WO2007099231A1 - Systeme d'expression d'un gene d'interet chez la levure - Google Patents

Systeme d'expression d'un gene d'interet chez la levure Download PDF

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WO2007099231A1
WO2007099231A1 PCT/FR2007/000365 FR2007000365W WO2007099231A1 WO 2007099231 A1 WO2007099231 A1 WO 2007099231A1 FR 2007000365 W FR2007000365 W FR 2007000365W WO 2007099231 A1 WO2007099231 A1 WO 2007099231A1
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yeast
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expression
expression system
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PCT/FR2007/000365
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WO2007099231A8 (fr
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Michel Aigle
Frédérique NESS
Joseph Zucca
Fanny Lambert
Jean Mane
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V. Mane Fils
Universite Victor Segalen Bordeaux 2
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Definitions

  • the present invention relates to a novel system for expressing a gene of interest in yeast, in particular implementing an expression cassette.
  • the expression of a gene of interest generally involves recombinant DNA technologies consisting of isolating or synthesizing a gene of interest, and cloning it into a heterologous host. The host is then cultured under conditions suitable for allowing the expression of the gene in large quantities. Several factors may affect gene expression in the host cell. These factors depend in the first place on the choice of the host employed. Yeast has long been used in large scale fermentation processes and the large-scale yeast production technology is well known.
  • Yeast has several advantages as a host for the expression of a gene of interest: 1) it can be cultured at a higher density than other types of eukaryotic cells, 2) its post-modification machinery Transcriptional and post-translational is similar to that found in mammalian cells, thus allowing the production of functional eukaryotic proteins.
  • the yeasts are grown in a simpler and lower cost culture medium than those used for culturing other types of eukaryotic cells.
  • the yeast genome is well characterized and is easily manipulated to allow the expression of a heterologous gene.
  • expression cassette is meant a nucleotide sequence comprising a promoter, at least one insertion site for cloning the gene of interest or a multiple cloning site (MCS) and a terminator.
  • promoter is meant a DNA sequence necessary for the initiation and control of transcription, by "insertion site for cloning” or “multiple cloning site” a DNA sequence respectively containing one or more restriction sites, and by "terminator” a DNA sequence necessary for the termination of transcription.
  • vector any DNA sequence in which it is possible to insert foreign nucleic acid fragments, the vectors for introducing foreign DNA into a host cell.
  • vectors are plasmids, cosmids, artificial yeast chromosomes (YAC), artificial chromosomes of bacteria (BAC) and artificial chromosomes derived from bacteriophage P1 (PAC), vectors derived from viruses.
  • patent application CA 02381347 claims an expression cassette and a vector comprising it to allow the expression of a gene of interest in yeast.
  • the patent application US 2005/0191726 describes a vector comprising one or more expression cassettes which contain a nucleotide sequence encoding a gene of interest, thus allowing the expression of a protein of interest in yeast.
  • the process for transforming yeast with such a vector can be carried out only once for each yeast strain.
  • the increase in the number of copies of the gene of interest in yeast can only be obtained by conventional genetics by crossing two transformed yeast strains.
  • selection marker is meant a gene whose expression confers on cells containing it a characteristic allowing them to be selected. This is for example an antibiotic resistance gene.
  • selection marker is meant a gene whose expression confers on cells containing it a characteristic allowing them to be selected. This is for example an antibiotic resistance gene.
  • the present invention therefore provides an expression system for transforming a yeast several times, so as to increase the number of copies of the expression system present in the genome and thus increase the expression of the gene of interest.
  • the present invention thus relates to a new system of expression in simple and rapid yeast, allowing on the one hand a reliable expression of the gene of interest, on the other hand to increase the number of copies of the expression system integrated into the genome of the yeast, and finally to eliminate the antibiotic resistance gene integrated into the genome of the yeast.
  • the inventors have developed a yeast expression system comprising known elements assembled in such a way that this expression system is much more efficient than the expression systems of the prior art.
  • This new expression system consists of specific sequences of integration of the system into the yeast genome, a selection insert and an expression cassette of the gene of interest.
  • This invention thus provides a simple and rapid system for the expression of a gene of interest in yeast, since only the cloning step of the gene of interest in the expression system remains to be performed.
  • the use in this expression system of specific sequences of integration into the yeast genome allows a single or multiple integration leading to the reliability of the success of the expression of the gene of interest.
  • this new system makes it possible to excise the selection marker associated with the expression system integrated in the yeast genome.
  • the number of copies of the expression system integrated into the yeast genome can be easily increased, since the excision of the selection marker gives the advantage of being able to transform again yeasts already containing a copy of the yeast system. expression.
  • the subject of the invention is therefore a system for expressing a gene of interest in a cell, preferably a yeast, comprising:
  • an expression cassette of the gene of interest comprising a promoter allowing the expression of said gene, at least one cloning site allowing integration of the gene, and a terminator.
  • the cloning site comprises the restriction enzyme restriction sites NotI, BamHI, Mfel and XhoI, allowing the insertion of the nucleotide sequence of the gene of interest into the cassette. 'expression.
  • this cloning site has for sequence SEQ ID No. 1 or any sequence identical to at least 70%, preferably 80%, very preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 1.
  • the framing of the selection marker by two LoxP sequences will allow the excision of this selection marker using the CRE / Lox system.
  • the CRE enzyme is a recombinase that specifically recognizes LoxP sequences.
  • the nucleotide sequence between these two sites is called target DNA and will be removed in the presence of the CRE enzyme.
  • the CRE enzyme binds to the LoxP sites, it cuts these sites in half and collects together two halves after the target DNA has been removed.
  • the LoxP sequences have for sequence SEQ ID No. 2 or any sequence homologous to at least 70%, of preferably 80%, very preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 2.
  • the sequences allowing the integration of the expression system into the genome of said yeast are multiple and are chosen from the group constituted by the TY sequences, the X and Y 'telomeric sequences, the DUP sequences, the ⁇ sequence or any repeated sequences in the yeast genome.
  • said integration sequences in the genome of yeast are the TY1A and TY1B sequences of Saccharomyces cerevisiae, and preferably have the sequence SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 respectively or any sequence homologous to at least 70%, preferably 80%, very preferably 90%, to the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4.
  • the promoters used in the expression system are strong promoters, that is to say promoters that induce a strong transcription of the genes under their control.
  • strong promoters are 1) promoters governing the expression of genes whose proteins are abundant in yeast such as promoters governing the expression of proteins of glycolysis or nitrogen metabolism; 2) promoters whose expression is specific, for example promoters whose activity is regulated by the presence of sugar or nitrogen; 3) promoters whose activity is important in view of transcriptome experiments; or 4) artificial promoters designed to allow strong transcription of the genes they regulate.
  • the terminators used in the expression system are chosen for their ability to allow good mRNA stability.
  • the chosen terminator corresponds to the strong promoter chosen previously.
  • the promoter allowing the expression of the gene of interest is the promoter of the Saccharomyces cerevisiae TDH3 gene, and preferably has the sequence SEQ ID No. 5 or any sequence at least 70% homologous, preferably 80% , very preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 5.
  • the associated terminator is the terminator of the Saccharomyces cerevisiae CYCl gene, and preferably has the sequence SEQ ID No. 6 or any sequence homologous to at least 70%, preferably 80%, and most preferably 90%, at the same time. sequence SEQ ID No. 6.
  • the promoter and the terminator allowing the expression of the selection marker are the promoter and terminator of the TEF1 gene of Ashbya gossypii, and preferably have for sequence the sequence SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8 respectively, or all sequences which are homologous to them at least 70%, preferably 80%, very preferably 90%.
  • the selection marker is an antibiotic resistance gene selected from the group consisting of geneticin resistance genes, nourseothricin, phleomycin, zeocin or any other gene of resistance dominant to one antibiotic for which wild yeast is sensitive.
  • the selection marker used in the expression system is the geneticin resistance gene and preferably has the sequence SEQ ID NO: 9 or any sequence homologous to at least 70%, preferably 80%, very preferably. preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 9.
  • the expression system has for sequence the nucleotide sequence of SEQ ID No. 10 or any sequence homologous to at least 70%, preferably 80%, very preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 10.
  • the present invention also relates to a vector comprising an expression system as defined above.
  • the vector comprising the expression system is a plasmid, and advantageously pUC57.
  • the invention also encompasses transformed bacteria comprising at least one recombinant vector as defined above.
  • transformed bacteria can belong to any species allowing the replication of the chosen carrier vector.
  • it is bacteria of the genus E. CoIi.
  • the subject of the invention is also a kit comprising, on the one hand, a vector comprising the expression system described above and, on the other hand, a vector excision of the selection marker present in the expression system.
  • This kit allows the removal of said selection marker integrated into the yeast genome via the expression system.
  • Said excision vector comprises:
  • the promoters used for the expression of the selection marker and the expression of the CRE gene are strong promoters as described above, and the associated terminators are terminators allowing good stability of the mRNA.
