FR3025804A1 - Procede de production d'un compose de la voie de biosynthese des sterols chez un organisme eucaryote - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols chez un organisme eucaryote ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez cet organisme eucaryote, en particulier d'un stérol. Ce procédé comporte une étape de culture in vitro de cellules dudit organisme eucaryote modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine, dans un milieu de culture adapté au développement de ces cellules et contenant au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour induire la surproduction dudit composé d'intérêt par lesdites cellules.

Description

1 La présente invention s'inscrit dans le domaine du contrôle de l'expression des voies métaboliques chez les organismes eucaryotes. Plus particulièrement, elle concerne un procédé de production d'un composé d'intérêt synthétisé par un organisme eucaryote dans la voie de biosynthèse des stérols, ou dérivé d'un composé synthétisé par un organisme eucaryote dans cette voie de biosynthèse des stérols. La présente invention concerne également des cellules eucaryotes recombinantes particulièrement adaptées à la mise en oeuvre d'un tel procédé, ainsi que l'utilisation de cellules de levures recombinantes pour la production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols. L'ingénierie du métabolisme des organismes constitue un domaine des biotechnologies en développement croissant. Le contrôle des voies métaboliques permet en effet notamment de produire ou surproduire des composés d'intérêt, de moduler les caractéristiques cellulaires, d'augmenter les performances de procédés mettant en oeuvre ces organismes, etc. En particulier, de nombreux travaux ont été menés pour accroître le rendement de la voie de biosynthèse des stérols dans différents types d'organismes, notamment chez les levures, par diverses stratégies telles que la surexpression de gènes impliqués dans cette voie de biosynthèse et/ou l'optimisation des conditions de fermentation. De tels travaux sont notamment décrits dans la publication de Wriessnegger et al., 2013. Un objectif majeur de tels travaux est l'accroissement du rendement de production par les levures d'un stérol particulier, l'ergostérol, qui s'avère être un produit économiquement important, notamment car il constitue un précurseur de la vitamine D2 et de la cortisone. Les procédés proposés par l'art antérieur aux fins d'augmenter le rendement de production des stérols par les levures, ou par d'autres organismes, présentent cependant des inconvénients, notamment une complexité de mise en oeuvre, un coût élevé, un niveau de pureté insuffisant du composé cible produit et/ou un niveau de production insuffisant de ce composé 302 5 804 2 cible. La présente invention vise à remédier aux inconvénients des procédés d'activation de la voie de biosynthèse des stérols proposés par l'art antérieur, notamment aux inconvénients exposés ci-avant, en proposant un procédé 5 alternatif pour l'activation de cette voie de biosynthèse chez un organisme eucaryote, qui soit simple et peu coûteux à mettre en oeuvre, et qui permette de surproduire, avec un rendement élevé, un composé d'intérêt produit par cet organisme dans la voie de biosynthèse des stérols, ou un composé d'intérêt dérivé d'un composé produit par cet organisme eucaryote dans la voie de 10 biosynthèse des stérols. A l'origine de l'invention, il a été découvert par les présents inventeurs dans le cadre d'un projet à visée toute autre, que, de manière tout à fait surprenante, la culture de cellules eucaryotes, en particulier de levures, génétiquement modifiées pour exprimer, ou surexprimer, une défensine, 15 notamment une défensine d'origine végétale, en présence d'un excès de certains éléments dans le milieu de culture, conduit à une modification importante du métabolisme cellulaire, résultant notamment en la surproduction de lipides et plus particulièrement de stérols. Les présents inventeurs ont ainsi découvert que de telles conditions de culture cellulaire induisent l'expression 20 de la grande majorité des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des stérols. Chez la levure, il a notamment été établi par les présents inventeurs que les cellules exprimant une défensine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1, soumises à un excès de zinc dans le milieu de culture cellulaire, par exemple à une concentration de zinc dans ce milieu 25 de culture d'environ 20 mM, accumulent une quantité importante de stérols. La fraction insaponifiable des lipides extractibles à l'hexane, c'est-à-dire des lipides neutres, est alors constituée à plus de 80 % de stérols. Une telle accumulation est notamment associée à une activation des gènes ERG3, ERG25, ERG27, ERG8 et MVD1, ainsi que des gènes ERG1, ERG2, ERG9, 30 ERG10, ERG13, ERG20, ERG24 et ERG26 de la levure impliqués dans la voie de biosynthèse de l'ergostérol, de même que du gène UPC2, qui est un 3025804 3 activateur de cette voie. La voie de biosynthèse des stérols chez la levure est notamment partiellement décrite dans les publications de Burg et al., 2011, et Shobayashi et al., 2005. Ainsi, il est proposé selon la présente invention un procédé de 5 production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols chez un organisme eucaryote, c'est-à-dire d'un composé synthétisé par cet organisme eucaryote dans la voie de biosynthèse des stérols, ou d'un composé dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez ledit organisme eucaryote, par activation de la voie de biosynthèse des stérols chez 10 ledit organisme eucaryote. Ce procédé comporte une étape de culture in vitro de cellules de cet organisme exprimant une défensine, notamment modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine, dans un milieu de culture adapté à leur développement et contenant au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium. Cet élément est présent en 15 excès dans le milieu de culture, c'est-à-dire, selon la présente invention, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour induire la surproduction dudit composé d'intérêt par lesdites cellules. On entend, par surproduction, la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit composé d'intérêt au moins 2 fois supérieure à la quantité 20 produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, lorsque le milieu de culture contient ledit élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules. Pour chaque élément considéré, choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, la concentration minimale dans le milieu de culture 25 nécessaire à la croissance optimale des cellules dépend non seulement de l'élément en lui-même, mais également de l'organisme eucaryote considéré, ainsi que de la composition générale du milieu de culture et, plus généralement, des conditions de culture. Il est du ressort de l'homme du métier, pour chaque situation donnée, de déterminer quelle est cette 30 concentration minimale, à partir de ses connaissances générales. Il peut notamment à cet effet mettre en oeuvre l'une des méthodes développées par 3025804 4 l'art antérieur pour l'optimisation de la composition des milieux de culture. Par exemple, pour chaque élément considéré, la concentration minimale à apporter dans le milieu de culture pour répondre aux besoins métaboliques et assurer la croissance optimale des cellules peut être 5 déterminée par la méthode dite « pulse and shift », qui est l'une des méthodes les plus efficaces proposées par l'art antérieur. Selon cette méthode, la concentration minimale en un élément donné est déterminée lors d'une culture menée en chémostat. La valeur initiale de concentration testée est généralement obtenue par analyse élémentaire de la biomasse étudiée. Cette 10 méthode a été initialement décrite par Kuhn et al., 1979. A titre d'exemple, il a été décrit dans la publication de Medaglia et Panke, 2010, l'utilisation de cette méthode pour optimiser un milieu de culture de Staphylococcus gallinarum. A titre d'illustration, la concentration minimale en zinc d'un milieu synthétique commercial tel que le Yeast Nitrogen Base (DIFCO), nécessaire à 15 la croissance optimale de la levure Saccharomyces cerevisiae (pour 10 g/L de glucose, soit une biomasse finale de 0,1 à 5 g/L selon les conditions de culture) est de 2,5 11M. Pour certains des éléments parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale des 20 cellules peut être nulle, c'est-à-dire que le milieu de culture doit en être dépourvu pour assurer la croissance optimale, ou même parfois la croissance tout court, des cellules. Il entre également dans les compétences de l'homme du métier de déterminer, pour chaque élément considéré, choisi parmi les métaux de 25 transition, le plomb et le sélénium, la concentration en ledit élément nécessaire pour permettre de déclencher la surproduction du composé d'intérêt par les cellules eucaryotes, c'est-à-dire, selon l'invention, pour permettre que la quantité du composé d'intérêt produite par les cellules soit au moins 2 fois supérieure à la quantité de ce composé produite par les mêmes cellules dans 30 des conditions de culture identiques, à la différence près que le milieu de culture contient l'élément considéré à la concentration minimale nécessaire à la 3025804 5 croissance optimale des cellules. Par conditions de culture, on entend la quantité de biomasse en culture, la composition du milieu de culture, la durée et la température de l'étape de culture, etc. Cette concentration en ledit élément permettant le déclenchement 5 chez les cellules eucaryotes de la réponse métabolique correspondant à la surexpression de la voie de biosynthèse des stérols, en présence de défensine, peut par exemple être déterminée par une méthode d'analyse de l'effet de différentes concentrations en ledit élément : soit sur l'expression des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des stérols par comparaison du 10 transcriptome de cellules cultivées d'une part sur milieu contenant ledit élément à la concentration minimale, et d'autre part sur milieu enrichi en ledit élément ; soit sur l'augmentation de la concentration en stérols ou en métabolites associés de façon stoechiométrique à la concentration en stérols, par comparaison de la composition de cellules cultivées d'une part sur milieu 15 contenant ledit élément à la concentration minimale, et d'autre part sur milieu enrichi en ledit élément. La détermination peut être effectuée par la méthode des « pulse and shift » décrite ci-avant. Elle peut également être réalisée de manière plus simple, par exemple en conduisant en parallèle des cultures batch de la 20 souche produisant la défensine dans des milieux contenant des concentrations croissantes en ledit élément, à partir de la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale des cellules. Le milieu de culture mis en oeuvre selon l'invention comporte en outre les substances nécessaires à la croissance des cellules et à la biosynthèse des 25 stérols. Ce milieu peut aussi bien être liquide que solide. Les conditions de culture, et notamment la température de culture, sont dépendantes de l'organisme eucaryote particulier considéré, et leur définition entre dans les compétences de l'homme du métier. Le métal de transition présent dans le milieu de culture peut 30 notamment être le zinc, le cadmium, le nickel, le cobalt ou le cuivre.

