g/l.
La inducción se ha realizado también en medio
mínimo selectivo SLI, que corresponde al medio SGI en el cual la
glucosa es reemplazada por la galactosa (20 g/l), hasta la obtención
de una concentración celular de 2 x 10^{7} células/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de la proteína
delta-7Red ha sido puesta en evidencia utilizando un
ensayo enzimático descrito por M. Taton et al. (Biochem.
Bioph. Res. Commun., 181, 465-473, 1991) pero sin
sistema de regeneración del NADPH, con preparaciones celulares
microsomales o citosólicas de la levadura inducida
anteriormente.
Las fracciones celulares han sido obtenidas por
pulverización mecánica de células inducidas y aislamiento de las
fracciones por ultracentrifugación según el método descrito por P.
Urban et al. (Eur. J. Biochem., 222,
843-850, 1994). Las células se recogen y después se
lavan dos veces con el tampón TE-KCl (TrisHCl 50 mM,
pH 7,4; EDTA 1 mM, KCl 0,1 M) y se ponen en suspensión en el tampón
de lisis TE-sorbitol 0,6 M. Se añaden perlas de
vidrio de 0,45-0,5 mm de diámetro (Braun) hasta
aflorar la superficie de la suspensión celular que se agita a
continuación durante 5 min a 4ºC. Se recupera el lisado celular en
superficie y las perlas de vidrio se lavan tres veces con el tampón
de lisis. El lisado y los lavados se reúnen y después se centrifugan
a 20.000 g durante 13 min a 4ºC de forma que se eliminan las
fracciones mitocondriales. El sobrenadante recogido se centrifuga
durante 1 h a 100.000 g y a 4ºC. El residuo que contiene la fracción
microsomal y el sobrenadante que representa la fracción citosólica
se recogen por
separado.
separado.
La fracción microsomal o la fracción citosólica
obtenidas se incuban respectivamente durante 90 min a 37ºC en el
tampón Tris/HCl 100 mM a pH 7,3 que contiene como sustrato
7-deshidrocolesterol 150 \muM emulsionado con
tween 80 (1,5 g/l) y en presencia de NADPH 2 mM. Los esteroles se
extraen por adición de 3 volúmenes de mezcla
metanol-diclorometano (50:50, v/v) y después se
analizan en CPG en comparación con los productos estándar.
La formación de colesterol (TR = 15,887 mn) a
partir de 7-deshidrocolesterol (TR = 16,528 mn) se
muestra en la figura 4 con una fracción microsomal (3,5 mg/ml en
proteína) obtenida anteriormente a partir de la levadura FY 1679
transformada con el vector delta-7/V8, inducida
durante 3 h y cuyos esteroles endógenos tienen tiempos de retención
superiores (TR = 16,682 min para el ergosta 5-22
dien 3-ol;
TR = 17,249 min para el ergosterol y TR = 17,664
min para el ergosta 5-en 3-ol).
Estos resultados demuestran que la proteína
delta-7Red, por una parte es expresada en la
levadura transformada, y por otra parte posee una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas de levadura cuyos esteroles mayoritarios
tienen un doble enlace en la posición C-5,7 han sido
transformadas con el vector delta-7/V8 obtenido en
el ejemplo 1, después cultivadas e inducidas como se indica en el
ejemplo 1. Los esteroles endógenos, cuyo perfil se analiza por CPG,
han sido extraídos y purificados por RP-HPLC como
se indica en el ejemplo 1 utilizando una columna C18 preparativa
(100 X 4,6 mm), y después identificados por IR, UV, SM y RMN. Las
tres cepas siguientes han sido utilizadas respectivamente:
- La cepa FY1679 descrita en el ejemplo 1;
- La cepa mutante erg5, denominada PLC 1051,
caracterizada por una deficiencia en esterol C-22
desaturasa, que ha sido construida por cruce entre la cepa FY1679 y
la cepa original pol5 descrita por S. W. Molzahn et al. (J.
Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972) y que acumula
ergosta 5,7-dien 3-ol.
- La cepa doble mutante erg4,5, denominada PLC
1451, caracterizada por una deficiencia en esterol
C-22 desaturasa (erg5) y esterol
C-24(28) reductasa (erg4), ha sido obtenida
por cruce entre la cepa FY1679 y una cepa pol5 descrita por S. W.
Molzahn et al. (ya citado) y ha adquirido una resistencia
espontánea a la nistatina a lo largo de un cribado sistemático de
levaduras a la búsqueda de mutantes de esteroles y que acumula
ergosta 5,7,24(28) trien 3-ol. La cepa
haploide resultante, que lleva la doble mutación erg4, erg5, crece
en presencia de galactosa y de sustrato no fermentable y es
auxotrofa para el uracilo, el triptófano y la histidina. Las cepas
PLC 1051 y PLC 1451 han sido depositadas en la CNCM el 10 de febrero
de 1995 con los números I-1536 y
I-1537 respectivamente.
Los esteroles mayores reducidos identificados
respectivamente a partir de las tres cepas transformadas
anteriormente se indican en la siguiente tabla:
La producción de pregnenolona se realiza
utilizando el ensayo enzimático de escisión de la cadena lateral del
colesterol in vitro descrito por Wada et al. (Arch.
Biochem. Biophys., 290, 376-380, 1991) en el cual
una concentración 260 \muM de un esterol reducido en
C-7 obtenido en el ejemplo 2 se incuba en 150 \mul
de tampón fosfato 10 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, tween 20 al 0,3% en
presencia de adrenodoxina reductasa 140 nM, de adrenodoxina 1,16
\muM y de citocromo P_{450}SCC 0,68 \muM de origen bovino
obtenidos a partir de glándulas suprarrenales por ejemplo según D.
W. Seybert et al., J. Biol. Chem., 254,
12088-12098, 1979.
La reacción se activa por adición de NADPH 150
\muM. Después de una incubación de 80 min a 37ºC, la reacción se
para por adición de un volumen de mezcla
metanol-diclorometano (50:50 v/v). Los esteroles se
extraen y se analizan por CPG como se indica en el ejemplo 1.
