FR2961218A1 - Methode de detection de composes modulateurs du metabolisme du cholesterol - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet une méthode d'identification de composés modulateurs du métabolisme du cholestérol par la détection d'activités enzymatiques intervenant dans la synthèse ou le catabolisme du cholestérol. Cette méthode permet de s'affranchir du risque létal pour les cellules de mammifère lorsque le cholestérol diminue, grâce à l'utilisation de levures génétiquement modifiées dont la survie n'est pas strictement dépendante de la production de cholestérol.

Description

Méthode de détection de composés modulateurs du métabolisme du cholestérol La présente invention a pour objet une méthode d'identification de composés modulateurs du cholestérol par la détection d'activités enzymatiques intervenant dans la synthèse ou le catabolisme du cholestérol. La présente invention a également pour objet l'utilisation des composés détectés dans le traitement de pathologies cardiovasculaires ou du métabolisme. Le cholestérol est le stérol animal le plus important. Il est un composant fondamental des membranes cellulaires, dont il contrôle la fluidité, et est présent dans tous les tissus animaux et particulièrement dans le cerveau. Les dysfonctionnements dans sa synthèse et son catabolisme sont liés à de nombreuses pathologies : athérosclérose, angine de poitrine, accident cardio-vasculaire, syndrome métabolique, diabète, syndrome de Smith-Lemli-Opitz... La détection de molécules capables de moduler le taux de cholestérol dans l'organisme est donc une avancée essentielle dans la lutte contre toutes ces pathologies.

Des inhibiteurs de la synthèse ou activateurs du catabolisme du cholestérol sont connus, tels que le triparanol inhibiteur de DHCR14 / stérol-014 réductase, DHCR24 / stérol-024 réductase, DHCR7 / stérol-07 réductase et A8-7 isomérase, AY9944 inhibiteur de DHCR7 / stérol-07 réductase (J. Sanchez-Wandelmer et al 2009), SR31747 inhibiteur de stérol A8-7 isomérase (R. Paul et al 1998), Amorolfine inhibiteur de DHCR14 / stérol-014 réductase et stérol A8-7 isomérase (A. J. Carrillo- Munoz et al ; 2006). Mais les pathologies liées au cholestérol sont nombreuses et nécessitent de nouveau progrès dans les traitements et donc de nouvelles méthodes pour étudier et détecter de modulateurs potentiels du métabolisme et du transport du cholestérol.

L'état de la technique décrit l'utilisation de milieux de sélection où l'augmentation de la concentration en cholestérol entraine une résistance aux toxines, aux antibiotiques ou aux antifongiques. La mise en contact d'une cellule produisant du cholestérol avec un activateur de la synthèse du cholestérol augmente la quantité de cholestérol de la cellule. Cela entraine une résistance à la toxine du milieu de sélection utilisé, ou à l'antibiotique ou antifongique utilisé et donc une croissance des cellules (voir le brevet européen EP0727489 B1). De même, un inhibiteur des enzymes de synthèse du cholestérol ou un activateur des enzymes catabolisant le cholestérol entraine une mort des cellules. La disparition du cholestérol est délétère pour la vie de la cellule, en particulier pour les cellules de mammifères utilisées jusqu'à présent. Cela ne permet donc pas la découverte de nouveaux modulateurs du métabolisme ou du transport du cholestérol. Une méthode simple et efficace de détection de ces modulateurs est donc recherchée. La demanderesse a montré, de façon surprenante, en utilisant des levures, qu'il était possible de détecter des modulateurs du cholestérol grâce à des milieux permettant une sélection inverse, où le cholestérol entraine une moindre résistance aux toxines. Ce qui permet une détermination des inhibiteurs de la synthèse du cholestérol et/ou des activateurs du catabolisme du cholestérol lorsque l'on observe une résistance aux toxines. De manière avantageuse, les cellules de levure produisant le cholestérol utilisées dans ce test sont des levures génétiquement modifiées. En effet, à l'état naturel, les levures produisent de l'ergostérol. La demanderesse utilise des levures génétiquement modifiées afin de détourner la production d'ergostérol pour produire du cholestérol. Dans un mode de réalisation de l'invention, les levures sont modifiées comme mentionné dans le brevet EP 0727489B1 ou par délétion des gènes de la famille ERG non essentiels (ERG 6, ERG 5, ERG 4, ERG 2 et ERG 3).

Une façon d'obtenir ce type de levures est également décrite dans la demande de brevet internationale W02005/121315 (Aventis Pharma). Les enzymes de la fin de la synthèse et du catabolisme de l'ergostérol ou du cholestérol décrites dans la présente demande ne sont pas essentielles à la levure sauvage ni à la levure modifiée pour produire du cholestérol ; leur activation ou inhibition n'a donc pas de lien avec la croissance ou la mort de ces levures.