  • the chosen terminator corresponds to the strong promoter chosen previously.
  • the promoters and terminators regulating the expression of the selection marker are the promoters and terminators of the TEF1 gene of Ashbya gossypii, and preferably have for sequence the sequence SEQ ID No. 7 and 8 respectively or any sequences which are homologous to them at at least 70%, preferably 80%, very preferably 90%.
  • the promoter allowing the expression of the CRE gene is the promoter of the GAL1 gene of Saccharomyces cerevisxae, and preferably has for sequence the sequence SEQ ID No. 11 or any sequence homologous to at least 70%, preferably 80%, very preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 11.
  • the terminator associated with the CRE gene is the terminator of the CYCl gene of Saccharomyces cerevisiae, and has preferably for sequence SEQ ID No. 6 or any sequence homologous to at least 70%, preferably 80%, very preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 6.
  • the selection marker present in the excision vector is an antibiotic resistance gene chosen from the group comprising genes for resistance to geneticin, nourseothricin, phleomycin, zeocin or any another dominant resistance gene to an antibiotic for which wild yeast is sensitive.
  • the selection marker used in the selection insert is the resistance gene with nourseothricin, and preferably has the sequence SEQ ID No. 12 or any sequence at least 70% homologous, preferably 80%, very preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 12.
  • the CRE gene preferably has for sequence the sequence SEQ ID No. 13 or any sequence homologous to at least
  • the excision vector described above is chosen from the vectors which are poorly segregated during cell divisions, leading by this characteristic to a loss of the vector in the absence of frequent selection pressure, by example multicopy replicative vectors.
  • the excision vector comprising the two nucleotide sequences described above is the plasmid pFL44s.
  • the excision vector is a multicopy vector, preferably pFL44s, in which the means for the selection of the cells containing it comprise the TEF1 promoter of Ashbya gossypii, the resistance gene for the nourseothricin and TEF1 terminator of Ashbya gossypii
  • the excision vector comprises the sequence SEQ ID No. 14 or any sequence homologous to at least 70%, preferably 80%, very preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 14.
  • the kit comprises an excision vector chosen from multicopy vectors, preferably pFL44s, said excision vector comprising the sequence SEQ ID No. 14 or any sequence homologous to at least 70 %, preferably 80%, very preferably 90%, to the sequence SEQ ID No. 14.
  • the invention also includes transformed yeasts comprising at least one expression system as described above.
  • the invention also relates to transformed yeasts as above and / or transformed with the excision vector as described above.
  • the yeasts belong to all species of hemiascomycetes yeasts, preferably to the genus Saccharomyces or its hybrids and very preferably, the yeasts come from the cerevisiae species or its hybrids.
  • yeast means any diploid or polyploid yeast or any haploid clone resulting from the sporulation of one of these strains or any diploid clone resulting from the crossing of two haploid clones.
  • the present invention relates to a method for expressing a gene of interest in yeast, comprising the following steps: a) cloning of the nucleotide sequence of the gene of interest in the expression system, b) transformation of yeast with the expression system thus obtained, c) yeast culture under the conditions allowing the expression of the gene of interest.
  • the nucleotide sequence of the gene of interest and the vector comprising the expression system are firstly digested with one or more restriction enzymes.
  • the sequence of the gene of interest is then inserted by simple ligation or other means of insertion into the expression system carried by the vector.
  • bacteria are transformed according to any known method with the ligation product (vector carrying the expression system containing the sequence of the gene of interest).
  • the bacteria containing the vector are selected by means of the selection marker, preferably an antibiotic resistance gene, present on the vector.
  • the vector containing the expression system is digested for one or more restriction enzymes, preferably PvuII, cutting on either side of the expression system.
  • the expression system is then purified and transformed into yeasts by any known method. Yeasts having integrated the expression system are selected by virtue of the selection marker, preferably an antibiotic resistance gene, present in the expression system. Finally, the transformed yeasts are cultured under the conditions allowing the expression of the gene of interest.
  • the subject of the invention is also a method for expressing a gene of interest in which the selection marker present in the yeast genome has been excised, said method comprising after step b) and before step c), the following steps b1), b2) and b3): b1) transformation of the yeast with the excision vector, b2) culture of the yeast under the conditions allowing the expression of the enzyme CRE, b3) isolation yeast having lost the selection marker.
  • the nucleotide sequence of the gene of interest is inserted into the expression system, and the yeasts are initially transformed with expression system as previously described.
  • the yeasts having integrated the expression system are selected thanks to the presence of a first selection marker, preferably an antibiotic resistance gene.
  • the positively selected yeasts are then transformed with the excision vector according to any known method.
  • the yeasts having integrated the excision vector are selected by virtue of a second selection marker, preferably an antibiotic resistance gene, present in the excision vector.
  • the yeasts having thus integrated the expression system and containing the excision vector, are then cultured under the conditions allowing the expression of the CRE enzyme.
  • the active CRE enzyme will make it possible to excise the first selection marker flanked by the loxP sequences in the expression system. Yeasts that have lost this selection marker are then selected. For example, yeasts that have lost this first antibiotic resistance gene are selected because of their lack of resistance to this antibiotic.
  • the yeasts obtained as a result of this selection step no longer possess the selection marker in the expression system, but still possess that present in the excision vector.
  • the excision vector is selected from vectors that are poorly segregated during cell divisions. Due to this characteristic, the excision vector is easily lost in the absence of frequent selection pressure.
  • Selection pressure is understood to mean any process that contributes to the selection of cells. For example, maintain in culture yeasts possessing an antibiotic resistance gene in the presence of this antibiotic corresponds to a selection pressure process. The yeasts obtained in the previous step are therefore cultured in the absence of selection pressure so as to lose the excision vector, and then are selected for the loss of the second selection marker.
  • yeasts thus obtained have integrated in their genome the expression system allowing the expression of the gene of interest, while their genome no longer contains genes for antibiotic resistance. These yeasts are then cultured under the conditions known to those skilled in the art for the expression of the gene of interest.
  • the subject of the invention is also a method for expressing a gene of interest in which steps b), b1), b2) and b3) are repeated as many times as desired for copies of the system. expression to increase the number of copies of the expression system in the yeast genome.
  • the yeasts are firstly transformed with the expression system and then selected as described above. These yeasts are then transformed with the excision vector, so as to allow the elimination of the selection marker as described above. Yeasts thus obtained no longer have a selection marker in their genome and have integrated at least one copy of the expression system. In a second step, in order to increase the number of copies of the expression system, these yeasts are again transformed with the expression system. The same method of selection, transformation with the excision vector and final selection is carried out as above. Yeasts thus obtained no longer have selection markers and have integrated into their genome at least two copies of the expression system. This process can be renewed as many times as desired.
  • the present invention can be used in a wide variety of fields of application. For example, in human health, it can allow the production of therapeutic proteins (peptide hormone, enzyme, antibodies), vaccinating antigens against viruses, toxins or parasites, or even standards for the diagnosis (blood markers, infectious diseases). ).
  • therapeutic proteins peptide hormone, enzyme, antibodies
  • vaccinating antigens against viruses, toxins or parasites or even standards for the diagnosis (blood markers, infectious diseases).
  • the invention may also make it possible to modify the metabolism of yeast, ie to synthesize metabolites (amino acids, non-peptide hormone, vitamin, growth factor) that it does not synthesize naturally or that it synthesizes in a non-significant amount, or allow it to modify or degrade other metabolites.
  • the invention may allow the optimization of yeast strains used in particular in the food sector, in particular yeast, bread-bakery, brewery, winemaking, cider house.
  • the invention may also allow the production of aromatic molecules that can be used for the manufacture of perfumes, odoriferous materials or compositions, cosmetic compositions, food flavorings or fragrant and / or flavourful food additives or dietary supplements.
  • the invention may allow the production of enzyme for industrial use such as hydrolases, isomerases or protein structuring solutions.
  • enzyme for industrial use such as hydrolases, isomerases or protein structuring solutions.
  • the present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of obtaining the expression system, vectors comprising this system, excision vectors, and their use for the expression of a gene of interest in yeast and for the excision of the selection marker present in the genome of the yeast.
  • FIG. 1 shows a diagram of the pM2-KAN expression system
  • FIG. 2 shows the analysis of the cloning of GFP in the pM2-KAN expression system
  • FIG. 3 shows the result of the transformation of the yeasts with the expression system
  • FIG. 5 shows a test of functionality of GFP in yeasts
  • FIG. 6 shows the production of VAO by yeasts
  • FIG. 7 shows the process for obtaining the pFL44s-NAT1-CRE excision vector.
  • the expression system comprises the 2715 bp nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 10. This nucleotide sequence was constructed from a sequence synthetic (SEQ ID No. 15) and a selection insert (SEQ ID No. 16).