La figura 5 muestra respectivamente que el
ergosta 5-en 3-ol (fig. 5A), el
ergosta 5,24(28) dien 3-ol (fig. 5B) o el
ergosta 5,22 dien 3-ol (fig. 5C) son sustrato del
citocromo P_{450}SCC y conducen a un producto que tiene un TR
idéntico al de la pregnenolona obtenida en las mismas condiciones
por escisión del colesterol.
Los resultados obtenidos muestran que una
levadura transformada que expresa la delta-7Red
acumula esteroles utilizables directamente para preparar la
pregnenolona por oxidación biológica in vitro.
La construcción del plásmido pADA7 ha sido
dirigida como se describe en la figura 6. El fragmento BglII
(2244pb) que contiene el gen ADE2 de S. cerevisiae se ha
aislado del plásmido pASZ 11 (A. Stotz et al., gen, 95, 91,
1990) y se ha insertado en el vector pBluescriptII KS+ (Stratagen)
en el sitio BamHI del sitio de clonación múltiple.
El plásmido obtenido, denominado
pBS-ADE2, ha sido linealizado a continuación en su
sitio Stu I único y desfosforilado.
Un fragmento de 2,44 kb aproximadamente que
contiene el promotor GAL10/CYC1, la fase codificadora de la
delta-7Red (esterol \Delta7 reductasa) y el
terminador PGK (tPGK) ha sido obtenido a partir del plásmido
delta-7/V8, obtenido en el ejemplo 1F por la
técnica de PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos
siguientes
| 5' GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3' | (SEQ ID Nº 6) |
y
| 5' AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3' | (SEQ ID Nº 7) |
que han sido definidos para aparearse
respectivamente con el extremo 3' de tPGK y el extremo 3' del gen
URA3. Se ha utilizado el plásmido delta-7/V8 como
matriz (80 ng), los oligonucleótidos anteriores (0,5 \muM cada
uno), la Pfu DNA polimerasa nativa (1 unidad en el tampón
recomendado por Stratagen) y las condiciones de amplificación
siguientes: 35 ciclos; 1 min a 95ºC; 5 s a 95ºC; 30 s a 56ºC; 4 min
30 s a 70ºC). El fragmento de amplificación obtenido se ha clonado
a continuación con extremos romos en el plásmido
pBS-ADE2 linealizado anteriormente para dar el
plásmido pADA7 en el cual el fragmento NotI-PstI de
4720 pb aproximadamente lleva el gen ADE2 interrumpido por la
casete de expresión de la delta-7Red.
El fragmento NotI-PstI( 4720
bp), aislado a partir del plásmido pAD\Delta7 digerido con las
enzimas de restricción NotI y PstI, ha sido introducido en la
levadura FY1679 Mata por transformación utilizando el método del
acetato de litio descrito por D. Gietz et al. (ya
citado).
Los transformantes que tienen integrado este
fragmento por recombinación homóloga han sido seleccionados por su
resistencia a la nistatina, siendo debido este fenotipo a la
expresión de la delta-7Red que convierte los
delta-5,7 esteroles de la levadura en
delta-5 esteroles.
Las células transformadas han sido incubadas a
28ºC durante 4 horas en medio completo YP descrito en el ejemplo 1F
que contiene glucosa (20 g/l) y suplementado con adenina (20 mg/l).
Estas células se concentran a continuación, y después se extienden
sobre un medio mínimo SLI-agar (1 g/l de
bactocasaminoácidos; 7 g/l de "base de nitrógeno para
levaduras"; 20 g/l de galactosa; 20 mg/l de adenina; 20 g/l de
agar) y se incuban durante una noche a 28ºC para inducir la
expresión del gen de la delta-7Red. La ausencia de
complementación de uracilo permite limitar el crecimiento de las
células. Los clones han sido recuperados, agrupados y después
extendidos en placas sobre un medio completo YP que contiene
galactosa (20 g/l), suplementado con adenina (20 mg/l) y en
presencia de concentraciones crecientes de nistatina (0 \mug/ml, 1
\mug/ml, 2 \mug/ml, 5 \mug/ml, 20 \mug/ml respectivamente).
El 4º día, se han obtenido una veintena de clones que han llegado
hasta la concentración de 5 \mug/ml de nistatina. Doce de estos
clones han sido repetidos sobre las placas en medio mínimo WO (7
g/l de "base de nitrógeno para levaduras" sin aminoácidos, 20
g/l de glucosa) enriquecido en uracilo, leucina, triptófano,
histidina y adenina (20 mg/l cada uno).
La auxotrofia para la adenina debida a la rotura
del gen ADE2 se ha confirmado a continuación observando la ausencia
de crecimiento sobre el medio mínimo WO descrito anteriormente
enriquecido en uracilo, leucina, triptófano, histidina pero
desprovisto de adenina.
La presencia de la casete de expresión en el
genoma de la levadura ha sido controlada por amplificación por PCR
a partir del ADN genómico de los clones obtenidos y utilizando los
cebadores que tienen las secuencias SEQ ID Nº 6 y SEQ ID Nº 7
anteriores.
La funcionalidad del gen
delta-7Red integrado ha sido confirmada por el
análisis por CPG de la composición de esteroles acumulados en la
levadura y extraídos por saponificación alcalina según el modo
operatorio descrito en el ejemplo 1B con una columna capilar SE 30
de cinco metros (Alltech). El análisis muestra un perfil modificado
que comprende los esteroles saturados en C-7 cuando
los clones se cultivan en presencia de galactosa. La cepa obtenida,
denominada ELR01, acumula el ergosta 5 en 3-ol y el
ergosta 5,22 dien 3-ol en lugar de ergosta 5, 7, 22
trien 3-ol (ergosterol), esterol mayoritario de la
cepa FY1679 inicial como se muestra en la figura 7.
La cepa ELR01 así construida expresa el gen de
la delta-7Red cuando se cultiva en presencia de
galactosa debido al hecho del control transcripcional por el
promotor GAL10/CYC1. Aunque la unidad de expresión para la
delta-7Red tenga el mismo sentido de transcripción
que el gen ADE2, ninguna expresión de la delta-7Red
es detectable por análisis de la composición en esteroles por CPG
cuando se realiza el cultivo en presencia de glucosa, a
consecuencia de la represión del promotor GAL10/CYC1.
El vector V13 corresponde al vector V8 (C.