Cela permet donc de d'étudier des modulateurs du cholestérol sans avoir de problème de survie de ces cellules : en effet, sans cholestérol les cellules de mammifères, utilisées jusque là pour ce genre de tests, meurent. Il est donc impossible d'observer l'effet de composés diminuant la synthèse de cholestérol puisque les cellules meurent dès que le taux de cholestérol est insuffisant. La présente invention permet la résolution de ce problème grâce à l'utilisation de levures génétiquement modifiées où la survie de la cellule n'est pas strictement dépendante de sa production de cholestérol. L'invention objet de la présente demande fournit donc une nouvelle alternative aux moyens de détection de modulateurs de la synthèse du cholestérol. Elle consiste à transformer des levures génétiquement pour qu'elles produisent à la fois du cholestérol et des enzymes liées au catabolisme du cholestérol. Les levures recombinantes sont mises en contact avec un composé potentiellement modulateur du cholestérol sur un milieu initialement toxique pour les levures productrices de cholestérol. L'observation de la restauration de croissance des levures ou au contraire de la mort des levures permet de déterminer si le composé testé inhibe ou accroît la production de cholestérol par les levures. Les levures utilisées peuvent être des Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (lactis et autres) ou Pichia pastoris.

De manière avantageuse les levures utilisées sont Saccharomyces cerevisae. Les composés qui induisent la diminution de la quantité de cholestérol produite soit par inhibition de sa synthèse soit par activation de son catabolisme confèrent une restauration de croissance des cellules sur un milieu initialement toxique pour ces cellules. Par cette méthode de détection de croissance dépendante du taux de cholestérol, des inhibiteurs des enzymes impliquées dans la synthèse du cholestérol et/ou des activateurs du catabolisme du cholestérol sont ainsi mis en évidence. De telles enzymes peuvent être : DHCR14, DHCR24, DHCR7 et 08-07stérol isomérase pour la synthèse du cholestérol.

De même cette méthode permet d'identifier des activateurs d'enzyme catabolisant le cholestérol, comme par exemple les cytochromes P450 (par exemple CYP27A1 CYP46A1, CYP 11 Al et CYP7A1). Les toxines selon l'invention peuvent être la syringomycine E, la phytosphingosine, la telomycine, l'iturine A, la toxine de vibrio choiera et les toxines dépendantes du cholestérol. De manière avantageuse, la toxine du milieu selon l'invention est la syringomycine E. Les souches de levures sont transformées par introduction d'un vecteur permettant l'expression de gènes codant pour la production d'enzymes liées au catabolisme du cholestérol. De manière avantageuse, la demanderesse utilise un vecteur d'expression de protéines recombinantes optimisé pour l'expression fonctionnelle des cytochromes P450 et leurs cofacteurs transporteurs d'électrons Dans un mode de réalisation de l'invention, ces vecteurs recombinants sont des plasmides. L'objet de l'invention est illustré, sans toutefois s'y limiter, par les exemples suivants : Matériel et méthodes : Le milieu utilisé pour la culture des levures est avantageusement un milieu Kàppeli composé de 600 ml H2O déminéralisé, 50 ml de la solution de sels concentrée 20 fois (Tableau 1), 10 g de Casamino acids (Difco) ou 8,9 g de (NH4)2SO4 (PROLABO 21 333.296) (Source d'azote), 2 ml de la solution de vitamines concentrée 500 fois ((Mix2), 0,2 ml de la solution de CaCl2 et FeCI3 concentrée 5000 fois ((Mix3) et 100 mg/L d'acides aminés et 50 mg/L de bases nécessaires (sauf Adénine à 100 mg/I) pour 1 L de milieu au total. Le pH est ajusté à 5,5 avec KOH concentrée, puis le volume est ajusté à 900 ml avant de filtrer sur unité Nalgène de 0,22 pm et d'ajouter 100 ml de source carbonée à 20 % (D-Glucose PROLABO 24 370. 294).

