JP2013534815A - コレステロールの代謝を調節する化合物を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、コレステロールの合成または異化に関連する酵素活性を検出することにより、コレステロールの代謝を調節する化合物を同定するための方法に関する。前記方法は、コレステロールレベルの減少が避けるべきである場合、遺伝子操作された酵母の使用により哺乳動物細胞の致死の危険性に可能性を与え、この生存はコレステロールの産生に厳密に依存しない。
Description
本発明の対象は、コレステロールの合成または異化に関連する酵素活性を検出することにより、コレステロールを調節する化合物を同定する方法である。本発明の対象は、さらに心血管病態または代謝病態の治療における検出された化合物の使用である。
コレステロールは、最も重要な動物性ステロールである。コレステロールは、細胞膜の基本成分であり、この流動性を管理し、全ての動物組織および特に脳に存在する。コレステロールの合成およびこの異化に関する機能障害は、多数の病態:アテローム性動脈硬化、狭心症、心血管系事象、メタボリックシンドローム、糖尿病、スミス−レムリ−オピッツ(Smith−Lemli−Opitz)症候群などに関連する。
従って、体内においてコレステロールレベルを調節できる分子の検出は、これらのすべての病態との闘いにおいて必要な前進である。
コレステロール合成の阻害因子またはコレステロール異化のアクチベーターは、DHCR14/ステロール−Δ14レダクターゼ、DHCR24/ステロール−Δ24レダクターゼ、DHCR7/ステロール−Δ7レダクターゼおよびΔ8−7イソメラーゼの阻害因子であるトリパラノール、DHCR7/ステロール−Δ7レダクターゼの阻害因子であるAY9944(J.Sanchez−Wandelmer et al 2009)、ステロールΔ8−7イソメラーゼの阻害因子であるSR31747(R.Paul et al 1998)またはDHCR14/ステロール−Δ14レダクターゼおよびステロール−Δ8−7イソメラーゼの阻害因子であるアモロルフィン(A.J.Carrillo−Munoz et al;2006)などが公知である。
しかしながら、コレステロールに関連する病態は多く、治療のさらなる進歩、従って、コレステロールの代謝および輸送の調節因子候補を研究および検出する新しい方法が必要とされる。
先行技術は、コレステロール濃度を増加することが、毒素、抗生物質および抗真菌剤に対する耐性につながる選択培地の使用を記載している。コレステロール産生細胞をコレステロール合成アクチベーターと接触させることにより、細胞内のコレステロール量が増加する。このことは、使用される選択培地の毒性または使用される抗生物質もしくは抗真菌剤に対する耐性、従って細胞の成長につながる(欧州特許EP0727489B1を参照されたい。)。
同様に、コレステロールを合成する酵素の阻害因子またはコレステロールを異化する酵素のアクチベーターは、細胞死を起こす。コレステロールの消失は、今までのところ細胞の生命に対して、特に、使用される哺乳動物細胞にとって有害である。従って、このことは、コレステロールの代謝または輸送の新しい調節因子の発見を不可能にする。
従って、これらの調節因子を検出する単純で有効な方法を探索する。
驚いたことに本出願人は、酵母を使用して、コレステロールが毒性に対する耐性の軽減につながる逆の選択が出来る培地を用いて、コレステロール調節因子を検出できることを示した。このことは、毒性に対する耐性が観察される場合、コレステロール合成の阻害因子および/またはコレステロール異化のアクチベーターの決定を可能にする。
有利なことに、本試験に使用されるコレステロール産生酵母細胞は、遺伝子操作された酵母である。これは、天然には酵母はエルゴステロールを産生するからである。本出願人は、コレステロールを産生するようにエルゴステロールの産生を転用するために、遺伝子操作された酵母を使用する。
本発明の一実施形態において、酵母は特許EP0727489 B1に述べられたように、または非必須遺伝子であるERGファミリー(ERG6、ERG5、ERG4、ERG2およびERG3)の欠失により、改変される。
この型の酵母を得る1つの方法は、国際特許出願WO2005/121315(Aventis Pharma)にも記載されている。
本出願に記載のエルゴステロールの終了またはコレステロールの合成および異化の酵素は、野生型酵母にもコレステロールを産生するように改変された酵母にも必須ではなく、従って、これらの活性化または阻害はこれらの酵母の成長または死には関係がない。
従って、このことにより、これらの細胞の生存に何の問題もなくコレステロールの調節因子の研究が可能になり、実際、コレステロールがなければ、今までに試験に使用されたこの型の哺乳動物細胞は死亡した。従って、この細胞は、コレステロールレベルが不十分であると間もなく死亡するので、コレステロール合成を減少させる化合物の効果を観察することは不可能である。
Sanchez−Wandelmer,J.,A.Davalos,E.Herrera,M.Giera,S.Cano,G.de la Pena,M.A.Lasuncion,and R.Busto.2009.Inhibition of cholesterol biosynthesis disrupts lipid raft/caveolae and affects insulin receptor activation in 3T3−L1 preadipocytes.Biochim Biophys Acta.1788:1731−9.