Cullin et al., ya citado) que lleva el marcador de selección
URA3 y una casete de expresión en la levadura que contiene el
promotor GAL10/CYC1 (pG/C) y en el cual un sitio SalI (Sa)
suplementario ha sido introducido en el sitio de clonación múltiple,
según el esquema de construcción dado en la figura 8.
El vector V8 ha sido digerido por las enzimas de
restricción HindIII y BamHI y el fragmento
BamHI-HindIII obtenido (1722 pb) que contiene el gen
URA3 y el promotor GAL10/CYC1 (indicado más adelante como
"ura-gal"), ha sido sub-clonado
entre los sitios correspondientes del vector pUC18 (Pharmacia)
digerido por las enzimas de restricción HindIII y BamHI.
El fragmento "ura-gal" ha
sido amplificado a continuación por PCR a partir de 30 ng del
plásmido obtenido pUC18/"ura-gal"
desnaturalizado durante 30 s a 95ºC utilizando las siguientes
condiciones: 30 ciclos; 5 s a 86ºC; 10 s a 95ºC; 40 s a 38ºC; 5 s a
55ºC y 2 min a 74ºC), 2 unidades de Taq DNA polimerasa (Boehringer)
en el tampón del fabricante y concentración 1 \muM de cada uno de
los cebadores que tienen las siguientes secuencias
nucleotídicas:
| 5' GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3' | (SEQ ID Nº 8) |
y
| 5' GTAAAACGAC GGCCAGT 3' | (SEQ ID Nº 9) |
El cebador SEQ ID Nº 8 contiene un sitio BamHI
GGATCC idéntico al del fragmento "ura-gal", 3
nucleótidos consecutivos en el sitio BamHI que no se hibridan a la
matriz, un sitio SalI GTCGAC y una secuencia homóloga a la del
promotor GAL10/CYC1. El cebador SEQ ID Nº 9 se aparea con la
secuencia que precede al sitio Hind III del sitio de clonación
múltiple de pUC18. El fragmento HindIII-BamHI de
1722 pb obtenido después de amplificación ha sido digerido por XhoI
y Bam HI liberando un fragmento de 254 pb que contiene el promotor
GAL10/CYC1 (pG/C) que ha sido sub-clonado a
continuación en el vector V8 digerido por las enzimas de restricción
BamHI y XhoI.
El vector V13 resultante contiene los sitios de
restricción que permiten sub-clonar fácilmente los
ADNc que codifican la adrenodoxina reductasa bovina madura (ADRm),
la adrenodoxina bovina madura (ADXm) y el citocromo P_{450}SCC
bovino.
A partir del vector V13, se han preparado
respectivamente el vector V13-ADR, el vector
V13-ADX y el vector V13-SCC10 de la
forma siguiente:
- \quad
- Un fragmento SalI-KpnI de 1478 pb que lleva el ADNc que codifica ADRm ha sido aislado del plásmido pGBADR-2 descrito en el ejemplo 25 de la solicitud de patente europea EP 340878 y ha sido sub-clonado en los sitios correspondientes del vector V13 para dar el vector V13-ADR.
- \quad
- Un fragmento SalI BamHI de 390 pb que lleva el ADNc que codifica ADXm ha sido aislado del plásmido pGBADX-1 descrito en el ejemplo 23 de la solicitud de patente europea EP 340878 y ha sido sub-clonado en los sitios correspondientes del vector V13 para dar el vector V13-ADX.
- \quad
- Un fragmento SalI-EcoRI de 1554 pb que lleva el ADNc que codifica P_{450}SCC ha sido aislado del plásmido pGBSCC-10 descrito en el ejemplo 6 de la solicitud de patente europea EP 340878 y ha sido sub-clonado en los sitios correspondientes del vector V13 para dar el vector V13-SCC10.
La construcción de los plásmidos
pCD62-1 y pCD62-2 ha sido dirigida
como se describe en la figura 9.
Un sitio NotI ha sido introducido en el plásmido
pFL26 (N. Bonneaud et al., Yeast, 7, 609-615,
1991), en la región intergénica que separa el gen leu2 del extremo
5' del gen spl1 (señalado como spll\Delta) (C. Kolman et
al., J. Bacteriol., 175, 1433, 1993) según el modo operatorio
siguiente:
Dos fragmentos de ADN de 704 pb y 347 pb que
llevan respectivamente el extremo 5' de leu2 y el extremo 3' de
Spll\Delta han sido sintetizados por PCR con ayuda de cebadores
que tienen las siguientes secuencias nucleotídicas:
| 5' TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3' | (SEQ ID Nº 10) |
y
| 5' GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3' | (SEQ ID Nº 11) |
para la amplificación del fragmento de 704 pb y
las secuencias nucleotídicas
\vskip1.000000\baselineskip
| 5' CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3' | (SEQ ID Nº 12) |
y
| 5' TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3' | (SEQ ID Nº 13) |
para la amplificación del fragmento de 347
pb.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores SEQ ID Nº 11 y SEQ ID Nº 12 poseen
una secuencia GGCGGCCG que corresponde a un sitio NotI y en la que
3 bases no se aparean con la matriz. El cebador SEQ ID Nº 10 se
aparea con una secuencia situada 536 pb corriente arriba del codón
de terminación de leu2 y el cebador SEQ ID Nº 13 tiene una secuencia
situada 194 pb corriente arriba del de spll\Delta.
Los fragmentos de 704 pb y de 347 pb son en
primer lugar amplificados por PCR utilizando como matriz el plásmido
pFL26 y como enzima la Pfu DNA polimerasa en las condiciones
estándar descritas por el proveedor (Stratagen).
Los dos fragmentos amplificados obtenidos se
aparean sobre 20 pb al nivel de los extremos generados por el
cebador SEQ ID Nº 11 (fragmento 704 pb) y el cebador SEQ ID Nº 12
(fragmento 347 pb) a partir del extremo 5'; estos 20 pb
corresponden respectivamente a los 20 primeros nucleótidos de cada
uno de estos cebadores.
