JPH07322892A - 免疫抑制物質のスクリーニング方法 - Google Patents
免疫抑制物質のスクリーニング方法Info
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- JPH07322892A JPH07322892A JP11673194A JP11673194A JPH07322892A JP H07322892 A JPH07322892 A JP H07322892A JP 11673194 A JP11673194 A JP 11673194A JP 11673194 A JP11673194 A JP 11673194A JP H07322892 A JPH07322892 A JP H07322892A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 免疫抑制物質のスクリーニングのための簡単
で迅速な方法の提供。 【構成】 液胞膜プロトンＡＴＰａｓｅ活性欠損酵母変
異株を、被験サンプルを添加した、又は添加しない、種
々のカルシウム濃度の培地で培養し、被験サンプルを添
加した培地において増殖限界カルシウム濃度が低下すれ
ば、該被験サンプル中に免疫抑制物質が含まれていると
推定する。
で迅速な方法の提供。 【構成】 液胞膜プロトンＡＴＰａｓｅ活性欠損酵母変
異株を、被験サンプルを添加した、又は添加しない、種
々のカルシウム濃度の培地で培養し、被験サンプルを添
加した培地において増殖限界カルシウム濃度が低下すれ
ば、該被験サンプル中に免疫抑制物質が含まれていると
推定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵母を用いる簡便な免
疫抑制物質のスクリーニング方法に関する。
疫抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫抑制剤は、臓器移植における拒絶反
応の抑制、自己免疫疾患や他の免疫学的機序が関与する
様々な疾患の予防や治療のために重要な物質であり、多
くの免疫抑制剤が知られている。特に、サイクロスポリ
ンＡ（ＣｓＡ）及びＦＫ５０６は免疫系細胞に特異的に
作用し、免疫応答の要であるＴ細胞の活性化の初期段階
で効果をあらわし、すでに確立された抗体産生などには
影響を与えないものとして重要である。
応の抑制、自己免疫疾患や他の免疫学的機序が関与する
様々な疾患の予防や治療のために重要な物質であり、多
くの免疫抑制剤が知られている。特に、サイクロスポリ
ンＡ（ＣｓＡ）及びＦＫ５０６は免疫系細胞に特異的に
作用し、免疫応答の要であるＴ細胞の活性化の初期段階
で効果をあらわし、すでに確立された抗体産生などには
影響を与えないものとして重要である。
【０００３】ＣｓＡ及びＦＫ５０６が免疫抑制効果を現
わす機序としては、ＣｓＡ又はＦＫ５０６は、それらの
細胞内受容体であるそれぞれサイクロフィリン（Ｃｙ
ｐ）又はＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）と結合し
て、それぞれＣｓＡ−Ｃｙｐ複合体又はＦＫ５０６−Ｆ
ＫＢＰ複合体を形成し、これらの複合体が共通に結合す
る物質である蛋白質セリン／スレオニン脱リン酸化酵素
カルシニューリンと結合し、これによってカルシニュー
リンの活性を阻害することにより免疫抑制効果が現われ
ると推定されている。
わす機序としては、ＣｓＡ又はＦＫ５０６は、それらの
細胞内受容体であるそれぞれサイクロフィリン（Ｃｙ
ｐ）又はＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）と結合し
て、それぞれＣｓＡ−Ｃｙｐ複合体又はＦＫ５０６−Ｆ
ＫＢＰ複合体を形成し、これらの複合体が共通に結合す
る物質である蛋白質セリン／スレオニン脱リン酸化酵素
カルシニューリンと結合し、これによってカルシニュー
リンの活性を阻害することにより免疫抑制効果が現われ
ると推定されている。
【０００４】酵母細胞においても、ＦＫ５０６やＣｓＡ
に対する結合蛋白質をコードする遺伝子の同族体（それ
ぞれ、ＦＫＢ１及びＣＹＰ１と称する）が単離されてお
り、これらの遺伝子が破壊された細胞についても解析が
行われているが、この遺伝子破壊が酵母の細胞増殖に本
質的な欠陥を与えることは観察されていない。
に対する結合蛋白質をコードする遺伝子の同族体（それ
ぞれ、ＦＫＢ１及びＣＹＰ１と称する）が単離されてお
り、これらの遺伝子が破壊された細胞についても解析が
行われているが、この遺伝子破壊が酵母の細胞増殖に本
質的な欠陥を与えることは観察されていない。
【０００５】また、カルシニューリンについては、それ
をコードする遺伝子としてＣＮＢ１（調節サブユニット
をコードする）、ＣＮＡ１（触媒サブユニット１をコー
ドする）及びＣＮＡ２（触媒サブユニット２をコードす
る）が単離されており、これらを用いて作製したカルシ
ニューリン活性欠損株においては、αファクターによる
Ｇ１期停止からの回復に欠損があること（Cyert,M.S.
