PT727489E

PT727489E - Sequência de adn codificante para uma proteína de a. thaliana tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5,7, proteína delta-7-red, processo de produção, estirpes de leveduras transformadas, utilizações

Info

Publication number: PT727489E
Application number: PT96400301T
Authority: PT
Inventors: Denis Pompon; Xavier Chenivesse; Catherine Duport; Eric Lecain
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1995-02-15
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 2010-04-27
Also published as: FI120877B; KR960031607A; IL162476A; HUP9600325A1; PL312828A1; IL162476A0; CZ43296A3; FI960663A0; RU2242517C2; ATE457354T1; SK283656B6; EP0727489A1; BRPI9600729B1; HU220587B1; CA2169524A1; UA72172C2; TR199600116A2; DK0727489T3; HRP960078A2; CN1664107A

Description

DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIA DE ADN CODIFICANTE PARA UMA PROTEÍNA DE A. THALIANA TENDO UMA ACTIVIDADE REDUTASE EM DELTA—7 DO ESTEROL DELTA—5, 7, PROTEÍNA DELTA—7—RED, PROCESSO DE PRODUÇÃO, ESTIRPES DE LEVEDURAS TRANSFORMADAS, UTILIZAÇÕES" A presente invenção refere-se à sequência de ADN codificante para uma proteína de A. thaliana tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7, à proteína delta-7Red, ao seu processo de produção, às estirpes de levedura transformadas e às suas utilizações. A redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 (E.C.1.3.1.21) é uma enzima microssómica cuja presença foi detectada pela sua actividade em homogenatos de fígado de rato (Μ. E. Dempsey et al., Methods Enzymol., 15, 501-514, 1969) assim como em preparações de plantas de Zea mays (M. Taton et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 465-473, 1991). Esta redutase é dependente do NADPH e reduz o 7-desidrocolesterol em colesterol in vitro.

Os esteróis são os constituintes principais das membranas dos eucariotas mas apresentam diferenças na estrutura de acordo com as espécies. Em células eucariotas, tal como as leveduras, o esterol principal é o ergosterol, o qual contém uma insaturação dupla em C-5 e C-7, uma cadeia lateral ramificada em C-24 e uma insaturação em C-22 enquanto nos mamíferos o colesterol é caracterizado por uma insaturação em C-5 e uma cadeia lateral saturada. 0 sitosterol, o estigmasterol e o campesterol que representam os esteróis mais comuns nas plantas, têm uma cadeia 1 lateral ramificada mas saturada e, como os esteróis dos vertebrados, não têm uma insaturação em C-7. A enzima responsável por esta diferença na estrutura do núcleo esterol é a redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7. A redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 nunca foi purificada até à homogeneidade e foi apenas descrita uma purificação parcial (Μ. E. Dempsey et al. ; M. Taton et al., já referido). A proteína não foi caracterizada pelas suas propriedades fisico-químicas. Não foi descrita qualquer informação sobre a sequência da proteína e sobre qualquer anticorpo dirigido contra esta. Além disso, foi descrita uma deficiência aparente na redutase do 7-desidrocolesterol no homem associada à síndrome RSH/Smith-Lemli-Opitz (SLO) (J. M. Opitz et al., Am. J. Med. Genet., 50, 326-338, 1994). A clonagem de um ADNc codificante para a redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 que possa permitir a identificação da sequência da proteína correspondente, assim como a caracterização do gene humano ou a identificação de uma deficiência congénita deste, não é, deste modo, realizável com os métodos conhecidos utilizando, por exemplo, técnicas da hibridação ou/e de detecção imunológica. Deste modo é particularmente necessária a obtenção de métodos de rastreio inventivos, permitindo realizar a clonagem, em particular na ausência de informações sobre a proteína. 0 ergosterol, o esterol principal das membranas dos fungos, contém um par de ligações duplas conjugadas em C-5, 7 que conferem uma actividade antimicótica aos compostos da família dos polienos, tal como a nistatina (R. Bittman et al., J. Blol. Chem., 260, 2884-2889, 1985). A forte dependência da acção da 2 nistatina da concentração membranar em esteróis insaturados em C-5, 7, permitiu seleccionar estirpes mutantes de S. cerevisiae no que respeita a esteróis acumulados (S. W. Molzahn et al., J. Gen. Microbiol., 72, 339-348, 1972). Deste modo, os mutantes erg2 e erg3 acumulam esteróis que não têm as ligações duplas conjugadas em C-5, 7 devido, respectivamente, a uma deficiência na isomerase em delta 8, 7 do esterol (W. Ashman et al., Lipids, 26, 628, 1991) e na desidrogenase em delta-5 do esterol (B.

Arthinton et al., Gene, 102, 39, 1991). Esses mutantes são viáveis porque o ergosterol, o principal esterol natural da levedura, pode ser substituído em determinadas condições por diferentes esteróis de substituição incluindo o colesterol.

Foi entendida, pela requerente a vantagem do aumento da resistência à nistatina de estirpes da levedura enriquecidas em esteróis não tendo a insaturação dupla em C-5, 7, para clonar ADNc codificando uma proteína heteróloga tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 com um método de rastreio utilizando uma interferência metabólica em S. cerevisiae. O sucesso desta abordagem que proporciona a vantagem de ser independente do conhecimento das sequências do ADN ou da proteína assim como de uma detecção baseada apenas na actividade enzimática, não é, no entanto, previsível devido a numerosas dificuldades técnicas a superar.

Uma primeira limitação provém do facto do modo de acção da nistatina não estar inteiramente elucidado (L. W. Parks et al., CRC Criticai Reviews in Microbiology, 301-304, 1978). Por exemplo, é previsível uma baixa especificidade de selecção pela nistatina, devido à sua natureza indirecta, conduzindo à selecção de modificações genómicas espontâneas em levedura, tais como os mutantes erg (S. W. Molzahn et al. já referido) ou de 3 mutações genómicas envolvendo resistências independentes da via dos esteróis. Do mesmo modo, as células transformadas por uma biblioteca podem expressar genes heterólogos conferindo uma resistência à nistatina sem relação com a via dos esteróis.

Um outro exemplo da limitação esperada refere-se ao facto da proteína heteróloga poder ser pouco activa na célula, originando uma resistência ausente ou baixa à nistatina, por exemplo, por uma das razões seguintes: 1) o gene codificante para a redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 é pouco expresso; 2) a proteína é pouco ou não activa por ter um enrolamento incorrecto ou ser resultante de um direccionamento subcelular incorrecto; 3) a proteína da planta não reconhece os esteróis característicos da levedura como substrato, ou 4) esteróis que podem ser substratos estão sob a forma esterificada ou armazenados em vesículas e não estão em contacto com a enzima. Pode ser, deste modo, previsto que esteróis deste modo acumulados escapem à acção da redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7, a qual, em eucariotas, é considerada localizada nos microssomas. A presente invenção refere-se à clonagem de ADNc de A. thaliana codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7, designada delta-7Red, de acordo com um processo de clonagem realizado numa levedura por interferência metabólica baseada na resistência à nistatina. A proteína delta-7Red permite reduzir os esteróis tendo uma insaturação em C-7, por um processo biológico de redução que proporciona, além disso, uma solução vantajosa para o problema da redução selectiva em C-7 de esteróis ou de esteróides tendo uma insaturação dupla em C-5, 7 que os métodos de redução por via química não permitem. 4 A invenção refere-se igualmente a células de levedura transformadas expressando a delta-7Red que, de um modo surpreendente, acumulam produtos saturados em C-7 e opcionalmente saturados em C-22 que, contrariamente ao ergosterol, são substratos da enzima de quebra da cadeia lateral de colesterol ou seja o citocromo P450SCC.

Estas propriedades inesperadas permitem uma utilização de leveduras transformadas da invenção num processo de preparação de esteróis ou de esteróides tendo um interesse industrial e/ou farmacológico, em particular na preparação de pregnenolona por oxidação biológica de esteróis endógenos de levedura, reduzidos em C-7, pelo citocromo P45o SCC (P45oSCC) na presença de redutase da adrenodoxina (ADR) e de adrenodoxina (ADX). As leveduras transformadas da invenção podem ser também utilizadas num processo de preparação de esteróides intermediários da via de metabolização de colesterol em hidrocortisona em mamíferos e outros vertebrados. Esta utilização tem a vantagem de permitir a preparação da hidrocortisona ou dos seus intermediários num processo de oxidação biológica não necessitando da utilização de um esterol exógeno, tal como o colesterol, como substrato inicial e contornar deste modo o problema da penetração de um esterol na levedura, uma vez que a impermeabilidade aos esteróis exógenos em condições de aerobiose foi descrita (R. T. Lorentz et al., J. Bacteriology, 981-985, 1986). A invenção refere-se também à utilização das sequências nucleicas obtidas utilizando o processo de clonagem da invenção. Pode ser utilizada uma sequência de ARN ou ADN codificante para a redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 no diagnóstico ou no tratamento de doenças envolvendo o produto do gene da redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7. Por exemplo, uma deficiência 5 na redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 que converte o 7-desidrocolesterol em colesterol está, supostamente, envolvida na síndrome RSH/SLO. Deste modo, pode ser utilizada uma sequência de ADN humano como sonda para diagnosticar uma deficiência na redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e pode ser, também, utilizada em terapia génica para corrigir essa deficiência. A presente invenção tem, deste modo, como objecto uma sequência de ácido nucleico contendo uma sequência codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7, sendo o referido ácido nucleico um ADN ou um ARN e sendo, particularmente, um ADNc. A actividade redutase em delta-7 do esterol delta 5, 7 pode ser detectada, por exemplo, utilizando um teste enzimático in vitro, descrito mais abaixo na parte experimental. A invenção tem mais particularmente como objecto uma sequência de ADNc, na qual a sequência codificante codifica para uma proteína de A. thaliana tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e tendo a sequência nucleotídica da sequência SEQ ID N° 1: GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60 AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111

Met Ala Glu Thr Vai Hls Ser Pro Zla Vai Tbr Tyr 1 5 10 159 GCA TCG ATG TTA TOG CTT CTC CCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cya Pro Pro Phe Vai Xle Leu 15 20 25 CTA TGG TAC ACA ATG CTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT Leu Trp Tyr Thr Met Vai Hie Gin Aep Gly Ser Vai Thr Cln Thr Phe 30 35 40 6 207 .255 gsc tíc τττ tcg sac aat gca gtt caa goa gtt atc aac ata tgg cca Gly Pfce Phe Trp olu Aso Giy Vai Gin Gly Leu He Aen Xie Trp Pr o 45 50 SS $0 ASA CCC ACT TTC ATT GCT T6G AAA ATT ATA TH? TGC TAT GCA GCA TTT Arg Pm The &«u lie Ala Trp Lys Ile li# Fhe Cys Tyr Giy Ale The $5 70 75 QM GCT ATT CTT CAO CXS CTT CÍS COT GÒT AAA ASA GTT «AG CGT CCA Giu Ale. lie Leu Gin teu Leu Lee pro Gijr tye Arg Vai Clu ôly Pro m ss se ATA TGT CCA OCC G0A AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC MT CGT CXG GCT Π® Ser Pre Ais Ciy As» Arg Pro Vai Tyr Lys Ala Âa» Gly Lee Ale 95 1.00 10$ 303 111 399 GCT TAC TTT OTO ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TCG TGG TTT Q&h Ale Tyr Phe vai Thr Leu Ais Ttsr Mi» Leu Gly Leu Trp Trp Fhs Gly 110 115 120 ATC TTC AAC CCT OCA ATT OTO TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TXT TCC IXs flse Aen Pro Ala 11® Vai Tyr Aep Mis Leu Gly Giu lie Phe Ser 12:5 130 135 140 GCft CTA ATA TTC ®GA AGC TTC ATA TXT TST GTT TTÓ TTG TAC ATA MA Ala Leu II# Phe Gly Ser Phe lis Phe Cya Vai Leu Leu Tyr lie tye 145 150 155 GGC CAT CTT GCA CCT TCA TCA AOT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA >51y Mia Vai Ala Pro Ser Ser Ser Agp Ser Gly Ser Cya Gly Aen Leu ISO 155 170 ATA ATT CÃO f«í TAf tSG GOC ATO GAG TTC TAC CCT CGA ATT GGT AAG Kle Ila Aep Phe Tyr Trp Oiy M#t Giu Leu Tyr Pro Arg ile Gly tys 175 ISO 235 AGC TTX «AC ATC M© GTG TXT ACT AAT TGC ÀGA TTC GCA ATO ATO TGT Ser Phe kap 11« Lye Vai Phe Thr Asa Cya Arg Phe Gly Met Mefe ser ISO 195 200 TGG GCA GTT CTT GCA OTO ACG TAC TGC ATA AM CAC TAT GAA ATA AAT Trp Ala Vai teu Ala Vai Thç Tyr Cya lie Lye Gin Tyr Glu Tle Aen 205 210 215 220 447 495 543 591 S39 687 7 735 GGC AAA CTA TCT CAT TCA ATS CTG CTG AAC ACC ATC CTG ATG CTC CTC 783