3025804 6 Les défensines sont bien connues en elles-mêmes. Ce sont de petites protéines cationiques synthétisées par les invertébrés, les vertébrés, les plantes et les champignons, qui sont impliquées dans le système de défense immunitaire innée (Ganz et al., 1995 ; Boman, 1998). Plusieurs activités 5 biologiques des défensines ont été décrites dans la littérature, notamment des activités antibactériennes et antifongiques (Ganz et al., 1995 ; Lay et al., 2005), ainsi que la capacité de certaines défensines à conférer la tolérance au zinc aux plantes et aux levures (Mirouze et al., 2006 ; Shahzad et al., 2013). Les défensines végétales, en particulier, sont riches en cystéines et 10 présentent une structure tridimensionnelle globulaire stabilisée par quatre ponts disulfure. Elles partagent un motif caractéristique, le motif CSa13, qui est composé d'une hélice a et de deux ou trois feuillets 13 antiparallèles stabilisés par trois ou quatre ponts disulfure, et/ou une boucle dite gamma-core, caractérisée par un motif GXC-X3_9-C, pouvant être située entre les deuxième 15 et troisième feuillets 13 (Cornet et al., 1995 ; Lay et al., 2005 ; Van der Weerden et al., 2012, 2013 ; Munoz et al., 2014). Selon la présente invention, les cellules eucaryotes soumises à l'étape de culture sont de préférence modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine : 20 - d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1 (PDF1), par exemple la défensine AhPDF1.1b d'Arabidopsis halleri, de séquence d'acides aminés SEQ ID No:2 (numéros d'accession GenBank : HF545648 pour la séquence nucléotidique et CCN97877 pour la séquence protéique ; Shahzad et al., 2013). Cette défensine avait été 25 initialement nommée AhPDF1.1 (Mirouze et al., 2006 ; numéros d'accession GenBank : AY961376 pour la séquence nucléotidique et AAY27736 pour la séquence protéique) ; - présentant une structure tridimensionnelle comportant un motif de type CSa13 et/ou une boucle gamma-core, d'origine végétale ou autre.

30 L'homme du métier saura aisément identifier, parmi les défensines existantes, 3025804 7 celles qui présentent un tel motif de type CSOE13 et/ou une telle boucle gammacore, à partir des données publiées dans la littérature, ou par comparaison, par modélisation moléculaire, par exemple avec le logiciel PyMol, de leur structure avec la structure de la défensine de radis RsAFP1 (numéro d'accession PDB : 5 1AYJ) décrite dans les publications précitées ; - et/ou présentant au moins 30 % d'identité en amino acides avec une défensine d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1, en particulier avec la défensine AhPDF1.1b d'Arabidopsis halleri de séquence SEQ ID No:2.