Mix1 : Solution de sels concentrée 20 fois PROLABO 20 621.295 PROLABO 26 936.293 PROLABO 25 167.298 PROLABO 25 300.290 PROLABO 23 174.290 PROLABO 29 253.293 PROLABO 22 896.184 PROLABO 27 936.233 PROLABO 20 183.291 PROLABO 20 276.235 PROLABO 26 846.235 PROLABO 25 897.197 PROLABO 27 833.237 0,32g/I 56mg/I 50mg/I 0,15g/I 50 mg / I 10mg/I 8mg/I 0,3g/I 0,5 g / I 57g/I 12g/I 20 mg Le pH de cette solution est compris entre 2,6 -2,7. La solution est conservée à +4°C et aliquotée en 50 ml par tube. Mix2 : Solution de vitamines concentrée 500 fois SIGMA T-4625 1 g/1 SIGMA P-9755 2,5g/I SIGMA N-4126 4g/I SIGMA B-4501 25mg/I SIGMA P-5710 5g/1 SIGMA I-5125 40 g / 1 La solution est conservée à -20°C et aliquotée en 2,2 ml par tube Mix3 : Solution concentrée 5 000 fois PROLABO 22 317.297 250g/1 PROLABO 24 208.237 250g/1 La solution est conservée à +4°C et aliquotée en 500 pL par tube. Les milieux de sporulation utilisés pour les levures sont les suivants : Milieu de sporulation SPI : extrait de levure 2,5 g/L, acétate de potassium 9,8 g/L, glucose 1 g/L, agar 20 g/L. Milieu de sporulation ACK : acétate de potassium 10 g/L, agar 20 g/L. Exemple A. Construction des vecteurs plasmidiques : Construction de vecteur d'expression pour DHCR24 et cytochrome P450 Ce plasmide a été construit dans le but d'obtenir sur un même vecteur 3 cassettes d'expression pour DHCR24 (dehydro-cholesterol-24-réductase), CYP27A1 mature et le transporteur d'électron adrénodoxine (ADX) mature conférant dans une levure modifiée la synthèse de cholestérol et son catabolisme via les activités de DHCR24 et CYP27A1 respectivement. L'activité de transporteurs d'électrons comme ADX (apporté sur le plasmide) et ADR (porté sur le génome de la souche) est nécessaire pour une activité fonctionnelle de cytochrome P450 mitochondriale telle que CYP11A1 (demande de brevet internationale WO02/061109) ou CYP27A1. Le plasmide pIM580 est obtenu par les méthodes de biologie moléculaire et de recombinaison dans la levure connues de l'homme de l'art. Ce vecteur d'expression dérive des plasmides pCD63 (Pompon et a11998 Nat. Biotechnol.) et pYeDP60 (Pompon et a11994 Eur. J. Biochem), et contient une origine de réplication 2p pour S. cerevisiae et le marqueur de sélection URA3 (Fig 7). Pour obtenir ce vecteur, le marqueur de sélection TRP1 de pCD63 est supprimé par recombinaison homologue dans la levure. Pour cela le fragment de pCD63 ouvert aux sites de restriction Bsul et Smal au niveau de la séquence du marqueur de sélection TRP1 est mis en contact avec le fragment PCR obtenu avec les amorces de séquences SEQ ID NO 1 et 2 sur matrice pCD63, au niveau des sites Bglll s'hybridant de part et d'autre du marqueur TRP1. Ce mélange de fragments d'ADN est ensuite introduit dans une levure de type W303 par méthode de transformation LiAc/PEG décrite par Gietz et al ; 1995 et 2002. Les clones recombinant sont sélectionnés pour la présence du marqueur de sélection URA3 et pour l'absence du marqueur TRP1 par croissance sur milieu dépourvu d'uracile et défaut de croissance sur un milieu dépourvu de tryptophane.

L'ADN est extrait des levures par lyse à zymoliase (12,5 mg/ml, Sorbitol 1M, tampon phosphate 0.1M ph 7,2 1 h à 37°C) suivi d'une lyse alcaline du kit Qiagen ref 12106 puis transféré dans des bactéries de type TG1 (méthode TSB adapté de Chung et al 1989) pour analyse par les techniques classiques de biologie moléculaire. Ce nouveau vecteur est nommé plM565.

Ensuite la cassette d'expression de DHCR24 modifiée sur les 2e et 3e codons sous le promoteur contrôle TPI (Triose Phosphate Isomérase) provenant du fragment Nael de plM330 (dérivé de pYX212 #MBV-028-10 R&D system) est introduite au site Pvull de pIM565 pour former le plasmide pIM578. La cassette d'expression de DHCR24 modifiée pour les 2e et 3e codons est décrite dans la demande de brevet internationale W02005/121315. Le promoteur choisi ici est le promoteur TPI, promoteur constitutif à la place de CYC1. Finalement la cassette d'expression de CYP11A1 (provenant de pCD63) est substituée par celle de CYP27A1 mature ( c'est-à-dire dépourvue de la séquence de ciblage à la mitochondrie) par recombinaison homologue dans la levure entre le vecteur pIM578 ouvert au site Nael et le fragment PCR issu de pIM558 avec les amorces de séquences SEQ ID NO 3 et 4 contenant la cassette d'expression de CYP27A1 mature sous le control du promoteur chimérique Ga110/CYC1 dérivé de pYeDP60 (D. Pompon et al ; 1994 et 1996). Le cDNA de CYP27A1 mature provient du clone de numéro GenBank NM_000784 dont la partie N-terminal dépourvue des 33 premiers acides aminés a été modifiée par PCR avec les amorces de séquences SEQ ID NO 5 et 6.