  • the synthetic sequence has a size of 1225 bp and has been synthesized by GenScript Corporation. This sequence includes:
  • the selection insert was isolated from the vector pUG6 cloned in E. coli (Guldener, U., Heck, S., Fiedler, T.,
  • the selection insert has 1500 bp and comprises: - a loxP sequence
  • This insert was isolated by digestion of the pUG ⁇ vector with the SalI and SacI restriction enzymes.
  • the expression system comprising the synthetic sequence was cloned into the vector pUC57 (GenScript Corporation) through the EcoRI and PstI restriction sites.
  • the pUG6 vector and the pUC57 vector containing the expression system were digested with SalI and SacI restriction enzymes.
  • the selection insert is then inserted by simple-ligation into the synthetic sequence between TY1A and the LoxP sequence located on either side of the SalI and SacI restriction sites.
  • the vector thus obtained comprising the expression system is called pM2-KAN (FIG. 1).
  • the XbaI and SacI restriction sites present in the selection insert make it possible to change the selection marker and its expression sequences if the user wishes.
  • the SalI and SpeI restriction sites make it possible to eliminate or replace all the sequences constituted by the selection marker and its expression sequences flanked by the two LoxP sequences.
  • the nucleotide sequence of the gene of interest: GFP was obtained by PCR using the primers 5 'GFP Not (SEQ ID No. 17) and 3' GFP Xho (SEQ ID No. 18) and using as template the vector p ⁇ G30 (Genbank reference: AF298781).
  • the 3 'primer allows the addition of a sequence encoding 6 histidines (C-terminal GFP) for subsequent detection or affinity purification of the protein produced.
  • the sequence of the gene of interest: GFP is obtained by PCR (SEQ ID No. 19).
  • the sequence of the gene of interest the GFP, amplified by PCR, and the pUC57 vector carrying the expression system are digested with the NotI restriction enzymes and XhoI.
  • the sequence of interest is inserted by simple ligation between the promoter of the TDH3 gene and the terminator of the CYCl gene located on either side of the NotI and XhoI restriction sites.
  • FIG. 2 shows the result of the digestion with NotI and XhoI restriction enzymes of the vector containing the pM2-KAN expression system and containing the gene of interest: GFP (columns 1 and 2) or not containing it ( pM2-KAN column).
  • the pUC57 vector containing the expression system is digested with the restriction enzyme PvuII. This enzyme cuts on both sides of the expression system containing the gene of interest: GFP.
  • the transformed yeasts thanks to the presence of the PCANr resistance gene carried by the expression system, are selected on rich medium YPD (yeast extract 1%, peptone 1%, glucose 2%) containing 300 mg / l of Geneticin.
  • Figure 3 shows the clones obtained after transformation of the yeasts Saccharomyces cerevisiae (strain 92411). Yeasts transformed without DNA (the top box) do not survive, whereas yeasts transformed with the expression system derived from the vector pM2-KAN by digestion with the restriction enzyme PvuII (the two lower boxes) survive and form colonies.
  • Example 2 Analysis of the Production of the Protein of Interest: GFP in Yeasts Transformed by the Expression System Containing the Sequence of the Gene of Interest
  • Example 2 Seven yeast clones transformed according to the protocol described in Example 1 were analyzed for the production of the protein of interest: GFP. A negative control was carried out with the same yeast strain transformed with the expression system not containing the sequence of the gene of interest.
  • the transformed yeasts are cultured on complete medium Glucose (YPD).
  • YPD complete medium Glucose
  • the cells are lysed by strong agitation in the presence of glass microbeads in lysis buffer
  • the total extract is clarified by centrifugation to remove cell debris.
  • the GFP protein is purified by affinity on Ni NTA resin by virtue of the sequence of 6 histidines present at the C-terminal of the protein. Briefly, the soluble fraction is incubated in the presence of Ni NTA resin (Quiagen).
  • the GFP-6His proteins retained on the resin are eluted (elution buffer: 50 mM phosphate buffer pH8, 300 mM NaCl, 150 mM imidazole) and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE gel 10%) and detected with coomassie blue.
  • Figure 4 shows that the GFP protein, whose expected theoretical size is approximately 25 kDa, is produced by all the yeasts transformed with the expression system containing the gene of interest: GFP (columns 1 to 7 92411 KAN GFP). Yeast transformed with the empty expression system (column 1 92411 KAN) does not produce GFP protein.
  • the letter E of FIG. 4 corresponds to the elution fraction of the Ni-NTA resin.
  • the yeasts transformed by the expression system and the yeasts "negative control" were observed by fluorescence microscopy after growth on complete glucose medium
  • Example 3 Transformation of yeasts with the expression system containing the gene of interest: vanillyl alcohol oxidase.
  • the expression system developed in Example 1 was used in this example to allow the expression of vanillyl alcohol oxidase (VAO) in yeasts.
  • VAO vanillyl alcohol oxidase
  • the nucleotide sequence of the VAO encoding the Penicillium simplicissimum VAO protein is Genbank number Y15627.
  • the VAO sequence used in this experiment (SEQ ID No. 20) was synthesized with a 5 'NotI site and XhoI at 3' to allow its cloning in the pivex vector, and this in phase with a nucleotide sequence making it possible to produce a protein with a tag of six histidines in C-terminal.
  • the pivex vector containing the VAO sequence as described above was digested with NotI and EcoRI to release the VA0-6His sequence. This sequence is then cloned by simple ligation in the pUC57 vector containing the expression system previously digested with NotI and Mfel.
  • the pUC57 vector containing the expression system is digested with the restriction enzyme PvuII.
  • This enzyme cuts on both sides of the expression system containing the gene of interest: VAO.
  • the DNA fragment resulting from this digestion is purified and transformed into yeasts by a heat shock method in the presence of PEG / lithium acetate.
  • the transformed yeasts thanks to the presence of the KANr resistance gene carried by the expression system, are selected on rich medium YPD (yeast extract 1%, peptone 1%, glucose 2%) containing 300 mg / l of Geneticin. Twenty-four clones of Saccharomyces cerevisiae yeasts (strain 92411) were obtained after transformation (clones 92411 KANVAO).
  • the transformed yeasts are cultured on complete medium Glucose (YPD).
  • the VAO protein is then purified by affinity on Ni-NTA resin as in Example 1.
  • the proteins retained on the resin are analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE gel) and detected with Coomassie blue.
  • Figure 6 shows for two clones that the VAO protein is produced (columns E 92411 KANVAO).
  • Clone 92411 T- corresponds to the negative control, i.e. to an untransformed strain 92411, does not produce VAO protein
  • BL21 I + F corresponds to a positive control resulting from the cloning of VAO into the pivex vector and its production in E. CoIi.
  • VAO has indeed an alcohol oxidase activity that allows the conversion of eugenol to coniferyl alcohol and vanillin.
  • the transformed yeasts were cultured at 30 ° C. with stirring in YPD medium. Their number should be 3 to 4 x 10 8 cells / ml. The cells are then centrifuged and taken up directly in glycine / NaOH buffer pH 10 for the conversion of eugenol. The latter is distributed without dissolution, directly in the middle up to 6 g / 1. The musts are incubated at 30 ° C., with shaking for 48 hours, before being analyzed.
  • the medium is acidified with phosphoric acid, centrifuged and diluted once with ethanol 96%.
  • the aqueous phase is then analyzed by high pressure liquid chromatography (HPLC).
  • the vector of excision has for original vector in this example the vector pFL44s (accession number X70266). This vector has a size of 4319 bp and has:
  • an insert comprising a selection marker and an insert comprising the sequence of the enzyme CRE (SEQ ID No. 14).
  • the insert comprising the selection marker in this case the resistance gene with nourseothricin NAT1
  • the NAT1 insert comprising the TEF gene promoter, the NAT1 gene sequence and the TEF gene terminator is inserted by simple ligation into the pFL44s vector.
  • the vector thus obtained is the vector pFL44s-NATl.
  • the insert comprising the sequence of the CRE enzyme is obtained from the vector psh47 (reference Genbank AF298782).
  • the vector psh47 and the vector pFL44s-NAT1 are digested with the restriction enzyme PvuII.
  • the CRE insert comprising the GAL1 gene promoter, the CRE gene sequence and the CYCl gene terminator is then inserted by simple ligation into the pFL44s-NAT1 vector.
  • the vector thus obtained is the pFL44s-NAT1-CRE vector (FIG. 7).
  • the yeasts initially transformed with the expression system containing the sequence of the gene of interest are transformed in a second step with the excision vector, here pFL44s-NAT1-CRE.
  • the transformed yeasts are selected on rich medium (YPD) supplemented with clonNAT (100 mg / ml).
  • the positively selected yeasts are then cultured in YPGalactose medium. Since the promoter of the CRE gene is inducible in the presence of galactose, this culture condition makes it possible to induce the expression of the CRE enzyme in yeasts.
  • the results of this experiment show that 100% of the clones have lost the KanR marker.