El producto resultante del apareamiento de los
fragmentos de ADN de 704 pb (1 ng) y de 347 pb (2 ng) ha sido
amplificado utilizando los cebadores SEQ ID Nº 10 y SEQ ID Nº 13 y
las condiciones siguientes: 30 ciclos de 10 s a 95ºC, 5 s a 60ºC, 1
min a 45ºC, 5 s a 65ºC y 2 min a 72ºC seguidos de un ciclo de 7 min
a 72ºC; 50 pmol de cada cebador y 1 unidad de Pfu DNA polimerasa en
50 \mul de tampón de reacción (Stratagen). Se ha obtenido un
fragmento amplificado de 1031 pb que contiene un sitio de corte
NotI. Este fragmento ha sido digerido a continuación por las
enzimas BstXI y NsiI y el fragmento de 920 pb obtenido, que contiene
el sitio NotI, ha sido insertado en el lugar del fragmento
BstXI-NsiI inicial de pFL26 para dar el plásmido
pFL26CD, cuya carta se representa en la figura 9a.
- preparación del plásmido pDP10036:
Un fragmento SalI-BamHI de 390
pb que lleva el ADNc que codifica la adrenodoxina bovina madura
(ADXm) se ha aislado del plásmido V13-ADX y después
se ha sub-clonado en los sitios
SalI-BglII del sitio de clonación múltiple del
plásmido pTG10033 que está flanqueado por el promotor inducible
GAL10/CYC1 y por el terminador ter PGK. El plásmido pTG10033, cuya
carta está representada en la figura 18 y que corresponde al vector
de expresión pTG10031 (figura 17), que contiene el promotor CYC1 y
terPGK, en el cual el promotor CYC1 ha sido reemplazado por el
promotor GAL10/CYC1 se ha preparado según el modo operatorio
descrito más adelante.
El plásmido así obtenido, denominado pDP10034,
lleva la casete de expresión ADX, es decir el gen que codifica ADXm
bajo el control transcripcional de GAL10/CYC1 y terPGK. A
continuación, el término "casete de expresión" será empleado
para todo gen bajo la dependencia transcripcional de GAL10/CYC1 y
terPGK.
Un fragmento HindIII de 3593 pb que lleva el
marcador de selección URA3 y la casete de expresión ADR se ha
aislado a partir del plásmido V13-ADR digerido por
la enzima de restricción HindIII y después se ha insertado en el
sitio correspondiente del plásmido pDP10034 digerido por la enzima
de restricción HindIII. El plásmido obtenido, denominado pDP10036,
contiene las casetes de expresión ADX y ADR separadas una de la otra
por el marcador URA3 (figura 9b).
- Preparación del plásmido pCD60:
El fragmento AflIII-AccI de 2770
pb que lleva la casete ADR se ha aislado por digestión parcial del
plásmido pDP10036 con las enzimas de restricción AflIII y AccI, los
extremos se han hecho romos por tratamiento con el fragmento de
Klenow de la ADN polimerasa I y se ha subclonado después de
ligamiento de los extremos romos en el sitio SmaI del plásmido
pBlue-Script KS+ (Stratagen). En el plásmido
obtenido, denominado pCD60, la casete de expresión ADR está
encuadrada de una y otra parte de un sitio NotI, situándose una
parte a 209 pb corriente arriba del sitio de unión AflIII/SmaI y
procedente del fragmento subclonado y la otra parte procedente del
sitio de clonación múltiple (SCM1) de pBlue-Script
KS+ (figura 9b).
El fragmento NotI de 2558 pb, aislado a partir
del plásmido pCD60 digerido por la enzima de restricción NotI, se
ha subclonado a continuación en el sitio único NotI del plásmido
pFL26CD. Según el sentido de la inserción del fragmento, se han
obtenido dos plásmidos, denominados pCD62-1 y
pCD62-2 (figura 9c).
En el plásmido pCD62-1, la
casete de expresión ADR está orientada en el sentido de la
transcripción del gen leu2 mientras que esta orientación está
invertida en el plásmido pCD62-2.
El plásmido pCD62-1 ha sido
retenido para las construcciones posteriores.
El plásmido pCD62-1 contiene
regiones homólogas en un locus cromosómico de la cepa FY1679. Estas
regiones corresponden respectivamente a los fragmentos
BglII-ClaI de 1060 pb (A),
EcoRI-NotI de 707 pb(B) y
NotI-BglII de 602 pb (C) indicados en la figura
10.
La región correspondiente al fragmento
ClaI-EcoRI de 486 pb del plásmido
pCD62-1 ha sido suprimida en la cepa FY1679, lo que
implica una auxotrofia de esta cepa frente a la leucina (cepa
LEU2^{-}) (R. S. Sikorski et al., Genetics, 122, 19,
1989).
El plásmido pCD62-1 ha sido
linealizado por digestión con la enzima de restricción XbaI cuyo
sitio de corte está situado en el exterior de las regiones
homólogas, después se ha introducido por transformación en la cepa
FY1679 (Matalpha) utilizando el método del acetato de litio (D.
Gietz et al., ya citado).
La capacidad de reparación celular del ADN por
la levadura ("gap repair") y la selección de recombinantes que
tienen el fenotipo LEU2^{+} han permitido seleccionar en un primer
tiempo dos tipos de recombinantes: el 1er tipo se obtiene después
de recombinaciones homólogas al nivel de los fragmentos A y B, el 2º
tipo se obtiene después de recombinaciones homólogas al nivel de
los fragmentos A y C. Sólo este último tipo de recombinación ha
permitido la integración de la casete de expresión ADR además de la
restauración del fenotipo LEU2^{+}.
Para seleccionar este 2º tipo de clon, se ha
realizado un cribado por PCR utilizando el cebador SEQ ID Nº 10
anterior y el cebador que tiene la secuencia nucleotídica
siguiente:
| 5' TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3' | (SEQ ID Nº 14) |
de forma que se confirme a la vez la presencia y
la localización correcta de la casete de expresión ADR en el genoma
de la cepa FY1679 (Matalpha).
En este cribado, el cebador SEQ ID Nº 14 se
aparea exclusivamente con la secuencia codificadora de ADRm y el
cebador SEQ ID Nº 10 se aparea con una secuencia cromosómica (figura
10).
La reacción de amplificación se ha realizado
utilizando como matriz el ADN genómico (20 ng) aislado de la cepa
FY1679 (Matalpha) (C. Hoffman et al., Gene, 57, 267, 1987),
la Taq DNA polimerasa (1U, Boehringer), 50 pmol de cada cebador y
30 ciclos de PCR (10 s a 95ºC, 1 min a 55ºC, 3 min a 72ºC) en las
condiciones estándar descritas por el proveedor.