Paul,R.,S.Silve,N.De Nys,P.H.Dupuy,C.L.Bouteiller,J.Rosenfeld,P.Ferrara,G.Le Fur,P.Casellas,and G.Loison.1998.Both the immunosuppressant SR31747 and the antiestrogen tamoxifen bind to an emopamil−insensitive site of mammalian Delta8−Delta7 sterol isomerase.J Pharmacol Exp Ther.285:1296−302.
Carrillo−Munoz,A.J.,G.Giusiano,P.A.Ezkurra,and G.Quindos.2006.Antifungal agents:mode of action in yeast cells.Rev Esp Quimioter.19:130−9.
P.Urban,D.Werck−Reichhart,H.G.Teutsh,F.Durst,S.Regnier,M.Kazmaier and D.Pompon,Characterization of recombinant plant cinnamate 4−hydroxylase produced in yeast Kinetic and spectral properties of the major plant P450 of the phenylpropanoid pathway,Eur J Biochem.1994 Jun 15;222(3):843−850.
Pompon,D.,B.Louerat,A.Bronine,and P.Urban.1996.Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments.Methods Enzymol.272:51−64.
Gietz,R.D.,R.H.Schiestl,A.R.Willems,and R.A.Woods.1995.Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS−DNA/PEG procedure.Yeast.11:355−60.
Gietz,R.D.,and R.A.Woods.2002.Transformation of yeast by lithium acetate/single−stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.Methods Enzymol.350:87−96.
Duport,C,R.Spagnoli,E.Degryse,and D.Pompon.1998.Self−sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast.Nat Biotechnol.16:186−9.
本発明は、この問題を、遺伝子操作された酵母の使用を介して解決でき、細胞の生存は、このコレステロールの産生に厳密に依存しない。
従って、本出願の対象である本発明は、コレステロール合成の調節因子を検出する手段の新規な代替手段を提供する。
新規な代替手段は、酵母がコレステロールおよびコレステロールの異化に関連する酵素の両方を産生するように、酵母を遺伝的に形質転換することにある。組換え酵母を、コレステロール産生酵母にとって当初は毒性である培地において、コレステロールを調節する可能性のある化合物と接触させる。酵母の成長の回復の観察、または逆に、酵母の死の観察は、被験化合物が、酵母によるコレステロールの産生を阻害または増加させるかどうかの決定を可能にさせる。
使用する酵母は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)(ラクティス(lactis)など)またはピキア・パトリス(Pichia pastoris)であってもよい。
有利には、使用する酵母はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)である。
コレステロール合成の阻害またはコレステロール異化の活性化のいずれかにより、産生されるコレステロールの量の減少を誘導する化合物は、これらの細胞にとって当初は毒性である培地において細胞の成長の回復をもたらす。コレステロール合成に関連する酵素の阻害因子および/またはコレステロール異化のアクチベーターは、従って、コレステロールレベル依存性成長を検出するためのこの方法を用いて実証される。
このような酵素は、コレステロール合成に関してはDHCR14、DHCR24、DHCR7およびステロールΔ8−Δ7イソメラーゼであってよい。
同様に、本方法は、コレステロールを異化する酵素のアクチベーター、例えばチトクロームP450(例えば、CYP27A1、CYP46A1、CYP11A1およびCYP7A1)の同定を可能にする。