10 Le pourcentage d'identité en amino acides entre deux séquences peptidiques peut être déterminé de manière classique en elle-même, en comparant les séquences alignées de manière optimale. Un tel alignement optimal peut notamment être réalisé par des moyens informatiques adaptés à cet effet, par exemple au moyen du logiciel BLAST. Les différences en acides 15 aminés entre la séquence testée et la séquence de référence (défensine d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1, par exemple AhPDF1.1b) peuvent consister en des délétions, insertions et/ou substitutions d'un ou plusieurs acides aminés, consécutifs ou non. A titre d'exemples, des défensines présentant au moins 30 % d'identité 20 en amino acides avec une défensine d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1, et utilisables dans le cadre de l'invention, sont : - la défensine AhPDF1.4 d'Arabidopsis halleri, de séquence d'acides aminés SEQ ID No:4 (numéro d'accession GenBank : CCN97876), et de 25 séquence nucléotidique SEQ ID No:3 (numéro d'accession GenBank : HF545647). Cette défensine possède un motif de type CSOE13 et une boucle gamma-core. Elle présente 38 % d'identité en amino acides avec Ah PDF1.1b ; - la défensine de drosophile (drosomycine, numéro d'accession GenBank : CAA53267). Cette défensine possède un motif de type CSOE13 et une 30 boucle gamma-core ; 3025804 8 - la défensine d'huître (numéro d'accession GenBank : ACQ76274). Cette défensine possède un motif de type CSOE13 et une boucle gamma-core. Le procédé selon l'invention, par une dérégulation du métabolisme des cellules de l'organisme eucaryote, plus particulièrement de la voie de 5 biosynthèse des stérols, permet avantageusement d'augmenter le taux de production par les cellules de tout composé d'intérêt synthétisé dans la voie de biosynthèse des stérols. On ne préjugera pas ici du mécanisme donnant lieu à un tel résultat avantageux. Il a cependant été démontré par les présents inventeurs que l'expression d'une défensine dans la cellule combinée à la mise 10 en présence en excès dans le milieu de culture d'au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, active la grande majorité des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des stérols, menant à une production fortement accrue, successivement, de chacun des composés intermédiaires synthétisés dans cette voie, et débouchant sur une 15 accumulation très élevée du composé final. Un tel procédé est avantageusement simple et peu coûteux à mettre en oeuvre, et il permet en particulier d'obtenir un composé d'intérêt avec un niveau de pureté très élevé, ainsi qu'un niveau de production très élevé. En cela, il constitue une voie alternative tout à fait avantageuse pour la production 20 de stérols. Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, l'élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, est présent dans le milieu de culture à une concentration supérieure ou égale à la concentration en cet élément qui est nécessaire pour induire la production, par 25 les cellules, d'une quantité du composé d'intérêt au moins 5 fois, de préférence au moins 10 fois, et par exemple au moins 50 fois, supérieure à la quantité produite par les cellules cultivées dans des conditions de culture identiques, le milieu de culture contenant cependant l'élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale des cellules.

30 Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, 3025804 9 l'organisme eucaryote est choisi parmi les levures, les champignons, les algues et micro algues, les végétaux et les animaux. Lorsque l'organisme eucaryote est du type ne produisant pas naturellement de défensine, et notamment pas une défensine particulière telle 5 que définie ci-avant, par exemple lorsque cet organisme est une levure, les cellules dudit organisme soumises à l'étape de culture conformément à la présente invention sont modifiées de sorte à être aptes à produire une telle défensine. Lorsque l'organisme eucaryote est du type produisant naturellement 10 une défensine, par exemple un organisme végétal, les cellules de cet organisme soumises à l'étape de culture conformément à la présente invention peuvent être modifiées de sorte à être aptes à surexprimer une défensine. Cette défensine peut être la défensine qu'ils produisent naturellement ou une autre défensine, notamment une défensine particulière telle que définie ci- 15 avant. Ainsi, dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, les cellules de l'organisme eucaryote sont des cellules recombinantes dans lesquelles a été introduite une séquence nucléotidique codant pour la défensine à exprimer ou surexprimer.

20 Une telle modification des cellules peut être réalisée par toute méthode classique en elle-même et connue de l'homme du métier, par exemple par transformation de la souche avec un vecteur d'expression approprié comprenant un ou plusieurs gènes codant pour la défensine ou un de ses précurseurs. Chacun de tels gènes peut être placé sous contrôle aussi 25 bien d'un promoteur constitutif, que d'un promoteur inductible. Les cellules peuvent notamment être des cellules de levure, par exemple de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Yarrowia lipolytica, génétiquement modifiées pour exprimer une défensine végétale, en particulier une défensine codée par un gène de la famille des PDF1, par exemple 30 AhPDF1.1b.

302 5 804 10 Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, particulièrement adaptés aux cas où l'organisme eucaryote est une levure, la concentration dans le milieu de culture de l'élément choisi parmi la liste précitée est au moins égale à 1 mM, de préférence au moins égale à 5 mM, et 5 préférentiellement au moins égale à 10 mM. Cette concentration est notamment comprise entre 15 et 30 mM, par exemple environ égale à 20 mM. Une telle concentration permet avantageusement d'obtenir les plus forts taux d'activation de la voie de biosynthèse des stérols, en particulier lorsque l'élément contenu dans le milieu de culture est le zinc et le milieu de culture est 10 le milieu usuellement mis en oeuvre Yeast Nitrogen Base (DIFCO). Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, le procédé comprend une étape préalable de culture in vitro des cellules dans un milieu de culture adapté au développement des cellules et contenant les éléments précités, c'est-à-dire les métaux de transition, le sélénium et le 15 plomb, à leurs concentrations minimales nécessaires à la croissance des cellules. Cette étape dite de pré-culture peut être réalisée dans le même milieu de culture que l'étape de culture en présence d'un excès d'au moins un desdits éléments, ou dans un milieu différent. Le procédé selon l'invention permet alors avantageusement de 20 découpler la production de biomasse et la production d'un composé d'intérêt produit dans la voie de biosynthèse des stérols. Il permet en effet alors de produire, dans une étape préalable, une grande quantité de biomasse, puis, dans un second temps, de déclencher l'activation de la voie de biosynthèse des stérols, notamment par simple ajout qu'une quantité plus importante de 25 l'élément dans le milieu de culture, de sorte à produire, en quantités élevées, le composé d'intérêt visé. Le procédé selon l'invention s'exprime ainsi également sous les termes d'un procédé d'augmentation du taux de production, par un organisme eucaryote, d'un composé d'intérêt apte à être synthétisé par cet organisme 30 dans cette voie de biosynthèse, ou dérivé d'un tel composé. Le procédé selon l'invention comprend de préférence une étape 3025804 11 subséquente de collecte des cellules de l'organisme eucaryote ayant accumulé le composé d'intérêt, et, le cas échéant, d'extraction du composé d'intérêt. L'extraction du composé d'intérêt ayant été produit en quantité importante par les cellules peut être effectuée selon toute technique classique 5 en elle-même, à partir notamment, selon le composé donné, d'un lysat cellulaire ou du surnageant de culture. Cette extraction peut comprendre une étape de purification du composé d'intérêt produit, par exemple par cristallisation ou par une technique de chromatographie telle que la chromatographie d'affinité, la chromatographie liquide haute performance 10 (HPLC), etc. Dans des modes de mise en oeuvre particuliers de l'invention, le composé d'intérêt est un composé final de la voie de biosynthèse des stérols chez l'organisme eucaryote considéré, notamment un stérol. Par exemple, lorsque l'organisme est une levure, le composé d'intérêt peut être l'ergostérol.