La amplificación ha llevado al aislamiento de un
fragmento de 2,9 kb correspondiente al caso en que la casete de
expresión ha sido integrada. En el caso contrario, ningún producto
de amplificación ha sido detectado.
La cepa FY1679 (Matalpha) así seleccionada que
contiene la casete de expresión ADR integrada ha sido denominada
CDR01.
\newpage
La expresión de ADR por esta cepa ha sido puesta
en evidencia a partir de fracciones celulares citosólicas
preparadas según el protocolo descrito en el ejemplo 1F, por
inmunodetección de la proteína reconocida por los anticuerpos
anti-ADR.
La funcionalidad de la ADR expresada por la cepa
CDR01 ha sido confirmada en el ensayo de escisión enzimática de la
cadena lateral del colesterol in vitro descrito en el ejemplo
3 y en el cual la ADR purificada (0,28 pmol) ha sido reemplazada
por una fracción celular citosólica de la cepa CDR01 que contiene
100 \mug de proteínas totales. Se ha observado una tasa de
bioconversión del colesterol en pregnenolona de aproximadamente
25%, comparable a la obtenida con la ADR purificada.
La cepa diploide EC01 se ha obtenido por
crecimiento de las cepas haploides CDR01 y ELR01 obtenidas
anteriormente según el protocolo descrito por G. Sprague et
al. (Methods in Enzymology, 194, 77, 1991):
Una primera selección sobre medio mínimo WO
descrito precedentemente, enriquecido en uracilo, triptófano e
histidina (20 mg/l de cada uno) pero desprovisto de leucina, ha
permitido aislar los clones diploides LEU2^{+} (carácter de
prototrofia que atestigua la presencia de la casete de expresión
ADR). A continuación se han ensayado estos clones en cuanto a su
resistencia a la nistatina a 5 \mug/ml (carácter de resistencia
que atestigua la presencia de la casete de expresión de la
delta-7Red) sobre el medio sintético sólido
SLI-agar descrito precedentemente.
Una cepa, denominada EC01, ha sido aislada así
arbitrariamente entre los clones resistentes a la nistatina.
La construcción del plásmido pCD63 ha sido
realizada como se describe en la figura 11.
El fragmento NotI de 4961 pb que contiene la
casete de expresión ADX, el marcador de selección URA3 y la casete
de expresión ADR se ha aislado a partir del plásmido pDP10036
preparado anteriormente y digerido con la enzima de restricción
NotI y después clonado en el sitio NotI del sitio de clonación
múltiple del plásmido pFL45L (N. Bonneaud et al., Yeast, 7,
609, 1991). El vector así obtenido, denominado pDP10037 está
representado en la figura 11.
Por una parte, el plásmido pDP10037 ha sido
linealizado por digestión con la enzima Tth111I cuyo sitio de corte
se sitúa en el gen que codifica ADRm.
Por otra parte, un fragmento
PvuII-EcoRV de 3476 pb que contiene la casete de
expresión P_{450}SCC y el extremo 5' del marcador URA3 ha sido
purificado a partir del plásmido V13-SCC10 obtenido
precedentemente y digerido con las enzimas de restricción PvuII y
EcoRV.
Los dos ADN lineales respectivamente obtenidos
tienen regiones homólogas que corresponden por una parte al extremo
5' del gen URA3 y a GAL10/CYC1, por otra parte a ter PGK como está
representado en la figura 11a.
Estos dos fragmentos se han introducido a
continuación en la cepa de levadura FY1679 (Mata) por
co-transformación por el método del acetato de
litio (D. Gietz et al., ya citado).
La selección siguiente de recombinantes
prototrofos para el uracilo y el triptófano (URA3^{+},
TRP1^{+}), ha permitido aislar clones en los que la rotura de la
doble hebra generada por digestión por la enzima de restricción
Tth111I ha sido reparada a consecuencia de la integración de la
casete de expresión P_{450}SCC por recombinación homóloga.
La selección de los recombinantes (URA3^{+},
TRP1^{+}) se ha realizado sobre el medio mínimo WO enriquecido en
leucina, histidina y leucina (20 mg/l de cada una) pero desprovisto
de uracilo y de triptófano. A partir de 50 clones reunidos, se ha
extraído el ADN total por el método descrito por C. Hoffman et
al., (Gene, 57, 267, 1987), y después se ha introducido por
electroporación en la cepa de E. coli
XL1-Blue (Stratagen). Los clones transformados por
el plásmido generado por "gap repair" se han seleccionado sobre
el medio rico LB (triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%,
NaCl al 1%) que contiene 50 mg/l de ampicilina. A partir de uno de
los clones seleccionados, el plásmido, denominado pCD63, se ha
extraído según el método descrito por J. Sambrook et al.,
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. El
plásmido pCD63 obtenido contiene las casetes de expresión ADX y
P_{450}SCC separadas por el marcador de selección URA3, como se
representa en la figura 11b.
El plásmido pCD63 se ha introducido en la cepa
EC01 obtenida anteriormente por transformación por el método del
acetato de litio (D. Gietz et al., ya descrito). La levadura
transformada se ha cultivado a continuación sobre el medio mínimo
WO descrito precedentemente y desprovisto de uracilo, de triptófano,
de adenina y de leucina pero suplementado con histidina (20
mg/l).
Se ha aislado así la cepa, denominada
EC01/pCD63. Una muestra de la cepa, bajo la referencia EC01/pCD63,
ha sido depositada en la CNCM el 10 de febrero de 1995 con el
número I-1538.
Se ha cultivado la cepa EC01/pCD63 a 28ºC en
aerobiosis (130 t/min) en un Erlenmeyer de 3 litros hasta que
alcanza la fase estacionaria de crecimiento (DO600 = 12 a 13) en el
medio selectivo SGI descrito en el ejemplo 1A y en el cual la
concentración en glucosa es de 5 g/l. Se ha diluido a continuación
el cultivo por adición de un volumen del medio completo YP descrito
anteriormente, y después adición de etanol (0,5% v/v) como fuente de
carbono. Cuando se ha alcanzado una nueva fase estacionaria de
crecimiento (DO600 = 12 a 13), se añade al cultivo galactosa (20
g/l), en forma de solución concentrada (500 g/l), para inducir
simultáneamente la expresión de los genes que codifican ADXm, ADRm,
P_{450}SCC y delta-7 Red que están respectivamente
bajo el control del promotor GAL10/CYC1.