本発明に従った毒素は、シリンゴマイシンE、フィトスフィンゴシン、テロマイシン、イツリンA、コレラ菌毒素およびコレステロール依存性毒素であってよい。
有利には、本発明に従った培地の毒素はシリンゴマイシンEである。
酵母株は、コレステロール異化に関連する酵素の産生をコードする遺伝子の発現を可能にするベクターを導入することによって形質転換される。
有利には、本出願人は、チトクロームP450およびこれらの電子輸送補因子の機能発現が最適化された、組換えタンパク質発現ベクターを使用する。
本発明の一実施形態において、これらの組み換えベクターはプラスミドである。
本発明の対象を例示するが、下記の実施例により本発明を限定するものではない。
材料および方法
酵母の培養に使用する培地は、有利には、合計1Lに対して培地中600mlの脱塩H2O、50mlの20倍濃縮塩溶液(表1)、10gのカザミノ酸(Difco)または8.9gの(NH4)2SO4(Prolabo 21 333.296)(窒素源)、2mlの500倍濃縮ビタミン溶液(Mix2)、0.2mlのCaCl2およびFeCl3の5000倍濃縮溶液(Mix3)ならびに100mg/Lのアミノ酸および50mg/Lの必要とされる塩基(アデニンを除いて100mg/l)から構成されるKappeli培地である。
酵母の培養に使用する培地は、有利には、合計1Lに対して培地中600mlの脱塩H2O、50mlの20倍濃縮塩溶液(表1)、10gのカザミノ酸(Difco)または8.9gの(NH4)2SO4(Prolabo 21 333.296)(窒素源)、2mlの500倍濃縮ビタミン溶液(Mix2)、0.2mlのCaCl2およびFeCl3の5000倍濃縮溶液(Mix3)ならびに100mg/Lのアミノ酸および50mg/Lの必要とされる塩基(アデニンを除いて100mg/l)から構成されるKappeli培地である。
pHを、濃KOHを用いて5.5に調整し、その後、体積を900mlに調整し、0.22μmのNalgeneフィルターを介してろ過し、100mlの炭素源を20%加える(D−グルコース、Prolabo 24 370.294)。
酵母のために使用した胞子形成培地は下記のとおりである:
SP1胞子形成培地:酵母エキス 2.5g/L、酢酸カリウム 9.8g/L、グルコース 1g/L、寒天 20g/L。
SP1胞子形成培地:酵母エキス 2.5g/L、酢酸カリウム 9.8g/L、グルコース 1g/L、寒天 20g/L。
ACK胞子形成培地:酢酸カリウム 10g/L、寒天 20g/L。
[実施例A]
プラスミドベクターの構築:
DHCR24およびチトクロームP450のための発現ベクターの構築
このプラスミドは、全く同一のベクター上に、DHCR24およびCYP27A1の活性を介して改変酵母中に、それぞれコレステロールの合成およびこの異化をもたらす、DHCR24(デヒドロコレステロール−24−レダクターゼ)、成熟CYP27A1および成熟アドレノドキシン(ADX)電子輸送体のための3つの発現カセットを得る目的で構築される。ADX(プラスミド上に提供される。)およびADR(菌株のゲノム上に担持される。)などの電子輸送体は、CYP11A1(国際特許出願WO02/061109)またはCYP27A1などのミトコンドリアのチトクロームP450の機能活性に必要とされる。
プラスミドベクターの構築:
DHCR24およびチトクロームP450のための発現ベクターの構築
このプラスミドは、全く同一のベクター上に、DHCR24およびCYP27A1の活性を介して改変酵母中に、それぞれコレステロールの合成およびこの異化をもたらす、DHCR24(デヒドロコレステロール−24−レダクターゼ)、成熟CYP27A1および成熟アドレノドキシン(ADX)電子輸送体のための3つの発現カセットを得る目的で構築される。ADX(プラスミド上に提供される。)およびADR(菌株のゲノム上に担持される。)などの電子輸送体は、CYP11A1(国際特許出願WO02/061109)またはCYP27A1などのミトコンドリアのチトクロームP450の機能活性に必要とされる。
プラスミドpIM580は、当業者には公知である酵母における分子生物学および組み換えの方法により得られる。この発現ベクターは、プラスミドpCD63(Pompon et al 1998 Nat.Biotechnol.)およびpYeDP60(Pompon et al 1994 Eur.Biochem.)に由来し、S.セレビシエ(S.cerevisiae)のための2μの複製起点およびURA3選択可能マーカー(図7)を含有する。
このベクターを得るために、pCD63のTRP1選択可能マーカーは、酵母における相同組み換えにより欠失される。このために、pCD63の断片をBsulおよびSmal制限部位において、TRP1選択可能マーカーの配列のレベルで開き、pCD63鋳型において配列番号1および2の配列のプライマーを用いて得られたPCR断片と接触させ、BgIII部位のレベルでTRP1マーカーのいずれかの側にハイブリダイズさせる。DNA断片のこの混合物を、その後W303型の酵母内に、Gietz et al,1995および2002により記載の形質転換方法LiAc/PEGを用いて導入する。