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol 88,7376-7380(1992)
；Cyert,M.S.ら、Mol.Cell.Biol.Vol.12,3460-3469(19
92 ）；Foor.F. ら、Nature,Vol.360,682-684(1992))
、及び１．２Ｍ ＮａＣｌに感受性であること（Nakam
ura T. ら、EMBO J.Vol.12,4063-4071(1993))が報告さ
れている。
をコードする遺伝子としてＣＮＢ１（調節サブユニット
をコードする）、ＣＮＡ１（触媒サブユニット１をコー
ドする）及びＣＮＡ２（触媒サブユニット２をコードす
る）が単離されており、これらを用いて作製したカルシ
ニューリン活性欠損株においては、αファクターによる
Ｇ１期停止からの回復に欠損があること（Cyert,M.S.
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol 88,7376-7380(1992)
；Cyert,M.S.ら、Mol.Cell.Biol.Vol.12,3460-3469(19
92 ）；Foor.F. ら、Nature,Vol.360,682-684(1992))
、及び１．２Ｍ ＮａＣｌに感受性であること（Nakam
ura T. ら、EMBO J.Vol.12,4063-4071(1993))が報告さ
れている。
【０００６】しかしながら、酵母におけるカルシウムと
カルシニューリンとの関係については報告されていな
い。本発明者らは、培地中のカルシウム濃度と酵母の増
殖との関係を研究する過程で、カルシニューリン活性を
有する酵母（カルシニューリン遺伝子が欠損していない
酵母) が増殖し得ない高濃度のカルシウムを含有する培
地においても、それに免疫抑制物質であるＣｓＡ又はＦ
Ｋ５０６を添加した場合にはその培地中で酵母が増殖し
得るという全く新しい知見を得、さらにこの現象におい
て、免疫抑制物質がその効果を発揮する過程に介在する
カルシニューリンが関与していることを見出している。
カルシニューリンとの関係については報告されていな
い。本発明者らは、培地中のカルシウム濃度と酵母の増
殖との関係を研究する過程で、カルシニューリン活性を
有する酵母（カルシニューリン遺伝子が欠損していない
酵母) が増殖し得ない高濃度のカルシウムを含有する培
地においても、それに免疫抑制物質であるＣｓＡ又はＦ
Ｋ５０６を添加した場合にはその培地中で酵母が増殖し
得るという全く新しい知見を得、さらにこの現象におい
て、免疫抑制物質がその効果を発揮する過程に介在する
カルシニューリンが関与していることを見出している。
【０００７】酵母菌において、培地中にＦＫ５０６を５
０μｇ／ml程度加えると細胞の約５０％が死ぬ。また、
ＣｓＡについても、ＦＫ５０６の１００倍程度で細胞増
殖阻害効果が生ずることが報告されている。しかしなが
ら、これら免疫抑制物質が生体内でその効果を示す濃度
に比べて、約１００倍程度高濃度である。その原因とし
て、酵母の細胞壁の透過性及び、細胞内酸性化小器官で
ある液胞の解毒作用が考えられる。
０μｇ／ml程度加えると細胞の約５０％が死ぬ。また、
ＣｓＡについても、ＦＫ５０６の１００倍程度で細胞増
殖阻害効果が生ずることが報告されている。しかしなが
ら、これら免疫抑制物質が生体内でその効果を示す濃度
に比べて、約１００倍程度高濃度である。その原因とし
て、酵母の細胞壁の透過性及び、細胞内酸性化小器官で
ある液胞の解毒作用が考えられる。
【０００８】本発明者らは、特に液胞機能の原動力とな
る液胞膜プロトンＡＴＰａｓｅの生化学的解析及び分子
生物学的解析を行ってきた（例えばOhyaら、J.Biol.Che
m.vol.266,13971-13977,1991、等) 。液胞膜プロトンＡ
ＴＰａｓｅの機能発現に関与する変異株（以下、Ｖａｃ
ｕｏｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｈ+ −ＡＴＰａｓｅの
頭文字でｖｍａ変異株と略す。）は、液胞内の酸性化が
進まないだけでなく、カルシウム感受性、非発酵性の炭
素源で増殖できない等の多面的な表現系を示す。
る液胞膜プロトンＡＴＰａｓｅの生化学的解析及び分子
生物学的解析を行ってきた（例えばOhyaら、J.Biol.Che
m.vol.266,13971-13977,1991、等) 。液胞膜プロトンＡ
ＴＰａｓｅの機能発現に関与する変異株（以下、Ｖａｃ
ｕｏｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｈ+ −ＡＴＰａｓｅの
頭文字でｖｍａ変異株と略す。）は、液胞内の酸性化が
進まないだけでなく、カルシウム感受性、非発酵性の炭
素源で増殖できない等の多面的な表現系を示す。
【０００９】本発明者らは、これらの研究の過程で、酵
母のｖｍａ変異株においては、免疫抑制物質であるＦＫ
５０６等の添加により、これに対する結合蛋白質との複
合体形成を介してカルシウムに対する感受性が上昇する
という、カルシニューリン活性酵母株の場合とは反対の
現象が生ずることを見出した。
母のｖｍａ変異株においては、免疫抑制物質であるＦＫ
５０６等の添加により、これに対する結合蛋白質との複
合体形成を介してカルシウムに対する感受性が上昇する
という、カルシニューリン活性酵母株の場合とは反対の
現象が生ずることを見出した。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】従って、本発明は、前記の新規な知見に基づい
て、免疫抑制物質の簡便なスクリーニング方法を提供し
ようとするものである。すなわち、本発明は、カルシウ
ム濃度を異にする複数の酵母用培地を二組用意し、一組
の培地には被験サンプルを添加し、他方の組の培地には
被験サンプルを添加せず、これらの培地に液胞膜プロト
ンＡＴＰａｓｅの活性が欠損した酵母変異株を接種して
培養し、被験サンプルを添加した場合に該変異株の増殖
を許容するカルシウム濃度が、被験サンプルを添加しな
かった場合に該変異株の増殖を許容するカルシウム濃度
よりも低い場合に、該被験サンプルが免疫抑制物質を含
有すると推定することを特徴とする免疫抑制物質のスク
リーニング方法を提供する。
の手段】従って、本発明は、前記の新規な知見に基づい
て、免疫抑制物質の簡便なスクリーニング方法を提供し
ようとするものである。すなわち、本発明は、カルシウ
ム濃度を異にする複数の酵母用培地を二組用意し、一組
の培地には被験サンプルを添加し、他方の組の培地には
被験サンプルを添加せず、これらの培地に液胞膜プロト
ンＡＴＰａｓｅの活性が欠損した酵母変異株を接種して
培養し、被験サンプルを添加した場合に該変異株の増殖
を許容するカルシウム濃度が、被験サンプルを添加しな
かった場合に該変異株の増殖を許容するカルシウム濃度
よりも低い場合に、該被験サンプルが免疫抑制物質を含
有すると推定することを特徴とする免疫抑制物質のスク
リーニング方法を提供する。
【００１１】
【具体的な説明】本発明において、液胞膜プロトンＡＴ
Ｐａｓｅの活性を欠損した変異株を「ｖｍａ変異株」又
は単に「変異株」と称し、この様な変異を有しない酵母
株を便宜上「野性株」と称する。ｖｍａ変異株は野性株
から変異により得られる。この意味において、多くの酵
母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces 属に属する
多くの酵母、例えば多くのサッカロミセス・セレビシエ
ー（Saccharomyces cerevisiae)種に属する株が野性株
である。
Ｐａｓｅの活性を欠損した変異株を「ｖｍａ変異株」又
は単に「変異株」と称し、この様な変異を有しない酵母
株を便宜上「野性株」と称する。ｖｍａ変異株は野性株
から変異により得られる。この意味において、多くの酵