Le plasmide ainsi obtenu contenant les trois cassettes d'expression pour DHCR24, ADX et CYP27A1 mature est nommé plM580. Le plasmide équivalent contenant la séquence codante de CYP46A1 est nommé pIM584 est obtenu de façon similaire. Le cDNA de CYP46 issu du clone de numéro GenBank NM_006668 est introduit dans pYeDP60 puis la cassette d'expression (promCYC1/GAL10-CYP46-TermPGK) est transférée dans plM578 par recombinaison homologue dans la levure. Le plasmide contrôle dépourvu de séquence codante pour cytochrome P450 est obtenu de façon similaire par recombinaison homologue entre la cassette d'expression de pYeDP60 et pIM578 ouvert au site Nael. Ce vecteur contrôle sans P450 est nommé plM582. Les plasmides pouvant être utilisés pour cette invention sont résumés dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 : Plasmide P450 DHCR24 Références pCD63 CYP11A1 mature absent Pompon et al 1998 Nat.Biotechnol. pYeDP60 aucun absent Pompon et a11994 Eur.J.Biochem. plM565 CYP1 lA1 mature absent La présente demande de brevet plM578 CYP1 lA1 mature présent La présente demande de brevet plM580 CYP27A1 mature présent La présente demande de brevet plM584 CYP46A1 présent La présente demande de brevet plM582 aucun présent La présente demande de brevet15 Exemple B : Construction des souches de levures modifiées Dans un mode de réalisation avantageux, des souches de levures produisant du cholestérol ont été construites comme suit : Construction de la souche yIM26 : La souche YIM126 a été construite pour empêcher le fonctionnement de gènes impliqués dans les modifications du cholestérol et notamment les deux enzymes responsables de l'estérification avec des chaines aliphatiques ARE1 et ARE2 et l'enzyme codé par le gène ERG5 responsable de la désaturation en position 22-23 de la chaine latérale des ergostas et des cholestas. Ces caractéristiques ont été réunies dans une même souche contenant les éléments nécessaires à la production de Cholestérol. Pour cela deux souches haploïdes contenant des caractéristiques intéressantes sont mises en contact pour donner une souche diploïde qui est ensuite mis à sporuler par croissance sur un milieu très riche puis très pauvre (comme décrit dans la demande de brevet internationale W02005/121315). Le mélange des cellules diploïdes et des asques, est ensuite mis en contact avec un milieu aqueux contenant 30 % d'éther pendant 3 et 6 minutes pour lyser préférentiellement les souches diploïdes. Les clones survivants sont ensuite étalés sur un milieu sélectif en fonction des caractères recherchés pour obtenir une souche haploïde combinant les caractères parentaux. Ainsi, la souche yIM126 a été obtenue par sélection de clone haploïde issu de trois croisements successifs de différentes souches par les méthodes connus de l'homme de l'art. Pour cela, la souche Fy11679-28c (demande de brevet internationale WO2002/061109) est croisée avec la souche ERT (souche WGIF01 de la demande de brevet internationale WO2005/121315). Un clone diploïde issu de ce croisement sélectionné sur les autotrophies complémentaires des souches parentales est mis à sporuler puis traité comme mentionné ci-dessus pour l'obtention de clones haploïdes. Les souches haploïde capables de croitre sur un milieu dépourvu d'adénine et de tryptophane signant le caractère adénine autotrophe de Fy1679-28c et la disruption erg6 :TRP1 de ERT ont été sélectionnées. L'haploïdie des clones a été vérifiée par croisement avec des souches contrôles W303 MATa ou MATalpha. Les clones ainsi obtenus combinant un locus ADE2 intact et la disruption du gène ERG6 par le marqueur de sélection pour le tryptophane TRP1 ont été nommés yIM110 et yIM111.

Ensuite la souche yIM110 est croisée avec la souche haploïde CDR06. CDR06 est une souche d'origine génétique FY1679 dont le locus ade2 est non fonctionnel par l'intégration d'une cassette d'expression pour la 07-stérol réductase de plante arabidopsis thaliana. CDR06 et CDR07 (décrites dans la demande de brevet WO2002/061109 ou Duport et al ; 2003) ont été obtenues à partir du même croisement et diffèrent par la présence du gène ERG5 qui est fonctionnel dans CDR06. Un clone diploïde yIM110XCDR06 est isolé puis mis dans les conditions de production des spores. Les spores sont préparées comme décrit précédemment et isolées sur un milieu riche puis testées sur différents milieux en présence et en absence d'adénine et en présence de nystatine pour vérifier la résistance de la souche à cet antifongique lié à la combinaison de l'absence fonctionnelle de l'activité ERG6p et la présence de l'activité 07-stérol réductase. De plus la composition en stérol est vérifiée par saponification suivie d'une extraction organique des stérols totaux. L'identité des stérols est analysée en GC/FID puis vérifiée en GC/MS. La présence d'un produit ayant le même temps de rétention que le desmostérol est observée pour les clones 4 et 6 à partir d'un culot de cellules cultivées et traité comme précédemment décrit dans la demande de brevet internationale WO2005/121315. Ces clones 4 et 6 sont également résistants à la nystatine lorsque le galactose est source de carbone. Ces clones haploïdes 4 et 6 sont dénommés respectivement yIM115 et yIM116.