Gly Lye Vai ser Aep Ser Met Leu vai Aon Thr Ile Leu Met Leu Vai 225 230 235 TAT CTC ACA AAA TTC TTC TCG TGG CAA GCT CCT TAT TGC AAC ACC ATC 831

Tyr Vai Thr Lya Phe Phe Trp Trp Glu Ala Cly Tyr Trp Aen Thr Met 240 245 250 CAC ATT GCA CAT CAC CCA GCT GCA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879

Aap Ile Ala Hia Aep Arg Ala Gly Phe Tyr Xle Cys Trp Gly Cya Leu 255 260 265 GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927

Vai Trp Val Pro Ser Vai Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Vai Aan 270 27S 280 CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975

Hia Pro Val Glu Leu Gly Thr Gin Leu Ala Xle Tyr Xle Leu Val Ala 285 290 295 300 GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023

Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lya Tyr Aap Cya Aap Arg Gin Arg Gin 305 310 315 GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071

Glu Phe Arg Arg Thr Aen Cly Lye Cya Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro 320 325 330 TCA AAG ATT GTG CCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119

Ser Lya Xle Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lya Thr 335 340 345 AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167

Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg Hia Phe Hia 350 355 360 TAT GTT CCT GAG ATC TTA ACT GCT TTC TTC TGG ACC GTA -CCG GCT CTC 1215

Tyr Val Pro Glu Xle Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu 365 370 375 380 TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263

Phe Aap Aan Pha Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe 385 390 395 mi GAT CGA GCC ΑΑβ MA GAC GAX ©AC CfóSft TGC CGA fCS A&G TAT Qm AAA Αθ£ fttg Ala í»ys Arg ftaji ftají Aep Ajfg Cy« Arg Saí tya Tyr Gly í»ye 400 405 410 TAT TGG AAG CT© Tftt T©T ©AG AAA GXC AAA TAC A6G MC ATT 000 G&A 1355

Tyr Trp Lys leu Tyr Cye <*lu Aya Vai Ay* Tyjf A4fg He lie fro Cly 41S 420 425 ATT TAT TGATTOTAAC ÔAAGTCTGTT ÕfTC®e&TTT TCTACTT&TT ACGTTAATTC 1415 11« Tyr 410 GAACGTTGÊA ATOATCAAAA Ç&CCGAGCCÂ MACAftAftAT ©CSAATICJAT ©CGATAGACA 1475 TTCTTTTGCT GAAAAAAAftA A 1496 A sequência de ADNc acima que codifica para uma proteína tendo 430 aminoácidos correspondente à sequência mostrada na figura 3 (SEQ ID N° 2) é uma sequência de ADNc que pode ser obtida, por exemplo, por clonagem numa levedura, a partir de uma biblioteca de expressão de A. thaliana, utilizando um método de rastreio baseado no aparecimento de uma resistência da levedura à nistatina, de acordo com as condições de operação, cuja descrição detalhada é proporcionada abaixo. 0 conhecimento da sequência nucleotídica SEQ ID N° 1 acima permite reproduzir a presente invenção por métodos conhecidos do especialista na técnica, por exemplo, por síntese química ou por rastreio de uma biblioteca genómica ou de uma biblioteca de ADNc utilizando sondas oligonucleotídicas da síntese por técnicas de hibridação ou por amplificação por PCR. A invenção tem, também, como objecto uma sequência de ADN codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e que híbrida com a sequência 9 nucleotídica SEQ ID N° 1, em condições de severidade média ou elevada ou que apresenta uma identidade de sequência de cerca de 60% e mais com esta sequência.

As sequências que hibridam com a sequência SEQ ID N° 1 de um modo detectável, hibridam sob condições padrão de severidade média, por exemplo, uma hibridação a 42 °C, durante 12 horas, numa solução formamida a 50%, SSC X 6, sequida por lavagens ou de severidade menos elevada, por exemplo, uma hibridação a 42 °C durante 24 horas, numa solução formamida a 20%, SSC X 6 seguido por lavagens sob as condições padrão conhecidas (T. Maniatis et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . A percentagem da identidade de sequência nucleotídica pode ser determinada utilizando, por exemplo, BLAST "basic local alignment search tool" (S. F. Altschul et al., J. Mol. Blol., 215, 403-410, 1990) no servidor NCBI.

A invenção refere-se também a uma sequência de ADN codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e amplificável pela técnica de PCR utilizando como iniciadores oligonucleótidos codificantes para uma sequência de consenso tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 3:

Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 15 10 15 em que Xaa na posição 7 é Trp ou Tyr e Xaa na posição 12 é His ou Lys, associados a um iniciador oligo dT. 10 A sequência SEQ ID N° 3 acima, corresponde a uma nova sequência de consenso que foi definida por alinhamento de identidade de sequências em aminoácidos, entre a nova sequência SEQ ID N° 2, deduzida a partir da sequência nucleotidica SEQ ID N° 1 e de sequências conhecidas, de outras redutases do esterol tendo uma especificidade de acção para uma posição além da posição C-7 ou de receptores da lamina B, como isto será detalhado mais abaixo na parte experimental. A partir da informação proporcionada pela sequência de aminoácidos SEQ ID N° 3, pode ser definido e sintetizado um iniciador constituído por mais de 45 nucleótidos, o qual, associado um segundo iniciador oligodT (17 nucleótidos) como sequência de ressalto, irá permitir amplificar um ADN codificante para uma proteína tendo actividade redutase em delta-7 do esterol delta 5, 7 utilizando um kit PCR comercial (por exemplo, Stratagene). A invenção refere-se também a uma proteína de A. thaliana tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 2:

Met Ala Glu Thr Vai Hie Ser Pro Zle Vai Thr Tyr Ala Ser Met Leu 15 10 15

Ser Leu Leu Ala Phe Cye Pro Pro Phe Vai Zle Leu Leu Trp Tyr Thr 20 25 30

Met Vai Hie Gin Aep Gly Ser Vai Thr Gin Thr Phe Gly Phe Phe Trp 35 40 45

Glu Aen Gly Vai Gin Gly Leu Xle Asn Ile Trp Pro Ar? Pro Thr Leu 50 55 60

Ile Ala Trp Lye Ile Ile Phe Cye Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu 65 70 75 80

Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lye Arg Vai Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala 85 90 95 11

Gly Asn Arg Pro Vai Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Vai 100 105 HO

Thr Leu Ala Thr Hie Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Zle Phe Asn Pro 115 120 125

Ala Ile Vai Tyr Aap His Leu Gly Glu Zle Phe Ser Ala Leu Zle Phe 130 135 140

Gly Ser Phe Zle Phe Cya Vai Leu Leu Tyr Zle Lya Gly Hie Vai Ala 145 150 155 160

Pro Ser Ser Ser Aep Ser Gly Ser Cye Gly Aen Leu Zle Zle Aap Phe 165 170 175

Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Zle Gly Lye Ser Phe Aap Zle 180 185 190

Lye Vai Phe Thr Aen Cye Arg Phe Gly Met Met ser Trp Ala Vai Leu 195 200 205

Ala Val Thr Tyr Cye Zle Lye Gin Tyr Glu Zle Aen Gly LyB vai Ser 210 215 220

Ser Met, Leu Vai Asn Thr Zle Leu Met Leu Val Tyr vai Thr Lys 225 230 S35 240

Trp Asn Thr Met Aap He Ala His 2SÕ 255 Trp Gly Cye Leu Val Trp Val Pro 2m 270 Tyr Lsu Val Asn His Pr© Val Glu 2SS ile Leu val Ala Gly lie Leu Cye 300 Arg Glu Arg Gin Glu Phe Arg Arg 315 320

Phe Phe Trp Trp Glu Ala õiy Tyr 245

Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Zle Çys 260

Ser Val tyr Thr Ser Pr© eiy «et 275 2ΘΟ

Gly Thr Gin Leu Ala 11« Tyr 2tG 295

Ile Tyr Ila Lye Tyr fisp cya Aap 305 310 12

Th*1 λβ» ύΧγ Ly» Cy» Leu V®1 tsp Qly heg Ais Pms Ser Lye 11¾ Vai

32 S 330 33S

Ala Ser Tyr TAr TAr Thf Sôse <3ly Slw ÍJir tys Tbr S«* L®« Lau £,¾¾ 340 343 350

Thr ser Gly Trp frp Gly Leu Ala Arg Hie Phe His Tyr vai Pro Glu

3BS 360 MS

Ile Leu Ser Ala Phe She frp "Thr Vai Prc Ala Leu Pha Asp Aan Phe 3?0 375 380

Leu Ais Tyx Ty* Vai Leu Thv Xm t&u Leu Pha Asp ftrg Ala Lya 3SI 390 39$ 400

Mg hm àsp hsp Arg Cy« ârf Lye Tyr Gly Lys fyr frp Lys La« 40S 41Çt 413 ®y* cya Gltf Lyia Vai Lys Tysr Arg lie II® Pr« óly 11® Xyr 430 425 430 A invenção tem especialmente como objecto uma proteína de A. thaliana tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 2 acima e designada delta-7Red. A invenção refere-se, também, a uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 tendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de sequência de cerca de 60% e superior com a sequência SEQ ID N° 2. A percentagem da identidade pode ser determinada, por exemplo, utilizando o programa BLAST indicado acima. 13 A invenção refere-se igualmente a uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e tendo uma reactividade imunológica cruzada com a proteína de A. thaliana delta-7Red definida acima. A proteína pode ser detectada, por exemplo, por imunoprecipitação utilizando um anti-soro dirigido contra a proteína delta-7Red, preparado de acordo com métodos conhecidos.

Um dos aspectos da invenção refere-se a uma proteína tendo uma actividade redutase em delta 5, -7, delta-7 do esterol, tal como a obtida por expressão numa célula hospedeira contendo uma sequência de ADN definida anteriormente e refere-se, especialmente, a uma proteína de A. thaliana tal como obtida por expressão numa célula hospedeira contendo uma sequência de ADN codificante para a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 2 acima.

Quando a proteína da invenção é obtida por expressão numa célula hospedeira, esta é realizada de acordo com os métodos de engenharia genética e da cultura celular conhecidos do especialista na técnica. A expressão pode ser realizada numa célula hospedeira procariota, por exemplo, E. coli ou numa célula hospedeira eucariota, por exemplo, uma célula de mamífero, uma célula de insecto ou uma levedura contendo a sequência codificante para delta Red 7 da invenção precedida por um promotor adequado. A proteína recombinante obtida pode ser glicosilada ou não glicosilada. 14 A invenção refere-se a nomeadamente a uma proteína de acordo com a invenção como obtida por expressão numa levedura. A invenção refere-se também a um anticorpo dirigido contra uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 anteriormente definida. 0 anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal preparado de acordo com os métodos conhecidos do especialista na técnica. A invenção refere-se também a um vector de expressão contendo uma sequência de ADN definida anteriormente, assim como a uma célula hospedeira transformada por este vector.

Os vectores da expressão são vectores conhecidos, permitindo a expressão da proteína sob controlo de um promotor adequado. Para as células procariotas, o promotor pode ser, por exemplo, promotor lac, promotor trp, promotor TAC, promotor β-lactamase ou promotor PL. Para as células de mamífero, o promotor pode ser promotor SV40 ou promotores de adeno-vírus. Podem ser também utilizados vectores do tipo Baculovírus para a expressão em células de insecto. Para as células de levedura, o promotor pode ser, por exemplo, promotor PGK, promotor ADH, promotor CYC1 ou promotor GAL10/CYC1.

As células hospedeiras podem ser células procariotas ou células eucariotas. As células procariota são, por exemplo, E. coli, Bacillus ou Streptomyces. As células hospedeiras eucariotas compreendem leveduras e fungos filamentosos, assim como células de organismos superiores, por exemplo, células de mamífero ou células de insecto. As células de mamífero podem ser células CHO de hamster ou células Cos de macaco. As células de insecto são, por exemplo, células SF9. As células de levedura 15 podem ser, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe ou Kluyveromyces lactis. A invenção tem também como objectivo um processo de clonagem de uma ácido nucleico codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 num microrganismo compreendendo um método de rastreio seleccionado de entre - resistência do microrganismo à nistatina ou a um composto semelhante cuja toxicidade depende da presença de esteróis contendo uma insaturação na posição C-7, - hibridação do ácido nucleico com a sequência nucleotídica da sequência SEQ ID N° 1 acima, - identificação do ácido nucleico por via informática de acordo com o programa BLAST de entre sequências de ADN isoladas aleatoriamente.

Por microrganismo, entende-se uma levedura, tais como, por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe ou K. lactis.

Os compostos análogos à nistatina compreendem, por exemplo, anfotericina B ou filipina.