組み換えクローンを、URA3選択可能マーカーの存在およびTRP1マーカーの不在に関して、無ウラシル培地において成長することおよび無トリプトファン培地においては成長しないことにより選択する。DNAを、酵母からザイモリアーゼを用いた溶解により抽出し(12.5mg/ml、1Mのソルビトール、0.1Mのリン酸バッファーpH7.2、1時間37℃)、その後、Qiagen kit整理番号12106を使用するアルカリ溶解、その後既存の分子生物学技術を使用する分析のためにTG1細菌内に移す(Chung et al 1989により適合されたTSB法)。この新しいベクターをpIM565と名付ける。
次に、pIM330(pYX212 #MBV−028−10 R&D systemに由来する。)のNael断片が起源であるTPIプロモーター(トリオースリン酸イソメラーゼ)の管理下で、DHCR24に関する発現カセットを、プラスミドpIM578を形成するようにpIM565のPvuII部位に導入する。2番目および3番目のコドンに関して改変されたDHCR24に関する発現カセットは、国際特許出願WO2005/121315に記載されている。ここで選択されたプロモーターは、CYC1の代わりの構成的プロモーターのTPIプロモーターである。
最終的に、(pCD63を起源とする。)CYP11A1に関する発現カセットと、成熟CYP27A1に関する発現カセット(即ち、ミトコンドリア標的化配列を欠いている。)とを、Nael部位で開かれたpIM578ベクターと、pIM558由来のPCR断片との間の、酵母における相同組み換えにより、成熟CYP27A1の発現カセットを含有する配列番号3および4のプライマーを用いて、pYeDP60(D.Pompon et al,1994および1996)由来のGal10/CYC1キメラプライマーの管理下で交換する。
成熟CYP27A1のcDNAはGenBank番号NM_000784のクローンを起源とし、この最初の33アミノ酸を欠いたN末端部を、配列番号5および6のプライマーを用いたPCRにより改変した。
DHCR24、ADXおよび成熟CYP27A1の発現カセットを含有する得られたプラスミドは、pIM580と名付けられる。
CYP46A1のコーディング配列を含有する同等のプラスミドをpIM584と名付け、類似の方法で得る。GenBank番号NM_006668のクローンに由来するCYP46のcDNAを、pYeDP60に導入し、その後、発現カセット(promCYC1/GAL10−CYP46−TermPGK)を酵母における相同組み換えによりpIM578に移す。
チトクロームP450に関するコーディング配列を欠いた対照プラスミドは、類似の手段で、pYeDP60に関する発現カセットとNaeI部位で開かれたpIM578との間の相同組み換えにより得られる。このP450を含まない対照ベクターを、pIM582と名付ける。
本発明に使用できるプラスミドを、下記の表1に要約する。
[実施例B]
改変酵母株の構築
有利な一実施形態において、コレステロール産生酵母株を下記のように構築した:
yIM26株の構築
YIM126株を、コレステロールの改変、特にアルファ鎖ARE1およびARE2のエステル化に関与する2種の酵素ならびにエルゴステロール(ergostas)およびコレステロール(cholestas)の側鎖の22−23位の不飽和に関与するERG5によりコードされる酵素に関連する遺伝子の操作を防ぐように構築した。これらの特徴は、コレステロール産生に必要とされる要素を含有する全く同一の菌株に組み合わされている。
改変酵母株の構築
有利な一実施形態において、コレステロール産生酵母株を下記のように構築した:
yIM26株の構築
YIM126株を、コレステロールの改変、特にアルファ鎖ARE1およびARE2のエステル化に関与する2種の酵素ならびにエルゴステロール(ergostas)およびコレステロール(cholestas)の側鎖の22−23位の不飽和に関与するERG5によりコードされる酵素に関連する遺伝子の操作を防ぐように構築した。これらの特徴は、コレステロール産生に必要とされる要素を含有する全く同一の菌株に組み合わされている。
そのために、興味深い特徴を含有する2つの半数体株を、(国際特許出願W02005/121315に記載のように)非常に富んだ培地で成長させ、次に非常に貧しい培地で成長させることによって、その後胞子形成可能な二倍体株を得るように接触させる。二倍体細胞および子嚢の混合物を、その後、二倍体株を優先的に溶解するために、30%のエーテルを含有する水性培地と、3および6分間接触させる。生存クローンを、親の形質を組み合わせた半数体株を得るために、続いて特徴探索に従った選択培地に播種する。