母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces 属に属する
多くの酵母、例えば多くのサッカロミセス・セレビシエ
ー（Saccharomyces cerevisiae)種に属する株が野性株
である。
【００１２】従って、本発明におけるカルシニューリン
活性を有する酵母株、すなわち野性株は、一般の実験室
や研究室において常用されている酵母株の中から任意に
選択することができ、また種々の微生物寄託機関に保管
されており、特に制限なく分譲され得る酵母株から選択
して用いることができる。従って、本発明においては、
Yeast Genetic Stock Centerに保管されており、自由に
分譲され得るサッカロミセス・セレビシエーＳ２８８Ｃ
株に由来するＹＰＨ４９９株（Sikorski and Hieter,Ge
netics,Vol.122,19-27,(1989))を例として用いるが，こ
れに限定されるものではない。
活性を有する酵母株、すなわち野性株は、一般の実験室
や研究室において常用されている酵母株の中から任意に
選択することができ、また種々の微生物寄託機関に保管
されており、特に制限なく分譲され得る酵母株から選択
して用いることができる。従って、本発明においては、
Yeast Genetic Stock Centerに保管されており、自由に
分譲され得るサッカロミセス・セレビシエーＳ２８８Ｃ
株に由来するＹＰＨ４９９株（Sikorski and Hieter,Ge
netics,Vol.122,19-27,(1989))を例として用いるが，こ
れに限定されるものではない。
【００１３】野性株からｖｍａ変異株を得るには、ＹＰ
Ｄ＋１００mM ＣａＣｌ2 培地（１％酵母エキス、２％
ペプトン、２％グルコース、１００mM ＣａＣｌ2 ）に
感受性でなおかつ、非醗酵性の炭素源で増殖できないと
いう表現系（例えば、Ohyaら；J.Biol.Chem.Vol.266,13
971-13977,(1991)) を利用するか、中性のpHに感受性と
いう表現系（例えば、Preston ら；Proc.Natl.Acad.Sc
i．USA.Vol.86,7027-7031,(1989))を利用して得るか、
あるいは、既知の塩基配列（例えば、ＶＭＡ１；Hirata
ら；J.Biol.Chem.Vol.265,6726-6733,(1990), ＶＭＡ２
／ＶＡＴ２；Nelsonら；J.Biol.Chem.Vol.264,1775-177
8(1989),ＶＭＡ３；Umemoto ら；J.Biol.Chem.Vol.265,
18447-18453,(1990), ＶＭＡ５／ＶＡＴｃ；Beltran
ら；J.Biol.Chem.Vol.267,774-779,(1992)) などを用い
て常法にしたがって遺伝子の破壊を行う等がある。
Ｄ＋１００mM ＣａＣｌ2 培地（１％酵母エキス、２％
ペプトン、２％グルコース、１００mM ＣａＣｌ2 ）に
感受性でなおかつ、非醗酵性の炭素源で増殖できないと
いう表現系（例えば、Ohyaら；J.Biol.Chem.Vol.266,13
971-13977,(1991)) を利用するか、中性のpHに感受性と
いう表現系（例えば、Preston ら；Proc.Natl.Acad.Sc
i．USA.Vol.86,7027-7031,(1989))を利用して得るか、
あるいは、既知の塩基配列（例えば、ＶＭＡ１；Hirata
ら；J.Biol.Chem.Vol.265,6726-6733,(1990), ＶＭＡ２
／ＶＡＴ２；Nelsonら；J.Biol.Chem.Vol.264,1775-177
8(1989),ＶＭＡ３；Umemoto ら；J.Biol.Chem.Vol.265,
18447-18453,(1990), ＶＭＡ５／ＶＡＴｃ；Beltran
ら；J.Biol.Chem.Vol.267,774-779,(1992)) などを用い