Por hibridação, entende-se uma hibridação em condições de severidade média ou elevada, de acordo com as condições padrão conhecidas (T. Maniatis et al., já referido). A identificação por via informática é realizada de acordo com o programa BLAST indicado acima. 16

Um exemplo de processo da clonagem acima, em que o método de rastreio utiliza a resistência à nistatina numa levedura é descrito abaixo na parte experimental. A invenção tem especialmente como objecto uma célula hospedeira, seleccionada de entre uma levedura ou um fungo filamentoso, transformada por um vector contendo uma sequência de ADN da invenção definida anteriormente.

Um dos objectivos da invenção refere-se, também, a um método de preparação de uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7, em que se cultiva uma célula hospedeira transformada da invenção e se isola a proteína expressa e refere-se, particularmente, a um processo em que a célula hospedeira é uma levedura transformada, em que a sequência de ADN codificante é colocada sob o controlo de um promotor de levedura.

Um dos objectivos da invenção refere-se também a um processo de redução in vitro de um esterol insaturado na posição C-7, em que se incuba o esterol a ser reduzido com a proteína obtida pelo processo acima e se isola, opcionalmente, o esterol reduzido obtido.

Um dos objectivos da invenção refere-se também a um processo de redução in vivo de um esterol exógeno insaturado na posição C-7, em que se incuba o esterol com uma célula hospedeira transformada da invenção e se isola, opcionalmente, o esterol reduzido obtido. A célula hospedeira pode ser uma célula procariota ou uma célula eucariota, em particular, uma levedura ou um fungo filamentoso. 17

Um dos objectivos da invenção refere-se também a um processo de redução in vivo de um esterol endógeno insaturado na posição C-7 em que, se cultiva uma estirpe hospedeira transformada da invenção seleccionada de entre uma levedura ou um fungo filamentoso e se isola, opcionalmente, o esterol reduzido acumulado. A invenção refere-se particularmente a um processo de redução in vitro ou in vivo, definido acima, em que o esterol reduzido obtido é um substrato da enzima de quebra da cadeia lateral do colesterol (P450 SCC) e refere-se, particularmente, a um processo de redução in vivo, em que o esterol endógeno a reduzir é ergosta-5, 7-dien 3-ol, ergosta-5, 7, 24(28)trien-3-ol ou ergosta-5, 7, 22-trien-3-ol ou uma sua mistura. A invenção tem também como objectivo um processo da produção de pregnenolona, em que se cultiva uma célula hospedeira transformada da invenção seleccionada de entre uma levedura ou um fungo filamentoso, se isola, opcionalmente, o ou os esteróis endógenos reduzidos na posição C-7 acumulados, se incubam os esteróis reduzidos na presença de P450SCC e, opcionalmente, na presença de redutase da adrenodoxina (ADR) e de adrenodoxina (ADX) e se isola, opcionalmente, a pregnenolona obtida. A invenção tem, particularmente, como objectivo um processo de produção de pregnenolona, definido acima, em que a célula hospedeira é uma levedura. A invenção refere-se também a um processo de produção de pregnenolona em que se cultiva uma levedura transformada por um ou mais vectores permitindo a co-expressão de uma proteína tendo 18 actividade redutase em delta-7 do esterol delta 5, 7 e de P450SCC e opcionalmente de ADR e de ADX e se isola, opcionalmente, a pregnenolona livre ou esterifiçada. A invenção refere-se, particularmente, ao processo acima em que se cultiva uma levedura transformada co-expressando uma proteína tendo a actividade redutase em delta 5, 7 delta-7 do esterol, P45o SCC, ADR e ADX, particularmente, o processo acima em que a proteína tendo a actividade redutase em delta 5, 7 delta-7 do esterol é a proteína delta-7Red de A. thaliana e, especialmente, o processo acima em que a estirpe de levedura é a estirpe EC01/pCD63. São proporcionados abaixo, na parte experimental, exemplos de produção de pregnenolona, de acordo com a invenção. A levedura transformada utilizada na realização do processo de produção de pregnenolona acima pode ser, por exemplo, uma levedura co-transformada por um vector de expressão da invenção contendo uma sequência de ADN codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e um vector de expressão do citocromo P45o SCC e opcionalmente da ADX e da ADR. São conhecidos vectores da expressão do citocromo p450 SCC e/ou da ADX e são descritas preparações, por exemplo, no pedido de patente europeia EP 0340878, assim como na parte experimental abaixo. A levedura transformada utilizada pode ser igualmente uma levedura em que a sequência de ADN codificante para a proteína tendo actividade redutase em delta-7 do esterol delta 5, 7 está integrada num local particular do genoma, por exemplo, no local ADE2 e em que o ergosterol deixa de ser o esterol maioritário 19 nas condições da expressão da redutase em delta-7. A levedura "integrada" obtida, pode ser, em seguida transformada por cassetes de expressão integradoras ou vectores de expressão contendo uma sequência de ADN codificante para o citocromo P450 SCC e opcionalmente, para ADX e ADR. É proporcionada abaixo na parte experimental um exemplo de construção de estirpes de levedura produzindo a pregnenolona in vivo ou o seu éster acético. A invenção tem deste modo igualmente como objecto uma estirpe de levedura transformada co-expressando uma proteína tendo actividade redutase em delta 5, 7 delta-7 do esterol, P450 SCC, ADR e ADX e acumulando pregnenolona livre ou esterifiçada, particularmente, uma estirpe de levedura acima, em que a proteína tendo a actividade redutase em delta 5, 7 delta-7 do esterol é a proteína delta-7Red de A. thaliana e, especialmente, uma estirpe de levedura denominada EC01/pCD63, cuja construção detalhada é proporcionada abaixo na parte experimental. A invenção estende-se também a uma sequência de ADN humano, tal como a obtida de acordo com o processo de clonagem definido acima, utilizada como sonda para diagnosticar uma deficiência congénita na redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7. A deficiência na redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 compreende, por exemplo, a deficiência na redutase do 7-desidrocolesterol responsável pela taxa de colesterol anormalmente baixa no plasma. A invenção refere-se igualmente a um método de detecção da deficiência na redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 que compreende a incubação de uma amostra contendo ADN genómico 20 humano com a sonda definida acima, em condições de hibridação padrão e a detecção da fixação ou da ausência de fixação da sonda genómica ao ADN, indicando, a ausência da fixação ou a redução desta, uma deficiência congénita na redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7. 0 método da invenção pode permitir, por exemplo, detectar uma deficiência congénita na redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 pré-natal ou no recém-nascido, assim como entre doentes atingidos por afecções variadas e, nomeadamente, entre doentes tendo as manifestações clinicas da sindrome RSH/SLO.

As figuras, aqui em anexo, ilustram alguns aspectos da invenção: A figura 1 representa o perfil em esteróis totais extraído a partir do clone F22 resistente à nistatina, obtido por rastreio da biblioteca de A. thaliana na levedura FY 1679. A análise é realizada por RP-HPLC a 205 nm ou 285 nm (figura IA) ou por GC comparativamente com a levedura FY1679 não transformada (figura 1B). A figura 2 representa um mapa de restrição do fragmento Not I do plasmídeo pF22 e a estratégia de sequenciação. A figura 3 representa a sequência nucleotídica do ADNc delta-7Red (SEQ ID N° 1) e a sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID N° 2). A figura 4 ilustra a medição in vitro da actividade redutase em delta-7 do esterol delta 5, 7 de uma fracção microssómica de FY1679 transformada com o vector de 21 expressão indutível "delta-7/V8". A análise é realizada por GC e mostra a transformação do substrato 7-desidrocolesterol (TR = 16, 528) em colesterol (TR = 15, 887) na presença dos esteróis endógenos ergosta - 5, 22-dien-3-ol (TR = 16, 682); ergosterol (TR = 17, 249); ergost-5-en-3-ol (TR = 17, 664). A figura 5 ilustra a produção de pregnenolona in vitro por quebra de ergost-5-en-3-ol (fig. 5A) ; de ergost- 5, 24 (28- dien- 3-ol (5B) ou de ergosta - 5, 22 - dien-3-ol (5C) purificada a partir de uma levedura transformada expressando delta-7Red, depois incubado com P450SCC, ADX e ADR. A análise é realizada por GC comparativamente a uma quebra de colesterol de controlo (linha continua). A figura 6 ilustra a construção do plasmideo integrativo pADA7 permitindo a integração de ADNc codificante para a delta-7Red (esterol Δ7 redutase) no local ADE2. A figura 7 representa a análise por GC dos esteróis totais extraídos por saponificação alcalina da estirpe FY1679 e da estirpe integrada ELR01 cultivadas na presença de galactose. A figura 8 esquematiza a construção do vector transportador E. coli - S. cerevisiae V13 contendo um local único Sall (Sa) no local de clonagem múltipla. A figura 9 representa as etapas da construção de plasmídeos integrativos pCD62-l e pCD62-2 que permitem a inserção da cassete de expressão ADR na região intergénica dos genes leu2 e spIIA. 22 SCM1 e SCM2: locais de clonagem múltipla. A figura 10 representa a estratégia da construção da estirpe CDRO1. A figura 11 representa as etapas da construção do plasmideo da expressão pCD63 contendo as duas cassetes de expressão ADX e P450SCC. A figura 12 representa a análise por GC de esteróis extraídos a partir das células (lisado celular) ou do meio de cultura (meio) isolados a partir da estirpe EC01/pCD63 após uma indução de 9 h (figura 12a) ou de 24 h (figura 12b) com galactose. A figura 13 representa a estrutura do plasmideo pTG 7457. A figura 14 representa a estrutura do plasmideo pTG 7453. A figura 15 representa a estrutura do plasmideo pTG 10014. A figura 16 representa a estrutura do plasmideo pTG 10004. A figura 17 representa a estrutura do plasmideo pTG 10031. A figura 18 representa a estrutura do plasmideo pTG 10033.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção sem a limitar. 23 EXEMPLO 1: Clonagem de ADNc codificante para a redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 (delta-7Red) de A. thaliana A - Rastreio da biblioteca de expressão de A. thaliana em levedura A biblioteca da expressão de ADNc de partida é a biblioteca descrita por M. Minet et al. (Plant J., 2, 417-422, 1992) que foi preparada a partir de ARNm de A. thaliana no estádio de germinação no estádio com duas folhas e em que foram inseridos os ADNc delimitados pelo local Not I no local Bst XI da cassete de expressão do vector transportador E. coli/S. cerevisiae pFL61. Esta cassete contém as sequências do promotor e do terminador do gene da cinase do fosfoglicerato (PGK) . A origem da replicação da levedura derivada da sequência 2 μ e um marcador de selecção URA3, asseguram a propagação do vector na levedura. A propagação do vector em E. coli é derivada do plasmídeo pUC19. A estirpe de levedura FY 1679 (Mata) que é uma estirpe isogénica da estirpe S288C descrita por A. Thierry et al. (Yeast, 6, 521-534, 1990), foi transformada pela biblioteca de ADNc utilizando o método do acetato de litio descrito por D. Gietz et al. (Nucleic Acids Res.r 20, 1425, 1992).

As células foram espalhadas sobre um meio sintético SGI contendo 7 g/L "base de azoto de levedura" (Difco) , 1 g/L de bactocasaminoácidos (Difco), glucose 20 g/L, triptofano 20mg/L e que é isento de uracilo. Foram obtidos 105 transformantes prototróficos para o uracilo, depois, foram agrupados e espalhados novamente sobre o mesmo meio sintético isento de uracilo e contendo nistatina 2 ou 5 pg/mL numa proporção de 24 5 x 104 células por caixa. Deste modo, foram rastreadas 106 células para cada concentração de nistatina. Após 3 dias de incubação a 28 °C, foram recuperados cerca de 100 clones que cresceram na concentração de 2 pg/mL em nistatina, constituindo grupos de 5 clones cuja composição em esteróis foi analisada por cromatografia liquida de elevado desempenho em fase invertida (seguidamente designada RP-HPLC), enquanto foi obtido apenas um clone resistente, denominado F22, com a concentração de 5 pg/mL em nistatina. B - Análise de esteróis acumulados no clone F22 São preparados esteróis totais da levedura de acordo com o método de saponificação alcalina descrito por L. Parks et al. (Methods in Enzymol., 111, 333-346, 1985), depois são analisados por RP-HPLC ou/e por cromatografia em fase gasosa (designada GC) . 0 resíduo de esteróis obtido é dissolvido na mistura etanol -tetra-hidrofurano-água (65:10:25 v/v), depois, é analisado por RP-HPLC com uma coluna de sílica C18 ligada Applied Biosystems (100 x 2, 1 mm) com um caudal de 1 mL/min e a 55 °C utilizando um gradiente linear de metanol em água (50% a 100% durante 18 min) e uma detecção fotométrica a 205 nm e 285 nm comparativamente com padrões de ergosterol, campesterol e colesterol. A composição em esteróis também é analisada por GC em coluna capilar SE-30 Alltech (30 m X 0, 32 mm) com hélio, como gás de arrastamento, uma temperatura de 280 °C e 310 °C para respectivamente o injector e o detector, com um aumento inicial 25 da temperatura de 110 °C a 245 °C à velocidade de 45 °C/min, depois de 3 °C/min para atingir 280 °C. A análise por RP-HPLC (figura IA) e a análise por GC (figura 1B) mostra o perfil de esteróis acumulados no clone de F22 obtido acima caracterizado pelo desaparecimento quase completo do ergosterol, esterol maioritário da estirpe não transformada FY 1679 e a sua substituição por dois esteróis principais e em quantidade análoga que não absorvem a 285 nm e, deste modo, deixam de ter uma insaturação dupla conjugada de acordo com a análise por RP-HPLC.