La co-expresión de los cuatro
genes ha sido puesta en evidencia por análisis de los esteroles
acumulados respectivamente en las células y en el sobrenadante del
cultivo según el siguiente modo operatorio:
Se recogen muestras de 50 ml de cultivo después
de 9 h y 24 h de inducción. Se centrifuga cada muestra (4000 g, 10
min, 4ºC) para separar las células del medio de cultivo.
Por una parte, se lisan las células por
pulverización mecánica en presencia de perlas de vidrio según el
método indicado en el ejemplo 1F. A partir del lisado así obtenido,
se extraen a continuación los esteroles intracelulares por adición
de un volumen de hexano.
Por otra parte, los esteroles presentes en el
medio de cultivo se extraen directamente por adición de un volumen
de hexano.
La composición de los esteroles extraídos se
analiza por CPG como se indica en el ejemplo 1, en comparación con
los productos estándar.
Los resultados obtenidos después de 9 horas o
después de 24 horas de inducción se muestran respectivamente en la
figura 12a y en la figura 12b.
Después de 9 horas de inducción, la figura 12a
muestra:
- \bullet
- en el lisado celular, la presencia de un compuesto mayoritario que tiene un tiempo de retención idéntico al del acetato de pregnenolona estándar (TR = 11,8 mn) mientras que solamente un pico muy débil está presente en el tiempo de retención de la pregnenolona (TR = 9,9 mn). Cantidades pequeñas de esteroles endógenos de la levadura reducidos en C-7 (ergosta 5-en 3-ol y ergosta 5,22 dien 3-ol) son identificadas respectivamente a TR = 18 mn y TR = 17 mn. La saponificación alcalina del lisado celular antes del análisis lleva a la presencia de un compuesto mayoritario que migra conjuntamente con la pregnenolona. Esto permite confirmar que el compuesto acumulado que tiene un TR de 11,8 mn corresponde al acetato de pregnenolona.
- \bullet
- en el medio de cultivo, la ausencia significativa de pregnenolona o de su acetato.
Después de 24 horas de inducción, la figura 12b
muestra:
- \bullet
- en el lisado celular, la presencia de pequeñas cantidades de pregnenolona (TR = 10,2 mn) y de acetato de pregnenolona (TR = 12 mn) así como de esteroles endógenos de la levadura reducidos (TR = 17 mn y TR = 18 mn). El colesterol (TR = 16,2 min) es un estándar interno añadido antes de la extracción.
- \bullet
- en el medio de cultivo, la presencia mayoritaria de acetato de pregnenolona y de una cantidad menor de pregnenolona.
Experimentos realizados en paralelo con la cepa
EC01 transformada por un plásmido control tal como pFL45L ya citado,
no han mostrado ningún pico correspondiente a la pregnenolona libre
o en forma acetato.
La identificación de los esteroles así realizada
muestra que la cepa de levadura EC01/pCD63 ha acumulado la
pregnenolona y el acetato de pregnenolona en ausencia de toda fuente
de esteroles exógenos, después de inducción en presencia de
galactosa con una producción mayor después de una inducción de 9
horas.
Estos resultados demuestran por una parte la
movilización eficaz de los esteroles endógenos reducidos en la
posición C-7 de la cepa EC01 y por otra parte la
extrema eficacia de acoplamiento de la reacción de corte de la
cadena lateral de los esteroles endógenos.
El vector de clonación M13mp19 (C.
Yanish-Peron et al., Gene, 33, 103, 1985) ha
sido mutagenizado utilizando el siguiente oligonucleótido
| 5' GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3' | SEQ ID Nº 15 |
para introducir un sitio NotI en la secuencia
del gen lacI truncado y dar el plásmido M13TG724.
\vskip1.000000\baselineskip
Un "polilenlazador" que contiene los sitios
EcoRI, SnaBI y NotI se ha introducido a continuación en el sitio
EcoRI del plásmido M13TG724 utilizando los siguientes
oligonucleótidos
| 5' AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3' | SEQ ID Nº 16 |
y
| 5' AATTCATACG TACGCGGCCG C 3' | SEQ ID Nº 17 |
para dar el plásmido M13TG7244 en el cual se ha
observado una modificación del inserto durante la fase de
amplificación. El inserto del plásmido M13TG7244 tiene la secuencia
nucleotídica siguiente
GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT
en la que los sitios EcoRI, SnaBI y NotI están
señalados y la secuencia lacZ de pUC19 está en cursiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de digestión del plásmido M13TG7244 por
las enzimas de restricción EcoRI y SstI, se ha introducido un
"polienlazador" que contiene los sitios MluI y AvrII utilizando
los siguientes oligonucleótidos
| 5' CAACGCGTCC TAGG 3' | SEQ ID Nº 18 y |
| 5' AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3' | SEQ ID Nº 19. |
Después de digestión con la enzima PvuII, el
fragmento PwII obtenido ha sido subclonado en pUC19 (C.
Yanish-Perron et al. ya citado) para dar el
plásmido pTG7457 (figura 13).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha digerido el pUC19 con las enzimas de
restricción BamHI y EcoRI y se ha introducido un nuevo
"polienlazador" BamHI SstI utilizando los oligonucleótidos
siguientes
| 5' GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3' | SEQ ID Nº 20, |
| 5' AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3' | SEQ ID Nº 21, |
| 5' CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 3' | SEQ ID Nº 22 |
y
| 5' AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3' | SEQ ID Nº 23. |
El plásmido pTG7453 se ha obtenido así (figura
14) y después se ha digerido a continuación por las enzimas de
restricción BamHI y SstI. Los sitios del "polienlazador" entre
BamHI y SstI se han introducido en un derivado del plásmido pTG7457
obtenido anterior y se han digerido por las enzimas de restricción
BamHI y SstI. El nuevo plásmido obtenido contiene los sitios PvuII,
HindIII, BamHI, EcoRI, XbaI, SmaI, BglII, SstI (=SacI), MluI, AvrII,
EcoRI, SnaBI, NotI, SnaBI, PvuI.