15 Autrement, le composé d'intérêt produit peut être un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols. Les cellules de l'organisme eucaryote soumises à l'étape de culture en présence dudit au moins un élément sont alors des cellules recombinantes qui sont modifiées selon l'invention pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la 20 biotransformation de ce composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse des stérols, notamment pour inhiber l'expression d'un gène codant pour une telle activité enzymatique. Une telle modification des cellules permet de bloquer la voie de biosynthèse des stérols en aval du composé intermédiaire d'intérêt dont la production est souhaitée, afin d'éviter la biotransformation de ce dernier 25 et afin de provoquer par voie de conséquence son accumulation dans les cellules. Cette modification peut être effectuée par toute méthode connue dans le domaine du génie génétique, notamment par mutagénèse. A titre d'exemple, chez la levure, le procédé selon l'invention peut être utilisé pour produire en quantité importante des composés intermédiaires de la 30 voie de biosynthèse des stérols présentant un intérêt chimique et/ou économique particulier, par exemple : le farnésyl-diphosphate (FPP), qui donne 3025804 12 accès aux isoprénoïdes et terpènes, dont les caroténoïdes ; le squalène, utilisé par exemple comme adjuvant médical, comme antioxydant ou en cosmétique ; le lanostérol, un composant de la lanoline, utilisable en cosmétique, en pharmacie ou pour le traitement du cuir par exemple.

5 Les cellules de l'organisme eucaryote peuvent par exemple être modifiées pour inhiber l'expression d'un gène choisi parmi ERG1, associé à l'activité enzymatique de biotransformation du squalène, ERG11, associé à l'activité enzymatique de biotransformation du lanostérol et ERG9, associé à l'activité enzymatique de biotransformation du FPP, dans la voie de 10 biosynthèse des stérols. Dans des variantes de l'invention, le composé d'intérêt est un composé dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols, par exemple d'un composé final de cette voie, ou d'un composé intermédiaire de cette voie. Les cellules de l'organisme eucaryote soumises à l'étape de culture 15 en présence dudit au moins un élément sont alors des cellules recombinantes qui sont modifiées pour activer au moins une, voire plusieurs, activité(s) enzymatique(s) impliquée(s) dans la biotransformation dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols en ledit composé d'intérêt. L'activation d'une telle activité enzymatique peut notamment être réalisée en modifiant les 20 cellules par introduction d'une séquence nucléotidique codant pour une enzyme présentant ladite activité enzymatique, de sorte à provoquer l'expression de cette enzyme dans les cellules. Autrement, elle peut être réalisée en modifiant les cellules pour provoquer la surexpression d'une enzyme naturellement produite dans les cellules et présentant ladite activité 25 enzymatique. Le cas échéant, lorsque le composé d'intérêt est un composé dérivé d'un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols, lesdites cellules eucaryotes peuvent être d'une part modifiées pour activer ladite ou lesdites activité(s) enzymatique(s) impliquée(s) dans la biotransformation dudit 30 composé de la voie de biosynthèse des stérols en ledit composé d'intérêt, et d'autre part modifiées pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la 3025804 13 biotransformation dudit composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse des stérols, notamment pour inhiber l'expression d'un gène codant pour une telle activité enzymatique, comme décrit ci-avant. De nombreuses souches eucaryotes, en particulier de levures, 5 modifiées pour activer une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols en un composé d'intérêt autre, distinct de cette voie, ont été développées par des techniques d'ingénierie génétique et décrites par l'art antérieur. Ainsi, à titre d'exemples non limitatifs de l'invention, les cellules de 10 l'organisme eucaryote soumises à l'étape de culture en présence d'un excès dudit au moins un élément peuvent être des cellules de levure recombinantes modifiées pour activer : - une activité C-méthyltransférase, de sorte à permettre la surproduction par lesdites cellules, à partir d'ergostérol, de 24-éthyl-stérol et de 15 24-éthylidène-stérol, comme décrit dans la publication de Husselstein et al., 1996 ; - une activité enzymatique d'hydroxylation de l'ergostérol, comme décrit notamment dans le document WO-A-2011/067144. Selon un autre exemple, les cellules de l'organisme eucaryote 20 soumises à l'étape de culture en présence d'un excès dudit au moins un élément peuvent être des cellules de levure recombinantes modifiées pour d'une part inhiber une activité A22-désaturase et d'autre part activer des activités A7-réductase et adrénodoxine réductase, de sorte à permettre de surproduire, en présence par ailleurs de défensine et d'un excès de l'élément 25 dans le milieu de culture, de la prégnénolone, ou le cas échéant de la progestérone par activation simultanée d'une activité I3-hydroxystéroïde déhydrogénase/isomérase. Des cellules de levure ainsi modifiées, mais n'exprimant toutefois pas de défensine, sont décrites dans la publication de Duport et al., 1998.