Na figura IA, o campesterol (Sigma) (24-R-ergosta 5-eno 3-ol) contém di-hidrobrassicasterol(24-S-ergosta 5-eno 3-ol) a cerca de 35%. C - Clonagem do ADNc de delta-7Red

Os plasmídeos provenientes do clone F22 foram amplificados em E. coli, de acordo com o método descrito por J. N. Strathern et al. (Methods in Enzymol., 194, 319-329, 1991), depois foram digerido por Not I. Foram obtidos um fragmento com cerca de 600 pares de bases (pb) e um fragmento com 1, 6 kpb. A estirpe FY1679 foi transformada, respectivamente, com cada dos fragmentos acima. Foi analisada a composição em esteróis de cada clone de levedura transformada como indicado acima e permitiu distinguir o plasmídeo contendo o gene responsável pelo perfil modificado em esteróis. Deste modo, o plasmídeo identificado foi denominado pF22. 26 D - Determinação da sequência de ADNc delta-7Red A inserção de ADNc de pF22 foi sub-clonada no local Not I do vector pUC9N derivado de pUC9 (Pharmacia) em que o local Eco RI do local de clonagem múltipla é substituído pela inserção de um local de restrição Not I conservando a grelha de leitura do gene LacZ. Foi, em seguida, proporcionado um mapa de restrição (figura 2).

Foram sub-clonados fragmentos de restrição tendo respectivamente o local externo Not I e os locais internos EcoRI, PvuII ou HindIII no plasmídeo pBluescript (Stratagene). A sequência nucleotídica foi determinada pelo método de Sanger com a polimerase de ADN Sequenase (kit Stratagene) nas duas cadeias utilizando os iniciadores directo e inverso de pUC9, T3 e T7 de pBluescript ou os iniciadores específicos deduzidos da sequência nucleotídica do ADNc. A compilação do conjunto das sequências obtidas origina a sequência nucleotídica do ADNc de delta-7Red de A. thaliana (SEQ ID N° 1) representada na figura 3. Esta compreende 1496 nucleótidos que terminam numa sequência de poliadenilação. Esta apresenta uma grelha de leitura aberta iniciando com uma metionina iniciadora no nucleótido 76 e terminando num codão de terminação no nucleótido 1366. Resulta numa grelha da leitura aberta de 1290 nucleótidos codificante para uma proteína de 430 aminoácidos. A região codificante do ADNc delta-7Red codifica para a proteína delta-7Red, cuja sequência deduzida em aminoácidos (SEQ ID N° 2) é mostrada na figura 3. A sequência da proteína compreende 430 aminoácidos tendo uma massa molecular calculada de 49, 286 kDa. 27

Foi depositada uma amostra da estirpe DH5-1 de E. coli contendo o ADNc delta-7Red no vector pUC9N (designado ADNc delta7red/pUC9N) na CNCM a 10 de Fevereiro de 1995 sob o número 1-1535. E - Determinação da sequência de consenso SEQ ID N2 3

Foi verificado por pesquisa informatizada nas bases de sequências (Genbank e EMBL) que a sequência da proteína delta-7Red de A. thaliana apresenta algumas semelhanças de sequência, com outras redutases do esterol, em particular com a redutase do esterol C-14 e com a redutase do esterol C-24 (28) de S. cerevisiae descritas, respectivamente, por R. T. Lorentz et al. (DNA Cell Biol., 11, 685-692, 1992) e W. Chen et al. (Yeast, 7, 305-308, 1991) assim como com o produto do gene sts 1+ de S. pombe descrito por M. Shimanuki et al. (Mol. Biol. Cell, 3, 263-273, 1992) e com a redutase do esterol C-14 de Neurospora crassa (N 0 X77955 na base de dados EMBL) . Além disso, a proteína delta-7Red apresenta uma semelhança com os 400 aminoácidos da extremidade do terminal C do receptor da lamina B de galinha e com a do receptor humano correspondente, descritos por H. J. Worman et al. (J. Cell Biol., 111 1535-1542, 1990) e E. Schuler et al. (J· Biol. Chem., 269 11312-11317, 1994) .

Foram estabelecidos alinhamentos de identidade de sequência entre a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 2 deduzida do ADNc de delta-7Red obtido acima e as das três redutases do esterol de levedura e os dois receptores de lamina B, depois, foi definida uma nova sequência de consenso tendo a sequência de aminoácidos (SEQ ID N° 3) : 28

Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr .1 5 10 15 em que Xaa na posição 7 é Trp ou Tyr e Xaa na posição 12 é His ou Lys, para preparar oligonucleótidos utilizáveis como iniciadores para amplificar por PCR de novas sequências de ADN genómico ou de ADNc codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7. F - Expressão da proteína delta-7Red em levedura. a) construção do vector de expressão indutível delta-7/V8 em levedura A eliminação das regiões não codificantes do ADNc de pF22 foi realizada pela técnica da amplificação por PCR utilizando os seguintes oligonucleótidos específicos: 5’CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3’ (SEQ ID N° 4) e 5’CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3’ (SEQ ID N° 5) que foram definidos para introduzir um local de restrição BamH I imediatamente a montante do codão de iniciação e um local Κρη I imediatamente a jusante do codão de terminação.

0 ADNc foi amplificado a partir de 1 ng de plasmídeo "ADNc delta7red/pUC9N" na presença de 2 unidades de polimerase de ADN 29

Pfu e cada um dos iniciadores acima 0, 2 μΜ utilizando as seguintes condições de amplificação: 94 °C, 10 s; 52 °C, 50 s; 74 °C, 90 s; 33 ciclos com o kit PCR de Stratagene.

Foi obtido um fragmento com cerca de de 1300 pb, depois foi digerido com as enzimas da restrição BamH I e Κρη I e foi inserido nos locais BamH I e Κρη I do vector transportador E. coli/S. cerevisiae pYeDPl/8-2 (designado V8) descrito por C. Cullin et al. (Gene, 65, 203-217, 1988) . O V8 contém o marcador da selecção URA3 e contém uma cassete de expressão em levedura contendo promotor GAL10/CYC1 e a sequência de terminação do gene PGK. O vector obtido, deste modo, denominado delta-7/V8, permite a expressão indutível pela galactose da proteína delta-7Red. b) Produção do delta-7red de proteína A estirpe de levedura FY 1679 (Mata) foi transformada com o plasmídeo delta-7/V8 obtido acima utilizando o método do acetato de lítio descrito por D. Gietz et al. (já referido). A levedura transformada foi cultivada a 27 °C, em meio selectivo SGI descrito acima, mas em que a concentração em glucose é 5 g/L, até a obtenção de uma saturação de densidade celular (DO600nm = 12). A cultura é, em seguida, diluída por adição de um volume de YP meio completo (10 g/L em extracto de levedura (Difco) e 10 g/L em bactopeptona (Difco)), seguida de adição de etanol (1, 5% v/v) como fonte de carbono. Quando o crescimento permitiu atingir uma concentração celular de, pelo menos, 7 x 107 células/mL, a expressão de delta-7Red foi induzida por adição de galactose na concentração de 20 g/L. 30 A indução foi também realizada em meio mínimo selectivo SLI que corresponde ao meio SGI, em que a glucose é substituída por galactose (20 g/L), até a obtenção de uma concentração celular de 2 X 107 células/mL. c) Teste enzimático in vitro da actividade redutase em delta-7 do esterol delta 5, 7 A expressão da proteína delta-7Red foi detectada utilizando um teste enzimático descrito por M. Taton et al. (Biochem. Bioph. Res. Commun., 181, 465-473, 1991), mas sem sistema de regeneração de NADPH, com preparações celulares microssómicas ou citosólicas da levedura induzida acima.

As fracções celulares foram obtidas por quebra mecânica de células induzidas e isolamento de fracções por ultracentrifugação, de acordo com o método descrito por P. Urban et al. {Eur. J. Biochem., 222, 843-850, 1994). As células são recolhidas, depois são lavadas duas vezes com tampão TE-KC1 (TrisHCl 50 mM, pH 7, 4; EDTA 1 mM, KC1 0, 1 M) e são colocadas em suspensão em tampão de lise TE-sorbitol 0, 6 M. Foram adicionadas esferas de vidro com 0, 45-0, 5 mm de diâmetro (Braun) até atingir a superfície da suspensão celular que se agita, em seguida durante 5 min, a 4 °C. O lisado celular na superfície é recuperado e as esferas de vidro são lavadas três vezes com o tampão de lise. O lisado e as lavagens são reunidos, depois, são centrifugados a 20000 g durante 13 min, a 4 °C, para eliminar as fracções mitocondriais. O sobrenadante recolhido é centrifugado durante lha 100000 g e a 4 °C. São recolhidos separadamente o sedimento que contém a fracção microssómica e o sobrenadante que representa a fracção citossólica. 31 A fracção microssómica ou a fracção citossólica obtidas, são incubadas respectivamente durante 90 min a 37 °C em tampão Tris/HCl 100 mM a pH 7, 3 contendo como substrato 7-desidrocolesterol 150 pm emulsionado com tween 80 (1, 5 g/L) e na presença de NADPH 2 mM. Os esteróis são extraídos por adição de 3 volumes de mistura metanol-diclorometano (50:50, v/v) depois são analisado em GC comparativamente aos produtos padrão. A formação de colesterol (TR = 15, 887 min) a partir de 7-desidrocolesterol (TR = 16, 528 min) é mostrada na figura 4 com uma fracção microssómica (3, 5 mg/mL de proteína) obtida acima a partir da levedura FY 1679 transformada com o vector delta-7/V8, induzido durante 3 h e cujos esteróis endógenos têm tempos da retenção superiores (TR = 16, 682 min para ergosta 5-22 dieno 3-ol; TR = 17, 249 min para o ergosterol e TR = 17, 664 min para o ergosta 5-eno 3-ol).

Estes resultados demonstram que a proteína delta-7Red, por um lado é expressa na levedura transformada, por outro tem uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7. EXEMPLO 2: Redução in vivo de esteróis endógenos de levedura insaturados na posição C-7

As estirpes de levedura cujos esteróis maioritários têm uma ligação dupla na posição C-5, 7 foram transformadas com o vector delta-7/V8 obtido com o exemplo 1, depois, foram cultivadas e foram induzidas como indicado no exemplo 1. Os esteróis endógenos, cujo perfil é analisado por GC, foram extraídos e 32 foram purificados por RP-HPLC como indicado no exemplo 1 utilizando a coluna C18 preparativa (100 x 4, 6 mm), depois foram identificados por IR, UV, SM e RMN. Foram utilizadas respectivamente as três estirpes seguintes: - a estirpe FY1679 descrita no exemplo 1; - a estirpe mutante erg5, denominada PLC 1051, caracterizada por uma deficiência na dessaturase do esterol C-22 que foi construída por cruzamento entre a estirpe FY1679 e a estirpe original pol5 descrita por S. W Molzahn et al. (J. Gen.

Microbiol., 72, 339-348, 1972) e a qual acumula ergosta 5, 7-dieno 3-ol. a estirpe duplo mutante erg4, 5, denominada PLC 1451, caracterizada por uma deficiência na dessaturase do esterol C-22 (erg5) e na redutase do esterol C-24 (28) (erg4), foi obtida por cruzamento entre a estirpe FY1679 e uma estirpe pol5 descrita por S. O W Molzahn et al. (já referido) tendo adquirido uma resistência espontânea à nistatina durante um rastreio sistemático de leveduras na pesquisa de mutantes de esteróis e que acumula ergosta 5, 7, 24(28) trieno 3-ol. A estirpe haplóide resultante, que contém a dupla mutação erg4, erg5, cresce na presença de galactose e do substrato não-fermentável e é auxotrófica para uracilo, triptofano e histidina. As Estirpes PLC 1051 e PLC 1451 foram depositadas na CNCM a 10 de Fevereiro de 1995, respectivamente, sob os números 1-1536 e 1-1537.