このようにして、当業者に公知の方法を使用してさまざまな株を3回連続交配させた半数体クローンの選択により、yIM126株を得た。
そのために、Fy11679−28c株(国際特許出願WO2002/061109)を、ERT株(国際特許出願WO2005/121315のWGIF01株)と交配させる。親株の相補的独立栄養に基づき選択された、この交配により得られた二倍体クローンに胞子形成させ、次いで半数体クローンを得るための上述の処理をする。Fy1679−28cのアデニン独立栄養形質およびERTのerg6:TRP1崩壊の顕著な特徴である、アデニンおよびトリプトファンを欠いた培地で成長できる半数体株を選択した。クローンの半数性を、対照株のW303 MATaまたはMATアルファと交配させることによって検証した。トリプトファンTRP1の選択可能マーカーにより、無傷のADE2遺伝子座およびERG6遺伝子の崩壊を組み合わせ、得られたクローンを、yIM110およびyIM111と名付けた。
次に、yIM110株を、CDR06半数体株と交配させる。CDR06は、FY1679を遺伝的起源とする株であり、このade2遺伝子座は、植物のアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)のΔ7−ステロールレダクターゼに関する発現カセットの統合を介して非機能性である。CDR06およびCDR07(特許出願WO2002/061109またはDuport et al,2003に記載)を同じ交配により得、これらはCDR06において機能性であるERG5遺伝子が存在するという理由で異なる。二倍体クローンyIM110XCDR06を単離し、その後、胞子産生条件下に置いた。胞子を先に記載したように調製し、富んだ培地において単離し、その後、アデニンの存在下および不在下ならびにERG6p活性の機能性の不在およびΔ7−ステロールレダクターゼ活性の存在の組み合わせと関係がある、ナイスタチンに対する菌株の耐性を検証するために、この抗真菌剤の存在下でさまざまな培地において試験する。さらに、鹸化、その後の全ステロールの有機抽出法によりステロール組成物を検証する。ステロールの同一性をGC/FIDにより分析し、次いでGC/MSにより検証する。国際特許出願WO2005/121315に過去に記載されたように培養し処理した細胞のペレットを使用して、デスモステロールと同じ保持時間を有する生成物の存在が、クローン4および6に観察された。これらのクローン4および6は、ガラクトースが炭素源である場合もまたナイスタチンに対して耐性である。これらの半数体クローン4および6を、それぞれyIM115およびyIM116と名付ける。
最終的に、yIM116およびCA23株の3回目の交配を、対象となる3種の遺伝子、即ちARE1、ARE2およびERG5の遮断を、コレステロールおよびさらにチトクロームP450を機能性にするために必要とされる電子輸送体に関する発現カセットを産生できる菌株に導入する目的で実施する。国際特許出願WO2005/121315に記載のCA23株は、3種の遺伝子、ARE1、ARE2およびERG5の非機能型およびLEU2遺伝子座に統合されたアドレノドキシンレダクターゼ(ADR)の電子輸送体に関する発現カセットを含有する。yIM116XCA23二倍体を、トリプトファン、ヒスチジンまたはロイシンを含有しないがアデニンおよびウラシルを含有する最小培地において単離した。この方法において、yIM116およびCA23の間の交配を起源とする二倍体細胞のみが成長できるのに反して、交配のパートナーはこれらの条件下では全く成長できない。二倍体クローンは、先に記載の条件下で胞子を形成する。先に記載のように胞子および二倍体株の混合物をエーテルで処理後、約100の胞子を単離する。これらのクローンを、これらの接合型記号、アデニン、ロイシン、ヒスチジンおよびトリプトファンを含まない培地において成長する能力、3種の抗真菌剤、ナイスタチン、ハイグロマイシンおよびジェネテシンに耐える能力に関して特徴付けた。最終的に、このようにして選択されたクローン4を、yIM126と名付けた。このクローンはロイシンの不在下で成長でき、機能性LEU2遺伝子に関する発現カセットの存在を示す。このクローンは、トリプトファンおよびヒスチジンの不在下でもまた成長でき、ERG6およびARE2遺伝子の崩壊の可能性を示す。高レベルのナイスタチンおよびジェネテシンに耐性であり、おそらく、それぞれDHCR7酵素の存在およびさらにARE1遺伝子の崩壊を示している。ARE1およびARE2遺伝子の生成物の存在を確認または否定するために、遊離またはエステル化されたステロールを分析し、ERG6遺伝子の遮断およびDHCR7の存在を否定または確認するために、ステロールの性質を分析する。
[実施例C]
酵母における、機能性酵素活性を介したコレステロールの産生およびこの異化を組み合わせた菌株の構築