Este nuevo plásmido se ha digerido por las
enzimas de restricción BglII y HindIII y se ha insertado en éste un
fragmento BglII-HindIII que contiene el promotor PGK
(R. A. Hitzeman et al., Nucleic Acids Res., 10, 7791, 1982;
G. Loison et al., Yeast, 5, 497, 1989) para dar el plásmido
pTG10014 (figura 15).
Los sitios del "polienlazador" entre BamHI
y SstI del plásmido pTG7453 han sido introducidos en un derivado
del plásmido pTG7457 como se ha indicado anteriormente. El nuevo
plásmido obtenido ha sido escindido por la enzima de restricción
SnaBI, y después se ha introducido el fragmento
RsaI-DraI de 456bp del plásmido pEMBL8 (L. Dente
et al., Nucleic Acid Res., 11, 1645, 1983) que contiene el
origen de replicación del fago f1 para dar el plásmido pTG7503.
El fragmento BamHI HindIII de 0,78 kb del
plásmido pGBSCC-9, preparado en el ejemplo 6 de la
solicitud de patente europea EP 0340378 y que contiene el promotor
CYC1 de S. cerevisiae, un "polienlazador" y el
terminador lactasa de K. lactis, ha sido
sub-clonado en el plásmido pTG7503 digerido con las
enzimas de restricción HindIII y BamHI para dar el plásmido
pTG10004 (figura 16).
Los sitios XhoI y MluI del promotor CYC1 se han
eliminado a continuación por mutagénesis dirigida del ADN de doble
hebra del plásmido pTG10004 utilizando el siguiente
oligonucleótido
| 5' GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3' | SEQ ID Nº 24. |
El plásmido pTG10005 así obtenido se ha digerido
a continuación por las enzimas de restricción SalI y XhoI y después
se ha introducido un sitio MluI utilizando los siguientes
oligonucleótidos
| 5' TCGACGGACG CGTGG 3' | SEQ ID Nº 25 |
y
| 5' TCGACCACGC GTCC 3' | SEQ ID Nº 26 |
para dar el plásmido pTG10006.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pYeDP1/8-2 (C.
Cullin et al., Gene, 203, 1988) ha sido abierto con la enzima
de restricción XhoI. Los extremos cohesivos creados se han llenado
con ayuda del fragmento de Klenow de la ADN polimerasa y después se
ha realizado de nuevo la ligadura del plásmido. El plásmido pTG10010
así obtenido en el cual el promotor GAL10/CYC1 no contiene el sitio
XhoI se utiliza como matriz para una amplificación por PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
La parte restante de la secuencia codificadora
de lacZ ha sido eliminada en el plásmido pTG7503 por mutagénesis
dirigida utilizando el siguiente oligonucleótido
| 5' TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3' | SEQ ID Nº 27 |
para dar el plásmido pTG7549.
El promotor LacZ presente en el plásmido pTG7549
ha sido delecionado a continuación utilizando los siguientes
oligonucleótidos
| 5' GGCCGCAAAA CCAAA 3' | SEQ ID Nº 28 |
| 5' AGCTTTTGGT TTTGC 3' | SEQ ID Nº 29 |
que se insertan en el plásmido previamente
digerido por las enzimas de restricción NotI y HindIII y que
restauran los dos sitios para dar el plásmido pTG7553.
Un fragmento BamHI MluI que contiene el promotor
CYC1 ha sido obtenido a partir del plásmido pTG10006 digerido por
las enzimas de restricción BamHI y MluI y un fragmento MluI HindIII
que contiene el promotor PGK ha sido aislado a partir del plásmido
pTG10015 digerido por las enzimas de restricción MluI y HindIII.
Estos dos fragmentos han sido ligados y el producto de la ligadura
obtenido se ha insertado en el plásmido pTG7553 previamente digerido
por las enzimas de restricción MluI y HindIII.
El siguiente oligonucleótido
| 5' GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3' | SEQ ID Nº 30 |
hibridado con el siguiente oligonucleótido
| 5' CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3' | SEQ ID Nº 31, |
que constituye un "enlazador" BamHI MluI
que contiene los sitios ClaI y NotI, se ha añadido y ligado para dar
el vector de expresión pTG 10031 (figura 17).
El fragmento amplificado por PCR obtenido
anteriormente a partir del plásmido pYeDP1/8-2 ha
sido digerido con las enzimas de restricción ClaI y SalI y después
ha sido introducido en el plásmido pTG10031 previamente digerido con
las mismas enzimas de restricción para dar el plásmido pTG10033
(figura 18).
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: ROUSSEL UCLAF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 102, Route de Noisy
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ROMAINVILLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 93230
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 49.91.49.91
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 49.91.46.10
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencia de ADN que codifica una proteína de A. thaliana que tiene una actividad delta-5,7 esterol-delta-7 reductasa, proteína delta-7Red, procedimiento de producción, cepas de levaduras transformadas, aplicaciones.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 31
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30 (OEB)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: FR 9501723
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO: 15-FEB-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: FR 9506517
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO: 01-JUN-1995
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1496 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Arabidopsis thaliana
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 76..1365
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 430 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO:7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota = "residuo 7 = Trp o Tyr"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota = "residuo 12 = His o Lys"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 10..29
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota = "SECUENCIA ID No 1 DE 76 A 95"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (10..28)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: /nota = "SECUENCIA ID No 1 COMPLEMENTARIA DE 1350 A 1368"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..23)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..17)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAAAACGAC GGCCAGT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..38)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..25)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..20)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACATTAGGT CCTTTGTAGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTGCGGCC GCGTACGTAT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..21)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCATACG TACGCGGCCG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAACGCGTCC TAGG
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..22)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..39)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..28)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGACGGACG CGTGG
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..14)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGACCACGC GTCC
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGCAAAA CCAAA
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..15)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTTTGGT TTTGC
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCTATCGA TGCGGCCGCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: Sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_característica
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: complemento (1..20)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGCGCGGC CGCATCGATA
\hfill20
Claims (32)
1. Una secuencia de ácido nucleico que contiene
una secuencia que codifica una proteína que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa, que
presenta una identidad de secuencia de aproximadamente 60% y más
con la secuencia SEQ ID Nº 1.