Na tabela seguinte são indicados os principais esteróis reduzidos identificados respectivamente a partir das três estirpes transformadas acima: 33

Estirpe inicial

Esterol endógeno principal Esterol endógeno inicial principal reduzido em C-7 FY 1679 ergosta-5, 7, 22-trien-3- Ergost-5-en-3-ol ol (ergosterol) (di-hidrobrassicasterol) ergosta-5, 22-dien-3-ol (brassicasterol) erg5 ergosta-5, 7-dien-3-ol ergost-5-en-3-ol PLC 1051 erg4, 5 PLC 1451

Ergosta-5, 7, 24- (28) Ergost-5, 24 (28)-dien- trien-3-ol 3-ol (ostreasterol) EXEMPLO 3: Produção de pregnenolona in vitro por quebra de esteróis endógenos de levedura reduzidos em C-7 A produção de pregnenolona é realizada utilizando o teste enzimático de quebra da cadeia lateral do colesterol in vitro descrito por Wada et al. (Arch. Biochem. Biophys., 290, 376-380, 1991), em que são incubados 260 pm de um esterol reduzido em C-7 obtido no exemplo 2 em 150 pL tampão fosfato 10 mM, pH 7, 4,

NaCl 100 mM, tween 20 a 0, 3% na presença de redutase da adrenodoxina 140 nM, adrenodoxina 1, 16 pM e citocromo P450SCC 0, 68 pM de origem bovina obtido a partir das glândulas supra-renais, por exemplo, de acordo com D. W. Seybert et al., J. Biol. Chem., 254, 12088-12098, 1979. A reacção é iniciada por adição de NADPH 150 pM. Após uma incubação de 80 min a 37 °C, a reacção é inactivada por adição de um volume de mistura de metanol-diclorometano (50:50 v/v). Os esteróis são extraídos e são analisados por GC como indicado no exemplo 1. 34 A figura 5 mostra, respectivamente, que ergosta 3-ol 5-eno (fig. 5A) , ergosta 5, 24 (28) dieno 3-ol (fig. 5B) ou ergosta-5, 22-dien-3-ol (fig. 5C) são substratos dos citocromo P450SCC e conduzem a um produto tendo um TR idêntico ao da pregnenolona obtida nas mesmas condições por produção do colesterol.

Os resultados obtidos mostram que uma levedura transformada expressando delta-7Red acumula esteróis utilizáveis directamente na preparação da pregnenolona por oxidação biológica in vitro. EXEMPLO 4: Construção de estirpes de levedura produzindo a pregnenolona ou o seu éster acético in vivo A - Construção da estirpe ELR01 contendo uma cassete de expressão para a delta-7Red de A. thaliana integrada no locus ADE2 da estirpe haplóide FY1679 do tipo a de conjugação (FY1679 Mata) a) Construção do plasmideo integrativo pADdelta-7 (pADA7): A construção do plasmideo pADA7 foi realizada como descrito na figura 6. Foi isolado o fragmento BglII (2244pb) contendo o gene ADE2 de S. cerevisiae a partir do plasmideo pASZ 11 (A. Stotz et al., Gene, 95, 91, 1990) e foi inserido no vector pBluescriptII KS+ (Stratagene) no local BamHI do local de clonagem múltipla. 0 plasmideo obtido, denominado pBS-ADE2, foi, em seguida, linearizado no seu local Stu I único e foi desfosforilado. 35

Foi obtido um fragmento com cerca de 2, 44 kb contendo o promotor GAL10/CYC1, a grelha codificante de delta-7Red (redutase Δ7 do esterol) e o terminador PGK (tPGK) a partir do plasmideo delta-7/V8, obtido no exemplo 1F pela técnica de PCR utilizando como iniciadores os oligonucleótidos seguintes 5’ GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3’ (SEQ ID N° 6) e 5’ AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3’ (SEQ ID N° 7) que foram definidos para se ligarem respectivamente à extremidade 3' de tPGK e à extremidade 3' do gene URA3. Utilizaram-se plasmideo delta-7/V8 como molde (80 ng) , os oligonucleótidos acima (0, 5 μΜ de cada), polimerase de ADN Pfu nativa (1 unidade no tampão recomendado por Stratagene) e as seguintes condições de amplificação: 35 ciclos; 1 min a 95 °C; 5 s a 95 °C; 30 s a 56 °C; 4 min 30 s a 70 °C) . O fragmento de amplificação obtido foi, em seguida, clonado nas extremidades rombas no plasmideo pBS-ADE2 linearizado acima para originar o plasmideo pADA7 em que o fragmento NotI-PstI com cerca de 4720 pb contém o gene ADE2 interrompido pela cassete de expressão da delta-7Red. b) Integração cromossómica na estirpe de levedura FY1679

Mata: O fragmento NotI-PstI (4720 pb) , isolado a partir do plasmideo pADA7 digerido com as enzimas da restrição Notl e 36

PstI, foi introduzido na levedura FY1679 Mata por transformação utilizando o método do acetato de litio descrito por D. Gietz et al. (já referido).

Os transformantes tendo integrado este fragmento por recombinação homóloga foram seleccionados pela sua resistência à nistatina, sendo este fenótipo devido à expressão da delta-7Red que converte os esteróis delta-5, 7 da levedura em esteróis delta 5.

As células transformadas foram incubadas a 28 °C, durante 4 horas, em meio completo YP descrito no exemplo 1F contendo glucose (20 g/L) e suplementado em adenina (20 mg/L) . Estas foram, em seguida, concentradas e, depois, foram espalhadas sobre meio minimo SLI-agar (bactocasaminoácidos 1 g/L; "base de azoto de levedura" 7 g/L; galactose 20 g/L; adenina 20 mg/L; agar 20 g/L) e foram incubadas durante uma noite a 28 °C para induzir a expressão do gene da delta-7Red. A ausência de suplementação com uracilo permite limitar o crescimento das células. Os clones foram recuperados, agrupados e, depois, espalhados em caixas em meio completo YP contendo galactose (20 g/L), suplementado com adenina (20 mg/L) e na presença de concentrações crescentes de nistatina (respectivamente, 0 pg/mL, 1 pg/mL, 2 pg/mL, 5 pg/mL, 20 pg/mL). No 4o dia, foram obtidos vinte clones que cresceram na concentração de 5 pg/mL em nistatina. Doze destes clones foram repicados em caixa em meio minimo WO ("base de azoto de levedura" 7 g/L sem aminoácidos, glucose 20 g/L) enriquecido com uracilo, leucina, triptofano, histidina e adenina (cada 20 mg/L). A auxotrofia para a adenina devida à interrupção do gene ADE2 foi então confirmada observando a ausência de crescimento 37 em meio mínimo WO descrito acima enriquecido com uracilo, leucina, triptofano, histidina mas isento de adenina. A presença da cassete de expressão no genoma da levedura foi controlada por amplificação por PCR a partir do ADN genómico dos clones obtidos e utilizando os iniciadores tendo sequências SEQ ID N° 6 e SEQ ID N° 7 acima. A funcionalidade do gene delta-7Red integrado foi confirmada por análise por GC da composição em esteróis acumulados na levedura e extractos por saponificação alcalina de acordo com o processo descrito no exemplo 1B com um tubo capilar SE 30 de cinco metros (Alltech). A análise mostra um perfil modificado compreendendo esteróis saturados com C-7 quando os clones são cultivados na presença de galactose. A estirpe obtida, denominada ELR01, acumula ergost-5-en-3-ol e ergosta-5, 22-dien-3-ol em vez de ergosta-5, 7, 22-trien-3-ol (ergosterol), esterol maioritário da estirpe FY1679 inicial como é mostrado na figura 7. A estirpe ELR01 construída deste modo expressa o gene delta-7Red quando é cultivada na presença de galactose devido ao controlo da transcrição pelo promotor GAL10/CYC1. Embora a unidade de expressão para a delta-7Red tenha o mesmo sentido de transcrição que o gene ADE2, não é detectável qualquer expressão da delta-7Red por análise da composição em esteróis por GC quando a cultura é realizada na presença de glucose, em consequência da repressão do promotor GAL10/CYC1. 38 Β - Construção da estirpe CDR01 contendo uma cassete de expressão para a forma madura da redutase da adrenodoxina bovina (ADRm) integrada entre os loci LEU2 e SPLl da estirpe haplóide FY1679 tipo de conjugação alfa (mat alfa). a) Construção do vector transportador E. coli - S.cerevisiae V13 0 vector V13 corresponde ao vector V8 (C. Cullin et al., já referido) que contém o marcador de selecção URA3 e uma cassete de expressão em levedura contendo o promotor GAL10/CYC1 (pG/C) e em que foi introduzido um local Sall (Sa) suplementar no local de clonagem múltipla, de acordo com o esquema de construção proporcionado na figura 8. 0 vector V8 foi digerido com as enzimas da restrição HindIII e BamHI e o fragmento BamHI-HindIII obtido (1722 pb) contendo o gene URA3 e promotor GAL10/CYC1 (designado abaixo "ura-gal"), foi sub-clonado entre os locais correspondentes do vector pUC18 (Pharmacia) digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI. 0 fragmento "ura-gal" foi amplificado por PCR a partir de 30 ng do plasmídeo obtido pUC18/"ura-gal" desnaturado durante 30 s a 95 °C, utilizando as seguintes condições: 30 ciclos; 5 s a 86 °C; 10 s a 95 °C; 40 s a 38 °C; 5 s a 55 °C e 2 min a 74 °C) , 2 unidades de polimerase de ADN Taq (Boehringer) no tampão do fabricante e 1 μΜ de cada iniciador tendo as sequências nucleotidica seguintes: 5’ GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3’ (SEQ !D N° 8) 39 e 5’ GTAAAACGAC GGCCAGT 3’ (SEQ ID N° 9) 0 iniciador SEQ ID N° 8 contém um local BamHI GGATCC idêntico ao do fragmento "ura-gal", 3 nucleótidos consecutivos ao local BamHI que não hibridam com o molde, um local Sall GTCGAC e uma sequência homóloga à do promotor GAL10/CYC1. 0 iniciador SEQ ID N° 9 emparelha com a sequência anterior ao local Hind III do local de clonagem múltipla do pUC18. 0 fragmento HindiIΙ-BamHI com 1722 pb obtido após amplificação foi digerido com Xhol e Bam Hl libertando um fragmento com 254 pb contendo o promotor GAL10/CYC1 (pG/C) que foi, em seguida, sub-clonado no vector V8 digerido com as enzimas da restrição BamHI e Xhol. 0 vector V13 resultante contém os locais de restrição permitindo de sub-clonar facilmente os ADNc codificantes para redutase da adrenodoxina bovina madura (ADRm), adrenodoxina bovina madura (ADXm) e citocromo P450SCC bovino. 0 vector V13-adr, o vector V13-ADX e o vector V13-SCC10 foram respectivamente preparados a partir do vector V13, do seguinte modo: a) Construção do vector V13-adr

Foi isolado um fragmento Sall-Kpnl, com 1478 pb, contendo o ADNc codificante para ADRm, a partir do plasmideo pGBADR-2

descrito no exemplo 25 do pedido de patente europeia EP 40 340878 e foi sub-clonado nos locais correspondentes do vector V13, para originar o vector V13-adr. β) Construção de V13-ADX vector

Foi isolado um fragmento Sall BamHI, com 390 pb, contendo o ADNc codificante para ADXm, a partir do plasmídeo pGBADX-1 descrito no exemplo 23 do pedido de patente europeia EP 340878 e foi sub-clonado nos locais correspondentes do vector V13, para originar o vector V13-ADX. γ) Construção do vector V13-SCC10

Foi isolado um fragmento SalI-EcoRI, com 1554 pb, contendo o ADNc codificante para P450SCC, a partir do plasmideo pGBSCC-10 descrito no exemplo 6 do pedido de patente europeia EP 340878 e foi sub-clonado nos locais correspondentes do vector V13, para originar o vector V13-SCC10. b) Construção dos plasmideos integrativos pCD62-l e pCD62—2: A construção dos plasmideos pCD62-l e pCD62-2 foi realizada como descrito na figura 9. 41

α) Construção do plasmídeo pFL26CD

Foi introduzido um local Notl no plasmideo pFL26 (N. Bonneaud et al., Yeast, 7, 609-615, 1991), na região intergénica que separa o gene leu2 da extremidade 5' do gene SPL1 (designado spIIA) (C. Kolman et al. , J. Bacteriol., 175, 1433, 1993) de acordo com o processo seguinte:

Foram sintetizados dois fragmentos de ADN com 704 pb e 347 pb contendo respectivamente a extremidade 5' de leu2 e a extremidade 3' de SpllA por PCR utilizado iniciadores tendo as sequências nucleotídica seguintes: 5’ TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3: <SEQ ID N° 10) e 5’ GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3' (SEQ ID N° 11) na amplificação do fragmento com 704 pb e as sequências nucleotidicas 5’ CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3’ (SEQ ID N° 12) e 5’ TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3’ (SEQ ID N° 13) na amplificação do fragmento com 347 pb.

Os iniciadores SEQ ID N° 11 e SEQ ID N° 12 possuem uma sequência GGCGGCCG que corresponde a um local Notl e em que 3 bases não emparelham com o molde. O iniciador SEQ ID N° 10 emparelha com uma sequência situada 536 pb a montante do codão de terminação de leu2 e o iniciador SEQ ID N° 13 com uma sequência situada 194 pb a montante da de spIIA. 42

Os fragmentos, são inicialmente amplificados com 704 pb e 347 pb por PCR utilizando como molde o plasmídeo pFL26 e como enzima a polimerase de ADN Pfu sob condições padrão descritas pelo fornecedor (Stratagene).