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Abstract

Système d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule, de préférence une levure, comprenant : (1) des moyens visant à l'intégration dudit système dans le génome de ladite cellule, comprenant deux séquences nucléotidiques, (2) des moyens visant à la sélection de ladite cellule ayant intégrée ledit système, comprenant un insert de sélection comprenant deux séquences LoxP encadrant un promoteur, un marqueur de sélection du type gène de résistance aux antibiotiques et un terminateur, (3) une cassette d'expression du gène d'intérêt, comprenant un promoteur permettant l'expression dudit gène, au moins un site de clonage permettant l'intégration du gène, et un terminateur.

Description

SYSTEME D'EXPRESSION D'UN GENE D'INTERET CHEZ LA LEVURE
La présente invention concerne un nouveau système d'expression d'un gène d'intérêt chez la levure, mettant notamment en œuvre une cassette d'expression.
L'expression d'un gène d'intérêt met généralement en œuvre des technologies d'ADN recombinant consistant à isoler ou synthétiser un gène d'intérêt, et à le cloner dans un hôte hétérologue. L'hôte est ensuite cultivé dans des conditions convenables pour permettre l'expression du gène en grande quantité. Plusieurs facteurs peuvent affecter l'expression du gène dans la cellule hôte. Ces facteurs dépendent en premier lieu du choix de l'hôte employé. La levure est utilisée depuis longtemps dans des procédés de fermentations à grande échelle et la technologie de production à grande échelle de levures est bien connue. La levure présente plusieurs avantages en tant qu'hôte pour l'expression d'un gène d'intérêt: 1) elle peut être cultivée à une plus grande densité que d'autres types de cellules eucaryotes, 2) sa machinerie de modifications post- transcriptionnelles et post-traductionnelles est similaire à celle trouvée dans les cellules de mammifères, permettant ainsi la production de protéines eucaryotes fonctionnelles. De plus, les levures sont cultivées dans un milieu de culture plus simple et de plus faible coût que ceux utilisés pour la culture d'autres types de cellules eucaryotes. Enfin, le génome des levures est bien caractérisé et est facilement manipulable pour permettre l'expression d'un gène hétérologue.
Plusieurs systèmes ont préalablement été décrits pour permettre l'expression d'un gène hétérologue chez la levure, par exemple dans les demandes de brevet CA 02381347 et US 2005/0191726. Pour faciliter la compréhension de la présente demande, plusieurs termes doivent être définis préalablement. On entend par « cassette d'expression » une séquence nucléotidique comprenant un promoteur, au moins un site d'insertion pour le clonage du gène d'intérêt ou un site multiple de clonage (MCS pour Multiple Cloning Site) et un terminateur. On entend par « promoteur » une séquence d'ADN nécessaire à l'initiation et au contrôle de la transcription, par « site d' insertion pour le clonage » ou « site multiple de clonage » une séquence d'ADN contenant respectivement un ou plusieurs sites de restriction, et par « terminateur » une séquence d'ADN nécessaire à la terminaison de la transcription. On entend par « vecteur » toute séquence d'ADN dans laquelle il est possible d'insérer des fragments d'acide nucléique étranger, les vecteurs permettant d'introduire de l'ADN étranger dans une cellule hôte. Des exemples de vecteurs sont les plasmides, les cosmides, les chromosomes artificiels de levures (YAC) , les chromosomes artificiels de bactéries (BAC) et les chromosomes artificiels dérivés du bactériophage Pl (PAC), les vecteurs dérivés de virus.
Ainsi, la demande de brevet CA 02381347 revendique une cassette d' expression et un vecteur la comprenant pour permettre l'expression d'un gène d'intérêt chez la levure. La demande de brevet US 2005/0191726 décrit un vecteur comprenant une ou plusieurs cassettes d'expression qui contiennent une séquence nucléotidique codant un gène d'intérêt, permettant ainsi l'expression d'une protéine d'intérêt chez la levure.
Ces différents systèmes permettant l'expression d'un gène d'intérêt chez la levure reposent sur l'utilisation d'un vecteur et la transformation de la levure par ledit vecteur.
De ce fait, une construction moléculaire particulière est en général réalisée pour chaque vecteur à chaque fois que l'on cherche à exprimer un gène d'intérêt dans la levure. Chaque construction n'est utilisable en général qu'une seule fois par souche, se limite à une seule intégration et nécessite un long travail de synthèse sans garantie de réussite. La présente invention propose donc un système d'expression simple et rapide permettant une expression fiable de n'importe quel gène d'intérêt chez la levure.
De plus, le procédé de transformation de la levure par un tel vecteur ne peut être réalisé qu'une seule fois pour chaque souche de levure. Ainsi, l'augmentation du nombre de copies du gène d' intérêt dans la levure ne peut être obtenue que par génétique classique en croisant deux souches de levures transformées .
En effet, lors d'une première transformation, les levures ayant bien intégré le système d'expression dans leur génome sont sélectionnées positivement grâce à la présence d'un marqueur de sélection. On entend par « marqueur de sélection » un gène dont l'expression confère aux cellules qui le contiennent une caractéristique permettant de les sélectionner. Il s'agit par exemple d'un gène de résistance aux antibiotiques. Cependant, comme toutes les levures sélectionnées positivement possèdent dans leur génome ce marqueur de sélection, une seconde transformation est impossible puisqu'il n'existe plus de moyen pour sélectionner positivement les levures qui auraient intégré une seconde fois le système d'expression. De ce fait, le rendement de l'expression du gène d'intérêt est limité. La présente invention propose donc un système d'expression permettant de transformer plusieurs fois une levure, de façon à augmenter le nombre de copies du système d'expression présentes dans le génome et ainsi augmenter l'expression du gène d'intérêt. Une augmentation du nombre de copies du système d'expression présentes dans le génome de la levure pourrait aussi être obtenue par une possible insertion multiple suivant les sites d' intégration utilisés par ce système. D'autre part, les procédés de l'art antérieur conduisent à l'expression d'un gène d'intérêt dans des levures qui ont intégré un gène de résistance aux antibiotiques dans leur génome . Or pour la commercialisation dans le domaine de l'industrie agro-alimentaire, il peut être intéressant d'utiliser un procédé d'expression d'un gène d'intérêt dans lequel les levures ne contiennent pas d'ADN non originaire de souches appartenant au même genre, de préférence à la même espèce de levure, et notamment de gènes de résistance aux antibiotiques, à l'exception du gène d'intérêt codant pour une protéine non produite naturellement par la souche de levure. La présente invention propose donc un système permettant d'éliminer le gène de résistance aux antibiotiques du génome des levures transformées.
La présente invention concerne donc un nouveau système d'expression chez la levure simple et rapide, permettant d'une part une expression fiable du gène d'intérêt, d'autre part d'augmenter le nombre de copies du système d'expression intégrées dans le génome de la levure, et enfin permettant d' éliminer le gène de résistance aux antibiotiques intégré dans le génome de la levure. Les inventeurs ont élaboré un système d'expression chez la levure comprenant des éléments connus assemblés de telle façon que ce système d'expression est beaucoup plus performant que les systèmes d'expression de l'art antérieur. Ce nouveau système d'expression est constitué de séquences spécifiques d'intégration du système dans le génome de la levure, d'un insert de sélection et d'une cassette d'expression du gène d'intérêt. Cette invention procure ainsi un système simple et rapide pour l'expression d'un gène d'intérêt chez la levure, puisque seule reste à réaliser l'étape de clonage du gène d'intérêt dans le système d'expression. L'utilisation dans ce système d'expression de séquences spécifiques d' intégration dans le génome de la levure permet une intégration simple ou multiple conduisant à la fiabilité du succès de l'expression du gène d'intérêt.
En combinaison avec un vecteur d'excision, ce nouveau système permet d'exciser le marqueur de sélection associé au système d'expression intégré dans le génome de la levure. Enfin, le nombre de copies du système d' expression intégrées dans le génome de la levure peut être facilement augmenté, puisque l'excision du marqueur de sélection donne l'avantage de pouvoir transformer à nouveau des levures contenant déjà une copie du système d'expression.
L'invention a donc pour objet un système d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule, de préférence une levure, comprenant :
(1) des moyens visant à l'intégration dudit système dans le génome de ladite cellule, comprenant deux séquences nucléotidiques, lesdites séquences nucléotidiques étant multiples dans le génome de la levure et choisies dans le groupe constitué par les séquences TY, les séquences télomériques X et Y' , les séquences DUP, la séquence δ, ou toute séquence répétées dans le génome de la levure,
(2) des moyens visant à la sélection de ladite cellule ayant intégré ledit système, comprenant un insert de sélection comprenant deux séquences LoxP encadrant un promoteur, un marqueur de sélection du type gène de résistance aux antibiotiques et un terminateur,
(3) une cassette d'expression du gène d'intérêt, comprenant un promoteur permettant l'expression dudit gène, au moins un site de clonage permettant l'intégration du gène, et un terminateur.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le site de clonage comprend les sites de restriction d'enzymes de restriction Notl, BamHI, Mfel et Xhol, permettant l'insertion de la séquence nucléotidique du gène d'intérêt dans la cassette d'expression.