DHCR24に関する発現カセットを含有し、チトロームP450およびADX電子輸送体を含む、または含まないプラスミドを、yIM126酵母に、LiAc/PEG形質転換法(Gietz et al,1995 and 2002)を使用して導入する。
酵母における、機能性酵素活性を介したコレステロールの産生およびこの異化を組み合わせた菌株の構築
DHCR24に関する発現カセットを含有し、チトロームP450およびADX電子輸送体を含む、または含まないプラスミドを、yIM126酵母に、LiAc/PEG形質転換法(Gietz et al,1995 and 2002)を使用して導入する。
このクローンを、無ウラシル培地において選択する。各組み合わせの2つから4つのクローンを、国際特許出願WO2005/121315に記載の手順に従ってGC/FID、その後CG/MSによる全ステロールの分析のために培養する。このクローンを、48時間、振とうしながら30℃において、2%グルコースおよび100μg/mlのアデニンを添加したYBN培地において培養する。光学密度(OD600nm)は、平均値7ユニットに達する。培養体積Vから細胞ペレットを回収し、同一体積Vの、20%のカザミノ酸、2%のグルコースおよび100μg/mlのアデニンを含有するKappeli培地に移す。これらの培養液を72時間から90時間、30℃においてインキュベートし、600nmにおける光学密度は40から50ユニットに達する。100光学密度ユニットの体積と同等のペレットを処理し、前記および国際特許出願WO2005/121315に記載のようにガスクロマトグラフィーにより分析する。
酵母試料のステロールプロファイルを、コレステロール(図1A)、デスモステロール(図1B)、プレグネノロン(図1C)、24OH−コレステロール(図1D)および27OH−コレステロール(図1E)などの、GC/FIDガスクロマトグラフィーによる標準溶液の保持時間と比較し、生成物を、保持時間の類似性により同定する。
ピークの表面積の分析および測定により、pIM580プラスミドを含有し、P450を含まず、コレステロール/デスモステロール比が3を超えるyIM126株のコレステロール産生が示される。P450の発現構築体を含有するyIM126株は、コレステロールを基質として使用する各P450に特異的なコレステロール誘導体を産生する、即ち、CYP11A1に関してはプレグネノロン(図3)、CP27A1に関しては27OH−コレステロール(図4)および27OH−ステロールおよびCYP46A1に関しては24OH−コレステロール(図5)の産生である。コレステロール/デスモステロール比は、CYP46の存在下で2倍、およびCYP11A1またはCYP27A1の存在下で5から6倍減少し、コレステロールがおそらく代謝されたことを示す。27OH−デスモステロールなどの27位においてヒドロキシル化された新しいステロールは、CYP27A1活性の存在下で特異的に現れる(図4)。
[実施例D]
コレステロール代謝を検出するための、細胞における生物学的方法
a)培養培地:
成長に関する、または成長の喪失に関する単純な表現型試験を介して、コレステロール産生酵母とコレステロールを産生しないまたはこれを異化しない酵母とを識別できる培養培地を開発する。この培養培地は、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)B−301D(Sigma#S6946)由来のシリンゴマイシンE毒素を150から250ng/mlで添加した、YPG寒天型(YPG完全培地:酵母エキス(Difco)10g/L、バクト−ペプトン(bacto−peptone)(Difco)20g/L、グルコース(Merck)20g/L)の富栄養培地である。
コレステロール代謝を検出するための、細胞における生物学的方法
a)培養培地:
成長に関する、または成長の喪失に関する単純な表現型試験を介して、コレステロール産生酵母とコレステロールを産生しないまたはこれを異化しない酵母とを識別できる培養培地を開発する。この培養培地は、シュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)B−301D(Sigma#S6946)由来のシリンゴマイシンE毒素を150から250ng/mlで添加した、YPG寒天型(YPG完全培地:酵母エキス(Difco)10g/L、バクト−ペプトン(bacto−peptone)(Difco)20g/L、グルコース(Merck)20g/L)の富栄養培地である。
固体培地を得るために寒天(20g/L)を加える。
b)コレステロール代謝の検出
前記の、DHCR24およびpIM580などのチトクロームP450に関する発現ベクターを含有するyIM126酵母株を、48時間、30℃において振とうしながら、2%グルコースおよび100μg/mlのアデニンを添加したYNB培地(酵母窒素源w/oアミノ酸(Difco)6.7g/L、グルコース(Merck)20g/L)において培養する。