Os dois fragmentos amplificados obtidos emparelham com 20 pb ao nivel das extremidades produzidas pelo iniciador SEQ ID N° 11 (fragmento com 704 pb) e SEQ ID N° 12 (fragmento com 347 pb) a partir da extremidade 5'; estas 20 pb correspondem respectivamente aos 20 primeiros nucleótidos de cada destes iniciadores. O produto resultante do emparelhamento dos fragmentos de ADN com 704 pb (1 ng) e com 347 pb (2 ng) foi amplificado utilizando os iniciadores SEQ ID N° 10 e SEQ ID N° 13 e as condições seguintes: 30 ciclos de 10 s a 95 °C, 5 s a 60 °c, 1. min a 45 °C, 5 s a 65 °C e 2 min a 72 °C, seguidos por um ciclo de 7 min a 72 °C; 50 pmol de cada iniciador e 1 unidade de polimerase de ADN Pfu em 50 pL de tampão de reacção (Stratagene). Foi obtido um fragmento amplificado com 1031 pb contendo um local de corte NotI. Este fragmento foi digerido com as enzimas BstXI e Nsil e o fragmento com 920 pb obtido, contendo o local NotI, foi inserido no local do fragmento

BstXI-Nsil inicial de pFL26 para originar o plasmídeo pFL26CD, cujo mapa é representado na figura 9a. β) Construção do plasmídeo pCD60 - Preparação do plasmídeo PDP10036:

Foi isolado um fragmento SalI-BamHI com 390 pb contendo ADNc codificante para a adrenodoxina bovina madura (ADXm) a 43 partir do plasmídeo V13-ADX, depois, foi sub-clonado nos locais SalI-BglII do local de clonagem múltipla do plasmídeo pTG10033 que é flanqueado pelo promotor indutível GAL10/CYC1 e pelo terminador ter PGK. Foi preparado o plasmídeo pTG10033, cujo mapa é representado na figura 18 e que corresponde ao vector de expressão pTG10031 (figura 17), contendo o promotor CYC1 e terPGK, em que o promotor CYC1 foi substituído pelo promotor GAL10/CYC1 de acordo com o processo descrito abaixo. O plasmídeo assim obtido, denominado pDP10034, contém a cassete de expressão ADX ou seja o gene codificante para ADxm no controlo de transcrição de GAL10/CYC1 e terPGK. A seguir, irá ser utilizado o termo "cassete de expressão" para qualquer gene sob a dependência de transcrição de GAL10/CYC1 e terPGK.

Foi isolado um fragmento de HindIII com 3593 pb contendo o marcador de selecção URA3 e a cassete de expressão ADR a partir do plasmídeo V13-adr digerido com a enzima da restrição HindIII depois foi inserido no local correspondente do plasmídeo pDP10034 digerido com a enzima de restrição HindIII. 0 plasmídeo obtido, denominado pDP10036, contém as cassetes da expressão ADX e ADR separadas entre si pelo marcador URA3 (figura 9b) . - Preparação do plasmídeo pCD60:

Foi isolado o fragmento de AflIII-AccI com 2770 pb contendo a cassete ADR por digestão parcial do plasmídeo pDP10036 com as enzimas da restrição AflIII e Accl, foi tornado de extremidades rombas por tratamento com o fragmento de klenow da polimerase I com ADN e foi sub-clonado após ligação das extremidades rombas no local Smal do plasmídeo pBlue-Script KS+ (Stratagene). No 44 plasmídeo obtido, denominado pCD60, a cassete de expressão ADR é flanqueada de um lado e do outro por um local Notl, localizando- se um a 2 0 9 pb a montante do local de ligação AflIII/Smal e proveniente do fragmento sub-clonado e o outro proveniente do local de clonagem múltipla (SCM1) de PBlue-Script KS+ (figura 9b). γ) Construção dos plasmídeos pCD62-l e pCD62-2: 0 fragmento Notl com 2558 pb, isolado partir do plasmideo pCD60 digerido com a enzima da restrição Notl, foi, em seguida, sub-clonado no local único Notl do plasmideo pFL26CD. De acordo com o sentido da inserção do fragmento, foram obtidos dois plasmídeos, denominados pCD62-l e pCD62-2 (figura 9c).

No plasmídeo pCD62-l, a cassete de expressão ADR está orientada no sentido da transcrição do gene leu2, enquanto esta orientação está invertida no plasmídeo pCD62-2. 0 plasmídeo pCD62-l foi conservado para construções seguintes. c) Integração cromossómica na estirpe de levedura FY1679 (Matalpha): 0 plasmídeo pCD62-l contém regiões homólogas a um locus cromossómico da estirpe FY1679. Estas regiões correspondem respectivamente aos fragmentos BglII-Clal com 1060 pb (A) , EcoRI-NotI com 707 pb (B) e NotI-BglII com 602 pb (C) indicados na figura 10. 45 A região correspondente ao fragmento Clal-EcoRI com 486 pb do plasmídeo pCD62-l foi eliminada na estirpe FY1679, implicando um auxotrofia desta estirpe no que respeita à leucina (estirpe LEU2”) (R. S. Sikorski et al., Genetics, 122, 19, 1989). 0 plasmideo pCD62-l foi linearizado por digestão com a enzima da restrição Xbal cujo local de corte está situado no exterior das regiões homólogas, depois foi introduzido por transformação na estirpe FY1679 (Matalpha) utilizando o método do acetato de litio (D. Gietz et ai., já referido). A capacidade de reparação celular do ADN pela levedura ("reparação de espaços") e a selecção de recombinantes tendo o fenótipo LEU2+ permitiu seleccionar inicialmente dois tipos de recombinantes: o Io tipo é obtido após recombinações homólogas ao nível dos fragmentos A e B, o 2o tipo é obtido após recombinações homólogas ao nível dos fragmentos A e C. Apenas este último tipo da recombinação permitiu a integração da cassete de expressão ADR, além do restabelecimento do fenótipo LEU2+.

Para seleccionar este 2o tipo de clone, foi realizada uma separação por PCR utilizando o iniciador SEQ ID N° 10 acima e o iniciador tendo a sequência nucleotídica seguinte: 5’ TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3' (SEQ ID N° 14) para confirmar de cada vez a presença e a localização correcta da cassete de expressão ADR no genoma da estirpe FY1679 (Matalpha) . 46 0 14 emparelha sequência codificante para ADRm e o emparelha com uma sequência cromossómica

Neste rastreio, exclusivamente com a iniciador SEQ ID N° 10 (figura 10).

o iniciador SEQ ID N A reacção da amplificação foi realizada utilizando como molde o ADN genómico (20 ng) isolado da estirpe FY1679 (Matalpha) (C. Hoffman et al.r Gene, 57, 267, 1987), polimerase de ADN Taq (1 U, Boehringer), 50 pmol de cada iniciador e 30 ciclos de PCR (10 s a 95 °C, 1 min a 55 °C, 3 min a 72 °C) , sob as condições padrão descritas pelo fornecedor. A amplificação originou o isolamento de um fragmento com 2, 9 kb correspondente ao caso em que a cassete de expressão foi integrada. No caso contrário, não foi detectado qualquer produto de amplificação. A estirpe FY1679 (Matalpha), assim seleccionada, contendo a cassete de expressão integrada ADR, foi denominada CDR01. A expressão de ADR por esta estirpe foi detectada a partir de fracções celulares citossólicas preparadas de acordo com o protocolo descrito no exemplo 1F, por imunodetecção da proteína reconhecida por anticorpos anti-ADR. A funcionalidade da ADR expressa pela estirpe CDR01 foi confirmada pelo teste enzimático da quebra in vitro da cadeia lateral do colesterol, descrita no exemplo 3 e em que a ADR purificada (0, 28 pmol) foi substituída por uma fracção celular citossólica da estirpe CDR01 contendo 100 pg de proteínas totais. Foi observada uma proporção de bioconversão de 47 colesterol em pregnenolona de cerca de 25%, comparável com a obtida com a ADR purificada. C - Construção da estirpe diplóide EC01 co-expressando a delta-7Red de A. thaliana e ADRm. A estirpe diplóide EC01 foi obtida por cruzamento das estirpes haplóides CDR01 e ELR01 obtidas acima, de acordo com o protocolo descrito por G. Sprague et al. (Methods in Enzymology, 194, 77, 1991):

Uma primeira selecção em meio mínimo WO descrito anteriormente, enriquecido em uracilo, triptofano e histidina (cada um 20 mg/L) mas isento de leucina, permitiu isolar clones diplóides LEU2+ (carácter de prototrofia que comprova a presença da cassete da expressão ADR) . Estes clones foram, em seguida, testados para a sua resistência à nistatina a 5 pg /mL (carácter da resistência que comprova a presença da cassete de expressão delta-7Red) em meio sintético sólido SLI-agar descrito anteriormente.

Foi, assim, isolada arbitrariamente, de entre os clones resistentes à nistatina, uma estirpe denominada EC01. 48 D - Construção da estirpe EC01/pCD63 produtora de pregnenolona e 3-acetato de pregnenolona. a) construção do plasmídeo da expressão pCD63 A construção do plasmídeo pCD63 foi realizada como descrito na figura 11.

Foi isolado o fragmento Notl com 4961 pb contendo a cassete de expressão ADX, o marcador de selecção URA3 e a cassete de expressão ADR a partir do plasmídeo pDP10036 preparado acima e foi digerido com a enzima da restrição Notl, depois, foi clonado no local Notl do local de clonagem múltipla do plasmídeo pFL45L (N. Bonneaud et al., Yeast, 7, 609, 1991) . O vector, assim, obtido, denominado pDP10037 é representado na figura 11.

Por um lado, o plasmídeo pDP10037 foi linearizado por digestão com a enzima Tthllll cujo local de corte se situa no gene codificante para ADRm.

Por outro lado, foi purificado um fragmento PvuII-EcoRV com 3476 pb contendo a cassete de expressão P450SCC e a extremidade 5' do marcador URA3 a partir do plasmídeo V13-SCC10 obtido anteriormente e foi digerido com as enzimas de restrição PvuII e EcoRV.

Os dois ADN lineares, obtidos respectivamente, têm regiões homólogas que correspondem, por um lado, à extremidade 5' do gene URA3 e a GAL10/CYC1, por outro lado, a ter PGK tal como é representado na figura 11a. 49

Estes dois fragmentos foram, em seguida, introduzidos na estirpe de levedura FY1679 (Mata) por co-transformação pelo método do acetato de lítio (D. Gietz et ai., já referido). A selecção seguinte de recombinantes prototróficos para uracilo e triptofano (URA3 + , TRP1 + ) , permitiu isolar clones em que a quebra da cadeia dupla produzida por digestão com a enzima da restrição Tthllll foi reparada em consequência da integração da cassete de expressão P450SCC por recombinação homóloga. A selecção de recombinantes (URA3+, TRP1+) foi realizada em meio mínimo WO enriquecido em leucina, histidina e leucina (cada um 20 mg/L) mas isento de uracilo e triptofano. O ADN total foi extraído pelo método descrito por C. Hoffman et al., (Gene, 57, 267, 1987) a partir de 50 clones reunidos, depois, foi introduzido por electroporação na estirpe de E. coli XLl-blue (Stratagene). Os clones transformados pelo plasmídeo produzido por "reparação de espaços" foram seleccionados em meio LB rico (triptona a 1%, extracto de levedura a 0, 5%, NaCl a 1%) contendo ampicilina 50 mg/L. Foi extraído o plasmídeo denominado pCD63, a partir de um dos clones seleccionados, de acordo com o método descrito por J. Sambrook et al., Molecular Clonlng, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. O plasmídeo pCD63 obtido contém as cassetes da expressão ADX e P450SCC separadas pelo marcador da selecção URA3, como está representado na figura 11b. b) Transformação da estirpe EC01 pelo plasmídeo pCD63 O plasmídeo pCD63 foi introduzido na estirpe EC01, obtida acima, por transformação pelo método do acetato de lítio (D. Gietz et al., já descrito). A levedura transformada foi, em 50 seguida, cultivada em meio mínimo WO descrito anteriormente e isento de uracilo, triptofano, adenina e leucina, mas suplementado com histidina (20 mg/L).