Avantageusement, ce site de clonage a pour séquence la SEQ ID n°l ou toute séquence identique à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°l.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'encadrement du marqueur de sélection par deux séquences LoxP va permettre l'excision de ce marqueur de sélection grâce au système CRE/Lox. L'enzyme CRE est une recombinase qui reconnaît spécifiquement les séquences LoxP. La séquence nucléotidique comprise entre ces deux sites est qualifiée d'ADN cible et sera éliminée en présence de l'enzyme CRE. En effet, lorsque l'enzyme CRE se lie aux sites LoxP, elle coupe ces sites en deux et recolle ensemble deux moitiés après que l'ADN cible ait été éliminé. Avantageusement, les séquences LoxP ont pour séquence la SEQ ID n°2 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°2.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, dans lequel la cellule est une levure, les séquences permettant l'intégration du système d'expression dans le génome de ladite levure sont multiples et sont choisies dans le groupe constitué par les séquences TY, les séquences télomériques X et Y' , les séquences DUP, la séquence δ ou toutes séquences répétées dans le génome de la levure. Ces séquences d'intégration multiples permettent d'obtenir une intégration multiple du système d'expression, augmentant ainsi le nombre de copies intégrées dans le génome de la levure. Avantageusement, lesdites séquences d'intégration dans le génome de la levure sont les séquences TYlA et TYlB de Saccharomyces cerevisiae, et ont de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°3 et SEQ ID n°4 respectivement ou toutes séquences homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, aux séquences SEQ ID n°3 et SEQ ID n°4.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, les promoteurs utilisés dans le système d'expression sont des promoteurs forts, c'est-à-dire des promoteurs qui induisent une forte transcription des gènes sous leur contrôle. Des exemples de promoteurs forts sont 1) des promoteurs gouvernant l'expression de gènes dont les protéines sont abondantes dans la levure comme les promoteurs gouvernant l'expression de protéines de la glycolyse ou du métabolisme de l'azote ; 2) des promoteurs dont l'expression est spécifique, par exemple des promoteurs dont l'activité est régulée par la présence de sucre ou d'azote ; 3) des promoteurs dont l'activité est importante au vu des expériences de transcriptome ; ou 4) des promoteurs artificiels conçus pour permettre une forte transcription des gènes qu'ils régulent. Les terminateurs utilisés dans le système d'expression sont choisis pour leur capacité à permettre une bonne stabilité des ARNm. Avantageusement, le terminateur choisi correspond au promoteur fort choisi précédemment. Avantageusement, le promoteur permettant l'expression du gène d'intérêt est le promoteur du gène TDH3 de Saccharomyces cerevisiae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°5 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°5. Avantageusement, le terminateur associé est le terminateur du gène CYCl de Saccharomyces cerevisiae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°6 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°6. Avantageusement, le promoteur et le terminateur permettant l'expression du marqueur de sélection sont le promoteur et le terminateur du gène TEFl de Ashbya gossypii, et ont de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°7 et SEQ ID n°8 respectivement ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le marqueur de sélection est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance dominant à un antibiotique pour lequel la levure sauvage est sensible. Avantageusement, le marqueur de sélection utilisé dans le système d'expression est le gène de résistance à la généticine et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°9 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°9.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le système d'expression a pour séquence la séquence nucléotidique de SEQ ID n°10 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°10.
La présente invention a également pour objet un vecteur comprenant un système d'expression tel que défini précédemment .
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le vecteur comprenant le système d'expression est un plasmide, et avantageusement pUC57.
L'invention englobe également des bactéries transformées, comprenant au moins un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
Ces bactéries transformées peuvent appartenir à n'importe quelle espèce permettant la réplication du vecteur support choisi. Avantageusement, il s'agit de bactéries du genre E. CoIi.
L'invention a également pour objet un kit comprenant d'une part un vecteur comprenant le système d'expression décrit précédemment et d'autre part un vecteur d'excision du marqueur de sélection présent dans le système d'expression. Ce kit permet l'élimination dudit marqueur de sélection intégré dans le génome de la levure par l'intermédiaire du système d'expression. Ledit vecteur d'excision comprend :
(1) des moyens visant à la sélection des cellules le contenant comprenant un promoteur, un marqueur de sélection et un terminateur, et
(2) des moyens visant à l'excision du marqueur de sélection présent dans le système d'expression comprenant un promoteur, le gène CRE, et un terminateur.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les promoteurs utilisés pour l'expression du marqueur de sélection et l'expression du gène CRE sont des promoteurs forts tels que décrits précédemment, et les terminateurs associés sont des terminateurs permettant une bonne stabilité des ARNm. Avantageusement, le terminateur choisi correspond au promoteur fort choisi précédemment. Avantageusement, les promoteurs et terminateurs régulant l'expression du marqueur de sélection sont les promoteurs et terminateurs du gène TEFl de Ashbya gossypii, et ont de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°7 et 8 respectivement ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%. Avantageusement, le promoteur permettant l'expression du gène CRE est le promoteur du gène GALl de Saccharomyces cerevisxae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°ll ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°ll.
Avantageusement, le terminateur associé au gène CRE est le terminateur du gène CYCl de Saccharomyces cerevisiae, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°6 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°6.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le marqueur de sélection présent dans le vecteur d'excision est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance dominant à un antibiotique pour lequel la levure sauvage est sensible.
Avantageusement, le marqueur de sélection utilisé dans 1' insert de sélection est le gène de résistance à la nourseothricine, et a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°12 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°12.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le gène CRE a de préférence pour séquence la séquence SEQ ID n°13 ou toute séquence homologue à au moins
70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°13.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le vecteur d'excision décrit précédemment est choisi parmi les vecteurs qui sont mal ségrégés pendant les divisions cellulaires, conduisant par cette caractéristique à une perte du vecteur en absence de pression de sélection fréquente, par exemple des vecteurs réplicatifs de type multicopies . Avantageusement, le vecteur d'excision comprenant les deux séquences nucléotidiques décrites précédemment est le plasmide pFL44s.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le vecteur d'excision est un vecteur multicopie, de préférence pFL44s, dans lequel les moyens visant à la sélection des cellules le contenant comprennent le promoteur TEFl de Ashbya gossypii, le gène de résistance à la nourseothricine et le terminateur TEFl de Ashbya gossypii
(séquence portée par le vecteur dont la référence Genbank est
X73149) , et les moyens visant à l'excision du marqueur de sélection présent dans le système d'expression comprennent le promoteur GALl de Saccharomyces cerevisiae, le gène CRE et le terminateur CYCl de Saccharomyces cerevisiae (séquence portée par le vecteur dont la référence Genbank est AF298782) . Avantageusement, le vecteur d'excision comprend la séquence SEQ ID n°14 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°14.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le kit comprend un vecteur d'excision choisi parmi les vecteurs multicopies, de préférence pFL44s, ledit vecteur d'excision comprenant la séquence SEQ ID n°14 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, à la séquence SEQ ID n°14.
L' invention englobe également des levures transformées, comprenant au moins un système d'expression tel que décrit précédemment. L'invention a aussi pour objet des levures transformées telles que ci-dessus et/ou transformées avec le vecteur d'excision tel que décrit précédemment.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les levures appartiennent à toute espèce de levures hémiascomycètes, de préférence au genre Saccharomyces ou ses hybrides et très préférentiellement, les levures proviennent de l'espèce cerevisiae ou ses hybrides. Au sens de la présente invention, on entend par levure toute levure diploïde ou polyploïde ou tout clone haploïde issu de la sporulation de l'une de ces souches ou encore tout clone diploïde issu du croisement de deux clones haploïdes.
La présente invention a pour objet un procédé d'expression d'un gène d'intérêt dans la levure, comprenant les étapes suivantes : a) clonage de la séquence nucléotidique du gène d'intérêt dans le système d'expression, b) transformation de la levure avec le système d'expression ainsi obtenu, c) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression du gène d'intérêt.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence nucléotidique du gène d' intérêt et le vecteur comprenant le système d' expression sont dans un premier temps digérés par une ou plusieurs enzymes de restriction. La séquence du gène d'intérêt est ensuite insérée par simple ligation ou tout autre moyen d' insertion dans le système d'expression porté par le vecteur. De façon à amplifier le système d'expression, des bactéries sont transformées selon n'importe quel procédé connu avec le produit de ligation (vecteur portant le système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt). Les bactéries contenant le vecteur sont sélectionnées grâce au marqueur de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques, présent sur le vecteur.
Dans un second temps, le vecteur contenant le système d'expression est digéré pour une ou plusieurs enzymes de restriction, de préférence PvuII, coupant de part et d'autre du système d'expression. Le système d'expression est ensuite purifié puis transformé dans les levures selon n'importe quel procédé connu. Les levures ayant intégré le système d'expression sont sélectionnées grâce au marqueur de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques, présent dans le système d'expression. Enfin, les levures transformées sont cultivées dans les conditions permettant l'expression du gène d'intérêt.