て常法にしたがって遺伝子の破壊を行う等がある。
【００１４】なお、これら変異株で液胞膜プロトンＡＴ
Ｐａｓｅの活性が欠損していることは、大矢らの方法
（J.Biol.Chem.vol.266,13971-13977, 1991)に従って確
認できる。本発明において使用できるｖｍａ変異株の一
例として、サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomy
ces cerevisiae) ＤＶ３ＴＬ−Ｂ２を挙げることができ
る。
Ｐａｓｅの活性が欠損していることは、大矢らの方法
（J.Biol.Chem.vol.266,13971-13977, 1991)に従って確
認できる。本発明において使用できるｖｍａ変異株の一
例として、サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomy
ces cerevisiae) ＤＶ３ＴＬ−Ｂ２を挙げることができ
る。
【００１５】本発明に従って免疫抑制物質のスクリーニ
ングを行うには、まず基礎培地におよそ１〜１００mMの
範囲で異るカルシウム濃度を有する一連の培地を二組用
意する。基礎培地としては、酵母の培養に用いる通常の
培地、例えば酵母エキス１％、ペプトン２％及びグルコ
ース２％を含有する培地を用いることができる。この培
地のpHは、カルシウム濃度による酵母の増殖限界を容易
に決定することができるように選択し、通常はpH５〜６
が好ましい。
ングを行うには、まず基礎培地におよそ１〜１００mMの
範囲で異るカルシウム濃度を有する一連の培地を二組用
意する。基礎培地としては、酵母の培養に用いる通常の
培地、例えば酵母エキス１％、ペプトン２％及びグルコ
ース２％を含有する培地を用いることができる。この培
地のpHは、カルシウム濃度による酵母の増殖限界を容易
に決定することができるように選択し、通常はpH５〜６
が好ましい。
【００１６】次に、これらの培地の内一組に同量の被験
サンプルを添加し、他の一組には被験試料を添加しな
い。次にこれらの培地にｖｍａ変異株を接種し、２３〜
３０℃において１〜４日間培養する。この結果、被験サ
ンプルを添加した場合に、変異株が増殖し得る最高カル
シウム濃度と、被験サンプルを添加しなかった場合に変
異株が増殖し得る最高カルシウム濃度を決定する。そし
て前者のカルシウム濃度が後者のカルシウム濃度より低
い場合に、前記被験試料が免疫抑制物質を含んでいるも
のと推定する。上記の試験は、固体培地又は液体培地の
いずれを用いても行うことができる。
サンプルを添加し、他の一組には被験試料を添加しな
い。次にこれらの培地にｖｍａ変異株を接種し、２３〜
３０℃において１〜４日間培養する。この結果、被験サ
ンプルを添加した場合に、変異株が増殖し得る最高カル
シウム濃度と、被験サンプルを添加しなかった場合に変
異株が増殖し得る最高カルシウム濃度を決定する。そし
て前者のカルシウム濃度が後者のカルシウム濃度より低
い場合に、前記被験試料が免疫抑制物質を含んでいるも
のと推定する。上記の試験は、固体培地又は液体培地の
いずれを用いても行うことができる。
【００１７】また、前記の方法の変法、又は便法とし
て、既知の免疫抑制物質を添加した場合に変異株が増殖
し得る最高カルシウム濃度と、既知免疫抑制物質を添加
しなかった場合に変異菌が増殖し得る最高カルシウム濃
度との間の濃度でカルシウムを含有する培地を用意し、
これに被験サンプルを添加し、変異株を接種して培養
し、変異株が増殖しなかった場合、又は増殖が抑制され
た場合に、該試サンプル中に免疫抑制物質が含有されて
いると推定することができる。簡便には次の方法により
スクリーニングを行うことができる。
て、既知の免疫抑制物質を添加した場合に変異株が増殖
し得る最高カルシウム濃度と、既知免疫抑制物質を添加
しなかった場合に変異菌が増殖し得る最高カルシウム濃
度との間の濃度でカルシウムを含有する培地を用意し、