前記の、DHCR24およびpIM580などのチトクロームP450に関する発現ベクターを含有するyIM126酵母株を、48時間、30℃において振とうしながら、2%グルコースおよび100μg/mlのアデニンを添加したYNB培地(酵母窒素源w/oアミノ酸(Difco)6.7g/L、グルコース(Merck)20g/L)において培養する。
培養により、600nmにおける光学密度が約7ユニットに達する。細胞ペレットを遠心分離により回収し、20%カザミノ酸、2%グルコースおよび100μg/mlのアデニンを含有する、同一量のKappeli培地に移し、30℃において24時間振とうし、600nmにおける光学密度は約40ユニットに達する。
当業者に公知の方法に従って、シリンゴマイシンEを含有するYPG寒天における滴下試験を実施するために、培養液を600nmにおける光学密度が1ユニットに希釈し、その後、1/50に希釈し、その後25倍希釈にする。
48時間から72時間、30℃においてインキュベーション後、シリンゴマイシンEを170ng/ml含有するTPG寒天において、コレステロールを産生するpIM582発現ベクターを含有する酵母(P450は含まない、図6、列1)は成長できず、一方、コレステロールを産生し、これを誘導生成物に転換するpIM580発現ベクターを含有する酵母(CYP27A1を含む、図6、列2)は成長できる(図6Aおよび6B)。シリンゴマイシンEを含有するこのYPG培地の毒性は、CG/FIDまたはCG/MSにより観察された、酵母において利用可能なコレステロールの量に依存する。
[実施例E]
コレステロールの代謝に干渉する生成物を検出するための、細胞における生物学的方法:
コレステロール合成に関して改変された酵母の成長のためのこの試験もまた、コレステロール合成またはコレステロール異化のいずれかに干渉する生成物の同定を可能にする。
コレステロールの代謝に干渉する生成物を検出するための、細胞における生物学的方法:
コレステロール合成に関して改変された酵母の成長のためのこの試験もまた、コレステロール合成またはコレステロール異化のいずれかに干渉する生成物の同定を可能にする。
DHCR24の発現プラスミドを含有し、P450を含む、または含まないyIM126酵母を、YNB培地、2%グルコース、100μg/mlのアデニンにおいて48時間、30℃において培養し、その後上記のようにKappeli培地において24時間、30℃において培養する。
この菌株にとって毒性である用量、即ち、pIM582プラスミドを含有するyIM126に関しては160ng/mlまたはpIM580プラスミドを含有するyIM126株に関しては250ng/mlでシリンゴマイシンEを含有するYPG寒天を接種するために、酵母懸濁液を、600nmにおける光学密度が0.005ユニット(1/200)までYNB培地で希釈する。
寒天培地の接種を、この表面に流し込み、過剰の液体をすぐに吸引することによって実施する。対象となる生成物を、寒天表面に堆積させ、従って接種し、その後乾燥させる。48時間から72時間、30℃のインキュベーション後、酵母成長のハローが、コレステロール合成またはコレステロール異化に干渉する生成物の堆積物の周りに観察される。コレステロールの合成の阻害またはコレステロールの異化の活性化のいずれかにより、コレステロールの量の減少を誘導する生成物は、当初は毒性であるこの培地において成長の回復をもたらす。DHCR24、DHCR27またはΔ8−Δ7ステロールイソメラーゼなどの、コレステロール合成に関連し、野生型酵母またはステロール合成に関して改変された酵母に必須ではない酵素の阻害因子は、従って、コレステロールレベル依存性成長を検出するためのこの方法を用いて容易に実証される。同様に、この方法は、チトクロームP450などの、コレステロールを異化する酵素のアクチベーター、例えばCYP27A1を同定できる。これにより、公知の生成物、例えば、ステロール−Δ14レダクターゼ、DHCR7およびΔ8−7イソメラーゼを阻害するトリパラノール、DHCR7を阻害するAY9944(J.Sanchez−Wandelmer et al 2009)、ステロールΔ8−7イソメラーゼを阻害するSR31747(R.Paul et al 1998)、またはDHCR14およびステロールΔ8−7イソメラーゼを阻害するアモロルフィン(A.J.Carrillo−Munoz et al,2006)を検証でき、同様に、コレステロールの堆積または27OH−コレステロールの堆積は、寒天に含まれるシリンゴマイシンEの毒性に関する保護領域を誘導する(図6)。
参考文献
Carrillo−Munoz,A.J.,G.Giusiano,P.A.Ezkurra,and G.Quindos.2006.Antifungal agents:mode of action in yeast cells.Rev Esp Quimioter.19:130−9.