L'invention a aussi pour objet un procédé d'expression d'un gène d'intérêt dans lequel le marqueur de sélection présent dans le génome de la levure a été excisé, ledit procédé comprenant après l'étape b) et avant l'étape c) , les étapes bl) , b2) et b3) suivantes : bl) transformation de la levure avec le vecteur d' excision, b2) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression de l'enzyme CRE, b3) isolement des levures ayant perdu le marqueur de sélection.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence nucléotidique du gène d' intérêt est insérée dans le système d'expression, et les levures sont dans un premier temps transformées avec de système d'expression comme décrit précédemment. Les levures ayant intégré le système d'expression sont sélectionnée grâce à la présence d'un premier marqueur de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques. Les levures sélectionnées positivement sont ensuite transformées avec le vecteur d'excision selon n'importe quel procédé connu. Les levures ayant intégré le vecteur d'excision sont sélectionnées grâce à un second marqueur de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques, présent dans le vecteur d' excision.
Les levures, ayant donc intégré le système d'expression et contenant le vecteur d'excision, sont alors cultivées dans les conditions permettant l'expression de l'enzyme CRE. L'enzyme CRE active va permettre d'exciser le premier marqueur de sélection encadré par les séquences loxP dans le système d'expression. Les levures ayant perdu ce marqueur de sélection sont ensuite sélectionnées. Par exemple, les levures ayant perdu ce premier gène de résistance à un antibiotique sont sélectionnées grâce à leur absence de résistance à cet antibiotique.
Les levures obtenues à la suite de cette étape de sélection ne possèdent plus le marqueur de sélection dans le système d'expression, mais possèdent encore celui présent dans le vecteur d'excision. Tel que décrit précédemment, le vecteur d'excision est choisi parmi les vecteurs qui sont mal ségrégés pendant les divisions cellulaires. De part cette caractéristique, le vecteur d'excision est facilement perdu en absence de pression de sélection fréquente. On entend par pression de sélection tout procédé contribuant à sélectionner les cellules. Par exemple, maintenir en culture des levures possédant un gène de résistance à un antibiotique en présence de cet antibiotique correspond à un procédé de pression de sélection. Les levures obtenues à l'étape précédente sont donc cultivées en absence de pression de sélection de façon à perdre le vecteur d'excision, puis sont sélectionnées pour la perte du second marqueur de sélection.
Les levures ainsi obtenues ont intégré dans leur génome le système d'expression permettant l'expression du gène d'intérêt, tandis que leur génome ne contient plus de gènes de résistance aux antibiotiques. Ces levures sont alors cultivées dans les conditions connues de l'homme du métier permettant l'expression du gène d'intérêt.
Enfin, l'invention a également pour objet un procédé d'expression d'un gène d'intérêt dans lequel les étapes b) , bl), b2) et b3) sont répétées autant de fois qu'il est souhaité de copies du système d'expression, dans le but d'augmenter le nombre de copies du système d'expression dans le génome de la levure.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les levures sont dans un premier temps transformées avec le système d'expression puis sélectionnées comme décrit précédemment. Ces levures sont ensuite transformées avec le vecteur d'excision, de façon à permettre l'élimination du marqueur de sélection comme décrit précédemment. Les levures ainsi obtenues ne possèdent plus de marqueur de sélection dans leur génome et ont intégré au moins une copie du système d' expression. Dans un second temps, de façon à augmenter le nombre de copies du système d'expression, ces levures sont de nouveau transformées avec le système d'expression. Le même procédé de sélection, de transformation avec le vecteur d'excision et de sélection finale est réalisé comme précédemment. Les levures ainsi obtenues ne possèdent plus de marqueurs de sélection et ont intégré dans leur génome au moins deux copies du système d'expression. Ce procédé peut être renouvelé autant de fois que souhaitées.
La présente invention peut être utilisée dans des domaines d'application très divers. Par exemple, en santé humaine, elle peut permettre la production de protéines thérapeutiques (hormone peptidique, enzyme, anticorps) , d'antigènes vaccinants contre des virus, des toxines ou des parasites, ou encore de standards pour le diagnostic (marqueurs sanguins, infectiologie) .
L' invention peut aussi permettre de modifier le métabolisme de la levure, i.e. synthétiser des métabolites (acides aminés, hormone non peptidique, vitamine, facteur de croissance) qu'elle ne synthétise pas naturellement ou qu'elle synthétise en quantité non significative, ou lui permettre de modifier ou dégrader d'autres métabolites.- L'invention peut permettre l'optimisation de souches de levures utilisables notamment dans le secteur alimentaire, en particulier la levurerie, la panification-boulangerie, la brasserie, la vinification, la cidrerie.
L'invention peut aussi permettre la production de molécules aromatiques utilisables pour la fabrication de parfums, de matières ou compositions odorantes, de compositions cosmétiques, d'arômes alimentaires ou d'additifs alimentaires odorants et/ou sapides ou encore de compléments alimentaires
(acides aminés, vitamines, acides organiques...) .
Enfin, l'invention peut permettre la production d'enzyme à usage industriel telles que des hydrolases, des isomérases ou des protéines structurantes de solutions. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention du système d'expression, de vecteurs comprenant ce système, de vecteurs d'excision, et de leur utilisation pour l'expression d'un gène d'intérêt dans la levure et pour l'excision du marqueur de sélection présent dans le génome de la levure.
Dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, il sera fait référence aux figures en annexe, dans lesquelles : - la figure 1 présente un schéma du système d'expression pM2-KAN,
- la figure 2 présente l'analyse du clonage de la GFP, dans le système d'expression pM2-KAN,
- la figure 3 présente le résultat de la transformation des levures avec le système d'expression,
- la figure 4 présente la production de la GFP par les levures,
- la figure 5 présente un test de fonctionnalité de la GFP dans les levures, - la figure 6 présente la production de la VAO par les levures,
- la figure 7 présente le procédé d' obtention du vecteur d'excision pFL44s-NATl-CRE .
Exemple 1 : Transformation des levures avec le système d'expression contenant le gène d'intérêt : la GFP.
1/ Synthèse du système d'expression
Le système d'expression comprend la séquence nucléotidique de 2715 pb décrite dans SEQ ID n°10. Cette séquence nucléotidique a été construite à partir d'une séquence synthétique (SEQ ID n°15) et d'un insert de sélection (SEQ ID n°16) .
La séquence synthétique possède une taille de 1225 pb et a été synthétisé par GenScript Corporation. Cette séquence comprend :
- la séquence TYlA de Saccharomyces cerevisiae
- une séquence LoxP
- la séquence du promoteur du gène TDH3 de Saccharomyces cerevisiae - une séquence de sites multiples de clonage
- la séquence du terminateur du gène CYCl de Saccharomyces cerevisiae
- la séquence TYlB de Saccharomyces cerevisiae
L' insert de sélection a été isolé à partir du vecteur pUG6 clone dans E. coli (Guldener, U., Heck, S., Fiedler, T.,
BeinHauer, J., and Hegemann, J. H. 1996. A new efficient gène disruption cassette for repeated use in budding yeast.
Nucleic Acids Res. 24:2519-2524). L' insert de sélection comporte 1500 pb et comprend : - une séquence loxP
- la séquence du promoteur du gène TEFl de Ashbya gossypiii
- la séquence du gène kanE
- la séquence du terminateur du gène TEFl de Ashbya gossypii
Cet insert a été isolé par digestion du vecteur pUGβ avec les enzymes de restriction Sali et Sacl.
Le système d'expression comprenant la séquence synthétique a été clone dans le vecteur pUC57 (GenScript Corporation) grâce aux sites de restriction EcoRI et Pstl. Le vecteur pUG6 et le vecteur pUC57 contenant le système d'expression ont été digérés par les enzymes de restriction Sali et Sacl. L' insert de sélection est ensuite inséré par simple -ligation dans la séquence synthétique entre TYlA et la séquence LoxP situés de part et d'autre des sites de restriction Sali et Sacl.
Le vecteur ainsi obtenu comportant le système d'expression (séquence synthétique + insert de sélection) est appelé pM2- KAN (figure 1) Les sites de restriction Xbal et Sacl présents dans l' insert de sélection permettent de changer le marqueur de sélection et ses séquences d'expression si l'utilisateur le souhaite. Les sites de restriction Sali et Spel permettent d'éliminer ou de remplacer l'ensemble des séquences constitué par le marqueur de sélection et ses séquences d'expression encadrés par les deux séquences LoxP.
2/ Insertion du gène d'intérêt dans le système d'expression
La séquence nucléotidique du gène d'intérêt : la GFP a été obtenue par PCR en utilisant les amorces 5' GFP Not (SEQ ID n°17) et 3' GFP Xho (SEQ ID n°18) et en utilisant comme matrice le vecteur pϋG30 (référence Genbank : AF298781) . Pour cet exemple, l'amorce 3' permet l'ajout d'une séquence codant 6 histidines (en C-terminal de la GFP) permettant ultérieurement la détection ou la purification par affinité de la protéine produite. La séquence du gène d'intérêt : la GFP, est obtenue par PCR (SEQ ID n°19) .