Finalement un 3e croisement avec les souches yIM116 et CA23 est réalisé dans le but d'introduire l'interruption de trois gènes d'intérêt c'est-à-dire ARE1, ARE2 et ERG5 dans une souche pouvant produire du cholestérol et aussi la cassette d'expression d'un transporteur d'électron nécessaire au fonctionnement de cytochrome P450. La souche CA23 décrite dans la demande de brevet internationale WO2005/121315 contient une forme non fonctionnelle de ces 3 gènes ARE1, ARE2 er ERG5 et la cassette d'expression du transporteur d'électrons adrenodoxine réductase (ADR) intégrée au locus LEU2. Un diploïde yIM116XCA23 a été isolé sur un milieu minimum ne contenant pas de tryptophane, d'histidine et de leucine mais contenant de l'adénine et de l'uracile. De cette façon, seules les cellules diploïdes provenant d'un croisement entre yIM116 et CA23 peuvent croitre alors qu'aucun des partenaires du croisement ne peut se développer dans ces conditions. Un clone diploïde est mis à sporuler dans les conditions décrites précédemment. Une centaine de spores sont isolées après traitement à l'éther d'un mélange de spores et de la souche diploïde comme précédemment décrit. Ces clones sont caractérisés pour leur signe sexuel, leurs capacités à croitre sur un milieu dépourvu en adénine, leucine, histidine et tryptophane, et leurs capacités à résister à trois antifongiques, nystatine, hygromycine et généticine. Finalement le clone n° 4 ainsi sélectionnés a été nommé yIM126. Ce clone peut croitre en l'absence de leucine indiquant la présence d'un gène LEU2 fonctionnel et donc la présence d'une cassette d'expression pour la forme mature de l'ADR sous le contrôle du promoteur GAL10/CYC1. Ce clone peut également croitre en l'absence de tryptophane et d'histidine indiquant la disruption potentielle des gènes ERG6 et ARE2. Il est résistant à des hauts niveaux de nystatine et à la généticine, indiquant probablement la présence de l'enzyme DHCR7 ainsi que la disruption du gène ARE1 respectivement. Les stérols libres et estérifiées sont analysés pour confirmer ou infirmer la présence des produits des gènes ARE1 et ARE2 ainsi que la qualité des stérols pour infirmer ou confirmer l'interruption du gène ERG6 et la présence de la DHCR7. Tableau 2 : phénotype des souches de levures utilisées Souches Génotype Références yIM110-111 Fy1679-28c x ERT = Fy Aer6 cette étude Mat a/alpha, his3, leu?, trpl, ura3, erg6::TRP1, nystatin R, Cycloheximide S yIM115-116 yIM110 x CDRO6 cette étude MATa/alpha, his3, leu2, Lltrpl, ura3 ade2:: GAL 10/CYC 1-A7stérol-Reductase erg6::TRP1, NystatinR, yIM126 CA23 x yIM116 : clone 4 cette étude MATa, ura3, leu2, his3, trpl, erg6::TRP1, ade2::prom GAL10/CYC1-L 7stérolReductase, LEU2::promGAL10/CYC-bADRmat-term PGK are2::HIS3, arel::Hygromycine, erg5::G418 Exemple C : Construction de souche combinant la production de cholestérol et son catabolisme par des activités enzymatiques fonctionnelles dans la levure. Les plasmides contenant les cassettes d'expression de DHCR24 avec ou sans cytochrome P450 et le transporteur d'électron ADX sont introduits dans la levure ylM126 par méthode de transformation au LiAC/PEG (Gietz et al ; 1995 et 2002). Les clones sont sélectionnés sur un milieu dépourvu d'uracile. Deux à quatre clones de chaque combinaison sont mis en culture pour une analyse des stérols totaux en GC/FID puis en GC/MS selon la procédure décrite dans la demande de brevet internationale WO2005/121315. Les clones sont mis en culture pendant 48 h sous agitation à 30°C dans le milieu YBN complété de 2 % glucose et adénine à 100 pg/ml. La densité optique (OD600nm) atteint une valeur moyenne de 7 unités. Les culots de cellule d'un volume V de culture sont récoltés et transférés dans un volume V identique de milieu de Kàppeli contenant 20 % casa-amino acide, 2 0/0 glucose, 100 pg/ml d'adénine. Ces cultures sont incubées 72 h à 90 h à 30°C et atteignent une densité optique à 600 nm de 40 à 50 unités. Le culot équivalent à un volume de 100 unités de densité optique est traité pour analyse en chromatographie en phase gazeuse comme précédemment mentionnée et décrite dans la demande de brevet internationale WO2005/121315. Les profils stérols des échantillons de levures sont comparés aux temps de rétention de solutions de références par chromatographie en phase gazeuse GC/FID telles que cholestérol (Fig 1A), desmostérol (Fig 1B), prégnénolone (Fig 1C), 240H-cholestérol (Fig 1 D), 27OH-cholestérol (Fig1 E) et les produits sont identifiés par similarité de temps de rétention. Les analyses et la mesure de la surface des pics montrent une production de cholestérol pour la souche yIM126 contenant le plasmide pIM580 sans P450 avec un ratio cholestérol/desmostérol supérieur à 3. Les souches yIM126 contenant les constructions d'expression de P450, produisent un dérivé du cholestérol spécifique de chaque P450 qui utilise le cholestérol comme substrat : c'est-à-dire production de prégnénolone pour CYP11A1 (Fig 3), de 27OH-cholestérol et de 27OH-stérols pour CYP27A1 (Fig 4) et de 24OH-cholestérol pour CYP46A1 (Fig 5). Le ratio cholestérol/desmostérol diminue d'un facteur 2 en présence de CYP46 et d'un facteur 5 à 6 en présence de CYP11A1 ou CYP27A1 indiquant que le cholestérol est probablement métabolisé. De nouveaux stérols hydroxylés en position 27 comme 27OH-desmostérol apparaissent spécifiquement en présence de l'activité CYP27A1. (Fig 4) Exemple D : Méthode biologique in cellulo de détection du métabolisme du Cholestérol: a) milieu de culture : Un milieu de culture est mis au point qui permet par un simple test phénotypique de croissance ou de défaut de croissance, de distinguer les levures produisant du cholestérol de celles qui n'en produisent pas ou qui le catabolisent. Ce milieu de culture est un milieu riche de type YPG agar (Milieu complet YPG : Extrait de levure (Difco) 10 g/L, bacto-peptone (Difco) 20 g/L, glucose (Merck) 20 g/L) additionné de la toxine syringomycine E de Pseudomonas syringae B-301D (Sigma #56946) de 150 à 250 ng/ml. De l'agar (20 g/L) est ajouté pour obtenir des milieux solides. b) détection du métabolisme du cholestérol Les souches de levure yIM126 contenant un vecteur d'expression pour DHCR24 et cytochrome P450 tel que pIM580 décrites précédemment, sont cultivées pendant 48 h sous agitation à 30°C dans un milieu YNB (Yeast nitrogen base w/o amino acids (Difco) 6,7 g/L, glucose (Merck) 20 g/L.) complété de 2 % glucose et adénine à 100 pg/ml. La culture atteint une densité optique à 600 nm de l'ordre de 7 unités. Le culot de cellules est récolté par centrifugation et transféré dans un volume identique de milieu de Kàppeli contenant 20 % casa-amino acide, 2 % glucose, 100 pg/ml d'adénine et mis sous agitation à 30°C pendant 24 h atteignant une densité optique à 600 nm de l'ordre de 40 unités. Les cultures sont diluées à 1 unité de densité optique à 600 nm puis au 1/50 et de 25 en 25 pour effectuer un test en goutte sur des géloses YPG contenant de la syringomycine E selon les méthodes connus par l'homme de l'art.