これに被験サンプルを添加し、変異株を接種して培養
し、変異株が増殖しなかった場合、又は増殖が抑制され
た場合に、該試サンプル中に免疫抑制物質が含有されて
いると推定することができる。簡便には次の方法により
スクリーニングを行うことができる。
【００１８】培地 ６mM ＣａＣｌ2 ２％ 酵母エキス ４％ バクトペプトン ４％ デキストロース（グルコース） １００mM コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
５．０）
５．０）
【００１９】細胞培養液 ＹＰＤ培地で３０℃にて一昼夜培養したｖｍａ変異株
（１〜３×１０8 細胞／ml）の細胞培養液（又はその凍
結乾燥物）方法 （１）９６穴平底タイタープレートの１穴に５０μｌの
培地１を加え、１μｌの細胞培養液を添加する。 （２）検定したいサンプルを滅菌水に懸濁後、５０μｌ
を穴に加える。陽性コントロールとして、最終濃度１μ
ｇ／mlとなるようにＦＫ５０６を添加し、陰性コントロ
ールとして滅菌水を添加する。 （３）３０℃で２４時間、緩やかに攪拌しながら保温す
る。 （４）ＯＤ600 の測定。ＯＤ600 が０．１５以下であれ
ば、免疫抑制効果のある物質の可能性が高い。 前記培地（液体培地又は水を未添加の培地配合物）、及
び細胞培養液（又はその凍結乾燥物）を組合わせてスク
リーニング用キットにすることもできる。
（１〜３×１０8 細胞／ml）の細胞培養液（又はその凍
結乾燥物）方法 （１）９６穴平底タイタープレートの１穴に５０μｌの
培地１を加え、１μｌの細胞培養液を添加する。 （２）検定したいサンプルを滅菌水に懸濁後、５０μｌ
を穴に加える。陽性コントロールとして、最終濃度１μ
ｇ／mlとなるようにＦＫ５０６を添加し、陰性コントロ
ールとして滅菌水を添加する。 （３）３０℃で２４時間、緩やかに攪拌しながら保温す
る。 （４）ＯＤ600 の測定。ＯＤ600 が０．１５以下であれ
ば、免疫抑制効果のある物質の可能性が高い。 前記培地（液体培地又は水を未添加の培地配合物）、及
び細胞培養液（又はその凍結乾燥物）を組合わせてスク
リーニング用キットにすることもできる。
【００２０】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。実施例 ＹＰＤ培地（酵母エキス（ＤＩＦＣＯ）１％、バクトペ
プトン（ＤＩＦＣＯ）２％及びグルコース２％を含有す
る基礎培地）にＣａＣｌ2 を０mM、１．６mM、３．１m
M、６．３mM、１３mM、２５mM、５０mM又は１００mM添
加し、さらにコハク酸／ＮａＯＨ緩衝液によりpH５．０
に調製した固体培地を三組用意した。
明する。実施例 ＹＰＤ培地（酵母エキス（ＤＩＦＣＯ）１％、バクトペ
プトン（ＤＩＦＣＯ）２％及びグルコース２％を含有す
る基礎培地）にＣａＣｌ2 を０mM、１．６mM、３．１m
M、６．３mM、１３mM、２５mM、５０mM又は１００mM添
加し、さらにコハク酸／ＮａＯＨ緩衝液によりpH５．０
に調製した固体培地を三組用意した。
【００２１】この内の一組にはＦＫ５０６を添加せず、
一組にはＦＫ５０６を最終濃度が０．１μｇ／mlとなる
ように添加し、他の一組にはＦＫ５０６を最終濃度が１
μｇ／mlとなるように添加した。次に、これらの培地に
ＹＩＴ５００株（野性株）、ＤＶ３ＴＬ−Ｂ２株（ｖｍ
ａ３変異株）、ＤＶ３Ｆ１−８Ａ株（ｖｍａ変異と結合
蛋白質（ＦＫＢ１）欠損変異（ｆｋｂ１変異）との二重
変異株）、又はＤＦ１−９Ｄ株（ｆｋｂ１変異株）を接
種し、３０℃にて２日間培養した。結果は次の表の通り
であった。
一組にはＦＫ５０６を最終濃度が０．１μｇ／mlとなる
ように添加し、他の一組にはＦＫ５０６を最終濃度が１
μｇ／mlとなるように添加した。次に、これらの培地に
ＹＩＴ５００株（野性株）、ＤＶ３ＴＬ−Ｂ２株（ｖｍ
ａ３変異株）、ＤＶ３Ｆ１−８Ａ株（ｖｍａ変異と結合
蛋白質（ＦＫＢ１）欠損変異（ｆｋｂ１変異）との二重