La séquence du gène d'intérêt : la GFP, amplifiée par PCR, et le vecteur pUC57 portant le système d' expression sont digérés par les enzymes de restriction Notl et Xhol. La séquence d'intérêt est insérée par simple ligation entre le promoteur du gène TDH3 et le terminateur du gène CYCl situés de part et d'autre des sites de restriction Notl et XhoI.
3/ Clonage du système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt dans E. coli
Pour augmenter l'efficacité du clonage, le vecteur pUC57 portant le système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt est digéré par l'enzyme de restriction BamHI avant transformation dans E. coli. Les bactéries E. coli sont ensuite transformées avec ce produit selon n'importe quel procédé de transformation connu. La figure 2 présente le résultat de la digestion par les enzymes de restriction Notl et Xhol du vecteur contenant le système d'expression pM2-KAN et contenant le gène d'intérêt : la GFP (colonnes 1 et 2) ou ne le contenant pas (colonne pM2-KAN) .
4/ Transformation des levures avec le système d'expression comprenant le gène d' intérêt : la GFP
Le vecteur pUC57 contenant le système d'expression est digéré par l'enzyme de restriction PvuII. Cette enzyme coupe de part et d'autre du système d'expression contenant le gène d'intérêt : la GFP. Le fragment d'ADN de 3465 pb (séquence synthétique + insert de sélection = 2715 pb + séquence du gène d'intérêt : la GFP = 750 pb) est purifié et transformé dans les levures selon une méthode de choc thermique en présence de PEG/lithium acétate. Les levures transformées, grâce à la présence du gène de résistance PCANr porté par le système d'expression, sont sélectionnées sur milieu riche YPD (extrait de levure 1%, peptone 1%, glucose 2%) contenant 300 mg/1 de Geneticin. La figure 3 montre les clones obtenus après transformation des levures Saccharomyces cerevisiae (souche 92411) . Les levures transformées sans ADN (la boite du haut) ne survivent pas, tandis que les levures transformées avec le système d'expression issu du vecteur pM2-KAN par digestion avec l'enzyme de restriction PvuII (les deux boites du bas) survivent et forment des colonies.
Exemple 2 : Analyse de la production de la protéine d' intérêt : la GFP dans les levures transformées par le système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt.
Sept clones de levures transformés selon le protocole décrit dans l'exemple 1 ont été analysés pour la production de la protéine d'intérêt : la GFP. Un contrôle négatif a été réalisé avec la même souche de levure transformée avec le système d'expression ne contenant pas la séquence du gène d'intérêt.
Les levures transformées sont cultivées sur milieu complet Glucose (YPD) . Les cellules sont lysées par agitation forte en présence de microbilles de verre dans un tampon de lyse
(tampon de lyse : 50 mM tampon phosphate pH8, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole) , puis l'extrait total est clarifié par centrifugation pour éliminer les débris cellulaires. La protéine GFP est purifiée par affinité sur résine Ni NTA grâce à la séquence de 6 histidines présente en C-terminal de la protéine. Brièvement, la fraction soluble est incubée Ih en présence de résine Ni NTA (Quiagen) . Après lavage (tampon de lavage : 50 mM tampon phosphate pH8, 300 mM NAcI, 20 mM Imidazole) , les protéines GFP-6His retenues sur la résine sont éluées (tampon d'élution : 50 mM tampon phosphate pH8, 300 mM NaCl, 150 mM Imidazole) et analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (gel SDS-PAGE 10%) et détectées au bleu de coomassie.
La figure 4 montre que la protéine GFP, dont la taille théorique attendue est d'environ 25 kDa, est produite par toutes les levures transformées avec le système d'expression contenant le gène d'intérêt : la GFP (colonnes 1 à 7 92411 KAN-GFP). La levure transformée avec le système d'expression vide (colonne 1 92411 KAN) ne produit pas de protéine GFP. La lettre E de la figure 4 correspond à la fraction d'élution de la résine Ni-NTA.
Pour analyser la fonctionnalité de la protéine GFP produite, les levures transformées par le système d'expression et les levures « contrôle négatif » (pas de séquence de la GFP dans le système d'expression) ont été observées en microscopie à fluorescence après croissance sur milieu complet glucose
(figure 5) . Le contrôle négatif ne montre aucune fluorescence
(panneau 1) . Les levures exprimant la GFP (panneaux 2 et 3) présentent une fluorescence diffuse dans l'ensemble du cytoplasme. Toutes les cellules du champ d'observation expriment la GFP (panneau 4 : microscopie à fluorescence, panneau 5 : microscopie Nomarski) .
Exemple 3 : Transformation des levures avec le système d' expression contenant le gène d' intérêt : la vanillyl alcool oxydase . Le système d'expression mis au point dans l'exemple 1 a été utilisé dans cet exemple pour permettre l'expression de la vanillyl alcool oxydase (VAO) dans les levures.
1/ Insertion du gène d'intérêt dans le système d'expression
La séquence nucléotidique de la VAO codant la protéine VAO de Pénicillium simplicissimum a pour référence Genbank le numéro Y15627. La séquence VAO utilisée dans cette expérience (SEQ ID n°20) a été synthétisée avec un site Notl en 5' et Xhol en 3' pour permettre son clonage dans le vecteur pivex, et ceci en phase avec une séquence nucléotidique permettant de produire une protéine avec une étiquette de six histidines en C-terminal. Le vecteur pivex contenant la séquence VAO telle que décrite ci-dessus a été digéré par Notl et EcoRI defaçon à libérer la séquence VA0-6His. Cette séquence est ensuite clonée par simple ligation dans le vecteur pUC57 contenant le système d'expression digéré préalablement par Notl et Mfel.
2/ Transformation des levures avec le système d'expression comprenant le gène d' intérêt : la vanillyl alcool oxidase
Le vecteur pUC57 contenant le système d'expression est digéré par l'enzyme de restriction PvuII. Cette enzyme coupe de part et d'autre du système d'expression contenant le gène d'intérêt : la VAO. Le fragment d'ADN issu de cette digestion est purifié et transformé dans les levures selon une méthode de choc thermique en présence de PEG/lithium acétate. Les levures transformées, grâce à la présence du gène de résistance KANr porté par le système d' expression, sont sélectionnées sur milieu riche YPD (extrait de levure 1%, peptone 1%, glucose 2%) contenant 300 mg/1 de Geneticine. Vingt-quatre clones de levures Saccharomyces cerevisiae (souche 92411) ont été obtenus après transformation (clones 92411 KANVAO) .
3/ Analyse de la production de la vanillyl alcool oxydase par les levures transformées
Les levures transformées sont cultivées sur milieu complet Glucose (YPD) . La protéine VAO est ensuite purifiée par affinité sur résine Ni NTA comme dans l'exemple 1. Les protéines retenues sur la résine sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (gel SDS-PAGE) et détectées au bleu de coomassie. La figure 6 montre pour deux clones que la protéine VAO est produite (colonnes E 92411 KANVAO) . Le clone 92411 T- correspond au témoin négatif, c'est-à-dire à une souche 92411 non transformée, ne produit pas de protéine VAO, tandis que BL21 I+F correspond à un témoin positif résultant du clonage de la VAO dans le vecteur pivex et de sa production dans E. CoIi.
Pour analyser la fonctionnalité de la protéine produite, la biosynthèse d'alcool coniférylique et de vanilline en erlenmeyer a été étudiée dans les levures transformées. La VAO possède en effet une activité alcool oxydase qui permet la conversion de l'eugénol en alcool coniférylique et en vanilline .
Les levures transformées ont été cultivées à 300C sous agitation dans du milieu YPD. Leur nombre doit atteindre 3 à 4 x 108 cellules / ml. Les cellules sont ensuite centrifugées et reprises directement dans un tampon glycine / NaOH pH 10 pour la conversion de l'eugénol. Ce dernier est distribué sans dissolution, directement dans le milieu à hauteur de 6 g/1. Les moûts sont incubés à 300C, sous agitation pendant 48h avant d'être analysés
En fin de conversion, le milieu est acidifié avec de l'acide phosphorique, centrifugé et dilué une fois avec de l'éthanol 96 %. La phase aqueuse est alors analysée en chromatographie haute pression sur phase liquide (HPLC) .
Figure imgf000028_0001
Les résultats montrent que les clones 93204, 93205 et 93206, ayant été transformés avec le système d'expression contenant le gène de la VAO, sont capables de convertir de l'eugénol en alcool coniférylique et en vanilline.
Exemple 4 : Excision du marqueur de sélection du génome des levures transformées.