30 Le procédé selon l'invention peut autrement être utilisé pour modifier la 3025804 14 composition d'une huile pouvant être extraite à partir d'un organisme eucaryote, par augmentation ou diminution de la proportion d'un composé d'intérêt particulier présent dans cette huile. Il trouve alors avantageusement application dans le domaine des huiles alimentaires ou industrielles, ou dans 5 celui des biocarburants, qu'il permet notamment d'enrichir en un composé donné. Un autre aspect de l'invention est l'utilisation combinée de cellules eucaryotes modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine, notamment une défensine telle que décrite ci-avant, et de la présence dans le milieu de 10 culture de ces cellules, en excès, d'un élément choisi parmi les métaux de transition, par exemple le zinc, le cadmium, le nickel, le cobalt et le cuivre, le sélénium et le plomb, pour la production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols chez lesdites cellules eucaryotes, ou dérivé d'un composé de cette voie de biosynthèse. Une telle utilisation vise en particulier la 15 production d'ergostérol, avec un rendement de production avantageusement élevé. Les conditions de culture peuvent répondre à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant. Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une souche de levure recombinante exprimant une défensine pour la production, avec un 20 rendement accru, d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez la levure. En particulier, des cellules de cette souche de levure recombinante sont soumises à une étape de culture in vitro, dans un milieu de culture adapté au développement desdites cellules et contenant au moins un élément choisi 25 parmi les métaux de transition, par exemple le zinc, le cadmium, le nickel, le cobalt et le cuivre, le plomb et le sélénium, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour induire la surproduction dudit composé d'intérêt par lesdites cellules. On entend, par surproduction, la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit 30 composé d'intérêt au moins 2 fois supérieure à la quantité produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, à la seule différence que le 3025804 15 milieu de culture contient ledit élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules. La défensine peut notamment être une défensine : - d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant 5 Defensin type 1, - présentant une structure tridimensionnelle comportant un motif de type CSOEI3 et/ou une boucle gamma-core, - et/ou présentant au moins 30 % d'identité en amino acides avec la défensine Ah PDF1.1b d'Arabidopsis halleri de séquence SEQ ID No:2.

10 Les conditions de culture des cellules peuvent en particulier répondre à l'une ou plusieurs des caractéristiques décrites ci-avant. Un autre objet de la présente invention est une cellule eucaryote recombinante modifiée pour exprimer ou surexprimer une défensine, en particulier une défensine telle que décrite ci-avant, et modifiée pour inhiber une 15 activité enzymatique impliquée dans la biotransformation d'un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols dans cette cellule, notamment pour inhiber l'expression d'un gène codant pour une telle activité enzymatique. Par exemple, cette cellule eucaryote peut être modifiée de sorte à 20 inhiber l'expression d'un gène choisi parmi ERG1, ERG11 et ERG9. Une telle inhibition peut être effectuée par toute méthode classique en elle-même pour l'homme du métier. Par exemple, elle peut être effectuée par des techniques de génie génétique, par établissement de mutants dits « Knock-out » par insertion d'un ADN recombinant dans le gène concerné, ou 25 encore par mutagénèse génétique. Cette cellule eucaryote peut en outre être modifiée plus avant, pour activer une activité enzymatique impliquée dans la transformation de ce composé intermédiaire en un composé d'intérêt. Selon un autre objet, la présente invention concerne une cellule 3025804 16 eucaryote recombinante modifiée pour exprimer ou surexprimer une défensine, en particulier une défensine telle que décrite ci-avant, et modifiée pour activer une activité enzymatique impliquée dans la transformation d'un composé, notamment un composé final, de la voie de biosynthèse des stérols, en un 5 composé d'intérêt distinct de cette voie. De telles cellules selon l'invention peuvent notamment être des cellules de levure, notamment de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Yarrowia lipolytica, exprimant une défensine végétale, en particulier du type codée par un gène de la famille PDF1, par exemple la défensine 10 AhPDF1.1b. Les caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière de l'exemple de mise en oeuvre ci-après, fourni à simple titre illustratif et nullement limitatif de l'invention, avec l'appui des figures 1 à 6, dans lesquelles : 15 - la figure 1 montre la superposition des structures obtenues par modélisation moléculaire, respectivement de la défensine AhPDF1.1b et de la défensine de radis de référence RsAFP1 ; - la figure 2 représente la carte du vecteur pYX212 vide ; - la figure 3 montre une plaque obtenue par chromatographie sur 20 couche mince (CCM) pour les fractions respectivement de lipides neutres insaponifiables (pistes 1 à 4) et d'autres lipides insaponifiables (pistes 5 à 8) extraites des cellules après culture de la souche BY4741 de Saccharomyces cerevisiae exprimant (AhPDF1.1b +) ou n'exprimant pas (AhPDF1.1b -) la défensine végétale AhPDF1.1b, en présence de zinc en excès à 20 mM (Zn +) 25 ou de zinc à 2,5 i.tM (Zn -) dans le milieu de culture ; les pistes 9 à 12 correspondant à des dépôts d'ergostérol pur, dans des quantités respectives de 5 lig (piste 9), 10 lig (piste 10), 25 lig (piste 11) et 50 lig (piste 12) ; - la figure 4 montre un chromatogramme obtenu par chromatographie en phase gazeuse pour le produit obtenu par CCM préparative à partir de la 30 fraction de lipides neutres insaponifiables extraite des cellules après culture de 3025804 17 la souche BY4741 de Saccharomyces cerevisiae exprimant la défensine végétale AhPDF1.1b, en présence 20 mM de zinc dans le milieu de culture ; - la figure 5 montre les spectres de masse obtenus pour (A) le pic au temps de rétention de 15,34 min du chromatogramme de la figure 4, (B) 5 l'ergostérol pur ; - et la figure 6 illustre la projection sur la voie de biosynthèse de l'ergostérol chez la levure, des résultats de l'expression différentielle des gènes impliqués dans cette voie de biosynthèse entre les deux conditions suivantes : levure recombinante exprimant la défensine AhPDF1.1b et soumise à un 10 traitement par le zinc (20 mM), et levure témoin (absence de défensine) cultivée dans les mêmes conditions ; sont encadrés en trait plein les gènes dont la quantité de transcrits est significativement supérieure dans les levures exprimant la défensine, et en traits pointillés le gène dont la quantité de transcrits est significativement inférieure dans les levures exprimant la 15 défensine. EXEMPLE 1 Une souche de Saccharomyces cerevisiae a été modifiée pour exprimer la défensine végétale d'Arabidopsis halleri AhPDF1.1b, puis cultivée 20 en présence d'un excès de zinc, conformément à la présente invention, de la manière suivante. La défensine AhPDF1.1b d'Arabidopsis halleri (numéro d'accession GenBank : HF545648, séquence nucléotidique SEQ ID No:1, séquence d'acides aminés SEQ ID No:2) a tout d'abord fait l'objet d'une étude de 25 modélisation moléculaire (Swiss Model, Geno3D ou PyMol), et sa structure a été superposée à celle de la défensine de radis RsAFP1 (séquence d'acides aminés : numéro d'accession GenBank AAA69541 ; séquence nucléotidique : numéro d'accession GenBank U18557), dont il a été largement décrit dans la littérature (Terras et al., 1995) qu'elle présente une structure à motif de type 30 CSOEI3 et boucle gamma-core. La représentation obtenue est montrée sur la 3025804 18 figure 1. On y observe une parfaite superposition des deux défensines, démontrant que la défensine AhPDF1.1b d'Arabidopsis halleri présente une structure à motif de type CSOEI3 et boucle gamma-core. La séquence codante de la défensine AhPDF1.1b a été amplifiée par 5 polymérisation par réaction en chaîne (PCR) et clonée dans le vecteur pYX212 (commercialisé par la société Ingenenius), dont la carte est montrée sur la figure 2, au niveau des sites de restriction EcoRI et Xhol. La séquence codante est sous le contrôle du promoteur constitutif de la triose phosphate isomérase (TPI) de levure et en amont du terminateur de la 10 protéine heat shock HSF1 (YGL073w) de levure. Le plasmide recombinant obtenu, ainsi que le plasmide vide pFL38H porteur du gène HIS3 conférant l'auxotrophie à l'histidine, décrit dans la publication de Talke et al., 2006, ont été introduits dans la souche de levure BY4741 (Mat a, his3A1 , leu240, met1540, ura340) en utilisant la méthode de 15 transformation au PEG et au chlorure de lithium (Gietz & Woods, 2002). Une transformation de la souche BY4741 a été réalisée en parallèle avec les plasmides vides pYX212 et pFL38H et sert de témoin négatif. Les souches recombinantes ont été cultivées à 30 °C à la densité d'environ 50 UFC/cm2 sur milieu solide (1,43 g/I Yeast Nitrogen Base sans 20 acides aminés ni ammonium (Réf. 233520, Difco), 20 g/I glucose, 6,4 g/I NH4NO3, 50 mM acide succinique-KOH pH 4,5, méthionine 20 mg/I, leucine 60 mg/I, 20 g/I agarose (Réf. D5, Euromedex)) supplémenté : - soit par du sulfate de zinc (ZnSO4) à la concentration finale de 2,5 i.tM, ce qui correspond à la concentration minimale nécessaire à la 25 croissance optimale des cellules, - soit par du sulfate de zinc (ZnSO4) à la concentration finale de 20 mM, c'est-à-dire en excès conformément à la présente invention. Pour chaque expérience, lorsque le diamètre des colonies a atteint 0,48 ± 0,02 mm en moyenne, ce qui correspond à une phase exponentielle de 3025804 19 croissance, les levures ont été prélevées, rincées 2 fois dans de l'eau pure, puis lyophilisées. Les lipides neutres ont été extraits à l'hexane et les lipides restants (polaires) ont été extraits par un mélange de chloroforme/méthanol (2V/1V) 5 selon le protocole décrit par Lomascolo et al., 1994. Chacune des fractions lipidiques a ensuite été saponifiée selon la norme AFNOR NFT 60-205 et des échantillons des fractions insaponifiables contenant entre 50 et 100 pg de lipides ont été prélevés. Les échantillons ont été analysés par Chromatographie en Couche 10 Mince (CCM) sur plaque TLC silica gel (Réf.