Après une incubation de 48 h à 72 h à 30°C les levures contenant le vecteur d'expression pIM582 (sans P450, Fig 6 colonne 1) produisant du cholestérol ne sont pas capables de croitre alors que les levures contenant le vecteur d'expression pIM580 (avec CYP27A1, Fig 6 colonne 2) produisant du cholestérol et le transformant en produit dérivés sont capables de croitre sur une gélose YPG contenant de la syringomycine E à 170 ng/ml (Fig 6A et 6B). La toxicité de ce milieu YPG contenant de la syringomycine E dépend de la quantité de cholestérol disponible dans la levure observé en GC/FID ou GC/MS. Exemple E : Méthode biologique in cellulo de détection de produit interférant sur le métabolisme du cholestérol : Ce test de croissance de levures modifiées pour la synthèse du cholestérol, permet également d'identifier des produits qui interfèrent soit avec la synthèse soit avec le catabolisme du cholestérol. Les levures yIM126 contenant les plasmides d'expression pour DHCR24 avec ou sans P450 sont cultivés en milieu YNB, 2 % Glucose, adénine à 100 pg/ml pendant 48 h à 30°C puis en milieu Kàppeli pendant 24 h à 30°c comme décrit plus haut. Les suspensions de levure sont diluées à une densité Optique à 600 nm de 0,005 unités (1/200) en milieu YNB pour ensemencer une gélose YPG contenant de la syringomycine E à une dose toxique pour la souche, soit 160 ng/ml pour yIM126 contenant le plasmide pIM582, ou 250 ng/ml pour la souche yIM126 contenant le plasmide plM580. L'inoculation du milieu gélosé s'effectue par inondation de sa surface et aspiration immédiate du liquide excédent. Des produits d'intérêts sont déposés sur la surface gélosée ainsi ensemencée puis séchée. Après une incubation de 48 h à 72 h à 30°C, des halos de croissance de levure sont observés autour des dépôts des produits interférant sur la synthèse ou le catabolisme du cholestérol. Les produits qui induisent la diminution de la quantité de cholestérol soit par inhibition de sa synthèse soit par activation de son catabolisme confèrent une restauration de croissance sur ce milieu initialement toxique. Par cette méthode de détection de croissance dépendante du taux de cholestérol, des inhibiteurs des enzymes impliquées dans la synthèse du cholestérol telles que DHCR24, DHCR7, A8-O7stérol isomérase, et non essentielles à la levure sauvage ou à une levure modifiée pour la synthèse des stérols, sont ainsi aisément mis en évidence. De même cette méthode permet d'identifier des activateurs d'enzyme telle que les cytochromes P450 comme CYP27A1 qui catabolisent le cholestérol. Cela est vérifié avec des produits connus comme le triparanol inhibiteur de stérol-014 réductase, DHCR7 et 08-7 isomérase, AY9944 inhibiteur de DHCR7 (J. Sanchez-Wandelmer et al 2009), SR31747 inhibiteur de stérol 08-7 isomérase (R. Paul et al 1998), Amorolfine inhibiteur de DHCR14 et stérol 08-7 isomérase (A. J. Carrillo-Munoz et al ; 2006) ; de même le dépôt de cholestérol ou de 27OH-cholestérol induisent une zone de protection vis-à- vis de la toxicité de la syringomycine E contenue dans la gélose .(FIG 6) Légende des figures : Fig 1A : temps de rétention du cholestérol par chromatographie en phase gazeuse GC/FID Fig 1B : temps de rétention du desmostérol par chromatographie en phase gazeuse GC/FID Fig 1C : temps de rétention du prégnénolone par chromatographie en phase gazeuse GC/FID Fig ID : temps de rétention du 24OH-cholestérol par chromatographie en phase gazeuse GC/FID Fig 1E : temps de rétention du 27OH-cholestérol par chromatographie en phase gazeuse GC/FID Fig 2 : Le profil stérol de la souche yIM126 en absence d'activité P450, montre la présence majoritaire de Cholestérol (TR 21,98 min.) et du Desmostérol (TR 23,11 min.).