1/ Construction du vecteur pFL44s-NATl-CRE pour l'excision du marqueur de sélection
Le vecteur d'excision a pour vecteur originel dans cet exemple le vecteur pFL44s (accession number X70266) . Ce vecteur d'une taille de 4319 pb possède :
- la séquence du gène URA3
- la séquence du gène de résistance AmpR - un site multiple de clonage
- la séquence de l'origine de réplication 2 micron.
Dans ce vecteur pFL44s sont insérés un insert comprenant un marqueur de sélection et un insert comprenant la séquence de l'enzyme CRE (SEQ ID n°14). L' insert comprenant le marqueur de sélection, ici le gène de résistance à la nourseothricine NATl, est obtenu à partir du vecteur codant pour la nourseothricine (référence Genbank X73149) . Ledit vecteur et le vecteur pFL44s sont digérés par les enzymes de restriction BgIII et EcoRI . L' insert NATl comprenant le promoteur du gène TEF, la séquence du gène NATl et le terminateur du gène TEF, est inséré par simple ligation dans le vecteur pFL44s. Le vecteur ainsi obtenu est le vecteur pFL44s-NATl. L' insert comprenant la séquence de l'enzyme CRE est obtenu à partir du vecteur psh47 (référence Genbank AF298782) . Le vecteur psh47 et le vecteur pFL44s-NATl sont digérés par l'enzyme de restriction PvuII. L' insert CRE comprenant le promoteur du gène GALl, la séquence de gène CRE et le terminateur du gène CYCl, est ensuite inséré par simple ligation dans le vecteur pFL44s-NATl. Le vecteur ainsi obtenu est le vecteur pFL44s-NATl-CRE (figure 7) .
2/ Transformation des levures avec le vecteur d'excision pour éliminer le marqueur de sélection présent dans le génome des levures
Les levures transformées dans un premier temps avec le système d'expression contenant la séquence du gène d'intérêt, sont transformées dans un deuxième temps avec le vecteur d'excision, ici pFL44s-NATl-CRE . Les levures transformées sont sélectionnées sur milieu riche (YPD) additionné de clonNAT (100 mg/ml) . Les levures sélectionnées positivement sont ensuite cultivées dans un milieu YPGalactose. Le promoteur du gène CRE étant inductible en présence de Galactose, cette condition de culture permet l'induction de l'expression de l'enzyme CRE dans les levures. Les résultats de cette expérience montrent que 100% des clones ont perdu le marqueur KanR.

Claims

REVENDICATIONS
1. Système d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule, de préférence une levure, comprenant :
(1) des moyens visant à l'intégration dudit système dans le génome de ladite cellule, comprenant deux séquences nucléotidiques, lesdites séquences nucléotidiques étant multiples dans le génome de la levure et choisies dans le groupe constitué par les séquences TY, les séquences télomériques X et Y' , les séquences DUP, la séquence δ ou toute séquence répétée dans le génome de la levure,
(2) des moyens visant à la sélection de ladite cellule ayant intégrée ledit système, comprenant un insert de sélection comprenant deux séquences LoxP encadrant un promoteur, un marqueur de sélection du type gène de résistance aux antibiotiques et un terminateur,
(3) une cassette d'expression du gène d'intérêt, comprenant un promoteur permettant l'expression dudit gène, au moins un site de clonage permettant l'intégration du gène, et un terminateur.
2. Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que les séquences nucléotidiques d'intégration dudit système d'expression sont les séquences TYlA et TYlB de Saccharomyces cerevisiae ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%.
3. Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits promoteurs sont des promoteurs forts et lesdits terminateurs assurent une bonne stabilité des ARNm.
4. Système d'expression selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur permettant l'expression du marqueur de sélection est le promoteur du gène TEFl de Ashbya gossypiï ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%, et le terminateur associé à l'expression du marqueur de sélection est le terminateur du gène TEFl de Ashbya gossypii ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%.
5. Système d'expression selon la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur fort du gène d'intérêt est le promoteur du gène TDH3 de Saccharomyces cerevïsiae ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90% et le terminateur associé à l'expression du gène d'intérêt est le terminateur du gène CYCl de Saccharomyces cerevisiae ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%.
6. Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marqueur de sélection est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance dominant à un antibiotique pour lequel la levure sauvage est sensible, et de préférence le gène de résistance à la généticine ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%.
7. Système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il a pour séquence la séquence nucléotidique SEQ ID n°10 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90% à la séquence SEQ ID n°10.
8. Vecteur comprenant le système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Plasmide comprenant le système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ledit plasmide étant de préférence pUC57.
10. Bactérie comprenant le vecteur selon l'une quelconque des revendications 8 à 9, ladite bactérie étant de préférence E.coli.
11. Kit constitué d'une part d'un vecteur comprenant le système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, et d'autre part d'un vecteur d'excision du marqueur de sélection, ledit vecteur d'excision comprenant : (1) des moyens visant à la sélection des cellules l'ayant intégré comprenant un promoteur, un marqueur de sélection et un terminateur, et
(2) des moyens visant à l'excision du marqueur de sélection présent dans le système d'expression comprenant un promoteur, le gène CRE, et un terminateur.
12. Kit selon la revendication 11, caractérisé en ce que lesdits promoteurs sont des promoteurs forts, et lesdits terminateurs associés assurent une bonne stabilité des ARNm.
13. Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que le promoteur et le terminateur régulant l'expression du marqueur de sélection présent dans le vecteur d'excision sont le promoteur et le terminateur du. gène TEFl de Ashbya gossypii ou les séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%.
14. Kit selon la revendication 13, caractérisé en ce que le promoteur régulant l'expression du gène CRE loxP est le promoteur du gène GALl de Saccharomyces cerevisiae, et le terminateur régulant l'expression du gène CRE loxP est le terminateur du gène CYCl de Saccharomyces cerevisiae ou toutes séquences qui leur sont homologues à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%.
15. Kit selon l'une quelconque . des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que le marqueur de sélection présent dans le vecteur d'excision est un gène de résistance aux antibiotiques choisi dans le groupe comprenant les gènes de résistance à la généticine, nourseothricine, phléomycine, zéocine ou tout autre gène de résistance dominant à un antibiotique pour lequel la levure sauvage est sensible, de préférence le gène de résistance à la nourseothricine ou toute séquence qui lui est homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90%.
16. Kit selon l'une quelconque des revendications
11 à 15, caractérisé en ce que le vecteur d'excision est choisi parmi les vecteurs qui sont mal ségrégés pendant les divisions cellulaires, de préférence le plasmide pFL44s.
17. Kit selon l'une quelconque des revendications
11 à 16, caractérisé en ce que le vecteur d'excision est choisi parmi les vecteurs multicopies, de préférence pFL44s, et qu'il comprend la séquence SEQ ID n°14 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90% à la séquence SEQ ID n°14.
18. Vecteur d'excision caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs multicopies, de préférence pFL44s, et qu'il comprend la séquence SEQ ID n°14 ou toute séquence homologue à au moins 70%, de préférence 80%, très préférentiellement 90% à la séquence SEQ ID n°14.
19. Levure comprenant au moins un système d'expression selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
20. Levure selon la revendication 19 transformée en outre avec le vecteur d'excision tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 11 à 17.
21. Levure selon l'une quelconque des revendications 19 à 20, caractérisée en ce qu'elle appartient à toute espèce de levures hémiascomycètes, de préférence au genre Saccharomyces ou ses hybrides, très préférentiellement à l'espèce cerevisiae ou ses hybrides.
22. Procédé d'expression d'un gène d'intérêt dans la levure, comprenant les étapes suivantes : a) clonage de la séquence nucléotidique du gène d'intérêt dans le système d'expression selon l'une des revendications 1 à 7, b) transformation de la levure avec le système d'expression ainsi obtenu, c) culture de la levure dans les conditions permettant l'expression du gène d'intérêt.
23. Procédé selon la revendication 22, comprenant, après l'étape b) et avant l'étape c) , les étapes bl) , b2) et b3) suivantes : bl) la transformation de la levure avec le vecteur d'excision tel que décrit l'une des revendications 11 à 17, b2) la culture de la levure dans les conditions permettant l'expression de l'enzyme CRE, b3) l'isolement des levures ayant perdu le marqueur de sélection.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, dans lequel les étapes b) , bl) , b2), b3) sont répétées autant de fois qu'il est souhaité de copies du système d'expression.
25. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 pour la production de protéines thérapeutiques, d'antigènes vaccinants, de standards pour le diagnostic.
26. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 pour la modification du métabolisme de la levure.
27. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 pour la production de molécules aromatiques utilisables pour la fabrication de parfums, de matières ou compositions odorantes, de compositions cosmétiques, d'arômes alimentaires ou d'additifs alimentaires odorants et/ou sapides ou encore de compléments alimentaires.
28. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 pour l'optimisation de souches de levures utilisables notamment dans le secteur alimentaire, en particulier la levurerie, la panification-boulangerie, la brasserie, la vinification, la cidrerie.
29. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 pour la production d'enzymes à usage industriel telles que des hydrolases, isomérases ou protéines structurantes de solutions.
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