変異株）、又はＤＦ１−９Ｄ株（ｆｋｂ１変異株）を接
種し、３０℃にて２日間培養した。結果は次の表の通り
であった。
【００２２】
【表１】
【００２３】上記の表から明らかな通り、ｖｍａ変異株
の１つであるＤＶ３ＴＬ−Ｂ２株は、免疫抑制物質であ
るＦＫ５０６の存在によりＣａ++に対する感受性が高く
なり、増殖限界は、ＦＫ５０６非存在下においてＣａ濃
度５０mMであるのに対して、ＦＫ５０６が０．１μｇ／
ml存在する場合には増殖限界はＣａ濃度１３mMであり、
ＦＫ５０６が１μｇ／ml存在する場合には増殖限界はＣ
ａ濃度１．６mMであった。従って、Ｃａの増殖限界濃度
の低下により免疫抑制物質の存在を推定することができ
る。
の１つであるＤＶ３ＴＬ−Ｂ２株は、免疫抑制物質であ
るＦＫ５０６の存在によりＣａ++に対する感受性が高く
なり、増殖限界は、ＦＫ５０６非存在下においてＣａ濃
度５０mMであるのに対して、ＦＫ５０６が０．１μｇ／
ml存在する場合には増殖限界はＣａ濃度１３mMであり、
ＦＫ５０６が１μｇ／ml存在する場合には増殖限界はＣ
ａ濃度１．６mMであった。従って、Ｃａの増殖限界濃度
の低下により免疫抑制物質の存在を推定することができ
る。
【００２４】また、ＶＭＡ３とＦＫＢ１の二重欠損変異
株（ＤＶ３Ｆ１−８Ａ）及びＦＫＢ１欠損変異株におい
ては上記の効果が認められなかったことから、ＦＫ５０
６の効果はｖｍａ３変異株のカルシウム透過性を高めて
いるのではなく、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰ−１２の複合体
でおそらくはカルシニューリンを通してｖｍａ３変異株
におけるカルシウム感受性を上昇させていると考えられ
る。
株（ＤＶ３Ｆ１−８Ａ）及びＦＫＢ１欠損変異株におい
ては上記の効果が認められなかったことから、ＦＫ５０
６の効果はｖｍａ３変異株のカルシウム透過性を高めて
いるのではなく、ＦＫ５０６−ＦＫＢＰ−１２の複合体
でおそらくはカルシニューリンを通してｖｍａ３変異株
におけるカルシウム感受性を上昇させていると考えられ
る。
【００２５】この現象は、液胞膜プロトンＡＴＰａｓｅ
の他のサブユニットあるいはアセンブルファクターをコ
ードしている遺伝子群（ＶＭＡ１，ＶＭＡ２，ＶＭＡ
４，ＶＭＡ５，ＶＭＡ６，ＶＭＡ１１，ＶＭＡ１２，Ｖ
ＭＡ１３）の破壊株においても認められた。また中性の
pHで増殖できない株ｖｐｈ１でも同様の現象が認められ
た。
の他のサブユニットあるいはアセンブルファクターをコ
ードしている遺伝子群（ＶＭＡ１，ＶＭＡ２，ＶＭＡ
４，ＶＭＡ５，ＶＭＡ６，ＶＭＡ１１，ＶＭＡ１２，Ｖ
ＭＡ１３）の破壊株においても認められた。また中性の
pHで増殖できない株ｖｐｈ１でも同様の現象が認められ
た。
【００２６】
【発明の効果】本発明の方法によれば、極めて簡便に、
且つ迅速に免疫抑制物質をスクリーニングすることがで
きる。
且つ迅速に免疫抑制物質をスクリーニングすることがで
きる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安楽 泰宏 東京都杉並区上荻２−21−９
Claims (1)
- 【請求項１】 カルシウム濃度を異にする複数の酵母用
培地を二組用意し、一組の培地には被験サンプルを添加
し、他方の組の培地には被験サンプルを添加せず、これ
らの培地に液胞膜プロトンＡＴＰａｓｅの活性が欠損し
ている酵母変異株を接種して培養し、被験サンプルを添
加した場合に該変異株の増殖を許容するカルシウム濃度
が、被験サンプルを添加しなかった場合に該変異株の増
殖を許容するカルシウム濃度よりも低い場合に、該被験
サンプルが免疫抑制物質を含有すると推定することを特