Fig 3 : En présence d'activité de CYP1 lA1 le profil stérol de la souche ylM126 est modifié avec diminution du ratio du Cholestérol (TR 21,97) au profit du Desmostérol (TR 23, 13) avec apparition d'un stérol correspondant à la Prégénolone (TR 14,73min.).

Fig 4 : En présence d'activité de CYP27A1 le profil stérol de la souche yIM126 est modifié avec diminution du ratio du Cholestérol (TR 21,96) au profit du Desmostérol (TR 23,11) et apparition de 2 autres stérols correspondant au 27OH-Cholestérol (TR 33,53 min) et le 27OH-Desmostérol (TR 33,93 min).

Fig 5 : En présence d'activité de CYP46A1 le profil stérol de la souche yIM126 est modifié avec apparition d'un stérol correspondant au 24OH-Cholestérol (TR 30,38 min). Fig 6 : Test de croissance de différentes souches produisant et ou catabolisant le cholestérol sur une gélose YPG contenant de la syringomycine E (SRG): Dilutions de culture de levure déposées sur une gélose YPG sans syringomycine E (6A) ou avec syringomycine E à 170 ng/ml (6B) ; Dilution DO à 600 nm de haut en bas : 0.02/0.0008/00003. Fig 7 : Test de restauration de croissance sur une gélose YPG contenant de la syringomycine E ensemencée avec une souche produisant du cholestérol.

La surface d'un milieu gélosé YPG contenant de la syringomycine E à 250 ng/ml est ensemencée par un nappage de suspension de levure ylM126-plM580-CYP27A1. 2 pl de produits à 1 mM ou 0,1 pg/ml sont déposés sur la surface séchée et ensemencée. Fig 7A de haut en bas : Cholestérol, 27OH-Cholestérol et Amorolfine à 0,1 mg/ml.