Duport,C,R.Spagnoli,E.Degryse,and D.Pompon.1998.Self−sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast.Nat Biotechnol.16:186−9.
Gietz,R.D.,R.H.Schiestl,A.R.Willems,and R.A.Woods.1995.Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS−DNA/PEG procedure.Yeast.11:355−60.
Gietz,R.D.,and R.A.Woods.2002.Transformation of yeast by lithium acetate/single−stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.Methods Enzymol.350:87−96.
Paul,R.,S.Silve,N.De Nys,P.H.Dupuy,C.L.Bouteiller,J.Rosenfeld,P.Ferrara,G.Le Fur,P.Casellas,and G.Loison.1998.Both the immunosuppressant SR31747 and the antiestrogen tamoxifen bind to an emopamil−insensitive site of mammalian Delta8−Delta7 sterol isomerase.J Pharmacol Exp Ther.285:1296−302.
Pompon,D.,B.Louerat,A.Bronine,and P.Urban.1996.Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments.Methods Enzymol.272:51−64.
Sanchez−Wandelmer,J.,A.Davalos,E.Herrera,M.Giera,S.Cano,G.de la Pena,M.A.Lasuncion,and R.Busto.2009.Inhibition of cholesterol biosynthesis disrupts lipid raft/caveolae and affects insulin receptor activation in 3T3−L1 preadipocytes.Biochim Biophys Acta.1788:1731−9.
P.Urban,D.Werck−Reichhart,H.G.Teutsh,F.Durst,S.Regnier,M.Kazmaier and D.Pompon,Characterization of recombinant plant cinnamate 4−hydroxylase produced in yeast Kinetic and spectral properties of the major plant P450 of the phenylpropanoid pathway,Eur J Biochem.1994 Jun 15;222(3):843−850.
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Claims (16)
- コレステロール検出段階を含むこと、および検出されたコレステロールレベルが、毒性培地において細胞の成長に反比例することを特徴とする、コレステロールを調節する化合物を同定する方法。
- コレステロール産生細胞と対象となる化合物とを、前記細胞にとって当初は毒性である培地において接触させる段階を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- コレステロールおよびコレステロール合成に参加する酵素の両方を産生する細胞と、対象となる化合物とを、前記細胞にとって当初は毒性である培地において接触させる段階を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- コレステロールおよびコレステロールを異化する酵素の両方を産生する細胞と、対象となる化合物とを、前記細胞にとって当初は毒性である培地において接触させる段階を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- コレステロール産生遺伝子操作酵母の使用を含むことを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)(ラクティス(lactis)など)またはピキア・パトリス(Pichia pastoris)からなる群に含まれる酵母の使用を含み、前記酵母がコレステロールを産生するように遺伝子操作されていることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- (a)酵母を、コレステロールおよびコレステロール産生を活性化する酵素の両方を発現するように形質転換する段階、
(b)形質転換された酵母を、対象となる化合物と接触させる段階、および
(c)毒素に対する耐性に関する試験を用いて、発現されたコレステロールのレベルの変化を定量化する段階、
を含むことを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。 - (a)酵母を、コレステロールおよびコレステロール産生を減少させる酵素の両方を発現するように形質転換する段階、
(b)形質転換された酵母を、対象となる化合物と接触させる段階、および
(c)毒素に対する耐性に関する試験を用いて、発現されたコレステロールのレベルの変化を定量化する段階、
を含むことを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。 - 使用する毒素が、シリンゴマイシンE、フィトスフィンゴシン、テロマイシン、イツリンA、コレラ菌毒素およびコレステロール依存性毒素からなる群に含まれることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 使用する毒素がシリンゴマイシンEであることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子操作された酵母により産生される酵素が、下記の群:DHCR7、DHCR14、DHCR24およびΔ8−7ステロールイソメラーゼから選択されることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子操作された酵母が、酵素のアクチベーターとして、CYP27A1、CYP46A1、CYP11A1およびCYP7A1から選択されるチトクロームP450を産生することを特徴とする、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 酵母ステロールをコレステロールに転換できる酵素発現カセットおよびコレステロールの代謝に作用するタンパク質活性に関する発現カセットを含むベクター。
- ベクターが、プラスミドであることを特徴とする、請求項13に記載のベクター。
- ベクターが、下記のプラスミド:pCD63、pYeDP60、pIM565、pIM578、pIM580、pIM582またはpIM584の1つであることを特徴とする、請求項13に記載のベクター。
- 心血管病態または代謝病態の治療における使用のための、請求項1から12に記載の方法の1つに従って検出される化合物。
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