Foi, deste modo, isolada a estirpe, denominada EC01/pCD63. Foi depositada uma amostra da estirpe na CNCM a 10 de Fevereiro de 1995, sob o número 1-1538, sob a referência EC01/pCD63. c) Produção de pregnenolona e 3—acetato de pregnenolona in vivo. A estirpe EC01/pCD63 foi cultivada a 28 °C em aerobiose (130 rpm) num Erlenmeyer de 3 litros até que esta atingiu a fase estacionária de crescimento (DO600 = 12 a 13) em meio selectivo SGI descrito no exemplo IA e em que a concentração de glucose é 5 g/L. A cultura é, em seguida, diluída por adição de um volume de meio completo YP descrito acima, depois, por adição de etanol (0, 5% v/v) como fonte de carbono. Quando foi obtida uma nova fase estacionária de crescimento (D0600 = 12 a 13), é adicionada galactose (20 g/L) à cultura, sob a forma de solução concentrada (500 g/L), para induzir, simultaneamente, a expressão dos genes codificantes para ADXm, ADRm, P450SCC e delta-7 Red que estão, respectivamente, sob o controlo do promotor GAL10/CYC1. A co-expressão dos quatro genes foi detectada por análise dos esteróis acumulados, respectivamente, nas células e no sobrenadante da cultura de acordo com o processo seguinte: São recolhidas amostras de 50 mL da cultura após 9 h e 24 h de indução. Cada amostra é centrifugada (4000 g, 10 min, 4 °C) de forma a separar as células do meio de cultura. 51

Por um lado, as células são lisadas por quebra mecânica na presença de esferas de vidro de acordo com o método indicado no exemplo 1F. São, em seguida, extraídos os esteróis intracelulares a partir do lisado deste modo obtido, por adição de um volume de hexano.

Por outro lado, os esteróis presentes no meio de cultura são extraídos directamente por adição de um volume de hexano. A composição em esteróis extraídos é analisada por GC como indicado no exemplo 1, comparativamente a produtos padrão.

Na figura 12a e na figura 12b são mostrados respectivamente os resultados obtidos após 9 horas ou 24 horas de indução.

Após 9 horas de indução, a figura 12a mostra: a presença de um composto maioritário tendo um tempo de retenção idêntico ao do acetato de pregnenolona padrão (TR = 11, 8 min), enquanto que está presente um pico, apenas muito fraco, no tempo de retenção da pregnenolona (TR =9,9 min), no lisado celular. São identificadas pequenas quantidades de esteróis endógenos da levedura reduzidos em C-7 (ergosta-5-en-3-ol e ergosta-5,22-dien-3-ol) , respect ivamente no TR = 18 min e no TR = 17 min. A saponificação alcalina do lisado celular antes da análise leva à presença de um composto maioritário co-migrante com a pregnenolona. Isto permite confirmar que o composto acumulado tendo um TR de 11, 8 min corresponde ao acetato de pregnenolona. 52 a ausência significativa de pregnenolona ou do seu acetato no meio de cultura.

Após 24 horas de indução, a figura 12b mostra: a presença de peguenas quantidades de pregnenolona (TR = 10, 2 min) e de acetato de pregnenolona (TR = 12 min) assim como de esteróis endógenos da levedura reduzidos (TR = 17 min e TR = 18 min), no lisado celular. O colesterol (TR = 16, 2 min) é um padrão interno adicionado antes da extracção. a presença maioritária de acetato de pregnenolona e uma quantidade menor de pregnenolona, no meio de cultura.

As experiências realizadas em paralelo com a estirpe EC01 transformada com um plasmideo de controlo, tal como pFL45L, já referido, não mostraram qualquer pico correspondente à pregnenolona livre ou sob a forma de acetato. A identificação de esteróis assim realizada mostra que a estirpe de levedura EC01/pCD63 acumulou pregnenolona e acetato de pregnenolona na ausência de qualquer fonte exógena de esteróis, após indução na presença de galactose, com uma produção mais significativa após uma indução de 9 horas.

Estes resultados mostram, por um lado, à mobilização eficaz dos esteróis endógenos reduzidos na posição C-7 da estirpe EC01, por outro a eficácia extrema de ligação da reacção de corte da cadeia lateral de esteróis endógenos. 53 TABELA RECORDATORIA DAS ESTIRPES INTEGRADAS.

Estirpes Locus de integração Gene integrado Plasmideo Transformante Marcador plasmídico Gene(s) no plasmideo Marcadores de selecção CDR01 (Mata) intergénica Leu2-SPL1 ADRm HIS3, URA3, TRP1 ELR01 (Mata) ADE2 Delta-7Red ADE2, URA3, LEU2, HIS3, TRP1 ECO 1 (diplóide) intergénica Leu2-SPL1 + ADE2 ADRm Delta-7Red HIS3, URA3, TRP1 EC01/pCD63 intergénica Leu2-SPL1 + ADE2 ADRm Delta-7RED PCD63 URA3 TRP1 ADXm P450SCC HIS3

Preparação de exemplo 4: construção do plasmideo pTG10033 1. Derivado de pUC19 tendo um novo local de clonagem múltipla: 0 vector de clonagem M13mpl9 (C. Yanish-Peron et al., Gene, 33, 103, 1985) foi mutagenizado utilizando o oligonucleótido seguinte 5’ GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3: SEQ ID N° 15 para introduzir um local Notl na seguência do gene lacl truncado e originar o plasmideo M13TG724.

Foi, em seguida, introduzido um "local de clonagem múltipla" contendo os locais EcoRI, SnaBI e Notl no local EcoRI do plasmideo M13TG724 utilizando os oligonucleótidos seguintes 54 5’ AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3’ SEQ ID N° 16 e 5’ AATTCATACG TACGCGGCCG C 3' SEQ ID N° 17 para originar o plasmideo M13TG7244 em que foi observada uma modificação da inserção durante a etapa da amplificação. A inserção do plasmideo M13TG7244 tem a sequência nucleotidica seguinte GAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT em que os locais EcoRI, SnaBI e Notl estão sublinhados e a sequência lacZ do pUC19 está em itálico.

Após a digestão de plasmideo M13TG7244 com as enzimas da restrição EcoRI e SstI, foi introduzido um local de clonagem múltipla contendo os locais MluI e Avrll, utilizando os oligonucleótidos seguintes 5’ CAACGCGTCC TAGG 3' SEQ ID N° 18 e 5’ AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3’ SEQ ID N° 19.

Após digestão com a enzima PvuII, o fragmento PwII obtido foi sub-clonado em pUC19 (C. Yanish-Perron et al. já referido) para originar o plasmideo pTG7457 (figura 13). 55 2. Sub-clonagem do terminador PGK:

Foi digerido pUC19 com as enzimas da restrição BamHI e EcoRI e foi introduzido um novo "local de clonagem múltipla" BamHI SstI utilizando os oligonucleótidos seguintes 5’ GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3' SEQ iD N° 20, 5’ AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3’ SEQ !D N° 21 5’ CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 3’ SEQ ID N° 22 e 5’ AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3’ SEQ ID 23

Foi, assim, obtido o plasmideo pTG7453 (figura 14) depois foi, em seguida, digerido com as enzimas da restrição BamHI e SstI. Foram introduzidos os locais do "local de clonagem múltipla" entre BamHI e SstI num derivado do plasmideo pTG7457 obtido acima e foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e SstI. 0 novo plasmideo obtido contém os locais PvuII, HindIII, BamHI, EcoRI, Xbal, Smal, BglII, SstI (= Saci), MluI, Avrll, EcoRI, SnaBI, Notl, SnaBI, Pvul.

Este novo plasmideo foi digerido com as enzimas de restrição BglII e HindIII e foi inserido um fragmento BglII-HindIII contendo o promotor PGK (R. A. Hitzeman et al., Nucleic Acids Res., 10, 7791, 1982; G. Loison et al., Yeast, 5, 497, 1989) neste para originar o plasmideo pTG10014 (figura 15). 56 3. Sub-clonagem de promotores: a) promotor CYC1

Foram introduzidos os locais do "local de clonagem múltipla" entre BamHI e SstI do plasmídeo pTG7453 num derivado do plasmídeo pTG7457 como indicado acima. 0 novo plasmídeo obtido foi quebrado com a enzima da restrição SnaBI, depois, foi introduzido o fragmento Rsal-Dral com 456 pb do plasmídeo pEMBL8 (L. Dente et al., Ácido Nucleico Res., 11, 1645, 1983), contendo a origem de replicação do fago fl para originar o plasmídeo pTG7503.

Foi sub-clonado o fragmento BamHI HindIII com 0, 78 kb do plasmídeo pGBSCC-9, preparado no exemplo 6 do pedido de patente europeia EP 0340378 e contendo o promotor CYC1 de S. cerevisiae, um "local de clonagem múltipla" e o terminador da lactase de K. lactis, no plasmídeo pTG7503 digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI para originar o plasmídeo pTG10004 (figura 16).

Foram, em seguida, eliminados os locais Xhol e MluI do promotor CYC1 por mutagénese dirigida do ADN de cadeia dupla do plasmídeo pTG10004 utilizando o oligonucleótido seguinte 5’ GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3’ SEQ ID N° 24. O plasmídeo pTG10005 deste modo obtido foi, em seguida, digerido com as enzimas da restrição Sall e Xhol, depois foi introduzido um local MluI utilizando os oligonucleótidos seguintes 57 5’ TCGACGGACG CGTGG 3’ SEQ ID N* 25 e 5' TCGACCACGC GTCC 3' SEQ ID N° 26 para originar o plasmídeo pTG10006. b) promotor GAL10/CYC1 0 plasmídeo pYeDPl/8-2 (C. Cullin et al., Gene, 203, 1988) foi aberto com a enzima de restrição Xhol. As extremidades coesivas criadas foram preenchidas utilizando o fragmento de Klenow da polimerase de ADN, depois, o plasmídeo foi religado. 0 plasmídeo pTGlOOlO deste modo obtido em que o promotor GAL10/CYC1 já não contém o local Xhol é utilizado como molde para uma amplificação por PCR. 4. Construção do vector de expressão pTG10031 A parte restante da sequência codificante lacZ foi eliminada no plasmídeo pTG7503 por mutagénese dirigida, utilizando o oligonucleótido seguinte S TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3' SEQ ID N° 27 para originar o plasmídeo pTG7549. O promotor LacZ presente no plasmídeo pTG7549 foi, em seguida, eliminado utilizando os oligonucleótidos seguintes 58 5’ GGCCGCAAAA CCAAA 3’ SEQ ID N° 28 e 5’ AGCTTTTGGT TTTGC 3' SEQ ID N° 29 que são inseridos no plasmídeo digerido previamente com as enzimas da restrição Notl e HindIII e que restauram os dois locais para originar o plasmideo pTG7553.

Foi obtido um fragmento BamHI MluI contendo o promotor CYC1 a partir do plasmideo pTG10006 digerido com as enzimas de restrição BamHI e MluI e foi isolado um fragmento MluI HindIII contendo de promotor PGK a partir do plasmideo pTG10015 digerido com as enzimas da restrição MluI e HindIII. Estes dois fragmentos foram ligados e o produto de ligação obtido foi inserido no plasmideo pTG7553 digerido previamente com as enzimas da restrição MluI e HindIII. 0 oligonucleótido seguinte 5’ GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3’ SEQ ID N° 30 hibrida com o oligonucleótido seguinte 5' CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3’ SEQ ID N° 31. que constitui um "elemento de ligação" BamHI MluI contendo os locais Clal e Notl, foi adicionado e ligado para originar o vector de expressão pTG 10031 (figura 17). 59 0 fragmento amplificado por PCR obtido acima, a partir do plasmideo pYeDPl/8-2 foi digerido com as enzimas da restrição Ciai e Sall, depois, foi introduzido no plasmideo pTG10031 digerido previamente com as mesmas enzimas de restrição para originar o plasmideo pTG10033 (figura 18). LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (i) REQUERENTE:

(A) NOME: ROUSSEL UCLAF (B) RUA: 102, Route de Noisy

(C) CIDADE: ROMAINVILLE

(E) PAÍS: FRANÇA (F) CÓDIGO POSTAL: 93230 (G) TELEFONE: 49914991 (H) TELEFAX: 49914610 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Sequência de ADN codificante para uma proteína de A. Thaliana tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7, proteína delta-7-red, processo de produção, estirpes de leveduras transformadas, utilizações. 60 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 31 (iv) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete (B) COMPUTADOR: PC IBM compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Série n° 1.0, Versão n° 1.30 (OEB) (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: FR 9501723 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 15-FEV-1995 (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: FR 9506517 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 01-JUN-1995 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1496 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (VI) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 61

(ix) CARACTERISTICA

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 76..1365 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1: GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAO AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACCAAGAGAA 60 AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCC GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111

Met Ala Glu Thr vai His Ser Pro Ile vai Thr Tyr 1 5 10 GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159 Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu 15 20 25 CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207 Leu Trp Tyr Thr Met Vai His Gin Asp Gly Ser val Thr Gin Thr Phe 30 35 40 GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255 Gly Phe Phe Trp Glu Aan Gly Vai Gin Gly Leu Ile Aen Ile Trp Pro 45 50 55 60 AGA ccc ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303 Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe 65 70 75 «AA CCT ATT CTT CAC CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GCT CCA 351 Glu Ala Ile Leu Gin Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Clu Gly Pro 80 85 90 ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399 lie Ser Pro Ala Gly Aen Arg Pro Vai Tyr Lys Ala Aan Gly Leu Ala 95 100 105 CCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447

Ala Tyr Phe Vai Thr Leu Ala Thr Hie Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly 110 115 120 ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495