Fig 7B de haut en bas : Triparanol, AY9944, SR31747 à 1 mM. Fig 8 : carte du plasmide pIM580. Bibliographie : Carrillo-Munoz, A. J., G. Giusiano, P. A. Ezkurra, and G. Quindos. 2006. Antifungal agents: mode of action in yeast cells. Rev Esp Quimioter. 19:130-9.

Duport, C., R. Spagnoli, E. Degryse, and D. Pompon. 1998. Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast. Nat Biotechnol. 16:186-9.

Gietz, R. D., R. H. Schiestl, A. R. Willems, and R. A. Woods. 1995. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11:355-60. Gietz, R. D., and R. A. Woods. 2002. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350:87-96. Paul, R., S. Silve, N. De Nys, P. H. Dupuy, C. L. Bouteiller, J. Rosenfeld, P. Ferrara, G. Le Fur, P. Casellas, and G. Loison. 1998. Both the immunosuppressant SR31747 and the antiestrogen tamoxifen bind to an emopamil-insensitive site of mammalian Delta8-Delta7 sterol isomerase. J Pharmacol Exp Ther. 285:1296-302. Pompon, D., B. Louerat, A. Bronine, and P. Urban. 1996. Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments. Methods Enzymol. 272:51-64. Sanchez-Wandelmer, J., A. Davalos, E. Herrera, M. Giera, S. Cano, G. de la Pena, M.A. Lasuncion, and R. Busto. 2009. Inhibition of cholesterol biosynthesis disrupts lipid raft/caveolae and affects insulin receptor activation in 3T3-L1 preadipocytes. Biochim Biophys Acta. 1788:1731-9. P. Urban, D. Werck-Reichhart, H. G. Teutsh, F. Durst, S. Regnier, M. Kazmaier and D. Pompon, Characterization of recombinant plant cinnamate 4-hydroxylase produced in yeast Kinetic and spectral properties of the major plant P450 of the phenylpropanoid pathway, Eur J Biochem.

1994 Jun 15; 222(3): 843-850.

Claims (7)

1. REVENDICATIONS1. Méthode d'identification de composés modulateurs du cholestérol caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de détection du cholestérol et que le taux de cholestérol détecté est inversement proportionnel à la croissance de cellules en milieu toxique.
2. 2. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'une cellule produisant du cholestérol et d'un composé d'intérêt sur un milieu initialement toxique pour ladite cellule.
3. 3. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'une cellule produisant à la fois du cholestérol et une enzyme participant à la synthèse du cholestérol, et d'un composé d'intérêt sur un milieu initialement toxique pour ladite cellule.
4. 4. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact d'une cellule produisant à la fois du cholestérol et une enzyme catabolisant le cholestérol, et d'un composé d'intérêt sur un milieu initialement toxique pour ladite cellule.
5. 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend l'utilisation de levures génétiquement modifiées produisant du cholestérol.
6. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée ce qu'elle comprend l'utilisation de levures comprises dans le groupe constitué de : Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (lactis et autres) ou Pichia pastoris, lesdites levures étant génétiquement modifiées pour produire du cholestérol.
7. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : (a) transformation d'une levure pour qu'elle exprime à la fois du cholestérol et une enzyme activant la production de cholestérol, (b) mise en contact de la levure transformée avec un composé d'intérêt, et (c) la quantification de l'évolution du taux de cholestérol exprimé par un test de résistance à une toxine. 6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :(a) transformation d'une levure pour qu'elle exprime à la fois du cholestérol et une enzyme diminuant la production de cholestérol, (b) mise en contact de la levure transformée avec un composé d'intérêt, et (c) la quantification de l'évolution du taux de cholestérol exprimé par un test de résistance à une toxine. 9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la toxine utilisée est comprise dans le groupe constitué de syringomycine E, phytosphingosine, télomycine, iturine A, toxine de Viobrio cholerae et toxines dépendantes du cholestérol. 10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la toxine utilisée est la syringomycine E. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que l'enzyme produite par la levure modifiée génétiquement est choisie parmi le groupe suivant : DHCR7, DHCR14, DHCR24 et A8-7 stérol isomérase. 12. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la levure modifiée génétiquement produit un cytochrome p450 choisi parmi le groupe constitué de CYP27A1, CYP46A1, CYP11AI et CYP7A1 en tant qu'activateur d'enzyme. 13. Vecteur comprenant des cassettes d'expression d'enzyme pour permettre la transformation des stérols de levure en cholestérol et une cassette d'expression pour une activité protéique agissant sur le métabolisme du cholestérol. 14. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il est un plasmide. 15. Vecteur selon la revendication 13 caractérisé en ce qu'il comporte une cassettes d'expression pour DHCR24, une pour CYP27A1 et une pour le transporteur d'électrons adrénodoxine.