60 F 254 de chez E. MERCK KGaA). A titre de témoins, différentes quantités (respectivement 5, 10, 25 et 50 lig) d'ergostérol pur (Réf. 45480, Sigma) ont été déposées en parallèle. La migration a été effectuée dans un tampon hexane:éther:acide formique dans 15 les proportions 70:30:1. A la fin de la migration, la plaque a été séchée à l'air puis aspergée uniformément avec une solution 50:50 d'acide orthophosphorique pur et de sulfate de cuivre saturée. Après séchage, la plaque a été chauffée à 180 °C pendant 8 à 10 min. Les quantités de stérols ont été déterminées par comparaison avec les échantillons constituant la 20 gamme d'étalonnage, à l'aide d'un densitomètre (modèle CAMAG TLC Scanner 3 "Scanner3_160813" S/N 160813 (1.14.28), E. Merck KGaA) qui analyse la plaque à la longueur d'onde de 325 nm. Les résultats obtenus sont montrés sur la figure 3. Comme on peut le constater, les cellules exprimant la défensine et cultivées en présence de zinc 25 à 20 mM dans le milieu de culture, et elles seules, conduisent à l'obtention dans la fraction des lipides neutres insaponifiable d'une quantité très importante d'un composé particulier, dont la bande caractéristique peut clairement être identifiée comme correspondant à l'ergostérol, par comparaison avec les pistes contenant l'ergostérol pur, de formule générale (I) : 3025804 20 HO (I) L'ergostérol est largement majoritaire dans cette fraction. Il peut être établi qu'il en représente plus de 80 %.

5 La confirmation que ce composé particulier est bien l'ergostérol a été établie par analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS), de la manière suivante. Une CCM préparative a été réalisée à partir de 100 pL de la fraction de lipides neutres insaponifiables obtenue pour la condition de culture 10 exprimant la défensine végétale AhPDF1.1b, en présence de 20 mM de zinc dans le milieu de culture. Après migration, la plaque a été grattée au niveau de la tache identifiée comme correspondant à l'ergostérol. Le produit a été extrait de la silice avec du chloroforme. Après filtration pour éliminer totalement les particules de silice, le chloroforme a été évaporé et l'extrait a été remis en 15 solution dans de l'hexane avant d'être injecté en chromatographie en phase gazeuse couplée avec un spectromètre de masse. Le chromatogramme obtenu est montré sur la figure 4 (abondance ionique totale sur la gamme m/z 50-450). On y observe un pic largement majoritaire élué après 15,34 min, ce qui correspond au temps de rétention 20 attendu pour l'ergostérol. De plus, le spectre de masse déterminé pour ce pic indique sans ambiguïté qu'il s'agit d'ergostérol, comme montré par la figure 5, sur laquelle 3025804 21 on observe une coïncidence des spectres de masse (A) du pic à 15,34 min et (B) de l'ergostérol pur. Les rendements de production d'ergostérol par les levures, exprimés en mg par g de masse sèche de levures (mg/gMS), ont par ailleurs été 5 déterminés pour chacune des conditions de culture. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 ci-après. Concentration en zinc Défensine Ah PDF1.1b Rendement (mg/gMS) 2,5 i_iM Pas d'expression 4 2,5 i_iM Expression 4 20 mM Pas d'expression 5 20 mM Expression > 120 Tableau 1 - Rendements de production d'ergostérol par les levures en fonction des conditions de transformation / culture Pour la combinaison « 20 mM de zinc - expression de la défensine », 10 le rendement de production d'ergostérol est largement supérieur à celui obtenu pour les autres conditions. Les stérols représentent plus de 12 % en masse par rapport à la masse sèche totale de levures. Il a par ailleurs été étudié quels gènes de la voie de biosynthèse des stérols sont affectés par le procédé d'activation selon l'invention.