Ile Phe Αβη Pro Ala Ile vai Tyr Aep Hie Leu Gly Glu Ile Phe ser 125 130 135 140 62 543 gca cta ata ttc gca agc ttc ata ttt tgt gtt ttg ttg tac ata aaa Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Vai Leu Leu Tyr Ile Lya 145 150 155 GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GCT AAC CTA Gly Kis Vai Ala Pro Ser Ser Ser Aep Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu 160 165 170 591 ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG Ile Ile Aep Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lya 175 180 185 639 AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT Ser Phe Aep Ile Lya Vai Phe Thr Aan Cya Arg Phe Gly Met Met Ser 190 195 200 687 TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT Trp Ala Vai Leu Ala Vai Thr Tyr Cya Ile Lya Gin Tyr Glu Ile Aan 205 210 215 220 735 GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTC AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG Gly Lya Vai Ser Aap Ser Met Leu Vai Aan Thr Ile Leu Met Leu Vai 225 230 235 783 TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA CCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG Tyr Vai Thr Lya Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Aan Thr Met 240 245 250 831 GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA Aap Ile Ala Hia Aap Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cya Leu 879 255 260 265 927 GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC Vai Trp Vai Pro Ser Vai Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Vai Aan 270 275 280 975 CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA Hia Pro Vai Glu Leu Gly Thr Gin Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Vai Ala 285 290 295 300 GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA Gly Ile Leu Cya Ile Tyr Ile Lya Tyr Asp Cya Aap Arg Gin Arg Gin 305 310 315 63 1023 CA<S TFÇ AGG AGÔ ACA AAC OOC AAA TST TTC STT TOO CCA AOA GCC GCG 1071 Glu FAe Arg Arg Thr Aan Qly Lys éye Leu Vai Trp Gly Arg Ala Pre 32Q 325 330 TCh AAC ATT GTO SCO TÇS TAT ACf A CA AÇA TCT CGT CAA ACT AAA ACT 1110 Ser Lye fie Vai Ala Ser Ty* Thr Thr Thr Ser OXy 01« Thr Lya Thr 335 340 345 ACT CTT CTC TTA ACG TCT CCA TOO TGC GOA TTS OCT OS*? CAT TTC CAT 1167 Ser Leu t,eu Lsa Thr Ser Sly Trp Trp Giy Le» Ala Arg Kis Phe «ia ISO 355 350 TAT GTT CCT GA6 ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGC ACC GTA cco CCX CTC 1315 tye Uai Pro Clu Ile Leu Ser Ala Pha Phe Trp Thr Vai Pró Ala Leu 16S 370 375 3SO TTC CRT AAC TTC TTC GCA TAC TTC TAC CTC CTC ACC CTT CTT CTC ΤΤΪ 1263 Fhe λβρ Aef* Phe Leu Ala Tyr Ph® Tyr Vai Leu Thr Leu Leu Leu Phe 3S§ 390 355 GAT GOA GCC AAC AGA GAG <3AT GftC CGA SGC CSA TCA AAG TAT CCS AAA 1311 Asp Arg Ala tya Aíg Asp Aap Aap Arg Cye Arg Ser Lya Tyr eiy Lye 400 40S 410 TAT TOC AAG CTC TAT TGT CAG AAA GTC AAA TÁC ACÕ ATC ATT cc« OCA 13S» 'Syr Trp tym Leu Tyr Cya Glw tye Vai Lys Tyr Arg fie Ue Pr© Ôly

415 420 42S ATT TAT TGATTOT&&C GAAGTCTGTF GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415 sle Tyr 430 GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT SCAAATTêAT OCG&TAGACA 1475 TTCTTTTGCT CARAAAAAAA A 1436 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 430 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 64 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 2:

Me& Ala Glu Thr Vai Hia Ser Pre lis Vai Thr Tyr Ala Ser Hat Lee

1 S 10 IS

Mah vai tile Gin Aep Gly ser vai Thr ©In Thr Phe Gly Phe Ph© Trp 33 40 45 ©1« Aen Gly vai Gin Gly L«u Hm A®« lie frp Pr© Ar© Pr© Thr Leu 50 55 60 lie Ais Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Ph® GIu Ala lie Leu 69 70 7$ 60

Gly Ser Phe Ile Ph® Cya vai Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Vai Ala 145 150 155 160

169 170 17S

Lye Vai Phe Thr Asn Cya Arg Phe Gly Hat Hat Ser Trp Ala Vai Leu 19S 200 205 65

Ala Val Thr Tyr Cye Ile Lys Gin 210 215

Aep Ser Met Leu Val Asn Thr Ile .225 230

Phe Phe trp Trp Glu Ala Giy Tyr 245

Aep Arg Ala Gly Phe Tyr He Cy® 260

Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met 215 250

Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser 220

Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys 235 240

Tyr Leu Val Asn Mis Pro Val Glu 255

Leu Gly Thr Gin Leu Ala He Tyr Ile Leu val Ala Gly Ha Leu cye 290 295 300

He Tyr He Lys Tyr Aep Cye Aap Arg Gin Arg Gin Glu Phe Arg Arg 305 310 31S 320 thr Asn Gly Lys Cye Leu val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Vai 325 330 335

Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lye Thr Ser Leu Leu Leu 340 34$ 350

Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg Mis Phe Hls Tyr Val Pro Glu 35$ 350 355

He Leu Ser Ala Fhe Phe Trp Thr vai Pro Ala Leu Phe Aep Asm Phe 370 375 350

Leu Ala Tyr Phe tyr val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Aep Arg Ala Lys 3SS 390 395 400

Arg Asp Asp Asp Arg Cya Arg Ser tya Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu 405 410 41$ tyr Cye Glu Lye Val Lys Tyr Arg Lie Ile Pro Gly Ile Tyr 420 425 430 66 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 7 ou (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota = "resíduo 7 = Trp Tyr " (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 12 ou (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota = "resíduo 12 = His Lys" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3: L@u X&& Xaa Gly Trp Xaa Gly Xa* Xaa Arg X&a Xaa xaa Tyr

1 S 10 IS 67 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: 10..29

1 DE (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota = "SEQUÊNCIA ID N° . 76 A 95" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 4: CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 29 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 68 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (10..28) 1 de (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/nota = "SEQUÊNCIA ID N° . COMPLEMENTAR A 1350 A 1368" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 5: CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 28 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..23) 69 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6: GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 23 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 7: AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 29 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" 70 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 8: GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 46 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..17) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 9: GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples 71 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 10: TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..38) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 11: GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 38 72 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 12: CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 34 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: caracteristica_misc 73 (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..25) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 13: TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..20) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 14: TACATTAGGT CCTTTGTAGC 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: nucleótido 74 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 15: GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 25 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 16: AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: nucleótido 75 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..21) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 17: AATTCATACG TACGCGGCCG C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 18: CAACGCGTCC TAGG 14 76 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..22) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 19: AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 77 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 20: GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° : 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..39) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 21: AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 39 78 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 22: CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 34 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" 79 (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..28) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 23: AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 28 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 24: GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 40 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 80 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 25: TCGACGGACG CGTGG 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..14) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 26: TCGACCACGC GTCC 14 81 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 27: TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 35 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" 82 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 28: GGCCGCAAAA CCAAA 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..15) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 29: AGCTTTTGGT TTTGC 15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 83 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 30: GATCTATCGA TGCGGCCGCG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: característica_misc (B) LOCALIZAÇÃO: complemento (1..20) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 31: CGCGCGCGGC CGCATCGATA 20

Lisboa, 20 de Abril de 2010 84

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de ácido de nucleico contendo uma sequência codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5,7 que apresenta uma identidade da sequência de cerca de 60% e superior com a sequência SEQ ID N° 1.
2. Sequência de ácido de nucleico de acordo com a reivindicação 1, em que o ácido nucleico é ADN ou ARN.
3. Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência codificante codifica para uma proteína de A. thaliana tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e tendo a sequência nucleotídica da sequência SEQ ID N° 1:
4. Sequência de ADN codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e amplificável pela técnica de PCR, utilizando, como iniciadores, oligonucleótidos codificantes para uma sequência de consenso tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 3: Leu Leu xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 15 10 15 em que Xaa na posição 7 é Trp ou Tyr e Xaa na posição 12 é His ou Lys associados com um iniciador oligodT. 1
5. Proteína de A. thaliana tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 e tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 2.
6. Proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 tendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de sequência de cerca de 60% e superior com a sequência SEQ ID N° 2.
7. Proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5,7, tal como obtida por expressão numa célula hospedeira contendo uma sequência de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
8. Proteína de A. thaliana tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 tal como obtida por expressão numa célula h8te contendo uma sequência de ADN codificante para a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 2.
9. Proteína de acordo com a reivindicação 7 ou reivindicação 8, em que a célula hospedeira é uma levedura.
10. Anticorpo dirigido contra uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5,7, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9.
11. Vector de expressão contendo uma sequência de ADN, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
12. Célula hospedeira transformada por um vector, de acordo com a reivindicação 11. 2
13. Processo de clonagem de um ácido nucleico codificante para uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7 num microrganismo compreendendo um método de rastreio seleccionado de entre: - resistência do microrganismo à nistatina ou a um composto análogo cuja toxicidade dependa da presença de esteróis contendo uma insaturação na posição C-7, hibridação do ácido nucleico com a sequência nucleotídica da sequência SEQ ID N° 1,
14. Célula hospedeira transformada de acordo com a reivindicação 12, em que o hospedeiro é uma levedura ou um fungo filamentoso.
15. Processo de preparação de uma proteína tendo uma actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5,7, em que se cultiva uma célula hospedeira transformada de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14 e se isola a proteína expressa.
16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que a célula hospedeira é uma levedura transformada em que a sequência de ADN codificante é colocada sob o controlo de um promotor de levedura.
17. Processo de redução in vitro de um esterol insaturado na posição C-7, em que, se incuba o esterol a ser reduzido com a proteína obtida de acordo com a reivindicação 15 ou reivindicação 16 e se isola, opcionalmente, o esterol reduzido obtido. 3
18. Processo de redução in vivo de um esterol exógeno insaturado na posição C-7, em que, se incuba o esterol com uma célula hospedeira transformada de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14 e se isola, opcionalmente, o esterol 10 reduzido obtido.
19. Processo de redução in vivo de um esterol endógeno insaturado na posição C-7, em que se cultiva uma estirpe hospedeira transformada de acordo com a reivindicação 14 e, se isola, opcionalmente, o esterol reduzido acumulado.
20. Processo de redução in vitro ou in vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, em que o esterol reduzido obtido é um substrato da enzima de quebra da cadeia lateral do colesterol (P450SCC) .
21. Processo de redução in vivo de acordo com a reivindicação 20 em que o esterol endógeno a reduzir é ergosta-5,7-dien-3-ol, ergosta-5,7,24(28)-trien-3-ol ou ergosta-5,7,22-trien-3-ol ou uma sua mistura.
22. Processo de produção de pregnenolona, em que se cultiva uma célula hospedeira transformada de acordo com a reivindicação 14, se isola, opcionalmente, o ou os esteróis endógenos reduzidos na posição C-7 acumulados, se incuba os esteróis reduzidos na presença de P450SCC e, opcionalmente, de redutase de adrenodoxina (ADR) e adrenodoxina (ADX) e se isola, opcionalmente, a pregnenolona obtida.
23. Processo de acordo com a reivindicação 22, em que a célula hospedeira é uma levedura. 4
24. Células de levedura transformadas expressando uma redutase em delta-7 do esterol delta 5, 7.
25. Estirpe de levedura transformada co-expressando uma proteína tendo actividade redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7, P45oSCC, ADR e ADX e acumulando pregnenolona livre ou esterifiçada.
26. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 25, em que a proteína tendo a actividade redutase em delta-7 do esterol delta 5, 7 é a proteína de A. thaliana delta-7Red.
27. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 26 denominada BC01/pCD63, depositada na CNCM a 10 de Fevereiro de 1995, sob o número 1-1538.
28. Processo da produção de pregnenolona, em que se cultiva uma levedura transformada por um ou mais vectores permitindo a co-expressão de uma proteína tendo actividade redutase em delta-7 do esterol delta 5, 7 e P450SCC e, opcionalmente, ADR e ADX e se isola, opcionalmente, a pregnenolona livre ou esterifiçada.
29. Processo de produção de pregnenolona, em que se cultiva uma levedura de acordo com a reivindicação 24.
30. Processo de acordo com a reivindicação 29, em que a proteína tendo a actividade redutase em delta-7 do esterol 5, 7 delta é a proteína de A. thaliana delta-7Red. 5
31. Processo de acordo com a reivindicação 30, em que a estirpe de levedura é a estirpe ECOI/pCD63, depositada na CNCM a 10 de Fevereiro de 1995 sob o número 1-1538.
32. Método de detecção da deficiência na redutase em delta-7 do esterol delta-5, 1, que compreende a incubação de uma amostra contendo ADN genómico humano com uma sonda de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em condições de hibridação padrão e a detecção da fixação ou da ausência de fixação da sonda ao ADN genómico, indicando, a ausência de fixação ou a sua redução, uma deficiência congénita na redutase em delta-7 do esterol delta-5, 7. Lisboa, 20 de Abril de 2010 6