2. La secuencia de ácido nucleico según la
reivindicación 1, en la que el ácido nucleico es un ADN o un
ARN.
3. La secuencia de ADN según la reivindicación
1, en la que la secuencia codificadora codifica una proteína de
A. thaliana que tiene una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y que
tiene la secuencia nucleotídica de la secuencia SEQ ID Nº 1.
4. Una secuencia de ADN que codifica una
proteína que tiene una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y que es
amplificable por la técnica de PCR utilizando como cebadores los
oligonucleótidos que codifican una secuencia de consenso que tiene
la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 3:
en la que Xaa en la posición 7 es
Trp o Tyr y Xaa en la posición 12 es His o Lys asociados a un
cebador oligo
dT.
5. Una proteína de A. thaliana que tiene
una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y que
tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2.
6. La proteína que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa que tiene
una secuencia de aminoácidos que presentan una identidad de
secuencia de aproximadamente 60% y más con la secuencia SEQ ID Nº
2.
7. La proteína que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa tal como
la obtenida por expresión en una célula hospedadora que contiene una
secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4.
8. La proteína de A. thaliana que tiene
una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa tal como
la obtenida por expresión en una célula hospedadora que contiene una
secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº
2.
9. La proteína según la reivindicación 7 o la
reivindicación 8, en la que la célula hospedadora es una
levadura.
10. Un anticuerpo dirigido contra una proteína
que tiene una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa según una
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.
11. Un vector de expresión que contiene una
secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4.
12. La célula hospedadora transformada por un
vector según la reivindicación 11.
13. El procedimiento de clonación de un ácido
nucleico que codifica una proteína que tiene una actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa en un
microorganismo que comprende un método de cribado elegido entre:
- -
- la resistencia del microorganismo a la nistatina o a un compuesto análogo cuya toxicidad depende de la presencia de esteroles que tienen una insaturación en la posición C-7,
- -
- la hibridación del ácido nucleico con la secuencia nucleotídica de la secuencia SEQ ID Nº 1.
14. La célula hospedadora transformada según la
reivindicación 12, en la que la célula hospedadora es una levadura o
un hongo filamentoso.
15. Un procedimiento de preparación de una
proteína que tiene una actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa, en el que
se cultiva una célula hospedadora transformada según una cualquiera
de las reivindicaciones 12 o 14 y se aísla la proteína
expresada.
16. El procedimiento según la reivindicación 15,
en el cual la célula hospedadora es una levadura transformada en la
que la secuencia de ADN codificadora está puesta bajo el control de
un promotor de levadura.
\newpage
17. Un procedimiento de reducción in
vitro de un esterol insaturado en la posición
C-7, en el que se incuba el esterol a reducir con la
proteína obtenida según la reivindicación 15 o la reivindicación 16
y se aísla eventualmente el esterol reducido obtenido.
18. Un procedimiento de reducción in vivo
de un esterol exógeno insaturado en la posición C-7,
en el que se incuba el esterol con una célula hospedadora
transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14 y
se aísla eventualmente el esterol 10 reducido obtenido.
19. El procedimiento de reducción in vivo
de un esterol endógeno insaturado en la posición
C-7, en el que se cultiva una cepa hospedadora
transformada según la reivindicación 14 y se aísla eventualmente el
esterol reducido acumulado.
20. El procedimiento de reducción in
vitro o in vivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, en el que el esterol reducido obtenido es
un sustrato de la enzima de escisión de la cadena lateral del
colesterol (P_{450}SCC).
21. El procedimiento de reducción in vivo
según la reivindicación 20, en el que el esterol endógeno a reducir
es el ergosta 5,7 dien 3-ol, el ergosta
5,7,24(28) trien 3-ol o el ergosta 5,7,22
trien 3-ol o un mezcla de estos.
22. Un procedimiento de producción de
pregnenolona, en el que se cultiva una célula hospedadora
transformada según la reivindicación 14, se aísla eventualmente el
esterol o los esteroles endógenos reducidos en la posición
C-7 acumulados, se incuban los esteroles reducidos
en presencia de P_{450}SCC, y eventualmente de adrenodoxina
reductasa (ADR) y de adrenodoxina (ADX), y se aísla eventualmente la
pregnenolona obtenida.
23. El procedimiento según la reivindicación 22,
en el que la célula hospedadora es una levadura.
24. Las células de levaduras transformadas que
expresan una delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa.
25. La cepa de levadura transformada que
coexpresa una proteína que tiene la actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa, el
P_{450}SCC, la ADR y la ADX y que acumula pregnenolona libre o
esterificada.
26. La cepa de levadura según la reivindicación
25, en la que la proteína que tiene la actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa es la
proteína de A. thaliana delta-7Red.
27. La cepa de levadura según la reivindicación
26, denominada BC01/pCD63 depositada en la CNCM el 10 de febrero de
1995 con el número I-1538.
28. Un procedimiento de producción de
pregnenolona, en el que se cultiva una levadura transformada por uno
o varios vectores que permiten la coexpresión de una proteína que
tiene la actividad delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa y de
P_{450}SCC, y eventualmente de la ADR y de la ADX, y se aísla
eventualmente la pregnenolona libre o esterificada.
29. Un procedimiento de producción de
pregnenolona en el que se cultiva una levadura según la
reivindicación 24.
30. El procedimiento según la reivindicación 29,
en el que la proteína que tiene la actividad
delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa es la
proteína de A. thaliana delta-7Red.
31. El procedimiento según la reivindicación 30,
en el que la cepa de levadura es la cepa ECOI/pCD63, depositada en
la CNCM el 10 de febrero de 1995 con el número
I-1538.
32. Un método de detección de la deficiencia en
delta-5,1
esterol-delta-7 reductasa que
comprende la incubación de una muestra que contiene el ADN genómico
humano con una sonda según una de las reivindicaciones 1 a 4, en
condiciones de hibridación estándar y la puesta en evidencia de la
fijación o de la ausencia de fijación de la sonda al ADN genómico,
la ausencia de fijación o la reducción de ésta lo que indica una
deficiencia congénita en delta-5,7
esterol-delta-7 reductasa.
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