15 A cet effet, il a été utilisé une approche transcriptomique. Les mêmes souches de levure que celles décrites ci-dessus ont été cultivées dans les mêmes conditions que décrites précédemment. Lorsque le diamètre des colonies a atteint 0,48 ± 0,02 mm en moyenne, les levures ont été prélevées et congelées immédiatement dans l'azote liquide.

20 L'ARN a alors été extrait en utilisant la méthode au TRlzol® décrite dans la publication de Chomczynski et Sacchi, 1987. En bref, les cellules ont été broyées par agitation intense en présence de billes de verre de 0,3 mm dans du Trizol à 4 °C pendant 15 min. Du chloroforrre a été ajouté à raison 3025804 22 d'1/5 du volume. Après centrifugation pendant 15 min à 9000 x g, le surnageant a été récupéré et de l'isopropanol a été ajouté à raison de 50 % du volume de surnageant. Après 10 min d'incubation à -20 °C puis 10 min de centrifugation à 9000 x g, le culot a été récupéré et rincé deux fois à l'éthanol 5 75 % puis repris dans 150 pl d'eau. 100 pg d'ARN total ont ensuite été purifiés à l'aide du kit RNeasy (Qiagen). L'ADN a été éliminé par utilisation d'une DNAse directement sur la colonne du kit. L'ARN a été élué dans 30 pl d'eau. 100 ng d'ARN purifié ont été marqués avec la cyanin3-dCTP en 10 utilisant le kit 'Quick Amp Labelling one-colour kit' d'Agilent technologies. Les ARNs marqués ont été hybridés sur une puce à ADN de levure '8-15 karray Agilent standard Yeast V2 g-Gene Expression Microarray' (Agilent technologies) pendant 17 h à 65 °C. Après rinçage, les lames ont été lues sur un scanner GenePix® 4000B.

15 A partir du fichier de données donnant les intensités d'hybridation pour tous les gènes dans les 4 conditions testées (levures témoin (« Déf - ») et levures exprimant la défensine (« Déf + ») cultivées en présence de zinc à la concentration finale de 2,5 i.tM (« Zn - ») ou de zinc à la concentration finale de zinc de 20 mM (« Zn + »), les résultats obtenus concernant l'expression de 20 tous les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de l'ergostérol sont donnés dans le tableau 2 ci-après.

3025804 23 Gène Déf - / Zn - Déf + / Zn - Déf - / Zn + Déf + / Zn + ERG1 10,063 10,011 8,8487 9,5168 ERG2 10,666 10,483 9,9281 10,286 ERG3 11,533 11,444 11,790 12,830 ERG4 10,527 10,377 10,816 11,373 ERG5 9,0856 9,1176 9,2295 9,4736 ERG6 9,1971 8,7485 8,9209 9,1201 ERG7 9,9551 10,065 9,4971 10,002 ERG8 10,597 10,686 11,022 10,367 ERG9 10,373 10,337 10,245 10,733 ERG10 10,835 10,742 9,7926 10,790 ERG11 11,167 11,170 10,396 11,028 ERG12 8,0901 7,8844 8,0822 8,0168 ERG13 9,5652 9,4018 8,9288 9,4047 ERG20 11,760 11,716 10,034 11,120 ERG24 10,013 9,9343 9,1541 9,8254 ERG25 11,768 11,733 11,603 12,798 ERG26 9,8690 9,7937 9,4158 9,9413 ERG27 10,072 10,279 9,6617 10,612 ERG28 9,4582 9,4305 8,6241 9,4682 HMG1 8,9564 8,9347 8,8616 9,0901 HMG2 10,308 10,321 9,8840 10,198 ID11 10,804 10,842 10,539 10,394 MVD1 8,2992 8,3027 8,0140 8,6319 Tableau 2 - Expression des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de l'ergostérol en fonction des conditions de transformation / culture (présence (« Déf + ») ou absence (« Déf - ») d'expression de défensine, et présence de zinc à 20 mM (« Zn + ») ou 2,5 i.tM (« Zn - ») dans le milieu de 5 culture) On constate en particulier que l'expression des gènes ERG1, ERG3, ERG4, ERG7, ERG9, ERG10, ERG11, ERG13, ERG20, ERG24, ERG25, ERG26, ERG27, ERG28, MVD1 est augmentée, parfois fortement, pour la combinaison « expression de la défensine + ajout de zinc en excès (20 mM) 10 dans le milieu de culture », par rapport à la condition « levure normale + ajout 3025804 24 de zinc en excès dans le milieu de culture » ; et pour ce qui concerne les gènes ERG3, ERG4, ERG9, ERG25, ERG27 et MVD1, par rapport à toutes les conditions testées. Les résultats obtenus ci-dessus sont projetés sur la voie de 5 biosynthèse de l'ergostérol chez la levure, en comparant la condition « expression de défensine / présence de zinc en excès dans le milieu de culture » (« Déf + / Zn +») avec la condition « absence de défensine / présence de zinc en excès dans le milieu de culture » (« Déf - / Zn +»). Le résultat est montré sur la figure 6. Sur cette figure, l'encadrement en pointillés du nom du 10 gène indique une diminution de l'expression du gène dans la levure exprimant la défensine, et l'encadrement en traits pleins indique une augmentation de l'expression du gène dans la levure exprimant la défensine. EXEMPLE 2 15 Une souche de Saccharomyces cerevisiae a été modifiée pour exprimer la défensine végétale d'Arabidopsis halleri AhPDF1.4 (séquence nucléotidique SEQ ID No:3, séquence d'acides aminés SEQ ID No:4 ; cette défensine possède un motif de type CSOE(3 et une boucle gamma-core, et présente 38 % d'identité en amino acides avec AhPDF1.1b), puis cultivée en 20 présence d'un excès de zinc (20 mM), conformément à la présente invention, suivant le même protocole que celui décrit dans l'Exemple 1 ci-avant. A titre comparatif, une culture dans le même milieu de culture contenant du zinc à une concentration bien moindre (2,5 i.tM), qui n'est pas considérée comme un excès au sens de la présente invention, a également été réalisée.