徴とする免疫抑制物質のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11673194A JPH07322892A (ja) | 1994-05-30 | 1994-05-30 | 免疫抑制物質のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11673194A JPH07322892A (ja) | 1994-05-30 | 1994-05-30 | 免疫抑制物質のスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07322892A true JPH07322892A (ja) | 1995-12-12 |
Family
ID=14694402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11673194A Pending JPH07322892A (ja) | 1994-05-30 | 1994-05-30 | 免疫抑制物質のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07322892A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6909030B2 (en) | 2001-10-15 | 2005-06-21 | Cedars-Sinai Medical Center | PTTG knockout rodent as a model to study mechanisms for various physiological phenomena, including diabetes |
| US6913926B2 (en) | 1996-11-21 | 2005-07-05 | Cedars-Sinai Medical Center | Method of regulating biological activity of pituitary tumor transforming gene (PTTG)1 using PTTG2 |
| US7097829B2 (en) | 1996-11-21 | 2006-08-29 | Cedars-Sinai Medical Center | Transgenic cells transfected with pituitary tumor transforming gene (PTTG)) expression vectors and uses therefor |
-
1994
- 1994-05-30 JP JP11673194A patent/JPH07322892A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6913926B2 (en) | 1996-11-21 | 2005-07-05 | Cedars-Sinai Medical Center | Method of regulating biological activity of pituitary tumor transforming gene (PTTG)1 using PTTG2 |
| US7097829B2 (en) | 1996-11-21 | 2006-08-29 | Cedars-Sinai Medical Center | Transgenic cells transfected with pituitary tumor transforming gene (PTTG)) expression vectors and uses therefor |
| US6909030B2 (en) | 2001-10-15 | 2005-06-21 | Cedars-Sinai Medical Center | PTTG knockout rodent as a model to study mechanisms for various physiological phenomena, including diabetes |
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