25 Les rendements de production d'ergostérol par les levures, exprimés en mg par g de masse sèche de levures (mg/gMS), ont été déterminés pour chacune des conditions de culture. Les résultats sont indiqués dans le tableau 3 ci-après.

3025804 25 Concentration en zinc Défensine AhPDF1.4 Rendement (mg/gMS) 2,5 i_iM Pas d'expression 2,5 2,5 i_iM Expression 1,5 20 mM Pas d'expression 1 20 mM Expression 41,5 Tableau 3 - Rendements de production d'ergostérol par les levures en fonction des conditions de transformation / culture Là encore, le rendement de production d'ergostérol est largement augmenté pour la combinaison « excès de zinc dans le milieu de culture - 5 expression de la défensine. » 3025804 26 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Boman, 1998, Scandinavian Journal of lmmunology 48: 15-25 Burg et al., 2011, Progress in Lipid Research 50: 403-410 Chomczynski et Sacchi, 1987, Anal Biochem. 162:156-159 Cornet et al., 1995, Structure 3: 435-48 5 Duport et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 186-189 Ganz et al., 1995, Pharmacology & Therapeutics 66: 191-205 Gietz & Woods, 2002, Methods in Enzymology 350: 87-96 Husselstein et al., 1996, FEBS Letters 381: 87-92 Kuhn et al., 1979, Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 6: 341-349 10 Lay et al., 2005, Curr Protein Pept Sci 6: 85-101 Lomascolo et al., 1994, Revue Canadienne de Microbiologie 40: 724- 729 Medaglia et Panke, 2010, Appl. Microbiol. Biotechnol. 87: 145-157 Mirouze et al., 2006, The Plant Journal 47: 329-342 15 Munoz et al., 2014, Mol Microbiol 92: 1357 Shahzad et al., 2013, New Phytologist doi: 10.1111/nph.12396 Shobayashi et al., 2005, Biosci Biotechnol Biochem 69: 2381-2388 Talke et al., 2006, Plant Physiology, 142: 148-167 Terras et al., 1995, Plant Cell. 7(5): 573-588 20 Van der Weerden et al., 2012, Fungal Biology Reviews 26: 121-131 Van der Weerden et al., 2013, Cell. Mol. Life Sci. 70: 3545-3570 Wriessnegger et al., 2013, Progress in Lipid Research 52: 277-293

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse des stérols chez un organisme eucaryote ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez ledit organisme eucaryote, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de culture in vitro de cellules dudit organisme eucaryote, modifiées pour exprimer ou surexprimer une défensine, dans un milieu de culture adapté au développement desdites cellules et contenant au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément nécessaire pour induire la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit composé d'intérêt au moins 2 fois supérieure à la quantité produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, ledit milieu de culture contenant ledit élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, selon lequel la défensine est une défensine : - d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant Defensin type 1, - présentant une structure tridimensionnelle comportant un motif de type CScip et/ou une boucle gamma-core, - et/ou présentant au moins 30 % d'identité en amino acides avec la défensine AhPDF1.1b d'Arabidopsis halleri de séquence SEQ ID No:2.
3. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, selon lequel ledit élément est le zinc.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, selon lequel ledit élément est présent dans ledit milieu de culture à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour 3025804 28 induire la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit composé d'intérêt au moins 5 fois, de préférence au moins 10 fois, supérieure à la quantité produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, ledit milieu de culture contenant ledit élément à la concentration 5 minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, selon lequel ledit organisme eucaryote est choisi parmi les levures, les champignons, les algues et micro algues, les végétaux et les animaux.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, selon 10 lequel les cellules dudit organisme eucaryote sont des cellules recombinantes dans lesquelles a été introduite une séquence nucléotidique codant pour ladite défensine.
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant une étape subséquente de collecte des cellules dudit organisme 15 eucaryote ayant accumulé ledit composé d'intérêt, et, le cas échéant, d'extraction dudit composé d'intérêt.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, selon lequel le composé d'intérêt est un composé final de la voie de biosynthèse des stérols. 2Q
9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, selon lequel le composé d'intérêt est un composé intermédiaire de la voie de biosynthèse des stérols, et lesdites cellules dudit organisme eucaryote sont des cellules recombinantes modifiées pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation dudit composé intermédiaire dans la voie 25 de biosynthèse des stérols.
10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, selon lequel le composé d'intérêt est un composé dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols, et lesdites cellules dudit organisme eucaryote sont 3025804 29 des cellules recombinantes modifiées pour activer une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation dudit composé de la voie de biosynthèse des stérols en ledit composé d'intérêt, et, le cas échéant, modifiées pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation d'un 5 composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse des stérols.
11. 11. Cellule eucaryote recombinante modifiée pour exprimer ou surexprimer une défensine et modifiée pour inhiber une activité enzymatique impliquée dans la biotransformation d'un composé intermédiaire dans la voie de biosynthèse des stérols dans ladite cellule. 10
12. 12. Cellule eucaryote recombinante selon la revendication 11, modifiée pour activer une activité enzymatique impliquée dans la transformation dudit composé intermédiaire en un composé d'intérêt.
13. 13. Utilisation d'une souche de levure recombinante exprimant une défensine pour la production d'un composé d'intérêt de la voie de biosynthèse 15 des stérols ou dérivé d'un composé de la voie de biosynthèse des stérols chez ladite levure.
14. 14. Utilisation selon la revendication 13, selon laquelle des cellules de ladite souche recombinante sont soumises à une étape de culture in vitro dans un milieu de culture adapté au développement desdites cellules et contenant 20 au moins un élément choisi parmi les métaux de transition, le plomb et le sélénium, à une concentration supérieure ou égale à la concentration en ledit élément qui est nécessaire pour induire la production, par lesdites cellules, d'une quantité dudit composé d'intérêt au moins 2 fois supérieure à la quantité produite par lesdites cellules dans des conditions de culture identiques, ledit 25 milieu de culture contenant ledit élément à la concentration minimale nécessaire à la croissance optimale desdites cellules.
15. 15. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 13 à 14, selon laquelle la défensine est une défensine : - d'origine végétale codée par un gène de la famille des Plant 3025804 Defensin type 1, - présentant une structure tridimensionnelle comportant un motif de type csa,f3 et/ou une boucle gamma-core, - et/ou présentant au moins 30 % d'identité en amino acides avec la 5 défensine AhPDF1.1b d'Arabidopsis halleri de séquence SEQ ID No:2.